Odla Primär Nasal epitelceller från barn och programmera in inducerade pluripotenta stamceller

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Ulm, A., Mayhew, C. N., Debley, J., Khurana Hershey, G. K., Ji, H. Cultivate Primary Nasal Epithelial Cells from Children and Reprogram into Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (109), e53814, doi:10.3791/53814 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Inducerade pluripotenta stamceller från mänskliga prover (hiPSCs) är en snabbt växande teknik stamcellsforskning. De erbjuder ett alternativ till embryonal stamcells (hESC) forskning med betydligt färre etiska och moraliska nackdelar 1,2. Även om de inte är epigenetiskt identiska med hESCs 3-5, hiPSCs erbjuder ett unikt sätt att modellera utveckling och sjukdom fenotyper, och de kan härledas från vävnader som är relevanta för sjukdomstillståndet 5-8. Nya metoder för att generera hiPSCs ständigt undersökas för att identifiera optimala celltyper till att börja med, som ett sätt att förbereda GMP-kvalitet iPSCs lämpliga för transplantation, och även för att öka aktualiteten och effektivitet omprogrammering processen 6,9-11.

Airway epitelceller är avgörande för utvecklingen av allergisk inflammation 12 och epitelet är en viktig drivkraft för allergiska reaktioner och luftvägs ombyggnad genom interaktion med Immune och stromaceller. Den luftvägsepitel spelar en viktig roll för uppkomsten och ihållande lungsjukdomar såsom astma. Dock lägre luftvägsepitelceller är svåra att få i en klinisk miljö, särskilt från friska kontrollpatienter och barn. Data från flera studier stöder antagandet att epitelceller från nässlemhinnan är en giltig och praktisk proxy för lägre luftvägs epitelceller 13-20, speciellt när man studerar svar på luftföroreningar och allergener. Nässlemhinnan består av mer än 90% flimmer epitelceller i luftvägarna och provtagning dessa nasala epitelceller (Pass) kan lätt utföras på barn så unga som fyra års ålder eller fem, eftersom det är mindre invasiv än andra cell / vävnadsprovtagningsteknik och är förknippade med minimal risk för biverkningar såsom infektion 20-23. Det erbjuder en snabb och enkelt sätt att prova både friska och sjuka barn utan långa, onödiga och ofta smärtsam bronkoskopi procedures som kräver sedering. Tidigare studier har visat att sjukdomstyper relaterade till astma svårighetsgrad kan urskiljas i både nässlemhinnan samt bronkial cellprover tagna från astmatiska barn, och genuttryck mellan de två vävnadstyper var likartad i ca 90% av icke-ubiquitous gener 22 , 24. Som en källa för iPSCs, NEC erbjuder fördelar över andra ofta utnyttjade celltyper. Fibroblaster används ofta för iPSC generation, men även om dessa celler lätt kan odlas från en hudbiopsi, denna process kräver typiskt lokalbedövning, en incision, och suturer, och är associerad med en viss risk för infektion. Därför kan erhålla informerat samtycke från patienter för denna typ av biopsi vara svårt 25. Ett alternativ till fibroblaster är perifera mononukleära blodceller (PBMC). Emellertid kan det vara svårt att erhålla tillräckligt med blod för iPSC generering från pediatriska patienter. Dessutom finns det begränsningar av nedströms apkomplikationer för fibroblaster och blodkroppar härledda iPSCs, särskilt deras differentiering förmåga att vissa celltyper 5,26. Med tanke på den relativa tillgängligheten och den låga risken för biverkningar efter sin samling, NEC representerar en ideal cell källa för iPSC generation från pediatriska populationer.

iPSCs har fått mycket uppmärksamhet på senare tid som en plattform för att studera människans utveckling, genererar nya sjukdomsmodeller och som en potentiell källa till celler för personliga terapier. Innan kan förverkligas den fulla potentialen av denna teknik, de molekylära grunderna för omprogrammeringen processen måste belysas, men nu detta protokoll och de förfaranden som beskrivs i att belysa forskningsstudier fokuserade på luftvägsexponeringar samt ge en plattform för studera effekterna av personlig medicin som involverar iPSCs.

Samverkans arbetet för flera labb har lett till genen av en framgångsrik teknik för att inte bara sampling av nässlemhinnan, utan även odling av NEC och omprogrammering dessa celler till iPSCs 23. Den här artikeln innehåller en översikt över ett protokoll för optimal provtagning, odling, och omprogrammering förhållanden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Följande protokoll följer de riktlinjer Institutionernas mänskliga forskningsetisk kommitté.

1. Provtagning nässlemhinnan

OBS: erhålla prover från patienter som är fria från tecken på andnings virusinfektion.

  1. Förbered en 15 ml konisk färsk innan deltagaren besök och tillsätt 2 ml BEGM (bronkialepitelceller cellodlingsmedium) plus 20 pl steril Penn / Strep / Fungizone (P / S / F) (0,01%).
  2. Öppna cytologi borste strax före provtagningen, och se till att hålla borsten steril och inte röra det till alla ytor förutom nasala ytor.
  3. Be deltagaren att sitta still och luta huvudet upp mot taket. Har mindre eller mer rastlösa barn sitter på sina händer och / eller liggande för att undvika banka borsta bort.
  4. Sikta borste på baksidan av näsan där passagen smalnar (Ser ut som en liten svart hål). Glida borsten ner och vrida handlederna när borsten har avlägsnats från Nostril.
  5. Placera borsten i konisk och dränka i BEGM. Klipp bort överflödigt borste och ersätta locket på tuben. INTE VORTEX.
    OBS: Om deltagaren är beredd, få en andra pensel på samma sätt, men i den andra näsborren. Erhållande av en borstning av båda näsborrarna kommer att resultera i en högre sannolikhet att provtagningen kommer att lyckas. Provtagning samma näsborre kan leda till blödningar och kommer sannolikt inte att förbättra provet.
  6. Behålla prover så nära 37 ° C som möjligt under transport med användning av en bägare med varmt vatten.

