Vorhersage und Validierung von Gen-regulatorischen Elementen Activated Während Retinsäure Induced Embryonic Stem Zelldifferenzierung

1Sanford-Burnham-Prebys Medical Discovery Institute at Lake Nona, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Research Center for Molecular Medicine, Medical and Health Science Center, University of Debrecen, 3MTA-DE “Lendulet” Immunogenomics Research Group, University of Debrecen
* These authors contributed equally
Developmental Biology

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Simandi, Z., Horvath, A., Nagy, P., Nagy, L. Prediction and Validation of Gene Regulatory Elements Activated During Retinoic Acid Induced Embryonic Stem Cell Differentiation. J. Vis. Exp. (112), e53978, doi:10.3791/53978 (2016).

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Abstract

Embryonale Entwicklung ist ein mehrstufiger Prozess, Aktivierung und Unterdrückung vieler Gene beteiligt sind. Enhancer-Elemente im Genom sind dafür bekannt, Gewebe und Zelltyp-spezifische Regulation der Genexpression während der Zelldifferenzierung beizutragen. Somit ist die Identifizierung und die weitere Untersuchung wichtig, um zu verstehen, wie das Zellschicksal bestimmt wird. Integration von Genexpressionsdaten (zB Microarray oder RNA-seq) und die Ergebnisse der Chromatin - Immunopräzipitation (ChIP) -basierten genomweite Studien (ChIP-seq) ermöglicht große Identifizierung dieser Regulationsregionen. Jedoch funktionellen Validierung von zelltypspezifischen Enhancern erfordert weitere in vitro- und in vivo experimentellen Verfahren. Hier beschreiben wir, wie aktive Enhancer kann experimentell identifiziert und validiert werden. Dieses Protokoll stellt eine Schritt-für-Schritt-Workflow, der folgendes beinhaltet: 1) Identifizierung der regulatorischen Regionen von ChIP-seq Datenanalyse, 2) Klonierung und expertellen Validierung putative regulatorische Potential der identifizierten genomischen Sequenzen in einem Reporter - Assay, und 3) Bestimmung der Enhancer - Aktivität in vivo durch Enhancer - RNA - Transkript Ebene zu messen. Das vorgestellte Protokoll ist detailliert genug, jedem zu helfen diesen Workflow im Labor einzurichten. Wichtig ist, dass das Protokoll einfach und in jedem zellulären Modellsystem verwendet, angepasst werden.

