Prédiction et validation des éléments de réglementation gène activé Pendant l'acide rétinoïque induit la différenciation des cellules souches embryonnaires

1Sanford-Burnham-Prebys Medical Discovery Institute at Lake Nona, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Research Center for Molecular Medicine, Medical and Health Science Center, University of Debrecen, 3MTA-DE “Lendulet” Immunogenomics Research Group, University of Debrecen
* These authors contributed equally
Developmental Biology

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Simandi, Z., Horvath, A., Nagy, P., Nagy, L. Prediction and Validation of Gene Regulatory Elements Activated During Retinoic Acid Induced Embryonic Stem Cell Differentiation. J. Vis. Exp. (112), e53978, doi:10.3791/53978 (2016).

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Abstract

Le développement embryonnaire est un processus en plusieurs étapes impliquant l'activation et la répression de nombreux gènes. Des éléments amplificateurs dans le génome sont connues pour contribuer à un tissu et un type de cellule spécifique régulation de l'expression génique au cours de la différenciation cellulaire. Ainsi, leur identification et une enquête plus approfondie est important afin de comprendre comment le destin cellulaire est déterminée. L' intégration des données de gènes d'expression (par exemple, microarray ou ARN-Seq) et les résultats de la chromatine immunoprécipitation (ChIP) à base d' études de l' ensemble du génome (ChIP-seq) permet l' identification à grande échelle de ces régions régulatrices. Cependant, la validation fonctionnelle d'amplificateurs spécifiques du type cellulaire doit être examinée in vitro et dans des procédures expérimentales in vivo. Nous décrivons ici comment exhausteurs actifs peuvent être identifiés et validés expérimentalement. Ce protocole fournit un flux de travail, étape par étape, qui comprend: 1) l'identification des régions régulatrices par l'analyse, 2) le clonage et exper données ChIP-seqvalidation imental du potentiel réglementaire putatif des séquences génomiques identifiées dans un dosage de rapporteur, et 3) la détermination de l' activité d'activateur in vivo par la mesure du niveau de la transcription de l' ARN d'activateur. Le protocole présenté est suffisamment détaillée pour aider quelqu'un à mettre en place ce flux de travail dans le laboratoire. Surtout, le protocole peut être facilement adapté et utilisé dans un système de modèle cellulaire.

Protocol

1. Enhancer Sélection basée sur l'analyse de Chip-seq

  1. Télécharger le fichier fastq de données brutes RXR ChIP-seq (mm_ES_RXR_24h_ATRA.fastq.gz) de http://ngsdebftp.med.unideb.hu/bioinformatics/
  2. Télécharger et extraire le fichier d'index BWA requis pour l'alignement (dans notre cas: Mus_musculus_UCSC_mm10).(ftp://igenome:G3nom3s4u@ussd-ftp.illumina.com/Mus_musculus/UCSC/mm10/Mus_musculus_UCSC_mm10.tar.gz
    NOTE: Visite https://github.com/ahorvath/Bioinformatics_scripts pour plus d'informations sur les étapes de l'analyse bioinformatique et pour télécharger les scripts utilisés ci-dessous.
  3. Alignez le fichier exemple de fastq au génome de mm10 (utiliser le script: perform_alignment.sh). Cela va créer un dossier avec un fichier .bam et les statistiques de l'alignement. RXR données ChIP-seq alignés (mm_ES_RXR_24h_ATRA.bam), et le fichier d'index correspondant (.bai) sont disponibles ici:
    http://ngsdebftp.med.unideb.hu/bioinformatics/
    NOTE: BWA est un logiciel qui aligne relaséquences relativement courtes (par exemple, les résultats de ChIP-seq) à une base de données de séquence, tels que le génome de référence de la souris (par exemple, mm10) 13.
  4. Exécutez le script (callpeaks.sh) pour le pic appelant et de novo analyse de motif. Utilisez le fichier .bam comme entrée. Le script est basé sur Homer findPeaks 14.
    REMARQUE: Les fichiers de sortie nous donnent des informations sur le nombre total de pics, l' enrichissement des motifs, le pourcentage de l'arrière - plan, et les séquences cibles avec des motifs, etc. (Figure 1). Typiquement plusieurs motifs sont énumérés dans l'ordre de leur importance.
  5. Remappez le # 1 motif classé (NR demi `AGGTCA`) (utiliser le script: remap_motif.sh)
    NOTE: Comme résultat, le script génère un fichier .bed qui montrera que CHIP-pics couvrent des régions génomiques qui contiennent le site de liaison canonique du facteur de transcription d'intérêt.
  6. Télécharger et visualiser les résultats du RXR lit ChIP-seq alignés (mm_ES_RXR_24h_ATRA.bam (également télécharger le .bai)) et les occurrences AGGTCA motifs (mm_ES_RXR_24h_ATRA_homerpeaks_motif1_mm10s_200_remaped_mbed.bed) par intégratif de génomique Viewer (IGV) 15 pour identifier les RAR putative / sites de liaison RXR (figure 2 et figure 3).
    NOTE: L' intégration des différentes données ChIP-seq permettra de prédire avec précision plus de bons activateurs candidats 16,17. Des études récentes ont révélé que des amplificateurs actifs sont généralement enrichis en P300 et sont en corrélation avec H3K4me1 et H3K27ac, et sont situées dans des régions de chromatine ouvertes, affichant ainsi DNase I hypersensibilité est également recommandée 18-21.
  7. Utilisez la "Définir une région d'intérêt" dans IGV 15 pour obtenir 200-400 séquence de pb de la région génomique sélectionnée et utiliser ces séquences pour la conception d'amorces ultérieures.

