भविष्यवाणी और जीन विनियामक तत्वों के मान्यकरण retinoic एसिड प्रेरित भ्रूण के दौरान सक्रिय स्टेम सेल भेदभाव

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Developmental Biology

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Simandi, Z., Horvath, A., Nagy, P., Nagy, L. Prediction and Validation of Gene Regulatory Elements Activated During Retinoic Acid Induced Embryonic Stem Cell Differentiation. J. Vis. Exp. (112), e53978, doi:10.3791/53978 (2016).

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Abstract

भ्रूण के विकास के लिए एक multistep सक्रियण और कई जीनों का दमन शामिल करने की प्रक्रिया है। जीनोम में बढ़ाने तत्वों सेलुलर भेदभाव के दौरान ऊतक और सेल प्रकार जीन अभिव्यक्ति की विशिष्ट नियमन में योगदान करने के लिए जाना जाता है। इस प्रकार, उनकी पहचान और आगे की जांच के क्रम में समझने के लिए कैसे सेल भाग्य चुना गया है में महत्वपूर्ण है। जीन अभिव्यक्ति डेटा (जैसे, माइक्रोएरे या आरएनए-सेक) और chromatin immunoprecipitation (चिप) आधारित जीनोम चौड़ा स्टडीज (चिप seq) के परिणामों की एकता इन विनियामक क्षेत्रों का बड़े पैमाने पर पहचान की अनुमति देता। हालांकि, सेल प्रकार विशिष्ट enhancers के कार्यात्मक सत्यापन विट्रो और इन विवो प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं में आगे की आवश्यकता है। यहाँ हम वर्णन कैसे सक्रिय enhancers पहचान और प्रयोगात्मक मान्य किया जा सकता। चिप seq डेटा विश्लेषण, 2) क्लोनिंग और अनुभव से 1) विनियामक क्षेत्रों की पहचान: इस प्रोटोकॉल एक कदम-दर-कदम कार्यप्रवाह भी शामिल है कि प्रदान करता हैएक संवाददाता परख में पहचान जीनोमिक दृश्यों के ख्यात नियामक क्षमता का imental सत्यापन, और 3) बढ़ाने शाही सेना प्रतिलेख के स्तर को मापने के द्वारा विवो में बढ़ाने गतिविधि का निर्धारण। प्रस्तुत प्रोटोकॉल प्रयोगशाला में इस कार्यप्रवाह स्थापित करने के लिए किसी की मदद करने के लिए पर्याप्त विस्तृत है। महत्वपूर्ण बात है, प्रोटोकॉल को आसानी से करने के लिए अनुकूल है और किसी भी सेलुलर मॉडल प्रणाली में इस्तेमाल किया जा सकता है।

Protocol

1. बढ़ाने चयन चिप-सेक विश्लेषण के आधार पर

  1. http://ngsdebftp.med.unideb.hu/bioinformatics/ से RXR चिप seq कच्चे डेटा fastq फ़ाइल (mm_ES_RXR_24h_ATRA.fastq.gz) डाउनलोड
  2. डाउनलोड करें और (संरेखण के लिए आवश्यक बीडब्ल्यूए सूचकांक फाइल निकालने हमारे मामले में: Mus_musculus_UCSC_mm10).(ftp://igenome:G3nom3s4u@ussd-ftp.illumina.com/Mus_musculus/UCSC/mm10/Mus_musculus_UCSC_mm10.tar.gz
    नोट: जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण के कदम के बारे में अधिक जानकारी के लिए https://github.com/ahorvath/Bioinformatics_scripts करने के लिए जाएँ और नीचे प्रयुक्त स्क्रिप्ट डाउनलोड करने के लिए।
  3. MM10 जीनोम के लिए उदाहरण fastq फ़ाइल संरेखित (लिपि का उपयोग करें: perform_alignment.sh)। यह एक .bam फ़ाइल और संरेखण के आंकड़े के साथ एक फ़ोल्डर पैदा करेगा। गठबंधन RXR चिप seq डेटा (mm_ES_RXR_24h_ATRA.bam), और इसी सूचकांक फ़ाइल (.bai) यहाँ उपलब्ध हैं:
    http://ngsdebftp.med.unideb.hu/bioinformatics/
    नोट: बीडब्ल्यूए एक सॉफ्टवेयर पैकेज है कि असली संरेखित करता हैइस तरह के माउस संदर्भ जीनोम अनुक्रम के रूप में एक डेटाबेस के लिए अपेक्षाकृत कम दृश्यों (जैसे, चिप seq परिणाम), (जैसे, MM10) 13।
  4. शिखर बुला और नए सिरे से आकृति के विश्लेषण के लिए स्क्रिप्ट (callpeaks.sh) चलाते हैं। इनपुट के रूप में .bam फ़ाइल का उपयोग करें। स्क्रिप्ट होमर findPeaks 14 पर आधारित है।
    ध्यान दें: आउटपुट फाइल हमें रूपांकनों की चोटियों की कुल संख्या, संवर्धन, पृष्ठभूमि का प्रतिशत, और रूपांकनों के साथ लक्ष्य दृश्यों, आदि के बारे में जानकारी दे। (चित्रा 1)। आम तौर पर कई रूपांकनों उनके महत्व के क्रम में सूचीबद्ध हैं।
  5. # 1 रैंक के मूल भाव (एनआर आधा `AGGTCA`) remap (लिपि का उपयोग करें: remap_motif.sh)
    नोट: नतीजतन, स्क्रिप्ट एक .bed फ़ाइल दिखा देंगे कि जो चिप चोटियों जीनोमिक क्षेत्रों है कि ब्याज की प्रतिलेखन कारक के विहित बाध्यकारी साइट में होते हैं कवर कर रहे हैं उत्पन्न करता है।
  6. डाउनलोड करें और गठबंधन RXR चिप seq पढ़ता के परिणामों की कल्पना (mm_ES_RXR_24h_ATRA.bam (भी .bai डाउनलोड)) और AGGTCA मूल भाव घटनाओं (mm_ES_RXR_24h_ATRA_homerpeaks_motif1_mm10s_200_remaped_mbed.bed) एकीकृत जीनोमिक्स व्यूअर (IGV) 15 से ख्यात RAR की पहचान करने के लिए / RXR बाध्यकारी साइटों (चित्रा 2 और चित्रा 3)।
    नोट: विभिन्न चिप seq डेटा के एकीकरण और अधिक ठीक अच्छे उम्मीदवार enhancers 16,17 की भविष्यवाणी करने में मदद मिलेगी। हाल के अध्ययनों से पता चला है कि सक्रिय enhancers आम तौर पर P300 के लिए समृद्ध कर रहे हैं और H3K4me1 और H3K27ac के साथ संबंध स्थापित, और खुले क्रोमेटिन क्षेत्रों में स्थित हैं, जिससे DNase-मैं अतिसंवेदनशीलता प्रदर्शित भी 18-21 की सिफारिश की है।
  7. चुने गए जीनोमिक क्षेत्र के 400 बीपी अनुक्रम और बाद प्राइमर डिजाइन के लिए इन दृश्यों का उपयोग - "ब्याज की एक क्षेत्र को परिभाषित करें" IGV 15 में 200 प्राप्त करने के लिए प्रयोग करें।

