在新鲜分离的人代绒毛滋养细胞转染和EMSA分析

Genetics

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Summary

这个协议描述了使用微孔化有效转染的siRNA在新鲜分离的人绒毛细胞滋养细胞和鉴定在这些细胞中DNA的蛋白质复合物的方法。转染的细胞可以通过Western印迹进行监测,并在为期4天的培养时间,EMSA分析。

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Lokossou, A. G., Toufaily, C., Vargas, A., Barbeau, B. siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts. J. Vis. Exp. (115), e53995, doi:10.3791/53995 (2016).

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Abstract

Protocol

该UQAM伦理委员会已经批准了这些协议,这是按照大学中心医院,蒙特利尔的圣 - 吕克医院(蒙特利尔,加拿大)的伦理委员会的指导方针。与会者签署了知情同意书。

1.介质制备工艺和主代绒毛滋养细胞的分离

  1. 通过补充的Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(DMEM)用25mM HEPES,10%胎牛血清(FBS)和1%青霉素/链霉素制备用于人原绒毛细胞滋养细胞的培养基。过滤通过无菌0.22微米的过滤器,并存储所制备的介质在-20℃在50毫升分装℃冰箱。
  2. 隔离从新鲜胎盘以下标准协议3个主要代绒毛滋养细胞。
    1. 用钳子,轻轻挠它关闭删除该组织胎膜,同时小心不要去除绒毛组织。切在使用手术刀和剪刀约3×3厘米的立方体剩余的胎盘绒毛。彻底含0.9%的NaCl除去母体血液清水洗净。
      1. 持用钳子每个立方体,小心翼翼地从剩下的血管和纤维组织用剪刀去除绒毛组织。
      2. 为15至30毫克的绒毛组织,消化四倍的Hank氏平衡盐溶液(HBSS)包含胰蛋白酶(从9.6×10 5〜1.8×10 6 U;终浓度为1.2mg / ml)和脱氧核糖核酸酶I(DNA酶I)(最终浓度200微克/毫升),用于在连续摇动的水浴在37℃下30分钟。
        注意:使用150毫升总体积为第一消化,将100ml用于第二消化和75ml对剩下的两个消化。
    2. 收集含有分散细胞,离心上清在1250 XG为不带刹车15分钟。在1毫升预热DMEM含有去除上清和悬浮细胞1%青霉素/链霉素。
    3. 层上的不连续的5%的顶部的分散的细胞- 70%聚乙烯吡咯烷酮包覆二氧化硅梯度(见梯度制备表1)和离心机在507 xg离心23分钟,不制动。通过抽吸除去1.017之间的密度层以1.033和收集40%和50%之间的各层中使用新的吸管的梯度。用10ml预热的DMEM含有1%青霉素/链霉素洗涤细胞广泛。
      注意:将收集的馏分对应密度1.048 1.062和,其中港口之间的滋养层。
    4. 算使用血球细胞。简单地说,混合细胞,并在新的离心管中加入10微升。加10μl台盼蓝并轻轻地再次混合。绘制出细胞悬液,并填补了血细胞计数室。算下10X目标细胞。
    5. 放置1×10 6和4.5×10 6细胞到用于分离的试管中的部分1.3和2中,各自LY。种子的剩余的细胞以1.5×10 6个细胞/孔在补充的DMEM培养基和培养物的密度在37℃和5%CO 2的最多4天的其它实验。
  3. 孤立的主要代绒毛滋养细胞的纯度评价
    1. 自旋为1×10的离心管在300×克新鲜分离的细胞滋养细胞的6。弃上清,加入1ml预热的磷酸盐缓冲盐水(PBS)的。离心机的细胞在300 XG,并通过抽吸去除PBS。
    2. 1毫升冷甲醇添加到细胞中并在-20℃下孵育20分钟。离心细胞,在300×g离心5分钟,并通过抽吸除去甲醇。
      注意:使用面膜罐,护目镜和橡胶手套在处理甲醇。
    3. 加入1毫升的PBS在室温下再水合的细胞,离心分离,在300 xg离心并通过抽吸除去PBS中。
    4. 孵育含有FBS(1:50 [体积/体积]稀释)和一个的FcR的细胞在PBS中在室温下阻断45分钟试剂(1:10),以消除非特异性结合。
    5. 用500μl室温的PBS,离心细胞洗两次,在300×g离心5分钟,并通过抽吸除去PBS中。悬浮细胞在100μl室温PBS中。
    6. 孵育细胞与小鼠单克隆异硫氰酸荧光素(FITC)缀合的抗人细胞角蛋白-7抗体克隆LP5K(1:200)或在PBS中的对照同种型匹配的非特异性抗体含有0.2%BSA的45分钟,在室温下黑暗。洗涤细胞在PBS中。
    7. 通过流式细胞术3分析细胞。使用细胞制剂,其通过流式细胞术进一步的实验表明最低96%的CK-7阳性细胞。