2. Reporter Assay

NOTE: Le système luciférine / luciférase est utilisécomme un essai rapporteur très sensible pour la régulation transcriptionnelle. En fonction de l'activité de l'activateur de cet enzyme luciférase est produite qui va catalyser l'oxydation de la luciférine à l'oxyluciférine entraînant bioluminescense, qui peut être détectée. Dans un premier temps, des séquences amplificatrices putatives identifiées devraient être sous - clonés dans un vecteur rapporteur (par exemple, TK-luciférase 22, pGL3 ou NanoLuc).

  1. Conception Primer
    1. Amorces Conception PCR pour l' amplification de 200-400 pb de régions amplificatrices putatives par Primer3 (disponible ici: http://bioinfo.ut.ee/primer3/) 23
    2. Copiez-collez la séquence génomique de IGV qui comprend le site de liaison putatif en Primer3 (voir étape 1.7). Set gamme de taille de produit à 250-300 pb Primer3.
    3. Valider les amorces de PCR en utilisant le navigateur UCSC Genome est in silico outil PCR (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr) 24
      NOTE: Ce protocole dans une étape ultérieure utilise HindIIrestriction I et BamHI enzymes pour le clonage. Vérifier si la séquence amplifiée par PCR , comme prévu par l'outil de PCR UCSC in silico contiendront des sites de restriction ou AAGCTT GGATCC (par exemple http://nc2.neb.com/NEBcutter2/).
    4. Obtenir les amorces nécessaires à partir d'un fournisseur commercial.
  2. Amplification PCR de Enhancer séquence d'ADN génomique
    1. Purifier l' ADN génomique modèle à partir de cellules primaires (par exemple, les fibroblastes embryonnaires primaires). Utilisez kit commercial pour ADNg isolement et suivre les instructions du fabricant.
      NOTE: La haute qualité de ADNg est essentiel pour l'amplification de la PCR réussie. Les clones BAC appropriés peuvent être utilisés si la PCR est pas facile de ADNg.
    2. Préparer réaction de PCR de 50 pi contenant 100 ng d' ADNg, 5 pi de 10 x tampon, 3 ul MgSO4 (25 mM), 5 pi de dNTP (2 mM chacun), 1,5 ul Fwd amorce (10 pM), 1,5 pi de Rev amorce (10 pM) , 1 ul d'ADN polymerase
    3. Définir le cycle de PCR (2 minutes 95 ° C (20 sec 95 ° C, 10 secondes 58-65 ° C, 18 sec à 70 ° C) répéter les opérations x25, 2 min 70 ° C, toujours à 4 ° C). Régler la température de recuit de l'examen de l'amorce de valeurs prédites Tm.
    4. Purifier le produit PCR avec un kit de purification PCR commerciale et suivez les instructions du fabricant.
    5. Introduire les sites de restriction pour le clonage en répétant la PCR avec des amorces tel qu'il est utilisé ci - dessus, mais en y ajoutant des surplombs sur leurs extrémités 5 '(par exemple Fwd: 5'-AAGCTT ATAT xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx-3' (Hind III), Rev: 5'-GGATCC TATA xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx -3 '(Bam HI)).
    6. Exécutez 5 ul du produit de PCR sur gel d'agarose pour vérifier les produits de PCR non spécifiques.
      NOTE: Si plusieurs bandes sont détectées, exécutez le produit PCR entier et purifier la bande appropriée par un kit d'extraction de gel commercial.
    7. Restriction
      NOTE: Pour cloner insert en amont du promoteur TK 22 le produit purifié PCR et le vecteur (par exemple, TK-Luc) devrait être digéré par HindIII et BamHI.
      1. Préparer un mélange réactionnel de 50 pi contenant 1 ug produit a été purifié par PCR, 1 pl de HindIII (20 U / pl), 1 ul de BamHI (20 U / pl) et 5 pi de tampon 10x.