2. रिपोर्टर परख

नोट: luciferin / luciferase प्रणाली का इस्तेमाल किया जाता हैट्रांसक्रिप्शनल विनियमन के लिए एक बहुत ही संवेदनशील संवाददाता परख के रूप में। बढ़ाने गतिविधि luciferase एंजाइम पर निर्भर करता है कि luciferin के ऑक्सीकरण को उत्प्रेरित bioluminescense में जिसके परिणामस्वरूप oxyluciferin करने के लिए है, जो पता लगाया जा सकता है का उत्पादन किया है। पहले कदम के रूप में, पहचान ख्यात बढ़ाने दृश्यों एक पत्रकार वेक्टर (जैसे, टी-luciferase 22, pGL3 या NanoLuc) में subcloned किया जाना चाहिए।

  1. प्रथम डिजाइन
    1. 200 के प्रवर्धन के लिए डिजाइन पीसीआर प्राइमरों - Primer3 से ख्यात बढ़ाने क्षेत्रों के 400 बीपी (यहाँ उपलब्ध: http://bioinfo.ut.ee/primer3/) 23
    2. कॉपी-पेस्ट कि Primer3 में ख्यात बाध्यकारी साइट शामिल IGV से जीनोमिक अनुक्रम (1.7 कदम देखें)। सेट उत्पाद आकार सीमा से 250 - Primer3 में 300 बीपी।
    3. मान्य UCSC जीनोम ब्राउज़र का उपयोग पीसीआर प्राइमरों सिलिको पीसीआर उपकरण में है (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr) 24
      नोट: बाद में एक चरण में इस प्रोटोकॉल का उपयोग करता है hindiiमैं और BamHI प्रतिबंध क्लोनिंग के लिए एंजाइमों। जाँच करें कि क्या पीसीआर प्रवर्धित दृश्य के रूप में UCSC में सिलिको पीसीआर उपकरण के द्वारा भविष्यवाणी की AAGCTT या GGATCC प्रतिबंध साइटों में शामिल होंगे (जैसे, http://nc2.neb.com/NEBcutter2/)।
    4. एक वाणिज्यिक विक्रेता से आवश्यक प्राइमरों प्राप्त करते हैं।
  2. जीनोमिक डीएनए से बढ़ाने अनुक्रम की पीसीआर प्रवर्धन
    1. प्राथमिक कोशिकाओं (जैसे, प्राथमिक भ्रूण fibroblasts) से टेम्पलेट जीनोमिक डीएनए शुद्ध। gDNA अलगाव के लिए वाणिज्यिक किट का प्रयोग करें और निर्माता के निर्देशों का पालन करें।
      नोट: gDNA की उच्च गुणवत्ता सफल पीसीआर प्रवर्धन के लिए आवश्यक है। उचित बीएसी क्लोन यदि पीसीआर gDNA से आसान नहीं है इस्तेमाल किया जा सकता है।
    2. 50 μl पीसीआर प्रतिक्रिया 100 एनजी gDNA, 5 μl 10x बफर, 3 μl MgSO 4 (25 मिमी), 5 μl dNTP (2 मिमी प्रत्येक), 1.5 μl अग्रेषित प्राइमर (10 माइक्रोन) के 1.5 μl रेव प्राइमर युक्त तैयार (10 माइक्रोन) के 1 μl डीएनए पोलीमरेज़
    3. पीसीआर चक्र सेट (2 मिनट 95 डिग्री सेल्सियस (20 सेकंड 95 डिग्री सेल्सियस, 10 सेकंड 58 - 65 डिग्री सेल्सियस, 18 सेकंड 70 डिग्री सेल्सियस) X25 दोहराने, 2 मिनट 70 डिग्री सेल्सियस, हमेशा के लिए 4 डिग्री सेल्सियस)। प्राइमर के विचार के साथ annealing तापमान सेट टीएम मूल्यों की भविष्यवाणी की।
    4. एक वाणिज्यिक पीसीआर शुद्धि किट के साथ पीसीआर उत्पाद शुद्ध और निर्माता के निर्देशों का पालन करें।
    5. ऊपर के रूप में इस्तेमाल किया प्राइमरों के साथ पीसीआर दोहरा, लेकिन उनके 5 पर overhangs जोड़कर क्लोनिंग के लिए प्रतिबंध साइटों का परिचय 'समाप्त होता है (उदाहरण के लिए, अग्रेषित: 5'-Atat AAGCTT xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx -3' (HindIII), रेव: 5'-टाटा GGATCC xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx -3 '(BamHI))।
    6. unspecific पीसीआर उत्पादों के लिए जाँच करने के लिए agarose जेल पर पीसीआर उत्पाद के 5 μl चलाएँ।
      ध्यान दें: अधिक बैंड का पता चला रहे हैं, तो पूरे पीसीआर उत्पाद चलाने के लिए और एक व्यावसायिक जेल निकालना किट द्वारा उचित बैंड शुद्ध।
    7. सीमा
      नोट: टी के प्रमोटर 22 शुद्ध पीसीआर उत्पाद और वेक्टर (जैसे, टी-ल्यूक) के ऊपर डालने के क्लोन करने के लिए HindIII और BamHI के साथ पचा जाना चाहिए।
      1. एक 50 μl प्रतिक्रिया युक्त 1 माइक्रोग्राम शुद्ध पीसीआर उत्पाद, 1 μl HindIII (20 यू / μl), 1 μl BamHI (20 यू / μl) और 5 μl 10x बफर मिश्रण तैयार करें।