2.人力小学代绒毛滋养细胞的转染

  1. 使用微孔设备的人原代绒毛滋养细胞的转染
    1. 制备含有6孔板2ml中微穿孔细胞的培养补充的DMEM培养基中。
    2. 主细胞滋养细胞(见1.2节)的分离后,取细胞的等分试样中的悬浮液,并使用血细胞计数器确定细胞数。
    3. 在300 XG转移1.5×10 6细胞到微量离心管中并离心沉淀细胞,在室温下5分钟。清洗细胞用1ml的Dulbecco PBS(DPBS)(Mg 2+离子 ,无Ca 2+)中并在300 xg离心离心沉淀细胞,在室温下5分钟。
    4. 除去上清液并轻轻重悬细胞于100μl重悬浮缓冲液中。
      注意:避免保持细胞悬浮液,在室温下超过15-30分钟,以最大限度地提高细胞生存力和转染效率。
    5. 加合胞素-2的siRNA(或控制加扰的siRNA)的300毫微克至1.5 ml离心管,并用100微升转染吸管吸出细胞的siRNA混合物。插吸管入站(见材料清单)和邮件主题单元为30毫秒的1300 V单脉冲。
    6. 立即将细胞转移到含有预热的37℃补充的培养基,以避免细胞损伤的6孔板(在步骤2.1.1的方法制备)。
    7. 重复步骤其余样品2.1.5和2.1.6。
    8. 轻轻摇动平板30秒,以确保即使在细胞的分布。孵育在37℃的板在加湿 CO 2培养箱中培养24至48小时。刷新培养基在转染后24小时。
    9. 通过评估Western blot分析转染效率(参见步骤3到6)。
  2. 在人类细胞滋养细胞主要的siRNA脂质体
    1. 绒毛细胞滋养细胞的分离后,种子的细胞以在2ml培养基中每孔1.5×10 6个细胞在6孔板的密度,孵育18小时。
    2. 稀释合胞-2特异性siRNA的300纳克(或控制加扰RNA干扰)和5μl基于脂质的转染试剂的单独1.5毫升管中的10微升抗生素和无血清培养基的总体积。孵育5分钟。
    3. 混合经稀释的试剂,并在室温下孵育另外的20分钟,以形成转染复合物。添加90微升抗生素和无血清培养基的到混合至100μl的终体积。
    4. 从6孔板(步骤2.2.1)除去培养基。加入2毫升的新鲜培养基中,并在100微升转染混合物到每个孔中。孵育在37℃下将细胞在CO 2培养箱中24至48小时。刷新培养基在转染后24小时。
    5. 通过评估Western blot分析转染效率(参见步骤3到6)。

从全细胞裂解液培养3.制备

  1. 取出介质和冲洗每口井(从步骤2.1.8和2.2.4)采用预热DPBS(镁离子 ,钙离子免费)。吸出DPBS,加入500微升的0.25%胰蛋白酶/乙二胺四乙酸(EDTA)。在CO 2培养箱中孵育1-3分钟,在37℃。通过加入500微升含血清的生长培养基的停止胰蛋白酶处理。
    注:按瓶/皿的类型使用适当的介质卷:1毫升,每107 细胞/ 100mm皿/ 150 平方厘米瓶; 0.5毫升每5×10 6个细胞/ 60mm培养皿/ 75cm 2的烧瓶中。
  2. 转移细胞到1.5ml微量离心管中,沉淀细胞,在300×g离心在室温下2分钟离心。离心300 xg离心清洗细胞用DPBS(镁离子 ,无Ca 2+)和沉淀的细胞在室温下2分钟。
  3. 小心取出上清液,而不会干扰颗粒。放置在冰上的管中。重悬沉淀50-200微升冰冷无线电免疫沉淀测定(RIPA)缓冲液( 见表2缓冲组合物)含有新鲜添加编蛋白酶和磷酸酶抑制剂在1倍终浓度。简单地说,涡管,在冰上留下30分钟。
  4. 离心16,000 XG 20分钟,在4℃。小心地将管冰上。使用移液管,将上清液转移到新鲜的预冷却的离心管保持在冰上。弃沉淀。