2. kroppar och Cytospin

  1. Skaka försiktigt borsten i BEGM och ta 10 ul av provet för en cellräkning med hjälp av en hemacytometer. Tillsätt 10 mikroliter av en levande / död fläck och räkna endast levande celler i mikroskop.
  2. Ta 50 pl av provet och späd till 200 pl med 1 x PBS. Lägg till cytospin tratt bifogas glasskiva och centrifugering vid 300 varv per minut under två minuter. Låt glida torr O / N och fläck glida following tillverkarens anvisningar. Låt torka O / N, företrädesvis i mörker.
  3. Fläck Skjut med Hema 3 Stain
    1. Överför varje lösning (Hema fixativ, ljusblå, Hema 3 Lösning I, rosa och Hema 3 Lösning II, djupblå) i en färgskål; Håll täckt när den inte används. Infoga bilder i glasfärg båt
    2. Dip glider kontinuerligt i fixeringsmedel under 30 sek, sedan låta överskottet rinna. Dip glider kontinuerligt i lösning I under 30 sekunder, låt överskottet rinna. Dip glider kontinuerligt i lösning II under 30 sekunder, sedan låta överskott för att dränera
    3. Skölj med avjoniserat vatten tills vattnet är klart. Låt torka O / N, företrädesvis i mörker
  4. Titta på glider under mikroskop och räkna celler, bestämma procent av epitelceller. Bör vara 90% eller större om provtagningen är bra.

3. sådd Celler

OBS: Utför alla cellodlingsförfaranden på ett korrekt och certifierad vävnadskulturhuva med steril teknik.

  1. Coat plattor med bovint Dermal Collagen (BDC), typ 1. Tillsätt 0,5 ml av 3 mg / ml BDC utspätt i 49,5 ml 1 x PBS. Förbered mindre om endast ett fåtal plattor kommer att användas. Coat en T25-kolv med 2 ml BDC och inkubera i steril huv O / N eller vid 37 ° C under 2 h, om så är nödvändigt.
  2. Efter inkubation, aspirera eventuell kvarvarande vätska. Exponera kolvar för UV-ljus under 30 min i sterila huven. Förvara flaskor för upp till en månad vid 4 ° C, men föra dem till RT eller 37 ° C före sådd celler.
  3. Hålla borste och celler i BEGM vid 37 ° C tills den ska utsäde. Försiktigt swish borsten inuti konisk, men inte virvel.
    1. Plattan 7 x 10 5 celler i en T25-kolv. Om det är mindre, använda en mindre behållare, såsom en brunn i en 6-brunnsplatta. Denna storlek platta kräver ca 3 x 10 5 celler.
      OBS: Om det inte finns så många celler, är det inte tillrådligt att fortsätta.
  4. Under en steril huv, dra borsten ut ur röret och GEntly rotera pensel på ytan av den belagda kolven, försiktigt så att inte repa beläggningen. Kasta pensel i en lämplig biologiskt behållare.
  5. Långsamt pipettera de återstående cellerna i BEGM ut ur den koniska och in i T25-kolv. Observera cellerna under mikroskop. Ett antal flytande celler kommer att observeras och det kan finnas en del skräp från näsan, vilket är godtagbart i detta skede (figur 3A).

4. Cell Culture

  1. Efter sådd celler, låt dem sedimentera under 48 timmar utan avbrott (fig 3). Efter 48 timmar, långsamt och försiktigt tillsätt 2 ml varm BEGM och 20 ul steril penicilin / streptomycin / Fungizone (P / S / F).
    OBS: INTE aspirera de ursprungliga 2 ml av media.
  2. Den 4: e dagen efter sådd, försiktigt aspirera all vätska, och ersätta med 4 ml färskt, värmas BEGM plus 1x Pen / Strep (Fungizone är inte längre nödvändigt). Ändra media varannan dag och bedöma celler för bifoganing, tillväxt, och sammanflödet. När cellerna når ~ 80% sammanflödet, vanligen i 2-3 veckor, de är redo att passe.
  3. En T25 kolv (ca 2,5 x 10 6 celler när sammanflytande) kan passera in i tre T25-kolvar eller en T75 kolv. Efter den första passagen, bör cellerna vara robust och frisk, når sammanflödet ungefär var tre dagar.