Protocol

1. Enhancer Auswahl Basierend auf Chip-seq Analyse

  1. Laden Sie die RXR ChIP-seq Rohdaten fastq Datei (mm_ES_RXR_24h_ATRA.fastq.gz) von http://ngsdebftp.med.unideb.hu/bioinformatics/
  2. Download und Dekomprimierung der erforderlichen BWA-Index-Datei für die Ausrichtung (in unserem Fall: Mus_musculus_UCSC_mm10).(ftp://igenome:G3nom3s4u@ussd-ftp.illumina.com/Mus_musculus/UCSC/mm10/Mus_musculus_UCSC_mm10.tar.gz
    HINWEIS: Besuch https://github.com/ahorvath/Bioinformatics_scripts für weitere Informationen in Bezug auf die Schritte der Analyse der Bioinformatik und die Skripte unter verwendet zum Download bereit.
  3. Richten Sie das Beispiel fastq Datei zu mm10 Genom (verwenden Sie das Skript aus: perform_alignment.sh). Dies wird einen Ordner mit einer .bam Datei und Statistiken der Ausrichtung erstellen. Aligned RXR ChIP-seq Daten (mm_ES_RXR_24h_ATRA.bam) und die entsprechende Indexdatei (.bai) finden Sie hier:
    http://ngsdebftp.med.unideb.hu/bioinformatics/
    HINWEIS: BWA ist ein Software-Paket, das rela ausrichtettiv kurze Sequenzen (zB ChIP-seq Ergebnisse) zu einer Sequenzdatenbank, wie der Maus Bezugsgenom (beispielsweise MM10) 13.
  4. Führen Sie das Skript (callpeaks.sh) für Spitzen Berufung und de novo - Motiv - Analyse. Verwenden Sie die .bam Datei als Eingabe. Das Drehbuch basiert auf Homer findPeaks 14.
    HINWEIS: Die Ausgabedateien geben uns Informationen über die Gesamtzahl der Spitzen, die Anreicherung der Motive, der Prozentsatz der Hintergrund, und die Zielsequenzen mit Motiven, etc. (Abbildung 1). Typischerweise werden mehrere Motive in der Reihenfolge ihrer Bedeutung aufgelistet.
  5. Ordnen Sie den Platz # 1 Motiv (NR Hälfte `AGGTCA`) (verwenden Sie das Skript: remap_motif.sh)
    HINWEIS: Als Ergebnis erzeugt das Skript eine .bed-Datei, die zeigen, welcher Chip-Spitzen decken genomische Regionen, die die kanonischen Bindungsstelle des Transkriptionsfaktors von Interesse enthalten.
  6. Downloaden und visualisieren Ergebnisse der ausgerichteten RXR ChIP-seq liest (mm_ES_RXR_24h_ATRA.bam (auch die .bai Download)) und die AGGTCA Motiv Vorkommen (mm_ES_RXR_24h_ATRA_homerpeaks_motif1_mm10s_200_remaped_mbed.bed) durch Integrative Genomics Viewer (IGV) 15 mutmaßliche RAR / RXR - Bindungsstellen (Abbildung 2 und Abbildung 3) zu identifizieren.
    HINWEIS: Die Integration von verschiedenen ChIP-seq Daten werden helfen , mehr genau vorhersagen 16,17 guter Kandidat Verstärker. Jüngste Studien zeigten , dass aktive Enhancer werden typischerweise für P300 angereichert und korrelieren mit H3K4me1 und H3K27ac und werden in offenen Chromatinstruktur Regionen, wodurch DNase-I - Überempfindlichkeits Anzeige wird ebenfalls 18-21 empfohlen.
  7. Verwenden Sie die "Definieren Sie einen Bereich von Interesse" in 15 IGV 200 zu erhalten - 400 bp - Sequenz des ausgewählten genomischen Region und diese Sequenzen für die nachfolgende Primer - Designs verwendet werden .

2. Reporter Assay

HINWEIS: Das Luciferin / Luciferase-System wird verwendet,als ein sehr empfindlicher Reporter-Assay für die Transkriptionsregulation. In Abhängigkeit von der Luciferase-Enzym Enhancer-Aktivität erzeugt wird, die die Oxidation von Luciferin katalysieren, wird zu Oxyluciferin in bioluminescense führt, die detektiert werden kann. Als ersten Schritt sollten putative Enhancer identifizierten Sequenzen subkloniert in einen Reportervektor (zB TK-Luciferase 22, pGL3 oder NanoLuc) werden.