从培养细胞的核提取物的制备4

  1. 每口井(步骤1.2.5),洗细胞滋养细胞两次用1毫升预热DPBS(镁离子 ,钙离子免费)的。吸DPBS,加入500微升0.25%胰蛋白酶/ EDTA的。在CO 2培养箱中孵育1-3分钟,在37℃,并通过加入500微升含血清的生长培养基的停止胰蛋白酶处理。
  2. 转移细胞到1.5ml微量离心管中,沉淀细胞,在300×g离心在室温下2分钟离心。通过离心洗细胞用DPBS(镁离子 ,无Ca 2+)和颗粒细胞在300×g离心在室温下2分钟。仔细清除所有上清而不破坏颗粒,然后将管冰上。
  3. 根据制造商的说明提取核蛋白。确定使用蛋白定量测定(布拉德福德或双金鸡宁酸测定法(BCA))各样品的蛋白质浓度。

5.样品制备和电泳

  1. 确定用于使用蛋白质定量测定各细胞提取物中的蛋白质浓度(例如,布拉德福德8或BCA 9)。
  2. 根据制造商的说明(如果抗体可在还原和变性条件下使用),2×Laemmli样品缓冲液( 表2)的等体积的增加总蛋白的20-30微克。
  3. 煮沸细胞溶胞产物在100℃下5分钟。等分试样50-100微升裂解物,以避免重复的冷冻/解冻循环和剩余的管储存于-20℃以备将来使用的。 而将样品加热,制备1升1倍的运行缓冲液( 表2)。
  4. 旋转样品以16,000 xg离心几秒钟,将它们放置在冰上。
  5. 加载蛋白质的等量成12%的SDS-PAGE凝胶上( 见表2为凝胶组合物)的各孔中,用分子量标记一起。在100 V.运行1凝胶2小时

6.从凝胶转移的蛋白质的膜

  1. 激活用甲醇聚偏二氟乙烯(PVDF)膜1分钟,并用1×转移缓冲液/ 10%甲醇溶液冲洗。根据制造商的说明,进行30分钟依赖于蛋白质大小转移至1小时。
    注意:转印效率可使用丽春红染色的封闭步骤之前进行评估。

7.抗体染色

  1. 在室温下1小时或过夜,在4℃下,用5%封闭溶液阻断膜。
  2. 6或用抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH; 0.4微克/毫升; 1:500),在5%封闭溶液过夜:用抗合胞素-2抗体(5000 1 4微克/毫升)孵育膜4℃(抗合胞-2)或在室温下45分钟。三次洗膜在Tris缓冲盐水吐温(TBST; 见表2缓冲组合物)5分钟。
  3. 孵育适当辣根过氧化物酶(HRP)的膜缀合的抗兔或抗小鼠抗体(1:10,000),在5%在室温下1小时阻断在TBST缓冲液中。洗膜在TBST中3次5分钟,然后在TBS中漂洗。检测使用基于化学发光印迹底信号。

8.单链寡核苷酸的放射性标记

  1. 磷酸化反应
    1. 在微量离心管中,加入50毫微克的正向寡核苷酸一起用1×T4多核苷酸激酶缓冲液,1UT4多核苷酸激酶和20微居里(γ-32 P)ATP和弥补无核酸酶的水反应体积为20微升。
    2. 孵育在37℃下30分钟。停止加入5微升的0.5M EDTA的反应。补足体积至50μl无核酸酶的水。
  2. 由寡核苷酸未掺入的核苷酸的去除
    1. 制备具有下列制造商的说明TE缓冲液( 表2)平衡过的G-25柱。放置在一个新鲜的无DNase的1.5 ml离心管色谱柱。
    2. 慢慢加入探针(从步骤8.1.2)的50微升过树脂,小心不要去打扰树脂床。自旋2分钟,在350 xg离心收集在1.5 ml离心管中纯化的样品。在350 xg离心洗用36微升不含核酸酶的水和自旋的G-25柱2分钟以收集它在离心管中。
  3. 杂交用互补链醇igonucleotide
    1. 放射性标记的探针(86微升)转移到1.5ml微量离心管中,并添加反向寡核苷酸的200毫微克与退火缓冲液的1倍( 见表2)。热,在95℃5分钟并在室温下留下过夜冷却。
    2. 通过向前加入50毫微克的未标记的制备非放射性的双链寡核苷酸和反向寡核苷酸以及退火缓冲液1×在1.5ml微量离心管中。补足体积至100μl无核酸酶的水。热火并保持在室温下按步骤8.3.1所述。

9.准备一个非变性聚丙烯酰胺凝胶的EMSA

  1. 用1.5毫米的空间梳( 见表2为凝胶组合物)制备的4%非变性凝胶(10×12厘米)。清洁用蒸馏水所有玻璃板。
    注意:这是至关重要的板完全不含离子洗涤剂,如SDS。
  2. 马上p我们在板之间的丙烯酰胺溶液允许聚合进行(约30分钟)。
  3. 组装电泳装置和填充0.5X TBE坦克。在150V样品装载之前预先进行30分钟的凝胶到1小时。

10. DNA结合反应

  1. 在1.5ml微量离心管中,在1×凝胶移位结合缓冲液( 表2)中添加核提取(步骤4.3)的10微克和补足终体积为10微升用无核酸酶水。作为对照,准备一管有没有核提取物。对于竞争反应,加1μL冷非特异性或双链寡核苷酸(步骤8.3.2)的。
  2. 从步骤8.3.1到每个反应加入1μl放射性探头。在室温下孵育20分钟进行反应。加入1μl的10倍的凝胶上样缓冲液的每反应和加载部分9中制备的凝胶上的每个样品。
  3. 在15运行1 1/2凝胶至2小时0 V迁移后,包装在塑料包装和定位胶和玻璃下面荧光屏曝光磁带。在4℃离开盒24小时。
  4. 从曝光纸盒中取出屏幕,并在扫描荧光成像装置插入。

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Representative Results

从足月妊娠胎盘新鲜用于分离人主要代绒毛滋养细胞进行的一组中的协议部分提供实验。继他们的孤立,我们首先分析细胞滋养细胞的纯度通过使用角蛋白7标记( 图1)。使用单克隆抗细胞角蛋白7的抗体的细胞制备物从而染色。 图1表示从以下主要绒毛细胞滋养细胞的纯化典型的实验中,通过标准的流式细胞仪分析的结果。以下的密度梯度步骤,> 97%的细胞(在这种情况下,99%),在标准实验阳性染色角蛋白-7,从而表明在该细胞类型的纯化程度非常高效率的。

其分离后,人原代细胞滋养层,可直接使用为TRAnsfection。两种不同的协议进行了评价, 即,微孔化和基于脂质的转染。这两个协议,用特异siRNA到合胞素-2的mRNA测试和比较,以加扰的siRNA(阴性对照)。转染效率下通过Western印迹分析进行评估。结果证实,合胞素-2的表达在细胞滋养细胞衍生的提取物在微孔化显著沉默( 图2)。另一方面,无显著沉默指出时的siRNA是由基于脂质的转染试剂进行转染。

我们还进行了新鲜分离的细胞滋养EMSA实验。将源自合胞素-2启动子区的放射性标记探针合成。合成的探针(称为WT 5'-CTCTAGGAACACCTGACTGATAAGGGAAAAATGTC-3')先前已显示结合CREB相关转录因子7。在核抽的存在下从24和48小时培养的绒毛细胞滋养细胞的行为,在合胞素-2启动子衍生的探针表现出两个DNA-蛋白质复合物的存在。 100倍冷的WT的寡核苷酸的加成争夺复合物的形成,同时用过量的冷无关寡核苷酸(小鼠神经嵴强化剂2; 5'-GATCCTGTGATTTTCGTCTTGGGTGGTCTCCCTCG-3')相似的竞争观察,证实这两个信号的特异性( 图3)。

图1
绒毛细胞滋养细胞的图1主要绒毛细胞滋养细胞通过流式细胞仪的纯度评价。新鲜分离制剂第一透,然后用同种型对照抗体(红色线)或特异性单克隆抗体标记的细胞角蛋白-7(黑线)。细胞通过流式细胞仪分析。 LES / ftp_upload / 53995 / 53995fig1large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。