5. passaging Celler

  1. aspirera försiktigt media från plattan. Tillsätt 1 ml 0,05% trypsin lösning per T25 kolven till plattan och plats i inkubatorn i ca 4 min eller tills celler lossnar från plattan. Kontrollera nivån på avskiljandet av celler varje 2 min och inte lämnar Trypsin på längre än 10 minuter.
  2. Tillsätt 5 ml Trypsin Neutralizing Solution (TNS), eller seruminnehållande medium för att neutralisera enzymet. Ta bort all vätska och celler från kolven och lägg i en 15 ml koniska rör.
  3. Centrifugera vid 200 x g (acceleration 0 retardation 0) under 5 min för att erhålla en cellpellet. aspirera supernatiga och återsuspendera cellerna i BEGM + P / S i den volym som krävs för de nya kolvar (4 ml för en T25 kolv, 10 ml för en T75 kolv)
  4. Utför cellräkning med en levande / död fläck som beskrivits ovan (2,1). Tillsätt lämplig mängd BEGM och celler för att de belagda kolvar och återgå till inkubatorn. Behåll enligt ovan eller cryopreserve i frysmedium (70% BEGM, 20% FBS och 10% DMSO) vid en koncentration av 0,5-2 x 10 6 celler per ml.

6. Omprogrammering till iPSCs

OBS! Innan generera iPSCs, säkerställa efterlevnaden av alla institutionella regler generering och användning av mänskliga iPSCs. Steril teknik är särskilt viktigt för IPSC kulturer, enligt odlingsmedium ej rutinmässigt innehåller antibiotika. Det är kritiskt att NEC verkar friska och är robust proliferativ för framgångsrik omprogrammering.

  1. Plattan 5 x 10 5 NEC per brunn i en 6-brunnars vävnadsodlingsplatta. Efter 24 timmar, tillsätt polybrentill BEGM till en slutlig koncentration av 8 | ig / ml och transducera NEC genom tillsats lentivirala partiklar som uttrycker Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc till media. Syftar till att uppnå en mångfald av infektion (MOI) av ~ 5 27.
    1. Att fastställa MOI, förbereda serieutspädningar av kraftfoder lentivirala lager och omvandla HT1080 celler med dessa utspädningar. Efter första entydigt detektion av dTomato uttryck i HT1080 celler, beräkna antalet "transducerande enheter / ml" genom poängsättning antalet dTomato-positiva celler / små klumpar av celler i varje utspädning.
      OBS: Vanligtvis kommer det att finnas utspädningar som är för höga (allt är dTomato positiv) och för låg (ingen eller endast ett par positiva celler).
    2. Utför poäng från späd där diskreta positiva celler / små klumpar av celler identifieras. Bestämma titern genom korrigering av antalet transducerande enheter / ml med den lämpliga spädningsfaktorn. MOI är då förhållandet mellan antaletav transducerade celler för att antalet viruspartiklar 27.
      OBS! Varje dTomato positiv cell / litet klump antas härröra från en enda viruspartikel.
  2. Om tre timmar efter transduktion, ta bort media och ersätt med färsk BEGM. Kasta lentivirus innehållande media med institutionellt-godkända förfaranden. Återgå transducerade NEC till inkubatorn under 3 dagar.
  3. På dag 3, byt media med färsk BEGM, och sedan inkubera i ytterligare 3 dagar. Aspirera bringade media, tvätta cellerna med 1 x PBS och tillsätt 1 ml 0,05% trypsin-lösning till brunnen. Passage celler med trypsin som skrivet ovan (avsnitt 5). Försiktigt aspirera supernatanten och återsuspendera cellerna i 4 ml BEGM + P / S. Celler kan passera till en ny brunn i en 6-brunnsplatta belagd med BDC eller läggas till MEF kulturer, om redo (se nästa steg).
  4. Förbereda MEF belagda plattor. På dag 4 till 0,1% gelatinlösning (1 ml / brunn) till 2 brunnar i en 6 väl (att utföra +/- Thiazovivin (SPT) se steg 6,6). På nästadag, tina en flaska med inaktive MEF 28.
  5. Placera MEFs i 10 ml av MEF media (DMEM + 1x NEAA + 10% DFCS). Centrifugering vid 200 xg under 5 minuter för att pelletera. Återsuspendera i MEF medier. Aspirera gelatin från sex brunnar och tillsätt 1,87 x 10 5 MEF per brunn av gelatin-belagda sex brunnar. Inkubera O / N vid 37 ° C, eller i minst 24 timmar.
  6. Överför 2 ml BEGM innehållande omvandlade celler per brunn i 2 brunnar i en tidigare belagd sex brunnar och inkubera O / N. På nästa dag, byt BEGM med 2,5 ml per brunn av standard hESC media som innehåller 4 ng / ml basisk fibroblasttillväxtfaktor. Mata celler med färsk hESC media +/- SPT dagligen under 10 dagar
    OBS: Det är möjligt att lägga till en cocktail av små molekyler (SB431542, PD0325901 och Thiazovivin (SPT) cocktail) för att öka effektiviteten och kinetik omprogrammering för NEC 23.
  7. Efter tio dagar, fortsätter att mata dagligen med hESC media utan SPT. Mata kulturer dagligen tills hESC-liknande koloniervisas (figur 5A, P0 koloni). Identifiera kolonier som hyser förmodade iPSCs av deras höga kärna: cytoplasma förhållande och framträdande nukleolerna.
  8. Manuellt punktskatter och överföra kolonier med hESC-liknande morfologi att separera brunnar för kultur och expansion som separata rader i en matare fritt system. Utskurna kolonier bör snabbt anpassa sig till dessa förhållanden.
    1. Efter plätering skars kolonier dessa diskreta förmodade IPSC linjer betraktas nu passage 1 (P1). Foder kulturer dagligen med mTeSR1. Passage och expandera IPSC linjer med standardprocedurer. Det kan ta flera dagar till en vecka för p1 kolonier för att nå den storlek som de bör passe.