  1. Primer - Design
    1. Design - PCR - Primer für die Amplifikation von 200 bis 400 bp mutmaßlicher Enhancer - Regionen von Primer3 (hier erhältlich: http://bioinfo.ut.ee/primer3/) 23
    2. Copy-Paste die genomische Sequenz von IGV, die die mutmaßliche Bindungsstelle in Primer3 enthält (siehe Schritt 1.7). Set Produktgrößenbereich von 250 bis 300 bp in Primer3.
    3. Überprüfen Sie die PCR - Primer die UCSC Genome Browser ist In - silico - PCR - Tool (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr) 24
      Hinweis: Dieses Protokoll in einem späteren Schritt verwendet HindIII und BamHI-Restriktionsenzymen für die Clonierung. Überprüfen Sie, ob die PCR - amplifizierte Sequenz wie von der UCSC In-silico - PCR - Tool vorhergesagt wird AAGCTT oder GGATCC Restriktionsstellen (zB http://nc2.neb.com/NEBcutter2/) enthalten.
    4. Erhalten Sie die erforderlichen Primer von einem kommerziellen Anbieter.
  2. PCR - Amplifikation von Enhancer - Sequenz aus genomischer DNA
    1. Reinige template genomische DNA aus primären Zellen (zB primäre embryonale Fibroblasten). Verwenden Sie im Handel erhältlichen Kits für gDNA Isolation und folgen Sie den Anweisungen des Herstellers.
      HINWEIS: Die hohe Qualität der gDNA ist von wesentlicher Bedeutung für eine erfolgreiche PCR-Amplifikation. Geeignete BAC-Klone können verwendet werden, wenn die PCR nicht leicht von gDNA ist.
    2. Bereiten Sie 50 ul PCR - Reaktion , die 100 ng gDNA, 5 ul 10x - Puffer, 3 ul MgSO 4 (25 mM), 5 ul dNTP (jeweils 2 mM), 1,5 ul Fwd Primer (10 & mgr; M), 1,5 ul Rev - Primer (10 uM) , 1 & mgr; l DNA-Polymerase
    3. Stellen Sie die PCR-Zyklus (2 min 95 ° C (20 sec 95 ° C, 10 sec 58 bis 65 ° C, 18 sec 70 ° C) Wiederholungs x25, 2 min 70 ° C, für immer 4 ° C). Eingestellt Glühtemperatur mit der Betrachtung des Primers des vorhergesagten Tm-Werten.
    4. Man reinige das PCR-Produkt mit einem handelsüblichen PCR Purification Kit und folgen den Anweisungen des Herstellers.
    5. Einführung der Restriktionsstellen für die Klonierung durch die PCR mit Primern , Wiederholen , wie oben verwendet, aber das Hinzufügen Auskragungen an ihren 5' - Enden (zB Fwd: 5'-AAGCTT ATAT xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx-3 '(HindIII), Rev: 5'-TATA GGATCC xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx -3 '(BamHI)).
    6. Versuch 5 & mgr; l des PCR-Produkts auf einem Agarosegel für unspezifische PCR-Produkte zu überprüfen.
      HINWEIS: Wenn mehrere Bänder festgestellt werden, das gesamte PCR-Produkt führen und das entsprechende Band durch ein kommerzielles Gel-Extraktions-Kits reinigen.
    7. Beschränkung
      HINWEIS: Für die Klonierung Insert stromaufwärts von TK - Promotor 22 das gereinigte PCR - Produkt und der Vektor (zB TK-Luc) sollten mit HindIII und BamHI verdaut werden.
      1. Vorbereiten eines 50 & mgr; l Reaktionsgemisch, enthaltend 1 & mgr; g gereinigtes PCR Produkt, 1 ul HindIII (20 U / ul), 1 ul BamHI (20 U / ul) und 5 ul 10x-Puffer.
      2. Bereiten Sie eine 250 & mgr; l Reaktionsgemisch, das 5 ug Vektor (TK Luc oder alternative Reportervektor), 5 ul HindIII (20 U / ul), 5 ul BamHI (20 U / ul), 5 ul thermisch empfindlichen alkalische Phosphatase (1 U / ul) und 25 ul 10x-Puffer.