图2
图2.比较基于脂质的转染和微孔之间的转染效率。将新鲜分离的细胞滋养细胞绒毛用300纳克合胞-2特异性siRNA 主场迎战使用基于脂质的试剂或微孔杂乱的对照siRNA转。 (A)Western印迹分析在细胞提取物中各转染条件下使用抗合胞-2和抗GAPDH抗体进行。 (B)中由Western印迹分析合胞素-2蛋白水平在下面与对应的GAPDH信号标准化带强度方面进行量化(误差棒被定义为SD,*** P <0.001)。5 / 53995fig2large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。

图3
图3.通过EMSA分析,鉴定DNA-蛋白质复合物。从24或48小时的培养的原绒毛滋养细胞的核提取物与对应于合胞素-2的启动子区的WT探针有或没有的特异性或非特异性过量(100倍)温育寒冷的寡核苷酸。 DNA-蛋白质复合物上的天然凝胶在迁移分离。特定信号与自由探针上的凝胶的右侧表示。在没有核提取物温育的WT探针也被用作阴性对照。 CT NE =滋养层细胞的核提取物。 请点击此处查看该图的放大版本。

珀决赛% 珀(90%)(毫升)的体积 的HBSS体积(ml)
70 2.33 0.67
65 2.17 0.83
60 2.00 1.00
55 1.83 1.17
50 1.67 1.33
45 1.50 1.50
40 1.33 1.67
35 1.17 1.83
三十 1.00 2.00
25 0.83 2.17
20 0.67 2.33
15 0.50 2.50
10 0.33 2.67
0.17 2.83

表1. 5%-70% 的聚乙烯吡咯烷酮包覆二氧化硅 梯度设置。

缓冲 组成 评论/说明
PBS 1X 0.9毫米氯化钙2,2.7毫米氯化钾,1.5mM的磷酸二氢钾 ,0.5mM的MgCl 2的,136.9毫摩尔NaCl和0.8毫 Na 2 HPO 4
RIPA缓冲液 150毫摩尔NaCl,1.0%NP-40或0.1%的Triton X-100,0.5%脱氧胆酸钠,0.1%SDS(十二烷基硫酸钠),50毫摩尔Tris-盐酸pH 8.0的
Laemmli样品缓冲液 4%SDS,10%2- mercaptoethano升,20%甘油,0.004%溴酚蓝,0.125摩尔Tris盐酸,pH值6.8
10X运行缓冲液的25mM Tris碱,190毫甘氨酸,0.1%SDS中
10X传输缓冲区 25毫米的Tris基地,192毫米甘氨酸
TBST 1X缓冲的10mM的Tris-HCl,15 mM氯化钠,0.05%吐温20在pH7 拌匀即可进行过滤。未能滤波器可导致在膜的“斑点”。
封闭液 5%牛奶或BSA(牛血清白蛋白)加入TBST 1X缓冲
TE缓冲的10mM的Tris-HCl(pH值8.0),1mM EDTA中
退火缓冲液 1 M氯化钠,的50mM的Tris-HCl pH值7.5,100mM的MgCl 2的,0,2毫摩尔EDTA,1毫摩尔DTT
5X凝胶迁移结合缓冲液 20%甘油1,5毫氯化镁 ,2.5毫摩尔EDTA,2.5毫摩尔DTT,250mM的氯化钠,50mM的Tris-盐酸(pH7.5)中和0.25mg / ml聚(DI-DC)。
装载缓冲的250mM的Tris-HCl(pH为7.5),0.2%溴酚蓝和40%甘油
TBE 5倍溶解54克Tris碱的和在1升去离子水27.5克的硼酸,其中包括20个50ml的0.5M EDTA,pH为8
4%天然凝胶 TBE 5×缓冲 6.0毫升
29:1的丙烯酰胺/双丙烯酰胺(30%重量/体积) 10毫升
40%的丙烯酰胺(重量/体积) 0.75毫升
100%的甘油 1.5毫升
蒸馏水 41.5毫升
过硫酸铵25% 250毫升
TEMED 75毫升
4%的Stac王露(6毫升)的SDS-PAGE DDH 2 O的 4.1毫升
30%的丙烯酰胺 1.0毫升
1.0米的Tris 0.75毫升
10%SDS 60微升
10%APS 60微升
TEMED 6微升
12%分离胶(10毫升)中的SDS-PAGE DDH 2 O的 3.3毫升
30%的丙烯酰胺 4.0毫升
1.5米的Tris 2.5毫升
10%SDS 100微升
10%APS 100微升
TEMED 4微升