7. Upprätthållande iPSCs i kultur

  1. Foder och utvärdera kulturer dagligen. Manuellt punkt områden uppvisar öppen differentiering genom skrapning med en steril glaspipett eller mikro pipettspets. Ändra media efter daglig plockning.
  2. Passageceller efter approximabart var fjärde dag: Försiktigt Aspirera media, tillsätt 1 ml varm Dispase (1 mg / ml) per brunn i en 6-brunnsplatta (halv matningsvolym), sedan inkubera vid 37 ° C under ca 4 min. Kanterna på kolonierna börjar att lyfta, som ser ut som en vit kontur runt kolonin. Försiktigt aspirera Dispase och tvätta 3x med värmde DMEM / F12.
  3. Tillsätt 2 ml mTeSR1 och använda en cell lyftaren för att lyfta av kolonierna från plattan. Använd en 5 ml serologisk pipett eller P1000 mikropipett att försiktigt mal sönder cellerna tills kolonierna är uppdelade i mindre grupper.
    1. Undvik att producera mycket små kluster eller enskilda celler, som överlevnad och efterföljande spridning kommer att vara suboptimal. När åter plätering kolonier, en 1: 4 till 1: kommer sex split bibehålla optimal koloni densitet. Försiktigt bort kolonier och media från plattan och tillsätt till nya, Matrigel brunnarna.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den inledande delen av näsan, som kallas den nasala vestibulen, är det område som omges av brosk 29. Borsten måste gå smidigt förbi detta område i näsan, utöver den nasala ventilen (ostium internum, eller "svarta hål" ses på baksidan av Nare), och provet erhålls från sämre turbinata (Figur 1). De nasala näsmusslan är beniga strukturer som ökar ytan av nosen 29, vilket gör dem till en idealisk plats för provtagning. Området är också kantad av vaskulariserad slemhinnevävnaden, som liknar foder i de nedre luftvägarna och är också aktiv i immunsvaret mot miljöexponeringar.

Sampling av den korrekta vävnaden säkerställer att de celler som omprogrammeras är epitelceller. Detta kan utvärderas av den initiala cellräkning och cytospin, men också genom att observera de celler i odling. DeCytospin, snurrade en gång ner, torkas och färgas, visar sammansättningen av provet. De flesta prover består av epitelceller, vilka är kolonnformad och cilierade, med en rund kärna. Med Hema 3 färgningssats, de stain en ljusblå färg med en mörkare lila kärnan (figur 2), och ofta när det tas direkt från näsan de ses hopklumpade tillsammans. Även nasala cellprover är initialt en blandning av celltyper samt skräp från näsan, med tiden i kultur och medie förändringar epitelceller blir dominerande (Figur 3A, B). När epitelcellerna växer till sammanflödet, de formad som en nyligen knäckt ägg, där kärnan är stor och ligger i centrum och cytoplasman är slags "nå ut" och sträcker sig så cellen förbereder sig för att dela (Figur 3B). När cellerna växer samman, börjar de att ta på sig mer av en fotboll form, och passar ihop tätt i skålen (Figur3C).

När cellerna transduceras, kommer de att uttrycka den tdTomato fluorescerande markör i kärnan. Figur 4 visar att cellerna när de väl har transduced, i ljusa fält, fluorescens och med båda bilderna samman. Inte varje cell uttrycker markören, och därför inte varje cell transducerades, men varje brunn bör ha cirka 90 procent transduktionseffektiviteten, och detta kommer att öka sannolikheten för att vissa celler kommer att uppnå pluripotens efter pläterade på MEF.

Gång samodlade med MEF och som cellerna börjar bilda kolonier, kommer de att gradvis sluta uttrycka tdTomato. Detta är dock inte den bästa indikationen på kolonibildning. Den bästa indikationen på kolonibildning är visuell bekräftelse. hESC kolonier, som är den "gyllene standarden" av pluripotens, är mestadels runda och består av många små, runda celler med large kärnor och en hög kärna till cytoplasma förhållande. Varje cell verkar mestadels består av kärnorna, och andra organeller inte tydligt. Följande iPSC koloni skörd, och kultur i standard feeder-fria förhållanden, bör nybildade IPSC kolonier ser likt sina hESC motsvarigheter, och de individuella cellerna är nästan identiska med den hESC fenotypen, såsom framgår av fig 5B.

Innan utnyttjar iPSCs genereras från nasala epitelceller (NEC-iPSCs) i experiment, är det tillrådligt att bedöma kvaliteten på nya linjer. Detta inbegriper typiskt bedömning av karyotyp, uttrycket av pluripotens markörer, och förmågan hos iPSCs att differentieras till var och en av de 3 embryonala groddblad (endoderm, mesoderm och ektoderm). Differentiering kapacitet kan testas på många sätt, men för närvarande är det strängaste analysen teratom analysen 2,23,30. Mer omfattande analyser, såsom transkriptions och epigenomiska profilering är användbara för att avgöra om några kromosomavvikelser införs genom omprogrammering 23.