        HINWEIS: AP Behandlung des Vektors stark verringert die Selbstligation von Einzel verdauten Vektor und damit den Hintergrund.
      3. Inkubieren der Reaktionsgemische für 4 h bei 37 ° C, dann die verdauten PCR-Produkte zu reinigen und um den Vektor mit einem handelsüblichen PCR-Reinigungskits.
    8. Ligation
      1. Stellen Sie die Reaktion für die Ligation in PCR-Röhrchen mit 2 ul 10x T4-DNA-Ligase-Puffer, 10 ng TK-Luc Vektor, 50 ng Einsatz (verdaute PCR-Produkt), 1 ul T4-DNA-Ligase (400 U / ul) und Nuklease-freies Wasser bis zu 20 & mgr; l.
        HINWEIS: Bereiten Sie eine negative Kontrolle, wo die Reaktion nicht Insert enthält.
      2. Vorsichtig mischen, die Reaktion durch Auf- und Abpipettieren, Spin-down kurz die PCR-Röhrchen Mini-Zentrifuge und dann bei RT inkubieren 10 min.
      3. Hitze inaktiviert bei 65 ° C für 10 min , dann auf Eis kühlen und zu verwenden , 5 & mgr; l des Produkts zur Umwandlung in 50 & mgr; l kompetente Zellen (beispielsweise DH5 & agr;).
      4. Verwenden Sie Standard-Hitzeschockverfahren Bakterien verwandeln, Kolonien aufzunehmen und Plasmid-DNA mit einem kommerziellen Kit isolieren. Überprüfen Sie alle Konstrukte durch auf die nächsten Schritte vor der Sequenzierung.
    9. Transfektion von ES - Zellen
      1. Verwenden Sie 48-Well-Platten. In 200 ul 0,1% Gelatine solutIonen / well 30 min vor der Zell plating.
      2. Platte embryonale Stammzellen (ES-Zellen) am Tag vor der Transfektion. Verwenden Sie Feeder-freie ES - Zellen und die Platte in einer Dichte von 3 × 10 4 Zellen pro Vertiefung in 250 & mgr; l ES Medien / Vertiefung.
      3. Bereiten Sie die Plasmid - Mischungen (jede Mischung wird für 8 Vertiefungen berechnet, 4 unbehandeltem und 4 Retinsäure-behandelten) mischen . 1: 1250 ng TK-Luc Leer (Negativkontrolle), 950 ng β-Galactosidase kodierenden Vektor (& beta; Gal), Mix 2 : TK-Luc HOXA1 Enhancer (positive Kontrolle) 1250 ng, 950 ng & bgr; Gal, Mix 3: 1,250 ng TK-Luc PRMT8 Enhancer (Region of Interest), 950 ng & bgr; Gal.
        HINWEIS: ES-Zellen exprimieren die gewünschten Transkriptionsfaktoren (RAR / RXR). Lassen Sie Brunnen untransfizierten Grundwerte zu bestimmen später während der Luciferase und β-Galactosidase-Messungen.
      4. In der Transfektion Qualität reduziert Serum Medien zu jedem Plasmid mischen bis zu 106 & mgr; l Gesamtvolumen (ausreichend für 8 Vertiefungen).
      5. In 4,5 ul ES Qualität transfizierbarenIonen-Reagenz dann durch Pipettieren 15-mal nach oben und unten vorsichtig mischen. Inkubieren Das Transfektionsgemisch für 10 min bei RT.
      6. In 13 ul des Transfektionsgemisch zu den Zellen pro Vertiefung, gründlich mischen durch Pipettieren. Legen Sie die Zellen wieder in den Inkubator (37 ° C) O / N vor Ligand Behandlung.
      7. Entfernen Sie das Medium vorsichtig durch Absaugen von Zellen und 250 & mgr; l frisches Medium / Well, enthaltend 0,01 bis 1 & mgr; M all-trans-Retinsäure (RA) als endgültige Konzentration oder DMSO als Vehikel. Inkubieren Zellen für 24 bis 48 Stunden.
        HINWEIS: Retinsäure ist lichtempfindlich.