      2. Préparer un vecteur contenant 250 mélange réactionnel pl de 5 pg (TK Luc ou vecteur rapporteur alternatif), 5 ul Hind III (20 U / pl), 5 ul de BamHI (20 U / pl), 5 ul thermosensibles Phosphatase alcaline (1 U / pl) et 25 ul de 10 x tampon.
        REMARQUE: le traitement AP du vecteur diminue fortement l'auto-ligature du seul vecteur digéré et donc l'arrière-plan.
      3. Incuber les mélanges réactionnels pendant 4 heures à 37 ° C, puis on purifie les produits de PCR digérés et le vecteur avec un kit de purification PCR commerciale.
    8. Ligation
      1. Mettre en place la réaction de ligature dans des tubes de PCR comprenant 2 pl 10x T4 tampon de ligase d'ADN, 10 ng TK-Luc vecteur, insérer 50 ng (produit de PCR digéré), 1 ul d'ADN ligase de T4 (400 U / pl) et sans nucléases eau jusqu'à 20 ul.
        NOTE: Préparer un contrôle négatif où la réaction ne contient pas insert.
      2. Mélanger délicatement la réaction par pipetage de haut en bas, centrifuger brièvement les tubes de PCR en utilisant un mini-centrifugeuse puis incuber à température ambiante pendant 10 min.
      3. Heat inactiver à 65 ° C pendant 10 minutes puis refroidir sur la glace et utiliser 5 pi du produit de transformation dans 50 ul de cellules compétentes (par exemple, DH5a).
      4. Utilisez la procédure de choc thermique standard pour transformer des bactéries, ramasser des colonies et isoler l'ADN plasmidique avec un kit commercial. Validez toutes les constructions par séquençage avant les prochaines étapes.
    9. La transfection de cellules ES
      1. Utiliser des plaques à 48 puits. Ajouter 200 ul de 0,1% de gélatine solutions / puits 30 min avant le placage des cellules.
      2. Plate souches embryonnaires (ES) cellules par jour avant la transfection. Utiliser des cellules et la plaque ES libre nourricières à une densité de 3 x 10 4 cellules par puits dans 250 ul ES médias / puits.
      3. Préparer les mélanges de plasmides (chaque mélange est calculé pour 8 puits, 4 non traité et 4 traités à l' acide rétinoïque) Mélanger 1:. 1.250 ng TK-Luc Empty (contrôle négatif), 950 ng β-galactosidase vecteur de codage (ßGal), Mix 2 : 1,250 ng TK-Luc HOXA1 enhancer (contrôle positif), 950 ng ßGal, Mix 3: 1,250 ng TK-Luc PRMT8 enhancer (région d'intérêt), 950 ng ßGal.
        NOTE: Les cellules ES expriment les facteurs de transcription souhaités (RAR / RXR). Laisser les puits non transfectées pour déterminer les valeurs de base plus tard au cours de la luciférase et de la β-galactosidase mesures.
      4. Ajouter des médias sériques réduits de qualité de transfection pour chaque plasmide mélanger jusqu'à 106 ul volume total (suffisant pour 8 puits).
      5. Ajouter 4,5 ul transfecter de qualité ESréactif ion, puis mélanger soigneusement par pipetage 15 fois haut et en bas. Laisser incuber le mélange de transfection pendant 10 minutes à température ambiante.
      6. Ajouter 13 ul du mélange de transfection des cellules par puits, mélanger par pipetage. Placez les cellules de nouveau dans l'incubateur (37 ° C) O / N avant le traitement de ligand.
      7. Retirez le support avec soin par aspiration à partir de cellules et ajouter 250 ul frais media / puits contenant 0,01 - 1 uM all trans-acide rétinoïque (RA) que la concentration finale ou DMSO comme véhicule. Incuber les cellules pendant 24-48 h.