Figur 1
Figur 1. Sämre turbinate. Provtagning rörelse och samplingsmålet, sämre turbinate, indikeras med svart pil. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2. Cytospin. De flesta av provet består av epitelceller, vilka är långa och columnar, med cilier i ena änden och ett runt kärnan i den andra. De är ofta hopklumpade tillsammans när samplas direkt från The Nare. Pilar anger individuella epitelceller."Https://www.jove.com/files/ftp_upload/53814/53814fig2large.jpg" target = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. Primära nasala epitelceller i odling. (A) Flytande celler och rester precis efter prov insamlas och pläterade. (B) Celler en dag efter att ha passerats. Cellmorfologi är konsekvent och kulturen består främst av nasala epitelceller, 10x förstoring, och (C) 5X förstoring. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 4
Figur 4. Transduktion av NEC. Celler som omvandlas har tagit upp vektorn och visa röd fluorescens markör tdTomato. Denna markör bör blekna som de framsteg mot ett pluripotent tillstånd. (A) Bright fält bild av omvandlade celler. (B) Fluorescerande bild av transducerade celler. (C) överlagring av ljusa fält och fluorescerande bilder (paneler A och B). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 5
Figur 5. iPSC stamcellsliknande kolonier. (A) Odling på MEF är koloni mestadels runt på kanterna och visar liten eller ingen skillnad. (B) Individuella celler visar typiska hESC-liknande morfologi, med små runda celler med stora kärnor.5large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Nasala epitelceller (Pass) är en lättillgänglig plattform för att studera luftvägssjukdom, och NEC-iPSCs erbjuder en spännande möjlighet att pröva sjukdomsutveckling, behandling och terapi 1,31,32. NEC kan lätt erhållas utan stressande eller potentiellt skadliga förfaranden 6,23. I vår erfarenhet, verkar provtagning av nässlemhinnan som beskrivs i detta protokoll att vara mindre stressande och bättre upplevd än blodinsamling för barn. Därför kan denna metod vara särskilt användbar i pediatriska patientpopulationer och relevant för att studera luftvägssjukdomar. Den andra fördelen med NEC är att när de är i kultur, epitelceller ut för med media och odlingsbetingelser och blir homogen. Detta är fördelaktigt än att använda en komplex vävnad såsom blodkroppar och gör det lättare att utvärdera effekten av cell ursprung i följd IPSC linjer med transcriptomic och epigenetiska metoder.

Närsampling av den nasala slemhinnan, är det viktigt att korrekt område av näsan samplas så att mestadels epitelceller hämtas, vilket framgår genom att betrakta cytospin under ett mikroskop (Figur 2). Korrekt provtagning kommer att ge ≥90% epitelceller. Det är kritiskt för att erhålla prover från friska patienter och för att säkerställa att provet uppsamlas på lämpligt sätt för att maximera antalet celler som erhålls och ströks. Den vridrörelse beskrivs i protokollet (avsnitt 1,5) ser till att borsten kommer i kontakt med så mycket av den nasala ytan som möjligt. Det är en naturlig reflex att slå huvudet när ett främmande föremål är på väg mot ett ansikte. Därför, i händelse av att ett barn vänder hans eller hennes huvud eller drar sig undan, är det viktigt att provtagning sker snabbt och exakt. Med hjälp av dessa tekniker kommer att öka effektiviteten i varannan steg i protokollet, och bestämma sannolikheten för en framgångsrik omprogrammering. Frågar barnetatt ligga ner, och även för att placera sina händer under dem eller har en förälder eller syskon hålla sina händer är ett bra sätt att uppmuntra dem att ligga stilla och bidra till att garantera en smidig och smärtfri provtagning.

Nyligen har några andra tekniker för provtagning utvärderats för komfort, lätthet, och provresultaten, baserat på cellinnehåll och sammansättning samt RNA och DNA ger 33. Gruppen över provtagning med en cytologiborste mot en polyesterpinne, och de samplade både sämre turbinata liksom de främre näsborrarna med kraftigt virvlande borsten eller pinnen runt näsborrarna. Sampling av underlägsen turbinata med en borste befanns vara något obekväma, även om det gjorde att ge bäst RNA utbytena och bestod av de mest cilierade epitelceller, i jämförelse med en polyesterbomullstopp. Det föreslås i detta protokoll metod därför verifieras som den mest tillförlitliga metoden för provtagning nasala epitel som ett sätt att studera andningsvägarnaepitel.

När provet har erhållits, måste den hållas vid 37 ° C. En av de mest effektiva sätten är att värma en bägare med vatten till högre än 37 ° C och krypa in den i en Styrofoam behållare för säker transport medan förbereder sig för att möta deltagaren. Strax innan provet uppsamlas, tillsätt kallt vatten så att temperaturen bringas till ca 37 ° C, och tillsätt det koniska röret med media. När borsten läggs till den koniska röret, tillbaka röret omedelbart till vattenbadet och hålla den där tills den kan återföras till labbet, vid vilken punkt röret bör sättas i en reglerad 37 ° C vattenbad tills cellerna är ympades på en odlingskolv. Vid alla punkter, bör steril teknik användas för att undvika att införa främmande agenter i kulturen.