      2. एक 250 μl प्रतिक्रिया मिश्रण युक्त 5μg वेक्टर (टी ल्यूक, या वैकल्पिक रिपोर्टर वेक्टर), 5 μl HindIII (20 यू / μl), 5 μl BamHI (20 यू / μl), 5 μl थर्मल alkaline फॉस्फेट (1 यू / μl) तैयार और 25 μl 10x बफर।
        नोट: वेक्टर के एपी इलाज बहुत ही पचा वेक्टर के आत्म बंधाव और इस तरह पृष्ठभूमि घट जाती है।
      3. 37 डिग्री सेल्सियस से कम 4 घंटे के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण सेते हैं, तो पचा पीसीआर उत्पादों और एक व्यावसायिक पीसीआर शुद्धि किट के साथ वेक्टर शुद्ध।
    8. Ligation
      1. 2 μl 10x टी -4 डीएनए ligase बफर, 10 एनजी टी-ल्यूक वेक्टर, 50 एनजी डालने (पच पीसीआर उत्पाद), 1 μl टी -4 डीएनए ligase (400 यू / μl) और nuclease मुक्त पानी सहित पीसीआर नलियों में बंधाव के लिए प्रतिक्रिया सेट अप 20 μl पर निर्भर है।
        नोट: एक नकारात्मक नियंत्रण जहां प्रतिक्रिया डालने शामिल नहीं है तैयार।
      2. धीरे से ऊपर pipetting द्वारा प्रतिक्रिया मिश्रण और नीचे, मिनी सेंट्रीफ्यूज का उपयोग करते हुए संक्षेप में पीसीआर ट्यूबों नीचे स्पिन और फिर 10 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं।
      3. हीट 10 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर निष्क्रिय फिर बर्फ पर ठंड और 50 μl सक्षम कोशिकाओं (जैसे, DH5α) में परिवर्तन के लिए उत्पाद के 5 μl का उपयोग करें।
      4. , बैक्टीरिया को बदलने कालोनियों लेने के लिए और प्लास्मिड डीएनए को अलग से एक व्यावसायिक किट के साथ करने के लिए मानक गर्मी झटका प्रक्रिया का उपयोग करें। अगले कदम के लिए पहले अनुक्रमण द्वारा सभी निर्माणों को मान्य।
    9. ते कोशिकाओं के अभिकर्मक
      1. 48 अच्छी तरह से प्लेटों का प्रयोग करें। 200 μl 0.1% जिलेटिन solut जोड़ेआयन / अच्छी तरह से 30 मिनट सेल चढ़ाना से पहले।
      2. प्लेट भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (ते) अभिकर्मक से एक दिन पहले। / अच्छी तरह से 250 μl ते मीडिया में अच्छी तरह से प्रति 3 एक्स 10 4 कोशिकाओं के घनत्व पर फीडर मुफ्त ते कोशिकाओं और प्लेट का प्रयोग करें।
      3. प्लाज्मिड घोला जा सकता है तैयार (प्रत्येक मिश्रण 8 कुओं, के लिए गणना की जाती है 4 इलाज और 4 retinoic एसिड का इलाज) मिक्स 1:। 1250 एनजी टी-ल्यूक खाली (नकारात्मक नियंत्रण), 950 एनजी β-Galactosidase कोडिंग वेक्टर (βGal), मिक्स 2 : 1,250 एनजी टी-ल्यूक Hoxa1 बढ़ाने (सकारात्मक नियंत्रण), 950 एनजी βGal, मिक्स 3: 1,250 एनजी टी-ल्यूक PRMT8 बढ़ाने (ब्याज के क्षेत्र), 950 एनजी βGal।
        नोट: ES कोशिकाओं वांछित प्रतिलेखन कारक व्यक्त (RAR / RXR)। बाद में luciferase और β-galactosidase माप के दौरान आधार मूल्यों को निर्धारित करने के लिए untransfected कुओं छोड़ दें।
      4. प्रत्येक प्लाज्मिड अभिकर्मक गुणवत्ता को कम सीरम मीडिया जोड़ें 106 μl के लिए कुल मात्रा (8 कुओं के लिए पर्याप्त) मिश्रण।
      5. 4.5 μl ते गुणवत्ता transfect जोड़ेआयन अभिकर्मक तो 15 बार ऊपर और नीचे pipetting द्वारा ध्यान से मिश्रण। आरटी पर 10 मिनट के लिए अभिकर्मक मिश्रण सेते हैं।
      6. अच्छी तरह से प्रति कोशिकाओं को अभिकर्मक मिश्रण के 13 μl जोड़ें, pipetting द्वारा मिश्रण अच्छी तरह से। कोशिकाओं को वापस इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस) हे / एन ligand इलाज से पहले में रखें।
      7. कोशिकाओं से ध्यान से मीडिया को दूर आकांक्षा से और 250 μl जोड़ने के ताजा मीडिया / अच्छी तरह से 0.01 युक्त - अंतिम एकाग्रता या DMSO वाहन के रूप में के रूप में 1 माइक्रोन सब पार retinoic एसिड (आरए)। 48 घंटा - 24 के लिए कोशिकाओं को सेते हैं।
        ध्यान दें: Retinoic एसिड प्रकाश के प्रति संवेदनशील है।
    10. सेल lysates की तैयारी
      1. पतला 5x lysis बफर (1.25 मिलीलीटर 0.5 एम Tris पीएच = 7.8, 1 मिलीग्राम 1 एम dithiothreitol (डीटीटी) (एच 2 ओ), 10 मिलीलीटर 0.1 एम EDTA पीएच = 8.0, 50 मिलीलीटर ग्लिसरॉल, 5 मिलीलीटर ट्राइटन X-100, बाँझ में 100 मिलीलीटर तक पानी), बाँझ पानी का उपयोग 1x 20 μl 1 एम डीटीटी / 10 मिलीलीटर जोड़ने और उपयोग करने से पहले आरटी को संतुलित करने के लिए। परख के दिन पर एक 48 अच्छी तरह से थाली के लिए 10 मिलीलीटर की तैयारी। कोशिकाओं से ध्यान से मीडिया को दूर आकांक्षा से। 1x पीबीएस के साथ कोशिकाओं को एक बार कुल्ला। 200 μl 1x बफर / अच्छी तरह से सीधे कोशिकाओं को जोड़ने।
      2. आर टी (रासायनिक सेल) में 2 घंटे के लिए हिला। -80 डिग्री सेल्सियस (यांत्रिक सेल) पर थाली पर सेल lysates रुक। Lysates कई दिनों के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
      3. lysates गला लें। पूरा विगलन के बाद, एक इलेक्ट्रॉनिक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग कर एक 96 अच्छी तरह से थाली करने के लिए सेल lysates हस्तांतरण। स्थानांतरण β-galactosidase परख के लिए 96 अच्छी तरह से स्पष्ट थाली करने के लिए सेल lysate के 80 μl और luciferase माप के लिए एक सफेद प्लेट के लिए सेल lysate के 40 μl। किसी भी बुलबुले के गठन से बचें।
    11. β-galactosidase परख
      नोट: बीटा galactosidase या वैकल्पिक दूसरी संवाददाताओं से गैर विशिष्ट प्रयोगात्मक बदलाव के लिए खाते में एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए।
      1. Β-galactosidase सब्सट्रेट बफर तैयार: 80.0 जी ना 2 HPO 4 • 7H 2 हे,3.8 जी नः 2 4 पीओ • एच 2 ओ, 30.0 छ KCl, 1.0 ग्राम MgSO 4 • 7H 2 हे, बाँझ पानी के साथ 1,000 मिलीलीटर के लिए बनाते हैं। 7.4 पीएच को समायोजित करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर जीवाणुरहित (0.2 माइक्रोन) और दुकान फ़िल्टर
      2. 4 मिलीग्राम ONPG के साथ 1 मिलीलीटर β-galactosidase सब्सट्रेट बफर मिक्स (ओ-nitrophenyl-β-D-galactosidase)। सिर्फ उपयोग करने से पहले 2-Mercaptoethanol (βME) बफर के 1 मिलीलीटर प्रति 3.5 μl जोड़ें। 80 μl सेल lysate 100 μl β-galactosidase सब्सट्रेट बफर जोड़ें।
      3. 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रियाओं सेते हैं जब तक एक बेहोश पीले रंग का विकास किया है। एक प्लेट पाठक और निर्यात के आंकड़ों पर आयुध डिपो 420 एनएम पर absorbance पढ़ें।
        नोट: समय, अभिकर्मक दक्षता पर निर्भर करता है आमतौर पर 30 मिनट से अधिक समय नहीं।
    12. luciferase परख
      1. , 15.1 मिलीग्राम डी luciferin नमक, 82.7 मिलीग्राम एटीपी नमक, 185 मिलीग्राम MgSO 4 • 7H 2 हे 50 मिलीलीटर polypropylene ट्यूब को जोड़ने,: 50 मिलीलीटर luciferin सब्सट्रेट अभिकर्मक तैयारफिर, 1.5 मिलीग्राम 1 एम HEPES बफर, 48.5 मिलीलीटर एटीपी मुफ्त पानी, भंवर जोड़ने सुनिश्चित करें कि सभी यौगिकों पूरी तरह से भंग कर सकते हैं। -80 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिलीलीटर aliquots - 5 रखें।
      2. गर्म 5 मिलीलीटर luciferin सब्सट्रेट शुरू करने से पहले आरटी के लिए अभिकर्मक। पिपेट 100 μl सब्सट्रेट सफेद प्लेट सेल lysate के 40 μl युक्त एक अच्छी तरह से अभिकर्मक और संकेत को मापने के लिए तुरंत एक luminescent काउंटर मशीन का उपयोग कर।
      3. तीन प्रतियों transfections में कम से कम तीन स्वतंत्र प्रयोगों से गतिविधियों प्राप्त करते हैं।
      4. मापा प्रत्येक मान से गैर ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के लिए मापा औसत मूल्यों को घटा कर पहले बेस सामान्यीकृत luciferase गतिविधि और अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए आधार सामान्यीकृत β-galactosidase मूल्यों की गणना। तब luciferase / β-galactosidase गतिविधि के अनुपात की गणना।

    3. बढ़ाने आरएनए की विशेषता

    नोट: बढ़ाने गतिविधि का एक और अधिक प्रत्यक्ष सूचक हाल के जीनोम w से उभरा हैआईडीई अध्ययन है कि कई छोटे गैर-कोडिंग RNAs पहचान करने के लिए 50 NT 2,000 है, जो enhancers से लिखित रहे हैं से आकार में लेकर, और बढ़ाने RNAs में कहा जाता है (eRNAs) 16,25,26 (चित्रा 4)। इरना प्रेरण अत्यधिक आसन्न एक्सॉन जीन कोडिंग की प्रेरण के साथ संबद्ध। इस प्रकार, संकेत निर्भर बढ़ाने गतिविधि RT-qPCR द्वारा विभिन्न स्थितियों के बीच इरना उत्पादन की तुलना द्वारा विवो में मात्रा निर्धारित किया जा सकता है।

    1. RT-qPCR द्वारा इरना का पता लगाने के लिए प्रथम डिजाइन के लिए दिशानिर्देश
      1. इरना के मापन के लिए जीनोमिक क्षेत्रों का चयन करें कि कम से कम 1.5 रहे हैं - एनोटेट प्रतिलेखन शुरू साइटों से 2 KB दूर।
        नोट: महत्वपूर्ण बात है, intragenic enhancers भर mRNA प्रतिलेखन के उच्च स्तर भावना अभिविन्यास में इरना की सही मात्रा का ठहराव रोकने के लिए, intragenic enhancers पर antisense eRNAs detectable हैं और extragenic enhancers पर eRNAs करने के स्तर में समान हैं।
      2. एक सामान्य नियम के रूप में, क्षेत्रों में 200 का उपयोग करें - 1,000 बीपी इधर-उधरप्रतिलेखन कारक या तो समझ में आता है या विरोधी भावना कतरा (चित्रा 4 और चित्रा 6) पर प्राइमर डिजाइन के लिए ब्याज की साइट बंधन का केंद्र रहा हूँ।
        नोट: GRO-सेक, DNase seq, H3K4me1, H3K4me3 या H3K27ac चिप seq डेटा वांछित प्रकार की कोशिकाओं और शर्तों इसे और अधिक सटीक प्राइमर डिजाइन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता से उपलब्ध हैं। eRNAs H3K4me1 और ME3 के उच्च स्तर की विशेषता ख्यात बढ़ाने क्षेत्रों से लिखित हैं। eRNAs की अभिव्यक्ति सकारात्मक सक्रिय बढ़ाने हिस्टोन मार्क H3K27ac के संवर्धन के साथ संबद्ध।
      3. डिजाइन पीसीआर Primer3 द्वारा eRNAs के फ्लोरोसेंट डाई आधारित RT-qPCR माप के लिए प्राइमरों (http://bioinfo.ut.ee/primer3/) 23 उत्पन्न अनुसार प्रथम डिजाइन के लिए विरोधी भावना अनुक्रम (भावना कतरा के पूरक रिवर्स): http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html। प्राइमर डिजाइन के लिए भावना या विरोधी भावना अनुक्रम के 300 बीपी - 200 डालें।
    2. इरना ट्रांसक्रिप्शन का मापन
    3. निर्माता की सिफारिशों के अनुसार वाणिज्यिक अम्लीय फिनोल / क्लोरोफॉर्म आधारित निष्कर्षण अभिकर्मक के साथ इलाज किया कोशिकाओं से कुल शाही सेना को अलग।
    4. DNaseI प्रयोग पृथक शाही सेना के इलाज के लिए उन्हें रिवर्स प्रतिलेखन प्रतिक्रिया में उपयोग करने से पहले। निर्माता की सिफारिश प्रतिलेखन रिवर्स करने के लिए पूर्व के अनुसार DNase निष्क्रिय।
    5. DNase मैं उपचार के बाद आरएनए एकाग्रता उपाय और आरटी प्रतिक्रिया प्रति 1,000 एनजी का उपयोग करें। उच्च गुणवत्ता रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस का प्रयोग करें।
      नोट: eRNAs की बड़ी संख्या polyadenylated नहीं किया जा सकता है, रिवर्स प्रतिलेखन यादृच्छिक प्राइमरों के उपयोग की आवश्यकता है।
    6. पता लगाने रिवर्स मानक प्रक्रिया का उपयोग कर RT-qPCR द्वारा लिखित इरना। सामान्य बनाने के लिए एक गैर इलाज पर निर्भर mRNA उपाय (जैसे, 36B4, Ppia, GAPDH, Actb)।

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Representative Results

हम क्रम में पहचान करने के जीनोम चौड़ा जो RA-विनियमित जीन उनके करीबी निकटता में रिसेप्टर संवर्धन एक अखिल विशिष्ट RXR एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया। Retinoic एसिड के साथ इलाज ES कोशिकाओं से प्राप्त RXR चिप seq डेटा का विश्लेषण जैव सूचना विज्ञान परमाणु रिसेप्टर आधा साइट (AGGTCA) के तहत RXR पर कब्जा कर लिया साइटों (चित्रा 1) के संवर्धन का पता चला। एक जैव सूचना विज्ञान कलन विधि का प्रयोग हम RXR चिप seq आंकड़ों के आधे साइट (चित्रा 2) के लिए मूल भाव खोज परिणाम वापस मैप किया। यह विश्लेषण हमें मदद की सही उन चिप चोटियों जो विहित परमाणु रिसेप्टर बाध्यकारी साइटों के साथ ओवरलैपिंग कर रहे थे की पहचान। IGV में इन साइटों के दृश्य Hoxa1, एक पहले से विशेषता RAR / RXR लक्ष्य (चित्रा 2 और चित्रा 3) के करीब निकटता में इन प्रतिलेखन कारक के संवर्धन का संकेत दिया। हम भी एक उपन्यास आरए लक्ष्य जीन, अर्थात् PRMT8 27 की पहचान की। इस Latter क्षेत्र दो आधे साइटों (AGGTCAAGGTCA) (चित्रा 3) के बीच कोई स्पेसर न्यूक्लियोटाइड के साथ एक सीधा दोहराने में शामिल है। कार्यात्मक मान्य करने के लिए उस तत्व Ra से Hoxa1 के लिए पहचान की वास्तव में RAR / RXR बाध्य कर सकते हैं और विनियमित हम टी-luciferase संवाददाता वैक्टर कि ~ निहित पहचान तत्वों सहित 300bp जीनोमिक क्षेत्र, निर्माण किया। हम यह भी प्रतिक्रिया तत्व (चित्रा 5) के बिना वैक्टर का निर्माण किया। ES कोशिकाओं ट्रांसफ़ेक्ट थे और luciferase गतिविधि अभाव और retinoic एसिड की उपस्थिति (चित्रा 5) में मापा गया था। retinoic एसिड प्रतिक्रिया तत्व (दुर्लभ) युक्त निर्माणों आरए उपचार पर शो में वृद्धि हुई luciferase संकेत तीव्रता, किया था, जबकि दुर्लभ बिना निर्माण inducible नहीं था।

हम यह भी Hoxa1 बढ़ाने की retinoic एसिड निर्भर गतिविधि का अध्ययन किया। पता लगाने के लिए अगर समझ और विरोधी भावना Hoxa1 RAR / RXR बाध्य बढ़ाने सी की इरना अभिव्यक्तिजीन की mRNA अभिव्यक्ति के साथ orrelate, हम भी Hoxa1 mRNA के स्तर (चित्रा 6) मापा जाता है। ये परिणाम है कि बढ़ाने गतिविधि, अल्पकालिक आरए उपचार (3 घंटा) से प्रेरित है और इस प्रकार पुष्टि है कि बढ़ाने की संभावना RA-निर्भर बढ़ाने विनियमन में शामिल है की पुष्टि की।

आकृति 1
चित्रा 1. होमर डी ई नोवो आकृति परिणाम है। उदाहरण के RXR चिप seq के लिए होमर द्वारा उत्पन्न एक उत्पादन एचटीएमएल (homerResults.html) दिखाया गया है। अनुक्रम लोगो समृद्ध प्रतिलेखन कारक RXR बाध्य loci में नए सिरे से मूल भाव खोज द्वारा की पहचान रूपांकनों शीर्ष करने के लिए इसी। 7463 RXR पर कब्जा कर लिया जीनोमिक क्षेत्रों के मूल भाव खोज के लिए इस्तेमाल किया गया। इन क्षेत्रों के 77.66% AGGTCA-तरह की आकृति (# 1 के रूप में स्थान) शामिल हैं। विस्तृत विवरण की यात्रा के लिए: (http://homer.salk.edu/ho मेर / मूल भाव /) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. ढूँढना जीनोमिक क्षेत्र गठबंधन RXR चिप seq की ब्याज। विज़ुअलाइज़ेशन के मूल भाव युक्त पढ़ता (mm_ES_RXR_24h_ATRA.bam और AGGTCA मूल भाव घटनाओं (mm_ES_RXR_24h_ATRA_homerpeaks_motif1_mm10s_200_remaped_mbed.bed) एकीकृत जीनोमिक्स व्यूअर द्वारा (IGV)। संरेखण पढ़ें कतरा द्वारा रंग के होते हैं (पढ़ता लाल, - किनारा: + कतरा पर। नीला) जीनोम संरेखण के लिए इस्तेमाल किया: MM10। कृपया यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा 3. Hoxa1 और PRMT8 Enhancers। RXR चिप Seq इलाज और आरए का इलाज (24 घंटा, 1 माइक्रोन) के भ्रूण स्टेम कोशिकाओं 27 से प्राप्त संकेतों के IGV स्नैपशॉट के जीनोमिक loci दिखाए जाते हैं। पहचान बाध्यकारी दृश्यों लाल रंग के होते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
2 KB दूर प्रतिलेखन शुरू साइट (टीएसएस) निकटतम जीन के लिए रिश्तेदार - परीक्षण इरना कोडिंग दृश्यों के लिए चित्रा 4. प्रायोगिक डिजाइन बढ़ाने आरएनए (इरना) माप के लिए चुना Enhancers कम से कम 1.5 स्थित होना चाहिए। ब्याज और मूल भाव विश्लेषण के प्रतिलेखन कारक (टीएफ) की चिप-सेक डेटा जीनोम चौड़ा प्रत्यक्ष बाध्यकारी साइटों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। transcrip के बंधन के रूप मेंराष्ट्रीय coactivator (जैसे, P300) अक्सर बाहर का enhancers के निशान, दोनों टीएफ और P300 के लिए समृद्ध क्षेत्रों अच्छा बढ़ाने उम्मीदवार हैं। eRNAs की अभिव्यक्ति सकारात्मक सक्रिय बढ़ाने हिस्टोन मार्क H3K27ac के संवर्धन के साथ संबंध स्थापित किया जाता है। क्षेत्र 200 -। दूर भावना या विरोधी भावना दिशा में प्रतिलेखन कारक के बंधन के केंद्र से 1,000 बीपी इरना प्राइमर डिजाइन के लिए सिफारिश की है यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5. संकेत दिया रिपोर्टर की luciferase गतिविधि ES कोशिकाओं में निर्माणों। Hoxa1 बढ़ाने का संकेत दिया जीनोमिक क्षेत्रों टी-ल्यूक वेक्टर में क्लोन और भ्रूण स्टेम कोशिकाओं में ट्रांसफ़ेक्ट थे। निर्माण 1 और 2 निहित retinoic एसिड प्रतिक्रिया तत्व (दुर्लभ, संयुक्त राष्ट्रderlined अनुक्रम)। प्रकोष्ठों आरए (24 घंटा, 1 माइक्रोन) के साथ इलाज किया गया। βGal सामान्य बनाने के लिए एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। बार्स चार जैविक प्रतिकृति से मतलब सामान्यीकृत मूल्यों का प्रतिनिधित्व। ± एसडी *** पी <0.005 यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6 retinoic एसिड प्रेरित बढ़ाने आरएनए प्रतिलेखन। Hoxa1 mRNA और इरना स्तर के रूप में आर टी-qPCR द्वारा मापा जाता है। कुल शाही सेना retinoic एसिड (आरए) या DMSO वाहन (veh) के रूप में के साथ 3 घंटे के लिए इलाज किया ते कोशिकाओं से अलग किया गया था। भावना और विरोधी भावना इरना का पता लगाने और पीसीआर amplicons के लिए आगे प्राइमरों दिखाए जाते हैं। RXR बाध्यकारी साइट के केंद्र से इरना RT-qPCR द्वारा पता लगाया क्षेत्रों की दूरी संकेत दिया है। मान 36B4 श्री की औसत के लिए सामान्यीकृत थेएनए। डेटा मतलब का प्रतिनिधित्व ± SEM *** पी <0.005 यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
KOD DNA polymerase Merck Millipore 71085-3 for PCR amplification of enhancer from gDNA
DNeasy Blood & Tissue kit  Qiagen 69504 for genomic DNA isolation
QIAquick PCR Purification kit Qiagen 28106 for PCR product purification
Gel extraction kit  Qiagen 28706 for gel extraction if there are more PCR product
HindIII NEB R3104L restriction enzyme
BamHI NEB R3136L restriction enzyme
FastAP Thermo Scientific EF0651 release of 5'- and 3'-phosphate groups from DNA
T4 DNA ligase NEB M0202 for ligation
QIAprep Spin Miniprep kit Qiagen 27106 for plasmid isolation
DMEM Gibco 31966-021 ES media
FBS Hyclone SH30070.03 ES media
MEM Non-Essential Amino Acid Sigma M7145 ES media
Penicillin-Streptomycin Sigma P4333 ES media
Beta Mercaptoethanol Sigma M6250 ES media
FuGENE HD  Promega E2311 transfection reagent
Opti-MEM® I Reduced Serum Medium Life Technologies 31985-062 for transfection
All-trans retinoic acid Sigma R2625 ligand, for activation of RAR/RXR
96-well clear plate Greiner 655101 for Beta galactosidase assay
96-well white plate Greiner 655075 for Luciferase assay
D-luciferin, potassium salt Goldbio.com 115144-35-9 for Luciferase assay
ATP salt Sigma A7699-1G for Luciferase assay
MgSO4•7H2O Sigma 230391-25G for Luciferase assay
HEPES Sigma H3375-25G for Luciferase assay
Na2HPO4 •7H2O Sigma 431478-50G for Beta galactosidase assay
NaH2PO4 •H2O Sigma S9638-25G for Beta galactosidase assay
MgSO4•7H2O Sigma 230391-25G for Beta galactosidase assay
KCl Sigma P9541-500G for Beta galactosidase assay
ONPG (o-nitrophenyl-β-D-galactosidase) Sigma N1127-1G for Beta galactosidase assay
TRIzol® Life Technologies 15596-026 RNA isolation
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Life Technologies 4368814 reverse transcription of eRNA
Rnase-free Dnase Promega M6101 Dnase treatment
SsoFast Eva Green BioRad 750000105 RT-qPCR mastermix
CFX384 Touch™ Real-Time PCR Detection System BioRad qPCR machine
BioTek Synergy 4 microplate reader BioTek luminescent counter