    10. Herstellung von Zelllysaten
      1. Verdünnte 5x Lysis Buffer (1,25 ml 0,5 M Tris pH = 7,8, 1 ml 1 M Dithiothreitol (DTT) (in H 2 O), 10 ml 0,1 M EDTA pH = 8,0, 50 ml Glycerin, 5 ml Triton X-100, sterile Wasser bis zu 100 ml) sterilem Wasser auf 1x, fügen Sie 20 ul 1 M DTT / 10 ml und äquilibrieren vor dem Gebrauch auf RT. Herstellung von 10 ml für eine 48-Well-Platte an dem Tag des Assays. Entfernen Sie das Medium vorsichtig durch Absaugen von Zellen. Spülen Sie die Zellen einmal mit 1x PBS. In 200 ul 1x Lysepuffer / Vertiefung direkt zu den Zellen.
      2. Schütteln für 2 h bei RT (chemische Lyse). Gefriert die Zelllysate auf der Platte bei -80 ° C (mechanische Lyse). Lysate kann für mehrere Tage bei -80 ° C gelagert werden.
      3. Tauen der Lysate. Nach dem vollständigen Auftauen übertragen Zelllysate auf eine 96-Well-Platte, eine elektronische Multikanal-Pipette. Transfer 80 ul des Zelllysats auf 96-Well-Platte klar für β-Galactosidase-Test und 40 & mgr; l des Zelllysats auf einer weißen Platte für Luciferase-Messung. Vermeiden Sie Blasen bilden.
    11. β-Galaktosidase - Assay
      HINWEIS: Beta-Galactosidase oder alternativen zweiten Reporter sollten als interne Kontrolle zur Berücksichtigung von nicht-spezifischen experimentellen Variationen verwendet werden.
      1. Bereiten β-Galactosidase - Substrat - Puffer: 80,0 g Na 2 HPO 4 • 7H 2 O,3,8 g NaH 2 PO 4 • H 2 O, 30,0 g KCl, 1,0 g MgSO 4 • 7H 2 O, bis zu 1.000 ml mit sterilem Wasser zu machen. PH-Einstellung auf 7,4. Filter zu sterilisieren (0,2 Mikron) und lagern bei 4 ° C
      2. Mix 1 ml β-Galactosidase-Substrat-Puffer mit 4 mg ONPG (o-Nitrophenyl-β-D-Galactosidase). Fügen 3,5 ul 2-Mercaptoethanol (& bgr; ME) pro 1 ml des Puffers unmittelbar vor der Verwendung. Füge 100 & mgr; l β-Galactosidase-Substrat-Puffer zu 80 & mgr; l Zelllysat.
      3. Inkubieren Sie die Reaktionen bei 37 ° C, bis eine schwach gelbe Farbe entwickelt hat. Lesen Sie die Absorption bei OD 420 nm auf einem Plattenleser und Export von Daten.
        HINWEIS: Die Zeit hängt von der Transfektionseffizienz abhängig, in der Regel nicht länger als 30 min.
    12. Luziferase Assay
      1. Bereiten Sie 50 ml Luciferinsubstrat Reagenz: 15,1 mg D-Luciferin Salz, 82,7 mg ATP Salz, 185 mg MgSO 4 • 7H 2 O, in den 50 ml Polypropylen - Röhrchen,dann 1,5 ml 1 M HEPES-Puffer hinzufügen, 48,5 ml ATP freies Wasser, Wirbel, stellen Sie sicher, dass alle Verbindungen vollständig auflösen. Halten von 5 bis 10 ml Aliquots bei -80 ° C.
      2. Warm 5 ml Luciferinsubstrat Reagenz auf RT vor dem Start. Je 100 & mgr; l Substratreagenz in jede Vertiefung der weißen Platte, die 40 & mgr; l des Zelllysats enthält, und messen Sie das Signal sofort eine Leucht Zähler Maschine.
      3. Erhalten Aktivitäten von mindestens drei unabhängigen Experimenten in dreifacher Ausführung Transfektionen.
      4. Berechnen Sie zuerst die Basis normalisierte Luciferase-Aktivität und die Basis normalisiert β-Galactosidase-Werte für jeden gut durch die Mittelwerte subtrahiert von jedem gemessenen Wert für nicht-transfizierten Zellen gemessen. Dann wird das Verhältnis der Luciferase / β-Galaktosidase-Aktivität.

    3. Charakterisierung von RNA-Vergrößerer

    HINWEIS: Ein direkter Indikator für die Enhancer-Aktivität hat aus den jüngsten Genom-w entstandenide Studien , die viele kurze nicht-kodierenden RNAs, in einer Größe von 50 bis 2.000 nt identifiziert, die von Enhancern transkribiert werden, und Enhancer RNAs bezeichnet (ERNAS) 16,25,26 (Figur 4). erná Induktion korreliert stark mit der Induktion von benachbarten Exon-codierenden Genen. Somit signalabhängige Enhancer - Aktivität kann durch den Vergleich Erna Produktion zwischen verschiedenen Bedingungen durch RT-qPCR in vivo quantifiziert werden.

    1. Richtlinien für die Primer - Design für Erna Nachweis von RT-qPCR
      1. Wählen Sie genomischen Regionen für Erna Messungen, die mindestens 1,5 sind - 2 kb weg von kommentierten Transkriptionsstartstellen.
        HINWEIS:, ein hohes Maß an mRNA Transkription über intragenischen Enhancer verhindern genaue Quantifizierung von Erna im Sinne Orientierung, Antisense-Ernas bei intragenischen Enhancer sind nachweisbar und sind ähnlich in der Ebene zu Ernas bei extragenischen Enhancer ist wichtig.
      2. In der Regel verwenden Regionen 200 - 1000 bp from die Mitte der Transkriptionsfaktor Stelle von Interesse für Primerdesign entweder auf dem Sense- oder Antisense - Strang (Abbildung 4 und Abbildung 6) -Bindung.
        HINWEIS: Wenn GRO-seq, DNase-seq, H3K4me1, H3K4me3 oder H3K27ac ChIP-seq Daten verfügbar sind, von den gewünschten Zelltypen und Bedingungen kann es für eine genauere Primer-Design verwendet werden. Ernas werden aus vermeintlichen Enhancer-Regionen durch ein hohes Maß an H3K4me1 und me3 gekennzeichnet transkribiert. Die Expression von Ernas korreliert positiv mit der Anreicherung von aktivierten Enhancer Histon-Marke H3K27ac.
      3. Design von PCR - Primern für fluoreszierende Farbstoffbasis RT-qPCR Messung ERNAS durch Primer3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3/) 23 anti-sense - Sequenz Generieren (reverse Komplement der Sense - Strang) für Primerdesign gemäß: http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html. Einfügen 200-300 bp der Sense- oder Antisense-Sequenz für Primer-Design.
    2. Die Messung der ERNA Transcription
    3. Isolieren der Gesamt-RNA aus behandelten Zellen mit handelsüblichen sauren Phenol / Chloroform-Extraktion basierende Reagenz nach den Empfehlungen des Herstellers.
    4. Verwenden Sie DNaseI isolierte RNA behandeln, bevor diese in reverse Transkriptionsreaktion verwendet wird. Inactivate DNase gemäß den Empfehlungen des Herstellers vor reversen Transkription.
    5. Messen Sie RNA-Konzentration nach DNase I Behandlung und Verwendung 1000 ng pro RT-Reaktion. Verwenden Sie hochwertige Reverse-Transkriptase.
      HINWEIS: Wie große Anzahl von ERNAS nicht polyadenyliert werden kann, die reverse Transkription der Verwendung von Zufallsprimern erfordert.
    6. Detect Reverse Erna von RT-qPCR unter Verwendung von Standardverfahren transkribiert. Messen Sie eine nicht-behandlungsabhängige mRNA für die Normierung (zB 36B4, PPIA, GAPDH, actb).

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Representative Results

Wir haben eine pan-spezifischen Antikörper RXR um Gene Rezeptor genomweite, welche RA-geregelt zu identifizieren Anreicherung in ihrer Nähe. Bioinformatik - Analyse von RXR ChIP-seq Daten aus ES - Zellen mit Retinsäure behandelt erhalten zeigten die Anreicherung des Kernrezeptor - Halbstelle (AGGTCA) unter der RXR Stellen besetzt (Abbildung 1). Mit Hilfe eines bioinformatischen Algorithmus abgebildet wir das Motiv Suchergebnisse der Hälfte Website zu den RXR ChIP-seq Daten (Abbildung 2) zurück. Diese Analyse hat uns geholfen, genau jene ChIP Spitzen zu identifizieren, die mit kanonischen Kernrezeptorbindungsstellen überlappen wurden. Visualisierung dieser Sites in IGV angegeben Anreicherung dieser Transkriptionsfaktoren in der Nähe von HOXA1, einem zuvor charakterisierten RAR / RXR Ziel (Abbildung 2 und Abbildung 3). Wir haben auch eine neue RA Zielgen identifiziert, nämlich PRMT8 27. Dieses latter Region enthält eine direkte Wiederholung ohne Spacer Nukleotide zwischen den beiden Halbseiten (AGGTCAAGGTCA) (Abbildung 3). Um funktionell zu validieren, dass das Element für HOXA1 identifiziert wurden, können in der Tat RAR / RXR binden und reguliert durch RA wir TK-Luciferase-Reportervektoren konstruiert, die ~ 300 bp genomischen Region enthalten sind, einschließlich der identifizierten Elemente. Wir Vektoren auch ohne das Antwortelement ausgebildet (Figur 5). ES - Zellen wurden transfiziert , und die Luciferase - Aktivität wurde in der Abwesenheit und Anwesenheit von Retinsäure (5) gemessen. Konstruiert den Retinsäure-Response-Element enthält (RARE) zeigten erhöhte Luciferase-Signalintensität bei RA-Behandlung, während das Konstrukt ohne RARE war nicht induzierbare.