En avsevärd mängd av variabilitet bland proverna sågs när cellerna sattes i kultur. Denna variation verkade bero på både donatorkälla samtprovet kvalitet själv. Ett sätt att öka prov kvalitet är att få en pensel från varje näsborre eller två borstar per deltagare. Efter sådd nytt prov, och som cellerna passe, skick celler bör kontrolleras regelbundet för att vara säker på att de är lämpliga att omprogrammeras. Celler som gör de bästa kandidaterna för är de som tar till kultur och föröka snabbt. Det är inte känt varför celler från vissa givare är mer robust än de från andra celler, men det kan bero på faktorer såsom ålder, storleken på näsan, och hälsa givaren vid tidpunkten för provtagningen. När ett prov ger mycket få celler, eller endast ett litet antal celler bifoga en gång pläterade, är osannolikt att växa till sammanflödet provet. Om en kämpande kultur når sammanflödet cellerna tenderar att vara svag och många celler dör under passage. Denna typ av prov är en mycket dålig kandidat för omprogrammering, eftersom det är viktigt att cellerna vara prolifererande snabbt och kraftfullt, och att de äromvandlas så snart som möjligt passagenummer. Det är inte tillrådligt att transfektera celler som växer långsamt, om detta beror på givar variabilitet dålig provtagning eller passage kulturer för tunt. Om omprogrammering försöker med en dålig cellkultur, är det osannolikt att fortsätta att bära frukt.

Förbereder cellerna för transduktion är en del av det protokoll som är svårast att förbereda sig för. Baserat på tillväxten av cellerna, 2 x 10 5 till 5 x 10 5 celler föreslås för transduktion och detta kan beroende av specifika patientprover. Därför kan det kräva ett par brunnar pläterade med varierande antal cell att få den perfekta nummer.

Detta protokoll beskriver inte bara hur lätt provtagning, men också relativt lätt och tidslinjer för att etablera primära cellkulturer och efterföljande omprogrammering av dessa primära cellkulturer till IPSC linjer för mer hållbara och mångsidiga forskningsmöjligheter. Helaprocessen från klinik till etablering av diskreta iPSCs i kultur tar ca tre månader, och nya metoder för att förkorta omprogrammering gånger utvecklas 6,34,35. Detta fält utvecklas snabbt att hitta mer effektiva och fullständiga metoder för att omvandla primära celler till iPSCs, och därefter differentiera iPSCs till specifika cell- och vävnadstyper av intresse. Men differentiering protokoll för vävnader som är viktiga för luftvägssjukdomar, såsom lung epitel, är fortfarande utarbetas 36-38.

Generera iPSCs från NEC har fördelen av enkel och relativt smärtfritt isolering av celler. Dessutom är det möjligt att NEC-iPSCs erbjuder fördelar över iPSCs som härrör från andra vävnadstyper som kan utnyttjas. Effekterna av IPSC epigenetik på efterföljande iPSC differentiering är inte fullständigt förstådd, även om bevis indikerar att mus och mänskliga iPSCs härbärgerar transkriptions- och epigenetisk minne av deras somatiska celler avursprung och att detta gynnar selektivt deras differentiering till härstamningar i samband med donatorcelltypen samtidigt begränsa andra öden 5,26. På grund av vikten av vävnaden av ursprung och hur detta påverkar de funktionella egenskaperna hos iPSCs, särskilt med avseende på bibehållandet av vävnadsspecifika epigenetiska märken 39-45, IPSC linjer måste tydligare studeras för att bättre förstå effekterna av ursprungsvävnad. Det har tidigare visats att NEC-härledda iPSCs hyser en genomisk metylering signatur indikerar retention av en epigenetisk minne av deras ursprungsvävnad 23. Sådan epigenetisk minne kvar i NEC-iPSCs kan vara till nytta i differentieringen av pluripotenta stamceller till luftvägsceller, som tidigare studier har visat att blodkroppar härledda iPSCs uppvisar epigenetiska minne av blodkropparna ursprungs lättare differentieras till blodkroppar än fibroblaster eller glatta muskelceller härrörande iPSCs