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References

  1. Wamstad, J. A., Wang, X., Demuren, O. O., Boyer, L. A. Distal enhancers: new insights into heart development and disease. Trends in cell biology. 24, 294-302 (2014).
  2. Pennacchio, L. A., Bickmore, W., Dean, A., Nobrega, M. A., Bejerano, G. Enhancers: five essential questions. Nat Rev Genet. 14, 288-295 (2013).
  3. Mardis, E. R. ChIP-seq: welcome to the new frontier. Nature methods. 4, 613-614 (2007).
  4. Muller, F., Tora, L. Chromatin and DNA sequences in defining promoters for transcription initiation. Biochim Biophys Acta. 1839, 118-128 (2013).
  5. Ounzain, S., Pedrazzini, T. The promise of enhancer-associated long noncoding RNAs in cardiac regeneration. Trends Cardiovasc Med. (2015).
  6. Lam, M. T., Li, W., Rosenfeld, M. G., Glass, C. K. Enhancer RNAs and regulated transcriptional programs. Trends Biochem Sci. 39, 170-182 (2014).
  7. Dickel, D. E., et al. Function-based identification of mammalian enhancers using site-specific integration. Nature methods. 11, 566-571 (2014).
  8. Blum, R., Vethantham, V., Bowman, C., Rudnicki, M., Dynlacht, B. D. Genome-wide identification of enhancers in skeletal muscle: the role of MyoD1. Genes Dev. 26, 2763-2779 (2012).
  9. Vermunt, M. W., et al. Large-scale identification of coregulated enhancer networks in the adult human brain. Cell reports 9. 767-779 (2014).
  10. Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro. Dev Biol. 168, 342-357 (1995).
  11. Mahony, S., et al. Ligand-dependent dynamics of retinoic acid receptor binding during early neurogenesis. Genome Biol. 12, (R2), (2011).
  12. Simandi, Z., Balint, B. L., Poliska, S., Ruhl, R., Nagy, L. Activation of retinoic acid receptor signaling coordinates lineage commitment of spontaneously differentiating mouse embryonic stem cells in embryoid bodies. FEBS Lett. 584, 3123-3130 (2010).
  13. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).
  14. Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Mol Cell. 38, 576-589 (2010).
  15. Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nat Biotechnol. 29, 24-26 (2011).
  16. Daniel, B., et al. The active enhancer network operated by liganded RXR supports angiogenic activity in macrophages. Genes Dev. 28, 1562-1577 (2013).
  17. Zhu, Y., et al. Predicting enhancer transcription and activity from chromatin modifications. Nucleic Acids Res. 41, 10032-10043 (2013).
  18. Visel, A., et al. ChIP-seq accurately predicts tissue-specific activity of enhancers. Nature. 457, 854-858 (2009).
  19. Heintzman, N. D., et al. Distinct and predictive chromatin signatures of transcriptional promoters and enhancers in the human genome. Nat Genet. 39, 311-318 (2007).
  20. Rada-Iglesias, A., et al. A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans. Nature. 470, 279-283 (2010).
  21. Bonn, S., et al. Tissue-specific analysis of chromatin state identifies temporal signatures of enhancer activity during embryonic development. Nat Genet. 44, 148-156 (2012).
  22. Hollenberg, S. M., Giguere, V., Segui, P., Evans, R. M. Colocalization of DNA-binding and transcriptional activation functions in the human glucocorticoid receptor. Cell. 49, 39-46 (1987).
  23. Untergasser, A., et al. Primer3--new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Res. 40, e115 (2012).
  24. Rhead, B., et al. The UCSC Genome Browser database: update 2010. Nucleic Acids Res. 38, D613-D619 (2010).
  25. Kim, T. K., et al. Widespread transcription at neuronal activity-regulated enhancers. Nature. 465, 182-187 (2010).
  26. Wang, D., et al. Reprogramming transcription by distinct classes of enhancers functionally defined by eRNA. Nature. 474, 390-394 (2011).
  27. Simandi, Z., et al. PRMT1 and PRMT8 regulate retinoic acid-dependent neuronal differentiation with implications to neuropathology. Stem Cells. 33, 726-741 (2014).
  28. Zhou, H. Y., et al. A Sox2 distal enhancer cluster regulates embryonic stem cell differentiation potential. Genes Dev. 28, 2699-2711 (2014).

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