Wir untersuchten auch die Retinsäure-abhängige Aktivität des HOXA1 Enhancer. wenn das Sense- und Antisense-erná Expression des HOXA1 RAR / RXR gebundene Enhancer c zu ermitteln,orrelate mit der mRNA Expression des Gens, wir gemessen auch das Niveau der HOXA1 mRNA (Abbildung 6). Diese Ergebnisse bestätigten, dass die Enhancer-Aktivität induziert durch kurzfristige RA Behandlung (3 h), wodurch bestätigt wird, dass der Verstärker wahrscheinlich in RA-abhängigen Enhancer-Regulation beteiligt ist.

Abbildung 1
Abbildung 1. Homer D e Novo Motiv Ergebnisse. Ein Ausgang HTML (homerResults.html) erzeugt durch Homer für das Beispiel RXR ChIP-seq dargestellt ist. Sequence Logos entsprechend angereichert Transkriptionsfaktor Motive durch de novo - Motiv Entdeckung an RXR gebundene Loci identifiziert nach oben. 7463 RXR besetzt genomischen Regionen für die Motivsuche verwendet wurden. 77,66% dieser Regionen enthält AGGTCA-ähnlichen Motiv (Platz als # 1). Eine detaillierte Beschreibung finden Sie unter: (http://homer.salk.edu/ho mer / Motiv /) Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. Finding Genomische Regionen mit einem Gehalt Motiv von Interesse. Die Visualisierung der ausgerichteten RXR ChIP-seq liest (mm_ES_RXR_24h_ATRA.bam und die AGGTCA Motiv Vorkommen (mm_ES_RXR_24h_ATRA_homerpeaks_motif1_mm10s_200_remaped_mbed.bed) durch Integrative Genomics Viewer (IGV). Alignments werden durch Lese Strang gefärbt (liest auf + Strang: rot, - Strang. blau) verwendet Genom für die Ausrichtung: mm10. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 3. Loci von HOXA1 und PRMT8 Enhancers. IGV Schnappschuss von RXR ChIP-Seq - Signale , die aus unbehandelten und RA-behandelten (24 h, 1 & mgr; M) embryonale Stammzellen 27 gezeigt. Identifizierte Bindungssequenzen sind rot gefärbt. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
. 2 kb entfernt relativ zur Transkriptionsstartstelle (TSS) des nächstgelegenen Gens - Abbildung 4. Experimentelles Design für die Prüfung von ERNA - kodierenden Sequenzen Enhancers für Enhancer - RNA (ERNA) Messung ausgewählt wird, sollte mindestens 1,5 liegen. ChIP-seq Daten des Transkriptionsfaktors (TF) von Interesse und dem Motiv Analyse kann verwendet werden, direkten Bindungsstellen genomweiten zu identifizieren. Als Bindung von TRANSCRIPtionalen coactivator häufig (zB P300) distale Enhancer markiert, beide angereicherte Regionen für den TF und P300 sind gute Enhancer Kandidaten. Die Expression von Ernas positiv mit der Anreicherung von aktivierten Enhancer Histon-Marke H3K27ac korrelieren. Regionen 200 -. 1000 bp entfernt in Sense- oder Antisense - Richtung von der Mitte des Transkriptionsfaktors Bindung von Erna Primerdesign wird empfohlen Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5