        NOTE: L'acide rétinoïque est sensible à la lumière.
    10. Préparation des lysats cellulaires
      1. Diluer Lysis Buffer 5x (1,25 ml Tris 0,5 M pH = 7,8, 1 ml de 1 M de dithiothréitol (DTT) (dans H 2 O), 10 ml d' EDTA 0,1 M pH = 8,0, 50 ml de glycerol, 5 ml de Triton X-100, stériles de l'eau jusqu'à 100 ml) à l'aide d'eau 1x stérile, ajouter 20 ul de DTT 1 M / 10 ml et équilibrer à la température ambiante avant utilisation. Préparer 10 ml pour une plaque à 48 puits le jour du dosage. Retirez le support avec soin par aspiration à partir de cellules. Rincer les cellules une fois avec PBS 1x. Ajouter 200 ul de 1 x tampon de lyse / puits directement aux cellules.
      2. Agiter pendant 2 h à RT (lyse chimique). Congeler les lysats cellulaires sur la plaque à -80 ° C (lyse mécanique). Les lysats peuvent être conservés à -80 ° C pendant plusieurs jours.
      3. Décongeler les lysats. Après décongélation complète, le transfert des lysats cellulaires à une plaque à 96 puits en utilisant une pipette électronique multicanaux. Transfert 80 pi du lysat cellulaire à plaque de 96 puits clair pour le dosage β-galactosidase et 40 pi de lysat cellulaire à une plaque blanche pour la mesure de la luciférase. Éviter la formation des bulles.
    11. β-galactosidase Assay
      NOTE: galactosidase Beta ou deuxième journalistes alternatifs devraient être utilisés comme un contrôle interne pour tenir compte des variations expérimentales non spécifiques.
      1. Préparer un tampon de substrat β-galactosidase: 80,0 g Na 2 HPO 4 • 7H 2 O,3,8 g de NaH 2 PO 4 • H 2 O, 30,0 g de KCl, 1,0 g MgSO 4 • 7H 2 O, font jusqu'à 1000 ml avec de l' eau stérile. Ajuster le pH à 7,4. Filtre Stériliser (0,2 micron) et conserver à 4 ° C
      2. Mélanger le tampon de substrat 1 ml de β-galactosidase avec 4 mg ONPG (o-nitrophényl-β-D-galactosidase). Ajouter 3,5 pi de 2-mercaptoéthanol (ßME) par 1 ml de tampon juste avant utilisation. Ajouter un tampon de substrat de β-galactosidase de 100 pi à 80 pi de lysat cellulaire.
      3. Incuber les réactions à 37 ° C jusqu'à ce qu'une couleur jaune pâle a développé. Lire l'absorbance à DO 420 nm sur un lecteur de plaque et d'exportation des données.
        REMARQUE: La durée varie en fonction de l'efficacité de transfection, généralement pas plus de 30 min.
    12. luciférase Assay
      1. Préparer 50 ml luciférine réactif de substrat: 15,1 mg de sel de D-luciférine, 82,7 mg de sel ATP, 185 mg MgSO 4 • 7H 2 O, ajouter 50 ml Tube en polypropylène,puis ajouter 1,5 ml de tampon 1 M HEPES, 48,5 ml ATP eau libre, vortex, assurez-vous que tous les composés se dissolvent complètement. Gardez 5 - 10 ml aliquotes à -80 ° C.
      2. Chaud 5 ml substrat luciférine réactif à la température ambiante avant de commencer. Distribuer 100 ul substrat réactif pour chaque puits de la plaque blanche contenant les 40 pi de lysat cellulaire et de mesurer le signal immédiatement en utilisant un luminescent compteur machine.
      3. Obtenir des activités d'au moins trois expériences indépendantes dans des transfections en triple.
      4. Calculer d'abord l'activité de la luciférase normalisée de base et des valeurs normalisées β-galactosidase de base pour chaque puits en soustrayant les valeurs moyennes mesurées pour les cellules non transfectées provenant de chaque valeur mesurée. Calcule ensuite le rapport de l'activité luciférase / β-galactosidase.

    3. Caractérisation de l'ARN Enhancer

    REMARQUE: Un indicateur plus directe de l'activité d'activateur a émergé de la récente génome wétudes ide qui ont identifié de nombreux ARN non-codants courts, dont la taille varie de 50 à 2000 nt, qui sont transcrits à partir des amplificateurs, et sont appelés ARN enhancer (Ernas) 16,25,26 (figure 4). erna induction est fortement corrélé à l'induction de gènes codant pour des exons adjacents. Ainsi, l' activité d'activateur dépendant du signal peut être quantifiée in vivo en comparant la production Erna entre les différentes conditions par RT-qPCR.

    1. Lignes directrices pour la conception Primer pour la détection Erna par RT-qPCR
      1. Sélectionnez régions génomiques pour des mesures Erna qui sont au moins 1,5 à 2 kb loin des sites de début de transcription annotés.
        NOTE: Il est important, des niveaux élevés de transcription de l'ARNm dans exhausteurs intragéniques prévenir une quantification précise de Erna dans l'orientation sens, Ernas antisens à exhausteurs intragéniques sont détectables et sont semblables dans le niveau de Ernas à exhausteurs extragéniques.
      2. En règle générale, utiliser des régions 200 - 1000 pb from le centre du site d'intérêt pour la conception d'amorce soit sur ​​le sens ou brin antisens (figure 4 et figure 6) liant le facteur de transcription.
        NOTE: Si GRO-seq, DNase-seq, H3K4me1, H3K4me3 ou données H3K27ac ChIP-seq sont disponibles à partir des types cellulaires souhaités et les conditions, il peut être utilisé pour la conception d'amorce plus précis. Ernas sont transcrits à partir de régions amplificatrices putatives caractérisées par des niveaux élevés de H3K4me1 et me3. L'expression de Ernas corrélation positive avec l'enrichissement de activé marque activateur de histone H3K27ac.
      3. Amorces Conception PCR pour base de colorant fluorescent mesure RT-qPCR de Ernas par Primer3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3/) 23 Générer séquence anti-sens (complément du brin sens inverse) pour la conception d'amorce selon: http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html. Insérez 2-300 pb de séquence sens ou anti-sens pour la conception d'amorce.
    2. Mesure de Erna Transcription
    3. Isoler l'ARN total à partir de cellules traitées avec du phénol acide commercial / réactif d'extraction à base de chloroforme selon les recommandations du fabricant.
    4. Utilisez DNaseI pour traiter l'ARN isolé avant de les utiliser dans la réaction de transcription inverse. Inactiver DNase selon les recommandations du fabricant avant la transcription inverse.
    5. Mesurer la concentration d'ARN après traitement à la DNase I et utiliser 1000 ng par réaction RT. Utilisez inverse de haute qualité transcriptase.
      Remarque: Comme un grand nombre de Ernas ne peut pas être polyadénylé, la transcription inverse nécessite l'utilisation d'amorces aléatoires.
    6. Détecter une transcription inverse Erna par RT-qPCR en utilisant la procédure standard. Mesurer un ARNm non-traitement dépendant de la normalisation (par exemple, 36B4, PPIA, Gapdh, ACTB).