saknar blood cellspecifik epigenetisk minne 5,26. Med tanke på den enorma potential iPSC-härledda luftvägsceller för modellering lungsjukdomar, är det viktigt att studera om NEC representerar en optimal celltyp för differentiering av iPSCs i luftvägarna celler / vävnad. Dessutom kan detta bibehålls stabilt minne representera kromosomala platser som är resistenta mot omprogrammering och kandidater för sjukdomstillstånd av donatorceller. Som protokoll för att konvertera iPSCs proximala och distala typer lungcell utvecklas 36-38, kan dessa NEC-iPSCs har en fördel i modellering luftvägssjukdomar såsom astma, KOL, cystisk fibros, och många andra och i att studera miljöeffekter på lungutveckling och homeostas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Författarna vill tacka för den pluripotenta stamceller Facility och Confocal Imaging Core på Cincinnati Barnsjukhus. Detta arbete stöddes av R21AI119236 (HJ), R21AI101375 (HJ), NIH / NCATS 8UL1TR000077-04 (HJ), U19 AI070412 (HJ) och 2U19AI70235 (GKKH).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 ml conical Fisher Scientific 14-959-49D Protocol Step 1.1.
BEGM Lonza CC-3170 Protocol Step 1.1.
Penn/Strep/Fungicide Life Technologies 15240-062 Protocol Step 1.1.
Penn/Strep Life Technologies 15140-122 Protocol Step 4.a.
cytosoft cytology brush Fisher Scientific 22-263-357 Protocol Step 1.2.
trypan blue Fisher Scientific MT-25-900-CI Protocol Step 2.1.
hemacytometer Fisher Scientific 02-671-54 Protocol Step 2.1.
PBS Fisher Scientific BP2438-4 Protocol Step 2.2.
Cytology Funnel Clips Fisher Scientific 10-357 Protocol Step 2.2.
cytospin funnel Fisher Scientific 23-640-320 Protocol Step 2.2.
Cytospin 4 Fisher Scientific A78300003 Protocol Step 2.2.
blank slide Fisher Scientific S95933 Protocol Step 2.2.
hema 3 stain kit Fisher Scientific 22-122-911 Protocol Step 2.2.
Bovine Dermal Colagen, type 1 Life Technologies A1064401 Protocol Step 3.2.
T25 flask Fisher Scientific 08-772-45 Protocol Step 3.3.
Trypsin Lonza CC-5012 Protocol Step 5.2.
Trypsin Neutralizing Solution Lonza CC-5002 Protocol Step 5.2.
Fetal Bovine Serum (FBS), heat sterilized at 65 °C for 30 min Sigma-Aldrich F2442 Protocol Step 5.5.
Dimethyl sulfoxide Hybri-Max™, sterile-filtered, BioReagent, suitable for hybridoma, ≥99.7% Sigma-Aldrich D2650 Protocol Step 5.5.
polycistonic lentivirus* e.g. Millipore SCR511 Protocol Step 6.4. 
A commercial source of reprogramming vector is listed. We routinely use the 4-in-1 plasmid reported by Voelkel et al (PMID: 20385817) to generate VSV-G-pseudotyped polycistronic reprogramming lentivirus in-house. This plasmid can be obtained by contacting 
polybrene Santa Cruz Biotechnology sc-134220 Protocol Step 6.4.
Irradiated CF1 MEFs GlobalStem  GSC-6301G Protocol Step 6.4.
hESC media See recipe included in protocol Protocol Step 6.11.
SB431542 Stemgent 04-0010 Protocol Step 6.11.
PD0325901 Stemgent 04-0006 Protocol Step 6.11.
Thiazovivin  Stemgent 04-0017 Protocol Step 6.11.
hESC-qualified Matrigel BD Biosciences 354277 Protocol Step 6.13.
Corning plate, 6 well Fisher Scientific 08-772-1B Protocol Step 6.13.
mTeSR1 StemCell 5850 Protocol Step 6.13.
250 ml disposable filter flask (0.22 µm) Fisher SCGP-U02-RE 
dispase StemCell 7923 Protocol Step 7.3.
DMEM/F12 Life Technologies 11320-033 Protocol Step 7.3.
cell lifter Fisher Scientific 08-100-240 Protocol Step 7.4.
hESC Media** Protocol Step 6.11.
components should be mixed and then filter sterilized. Media can be kept at 4 °C for up to two weeks. When warming media, do not leave at 37 °C longer than 15 min
DMEM-F12 50/50 media Invitrogen  11330-032 Final Concentration
KO replacement serum (KO-SR) Invitrogen 10828-028 0.2
200 mM L-glutamine Invitrogen 25030-081 1 mM
55 mM ß-mercaptoethanol Invitrogen 21985-023 0.1 mM
100x non-essential amino acids Invitrogen 11140-050 1x
2 µg/ml Basic-Fibroblast Growth Factor (b-FGF) Invitrogen 13256-029 4 ng/ml