Abbildung 5. Luziferase - Aktivität des Indicated Reporterkonstrukten in ES - Zellen. Angegeben genomischen Regionen des HOXA1 Enhancer wurden in TK-Luc-Vektor kloniert und in embryonale Stammzellen transfiziert. Konstruieren 1 und 2 enthalten die Retinsäure-Response-Element (RARE, underlined Sequenz). Die Zellen wurden mit RA (24 h, 1 & mgr; M) behandelt. & bgr; Gal wurde als interne Kontrolle für die Normalisierung eingesetzt. Die Balken stellen Mittel normalisierte Werte von vier biologischen Replikaten. ± sd *** P <0,005 Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 6
Abbildung 6. Retinsäure Induced Enhancer RNA - Transkription. HOXA1 mRNA und Erna Ebenen , wie durch RT-qPCR gemessen. Gesamt-RNA wurde aus ES-Zellen für 3 Stunden mit Retinsäure (RA) oder DMSO als Vehikel (veh) behandelt isoliert. Vorwärts-Primer für die Sense- und Antisense-erná Nachweis und der PCR-Amplicons gezeigt. Die Entfernung von Regionen von Erna RT-qPCR vom Zentrum der RXR-Bindungsstelle erkannt wird angezeigt. Werte wurden mit dem Durchschnitt 36B4 mR normalisiertN / A. Die Daten stellen den Mittelwert ± SEM *** P <0,005 Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
KOD DNA polymerase Merck Millipore 71085-3 for PCR amplification of enhancer from gDNA
DNeasy Blood & Tissue kit  Qiagen 69504 for genomic DNA isolation
QIAquick PCR Purification kit Qiagen 28106 for PCR product purification
Gel extraction kit  Qiagen 28706 for gel extraction if there are more PCR product
HindIII NEB R3104L restriction enzyme
BamHI NEB R3136L restriction enzyme
FastAP Thermo Scientific EF0651 release of 5'- and 3'-phosphate groups from DNA
T4 DNA ligase NEB M0202 for ligation
QIAprep Spin Miniprep kit Qiagen 27106 for plasmid isolation
DMEM Gibco 31966-021 ES media
FBS Hyclone SH30070.03 ES media
MEM Non-Essential Amino Acid Sigma M7145 ES media
Penicillin-Streptomycin Sigma P4333 ES media
Beta Mercaptoethanol Sigma M6250 ES media
FuGENE HD  Promega E2311 transfection reagent
Opti-MEM® I Reduced Serum Medium Life Technologies 31985-062 for transfection
All-trans retinoic acid Sigma R2625 ligand, for activation of RAR/RXR
96-well clear plate Greiner 655101 for Beta galactosidase assay
96-well white plate Greiner 655075 for Luciferase assay
D-luciferin, potassium salt Goldbio.com 115144-35-9 for Luciferase assay
ATP salt Sigma A7699-1G for Luciferase assay
MgSO4•7H2O Sigma 230391-25G for Luciferase assay
HEPES Sigma H3375-25G for Luciferase assay
Na2HPO4 •7H2O Sigma 431478-50G for Beta galactosidase assay
NaH2PO4 •H2O Sigma S9638-25G for Beta galactosidase assay
MgSO4•7H2O Sigma 230391-25G for Beta galactosidase assay
KCl Sigma P9541-500G for Beta galactosidase assay
ONPG (o-nitrophenyl-β-D-galactosidase) Sigma N1127-1G for Beta galactosidase assay
TRIzol® Life Technologies 15596-026 RNA isolation
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Life Technologies 4368814 reverse transcription of eRNA
Rnase-free Dnase Promega M6101 Dnase treatment
SsoFast Eva Green BioRad 750000105 RT-qPCR mastermix
CFX384 Touch™ Real-Time PCR Detection System BioRad qPCR machine
BioTek Synergy 4 microplate reader BioTek luminescent counter

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References

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