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Representative Results

Nous avons utilisé un anticorps RXR pan-spécifique afin d'identifier quels gènes RA réglementés de l'ensemble du génome ont l'enrichissement des récepteurs dans leur proximité. Analyse bio - informatique des données de RXR copeau suivants obtenus à partir de cellules ES traitées à l' acide rétinoïque a révélé l'enrichissement du demi - site du récepteur nucléaire (AGGTCA) sous le RXR sites occupés (figure 1). En utilisant un algorithme de bio - informatique , nous avons cartographié retour le résultat de recherche de motif pour le demi - site pour les données RXR ChIP-seq (Figure 2). Cette analyse nous a permis d'identifier avec précision les pics de ChIP qui se chevauchaient avec des sites de liaison aux récepteurs nucléaires canoniques. Visualisation de ces sites dans IGV a indiqué l' enrichissement de ces facteurs de transcription dans la proximité de HOXA1, une cible RAR / RXR caractérisé précédemment (Figure 2 et Figure 3). Nous avons également identifié un gène cible roman RA, à savoir PRMT8 27. Ce larégion tter contient une répétition directe sans nucléotides d'espacement entre les deux demi - sites (AGGTCAAGGTCA) (Figure 3). Pour valider fonctionnellement que l'élément identifié pour HOXA1 peut en effet lier RAR / RXR et réglementé par RA, nous avons construit des vecteurs rapporteurs TK-luciférase qui contenaient ~ 300bp région génomique, y compris les éléments identifiés. Nous avons également construit des vecteurs sans l'élément de réponse (Figure 5). Les cellules ES ont été transfectées et l' activité de la luciférase a été mesurée en l'absence et en présence d'acide rétinoïque (figure 5). Constructs contenant l'élément de réponse de l'acide rétinoïque (RARE) a augmenté spectacle luciférase intensité du signal lors du traitement RA, alors que la construction sans RARE n'a pas été inductible.

Nous avons également étudié l'activité de l'acide rétinoïque dépendant de l'amplificateur HOXA1. Pour déterminer si le sens et anti-sens Erna expression de l'activateur HOXA1 RAR / RXR lié correlate avec l'expression de l' ARNm du gène, nous avons également mesuré le niveau d'ARNm HOXA1 (figure 6). Ces résultats confirment que l'activité de l'activateur est induite par un traitement à la PR à court terme (3 h), ce qui confirme que l'activateur est susceptible impliqué dans la régulation de l'activateur de l'AR-dépendante.

Figure 1
Figure 1. Homer D e Novo Motif Résultats. Un HTML de sortie (homerResults.html) générée par Homer pour l'exemple RXR ChIP-seq est affiché. Logos de séquence correspondant à haut enrichis motifs de facteurs de transcription identifiés par de novo découverte de motif à des loci RXR lié. 7463 RXR occupées régions génomiques ont été utilisés pour la recherche de motif. 77,66% de ces régions contient motif AGGTCA-like (classé n ° 1). Pour une description détaillée, visitez: (http://homer.salk.edu/ho mer / motif /) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Trouver des régions génomiques contenant Motif d'intérêt. Visualisation du RXR ChIP-seq aligné lectures (mm_ES_RXR_24h_ATRA.bam et les occurrences AGGTCA motifs (mm_ES_RXR_24h_ATRA_homerpeaks_motif1_mm10s_200_remaped_mbed.bed) par intégratif de génomique Viewer (IGV). Alignements sont colorés par lecture brin (lectures sur + brin: rouge, - brin:. bleu) Genome utilisé pour l'alignement: mm10. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

jpg "/>
Figure 3. Genomic Loci de HOXA1 et Enhancers PRMT8. IGV __gVirt_NP_NN_NNPS<__ instantané de RXR signaux ChIP-Seq obtenus à partir de (24 h, 1 uM) des cellules souches embryonnaires non traitées et traitées RA-27 sont présentées. Identifié séquences de liaison sont de couleur rouge. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
. Figure 4. Experimental Design for Testing Erna séquences codantes Les activateurs choisis pour l' ARN d'activateur (Erna) mesure doit être situé à au moins 1,5 à 2 kb de distance par rapport au site de début de transcription (TSS) du gène le plus proche. les données de copeau suivants du facteur de transcription (TF) d'intérêt et l'analyse des motifs peuvent être utilisés pour identifier les sites de liaison directe du génome entier. Comme liaison de transcriptasetional coactivateur (par exemple, P300) marque souvent exhausteurs distales, les régions enrichies tant pour le TF et P300 sont de bons candidats activateurs. L'expression de Ernas est en corrélation positive avec l'enrichissement de activé marque activateur de histone H3K27ac. Régions 200 -. 1000 pb loin dans le sens ou le sens anti-sens du centre de liaison du facteur de transcription est recommandé pour la conception Erna primaire S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5. luciférase activité du Rapporteur Indiquées Construit dans les cellules ES. régions génomiques Indiquées de l'activateur HOXA1 ont été clonées dans TK-Luc vecteur et transfectées dans des cellules souches embryonnaires. Construire 1 et 2 contenait l'élément de réponse de l'acide rétinoïque (RARE, nonséquence derlined). Les cellules ont été traitées avec RA (24 heures, 1 uM). ßGal a été utilisé comme contrôle interne pour la normalisation. Les barres représentent des valeurs normalisées moyennes de quatre répétitions biologiques. Sd ± *** P <0,005 S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6
Figure 6. Niveaux acide rétinoïque induit Enhancer ARN de transcription. HOXA1 ARNm et Erna telle que mesurée par RT-qPCR. L'ARN total a été isolé à partir de cellules ES traités pendant 3 h avec de l'acide rétinoïque (RA) ou de DMSO comme véhicule (véh). amorces à terme pour le sens et anti-sens détection Erna et les amplicons PCR sont présentés. Distance des régions détectées par Erna RT-qPCR du centre du site de liaison RXR est indiquée. Les valeurs ont été normalisées à la moyenne des 36B4 mRN / A. Les données représentent la moyenne ± ETM *** P <0,005 S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
KOD DNA polymerase Merck Millipore 71085-3 for PCR amplification of enhancer from gDNA
DNeasy Blood & Tissue kit  Qiagen 69504 for genomic DNA isolation
QIAquick PCR Purification kit Qiagen 28106 for PCR product purification
Gel extraction kit  Qiagen 28706 for gel extraction if there are more PCR product
HindIII NEB R3104L restriction enzyme
BamHI NEB R3136L restriction enzyme
FastAP Thermo Scientific EF0651 release of 5'- and 3'-phosphate groups from DNA
T4 DNA ligase NEB M0202 for ligation
QIAprep Spin Miniprep kit Qiagen 27106 for plasmid isolation
DMEM Gibco 31966-021 ES media
FBS Hyclone SH30070.03 ES media
MEM Non-Essential Amino Acid Sigma M7145 ES media
Penicillin-Streptomycin Sigma P4333 ES media
Beta Mercaptoethanol Sigma M6250 ES media
FuGENE HD  Promega E2311 transfection reagent
Opti-MEM® I Reduced Serum Medium Life Technologies 31985-062 for transfection
All-trans retinoic acid Sigma R2625 ligand, for activation of RAR/RXR
96-well clear plate Greiner 655101 for Beta galactosidase assay
96-well white plate Greiner 655075 for Luciferase assay
D-luciferin, potassium salt Goldbio.com 115144-35-9 for Luciferase assay
ATP salt Sigma A7699-1G for Luciferase assay
MgSO4•7H2O Sigma 230391-25G for Luciferase assay
HEPES Sigma H3375-25G for Luciferase assay
Na2HPO4 •7H2O Sigma 431478-50G for Beta galactosidase assay
NaH2PO4 •H2O Sigma S9638-25G for Beta galactosidase assay
MgSO4•7H2O Sigma 230391-25G for Beta galactosidase assay
KCl Sigma P9541-500G for Beta galactosidase assay
ONPG (o-nitrophenyl-β-D-galactosidase) Sigma N1127-1G for Beta galactosidase assay
TRIzol® Life Technologies 15596-026 RNA isolation
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Life Technologies 4368814 reverse transcription of eRNA
Rnase-free Dnase Promega M6101 Dnase treatment
SsoFast Eva Green BioRad 750000105 RT-qPCR mastermix
CFX384 Touch™ Real-Time PCR Detection System BioRad qPCR machine
BioTek Synergy 4 microplate reader BioTek luminescent counter

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References

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