表2.组成的缓冲区。

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Discussion

研究人类胎盘功能和发展已通过旨在优化各种胎盘细胞群的分离方案有了很大的提高。其中最好的研究的胎盘细胞群仍是代绒毛滋养细胞,其研究有很大的优化,从许可协议的高效,可靠的隔离受益。这进一步允许了若干实验,如转染和促进剂的研究。使用先前描述的方案3中 ,可以得到主绒毛细胞滋养细胞的纯群体。 CK-7是一种中间丝蛋白,其在滋养细胞中表达。针对此蛋白的单克隆抗体用于确定从胎盘10其分离之后此滋养群体的纯度。制剂是指当细胞96%是阳性,CK-7是纯的。细胞随后可被直接用于转染。转协议涉及基于脂质的方法被广泛用于核酸转移到初级细胞11,12。然而,在某些细胞中的脂质制剂的毒性成为一个缺点。微孔是用枪头作为电空间,产生最少的热量,金属离子溶解,pH值的变化和氧化形成电穿孔技术;所有这些都可以是有害的细胞。基于本文提供的数据,微孔化表示用于siRNA递送比基于脂质的转染方案更有效的方法,来判断通过Western印迹分析。使用EMSA方法,设计了针对已知结合的重要因素为其活性7中测试的合胞素-2启动子的所选择的区域的探针。探头与从孤立的滋养核提取物培养。如在图3中,获得了特定的信号。

本文H所述的不同协议AVE近年来得到了优化。但是,它们都依赖于高品质的滋养层细胞的准备工作,这取决于一定数量的关键步骤。首先,出生后,胎盘需要保持在缓冲液和细胞必须从他们被浸入该溶液中后不超过5小时进行分离。胰蛋白酶和DNA酶治疗也非常重要,应认真开展以最大限度地提高细胞滋养细胞制剂的质量。所需的其隔离时的胎盘绒毛和减少的广泛洗涤都是额外的改进,其可强烈提高细胞数隔离的效率。本协议的产量在密度梯度一步,应密切监测进一步取决于最佳离心。未能正确平衡管也将导致渐变的失真,并严重减少细胞数。

转染协议描述ð这里已经几年测试。虽然需要微孔条件通常是简单的,仍然是需要转染的各种原代细胞的优化。这也涉及转染核酸(siRNA或质粒DNA)的量的最优化。因此,对于这里描述的协议,建议各种的siRNA浓度的优化,以确定一个有效抑制的siRNA。合适的悬浮液体积与细胞的微孔化和完全悬浮前将细胞沉淀的加成是额外的因素,从而影响转染效率。

EMSA实验也必要的优化。定与胎盘供体和变化的细胞滋养细胞分离效率和纯度有关的异质性,EMSA实验需要重复最多5次,以确认结果。此外,具有高的细胞数是很重要的,以确保有足够的prote在核提取物制剂和蛋白质/ DNA复合物的后续检测的水平。此外,高放射性寡核苷酸探针应来制备,并应准备从最近购买的放射性ATP的新鲜。

一系列的限制必须在提交协议强调。首先需要强调的是,流式细胞仪分析不能评估在细胞制剂合体片段的可能存在。其它协议被提出以解决此问题,例如,使用流式细胞仪或使用抗体结合磁珠13,14排序。应该虽然,这些片段通常不坚持细胞培养孔,并经常除去以下所述细胞洗涤步骤被提及。另一个限制到所提出的协议是主绒毛细胞滋养细胞在细胞培养非常有限的存活时间。因此,无论选择的方法,稳定的VIL的转LOUS细胞滋养细胞仍然高不可攀。 EMSA分析,如在该协议描述的,也有一定的局限性。虽然信号的特异性可以很容易地通过竞争实验用过量未标记的寡核苷酸来评估,结合因子只能使用针对导致supershifted信号特异性转录因子的抗体识别。 EMSA实验,因为它在体外 DNA -蛋白质相互作用研究还仍然有限。需要具有比较有代表性的设置,如ChIP实验实验和体内的协议更近的进一步确认EMSA结果。

为滋养层分离和转染本文描述的协议具有对于其中需要瞬时沉默或特定基因的过量表达,以了解其在功能上,增殖或特定滋养层细胞类型的分化的作用的研究重要的应用。此外,在转,T表达的蛋白质的agged版本将适于胞内跟踪并通过标准技术,如共焦显微镜分析和流式细胞术。该EMSA协议可以用来研究有关启动调控和牵连的转录因子复杂的细节。此外,这种实验方法将允许研究人员确定参与有关胎盘缺陷和代绒毛滋养细胞表达的基因的调控改变某些疾病的发展的因素。

总之,人原代细胞滋养细胞可以是从胎盘容易地分离,并且适合于标准协议,诸如siRNA转染和EMSA。虽然不同的转染程序,如脂质体15和核转16可用,微孔似乎是孤立的代绒毛滋养细胞的转染一种非常有效的方法,提供有限的细胞去的方法ATH和成本相对较低。绒毛细胞滋养细胞的上下文中,这种方法应允许不同的基因的沉默,并且其含义中的各种功能或细胞类型的特征的评估。此外,表达载体的转染也使用此协议可行并且将产生互补的数据对基于siRNA的方法。相对于EMSA,这种技术提供了相对于其他方法,如DNA酶I足迹,甲基化干扰测定法,染色质免疫沉淀,染色质构象分析时评估蛋白质-DNA复合体的更快速和更简单的方法。因此,在标准的启动子分析或任何其他增强子/含抑制器-DNA区的测试这种技术仍然有价值。我们其代绒毛滋养细胞可靠使用的示范很重要,因为它增加了对基因的调控,与功能层面的潜在影响的信息。尽管他们在培养的时间有限,主要绒毛滋养细胞是适合标准研究和应该适应更近以及信息的方法。

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Acknowledgements

这项工作是由加拿大国家科学与工程研究理事会(NSERC)(#298527)(BB)的资助。 CT是由一个机构FARE奖学金支持。 AV是由NSERC·格雷厄姆·贝尔博士支持奖学金。 BB召开了加拿大研究主席在人类反转录病毒学(第2层)。由于碧翠丝Beisner在修改文本的帮助。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HBSS without  Ca2+, Mg2+  Sigma #H2387
HBSS (10x) Sigma #14060-057
DMEM High Glucose without Hepes Gibco #12100-061
Hepes (1 M) Gibco #15630-080
Penicillin-Streptomycin-Neomycin (100x) Gibco #15640-055
Amphotericin B  Sigma #A2411
CaCl2 Sigma #C4901
MgSO4.7H2 Sigma #M
Fetal bovine serum Gibco #16170-078 
Percoll  Sigma #P-1644 For density gradient
Syncytin-2 siRNA Ambion Life technologies #AM16708
Scrambled siRNA Qiagen # SI03650318
DNase I Sigma-Aldrich #D5025
Trypsine, type I  Sigma #T8003
DharmaFECT Lipotransfection  reagents  GEhealthcare # T-2001-01
Trypsin/EDTA Life technologies #25300-062
Protease Inhibitor Cocktail Roche Diagnostic #11873580001
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific #23225
BSA Sigma #A7906
TWEEN 20 Sigma #P9416 
Anti-rabbit IgG, HRP-linked antibody  Cell Signaling #7074
BM Chemiluminescence Western Blotting Substrate (POD) Roche Diagnostic #11500708001
DPBS  Life technologies #14287-080
T4 Polynucleotide Kinase NEB #M0201S
ATP, [γ-32P] Perkin Elmer #BLU002A100UC
Acrylmide Sigma  #A9099
TEMED Life technologies #17919
Ammonium Persulfate Sigma  #A3678
Anti-human cytokeratin-7 antibody clone LP5K, FITC conjugated Millipore CBL194F Dilution 1:200
FcR blocking reagent  Miltenyi Biotec 130- 059-901 Dilution 1:10
Flow Cytometer BD Acuri system Becton Dickinson
Microporator MP-100 apparatus  Digital Bio
Resuspension Buffer R (Neon Transfection System 100 µl Kit) Life technologies MPK10096
PVDF membrane  Millipore IPVH00010  Activate with methanol
Anti-human GAPDH antibody Santa Cruz Biotechnology sc-137179 1:500
HorseRadish Peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-rabbit antibody or anti-mouse antibody Cell Signalling #7074 1:10,000
HorseRadish Peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse antibody Cell Signalling #7076  1:10,000
NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagent Thermo Scientific #78833
G-25 column  GE Healthcare #27-5325-01
Chemiluminsescence and fluorescence imaging device Montréal Biotech Fusion FX5
4% native gel Home made
PBS Home made 1x
Personal Molecular Imager (PMI) System BioRad

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References

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