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell stem cell. 10, (6), 678-684 (2012).
  2. Boulting, G. L., et al. A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells. Nature biotechnology. 29, (3), 279-286 (2011).
  3. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, (5391), 1145-1147 (1998).
  4. Guenther, M. G., et al. Chromatin structure and gene expression programs of human embryonic and induced pluripotent stem cells. Cell stem cell. 7, (2), 249-257 (2010).
  5. Polo, J. M., et al. Cell type of origin influences the molecular and functional properties of mouse induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 28, (8), 848-855 (2010).
  6. Ono, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human nasal epithelial cells using a Sendai virus vector. PloS one. 7, (8), e42855 (2012).
  7. Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27, (11), 2667-2674 (2009).
  8. Brennand, K. J., et al. Modelling schizophrenia using human induced pluripotent stem cells. Nature. 473, (7346), 221-225 (2011).
  9. Mou, H., et al. Generation of multipotent lung and airway progenitors from mouse ESCs and patient-specific cystic fibrosis iPSCs. Cell stem cell. 10, (4), 385-397 (2012).
  10. Stadtfeld, M., Nagaya, M., Utikal, J., Weir, G., Hochedlinger, K. Induced pluripotent stem cells generated without viral integration. Science. 322, (5903), 945-949 (2008).
  11. Huangfu, D., et al. Induction of pluripotent stem cells by defined factors is greatly improved by small-molecule compounds. Nat Biotechnol. 26, (7), 795-797 (2008).
  12. Kuperman, D. A., et al. Direct effects of interleukin-13 on epithelial cells cause airway hyperreactivity and mucus overproduction in asthma. Nat Med. 8, (8), 885-889 (2002).
  13. Braunstahl, G. J., et al. Segmental bronchoprovocation in allergic rhinitis patients affects mast cell and basophil numbers in nasal and bronchial mucosa. American journal of respiratory and critical care medicine. 164, (5), 858-865 (2001).
  14. Compalati, E., et al. The link between allergic rhinitis and asthma: the united airways disease. Expert review of clinical immunology. 6, (3), 413-423 (2010).
  15. Crimi, E., et al. Inflammatory and mechanical factors of allergen-induced bronchoconstriction in mild asthma and rhinitis. Journal of applied physiology. 91, (3), 1029-1034 (2001).
  16. Djukanovic, R., et al. Bronchial mucosal manifestations of atopy: a comparison of markers of inflammation between atopic asthmatics, atopic nonasthmatics and healthy controls. The European respiratory journal : official journal of the European Society for Clinical Respiratory Physiology. 5, (5), 538-544 (1992).
  17. Gaga, M., et al. Eosinophils are a feature of upper and lower airway pathology in non-atopic asthma, irrespective of the presence of rhinitis. Clinical and experimental allergy : journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology. 30, (5), 663-669 (2000).
  18. Hurst, J. R., Wilkinson, T. M., Perera, W. R., Donaldson, G. C., Wedzicha, J. A. Relationships among bacteria, upper airway, lower airway, and systemic inflammation in COPD. Chest. 127, (4), 1219-1226 (2005).
  19. Gaga, M., V, A. M., Chanez, P. Upper and lower airways: similarities and differences. European respiratory monograph. 18, 1-15 (2001).
  20. Lopez-Guisa, J. M., et al. Airway epithelial cells from asthmatic children differentially express proremodeling factors. J Allergy Clin Immunol. 129, (4), 990-997 (2012).
  21. Doi, A., et al. Differential methylation of tissue- and cancer-specific CpG island shores distinguishes human induced pluripotent stem cells, embryonic stem cells and fibroblasts. Nature genetics. 41, (12), 1350-1353 (2009).
  22. Poole, A., et al. Dissecting childhood asthma with nasal transcriptomics distinguishes subphenotypes of disease. J Allergy Clin Immunol. (2014).
  23. Ji, H., et al. Dynamic transcriptional and epigenomic reprogramming from pediatric nasal epithelial cells to induced pluripotent stem cells. J Allergy Clin Immunol. 135, (1), 236-244 (2015).
  24. Guajardo, J. R., et al. Altered gene expression profiles in nasal respiratory epithelium reflect stable versus acute childhood asthma. The Journal of allergy and clinical immunology. 115, (2), 243-251 (2005).
  25. Yamanaka, S. Patient-specific pluripotent stem cells become even more accessible. Cell Stem Cell. 7, (1), 1-2 (2010).
  26. Kim, K., et al. Donor cell type can influence the epigenome and differentiation potential of human induced pluripotent stem cells. Nature. 29, (12), 1117-1119 (2011).
  27. Warlich, E., et al. Lentiviral vector design and imaging approaches to visualize the early stages of cellular reprogramming. Mol Ther. 19, (4), 782-789 (2011).
  28. Wicell. Wicell Feeder Based (MEF) Pluripotent Stem Cell Protocols. (2003).
  29. Harkema, J. R., Carey, S. A., Wagner, J. G. The nose revisited: a brief review of the comparative structure, function, and toxicologic pathology of the nasal epithelium. Toxicol Pathol. 34, (3), 252-269 (2006).
  30. Allegrucci, C., Young, L. E. Differences between human embryonic stem cell lines. Hum Reprod Update. 13, (2), 103-120 (2007).
  31. Yoshida, Y., Yamanaka, S. Recent stem cell advances: induced pluripotent stem cells for disease modeling and stem cell-based regeneration. Circulation. 122, (1), 80-87 (2010).
  32. Pasca, S. P., et al. Using iPSC-derived neurons to uncover cellular phenotypes associated with Timothy syndrome. Nature medicine. 17, (12), 1657-1662 (2011).
  33. Lai, P. S., et al. Alternate methods of nasal epithelial cell sampling for airway genomic studies. J Allergy Clin Immunol. (2015).
  34. Shi, Y., et al. A combined chemical and genetic approach for the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 2, (6), 525-528 (2008).
  35. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature. 8, (5), 409-412 (2011).
  36. Dye, B. R., et al. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids. Elife. 4, (2015).
  37. Huang, S. X., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 32, (1), 84-91 (2014).
  38. Wong, A. P., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into mature airway epithelia expressing functional CFTR protein. Nature biotechnology. 30, (9), 876-882 (2012).
  39. Marchetto, M. C., et al. Transcriptional signature and memory retention of human-induced pluripotent stem cells. PloS one. 4, (9), e7076 (2009).
  40. Nukaya, D., Minami, K., Hoshikawa, R., Yokoi, N., Seino, S. Preferential gene expression and epigenetic memory of induced pluripotent stem cells derived from mouse pancreas. Genes Cells. 20, (5), 367-381 (2015).
  41. Vaskova, E. A., Stekleneva, A. E., Medvedev, S. P., Zakian, S. M. 'Epigenetic memory' phenomenon in induced pluripotent stem cells. Acta Naturae. 5, (4), 15-21 (2013).
  42. Bar-Nur, O., Russ, H. A., Efrat, S., Benvenisty, N. Epigenetic memory and preferential lineage-specific differentiation in induced pluripotent stem cells derived from human pancreatic islet beta cells. Cell Stem Cell. 9, (1), 17-23 (2011).
  43. Jandial, R., Levy, M. L. Cellular alchemy: induced pluripotent stem cells retain epigenetic memory. World Neurosurg. 75, (1), 5-6 (2011).
  44. Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467, (7313), 285-290 (2010).
  45. Ohi, Y., et al. Incomplete DNA methylation underlies a transcriptional memory of somatic cells in human iPS cells. Nat Cell Biol. 13, (5), 541-549 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics