Macerated ऊतक की स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी बाह्य मैट्रिक्स कल्पना करने के लिए

Biology

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Stephenson, M. K., Lenihan, S., Covarrubias, R., Huttinger, R. M., Gumina, R. J., Sawyer, D. B., Galindo, C. L. Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix. J. Vis. Exp. (112), e54005, doi:10.3791/54005 (2016).

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Abstract

Protocol

आचार कथन: जानवर से निपटने के लिए प्रोटोकॉल वेंडरबिल्ट संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC द्वारा अनुमोदित किया गया, AAALAC-अंतर्राष्ट्रीय मानकों के अनुसार प्रोटोकॉल नंबर एम / 10/117 (स्वाइन) और एम / 10/219 (चूहों) और आयोजन किया। बैंकिंग मानव हृदय के ऊतकों का उपयोग वेंडरबिल्ट विश्वविद्यालय के मेडिकल सेंटर आईआरबी (प्रोटोकॉल संख्या 100887) द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. नमूना संग्रहण और भंडारण

  1. 0.1 एम फॉस्फेट बफर (पंजाब) के घोल में ताजा 4% glutaraldehyde बनाओ।
    चेतावनी: glutaraldehyde, विषैला होता है एक धूआं हुड में दस्ताने और काम पहनते हैं।
    1. 1000 मिलीलीटर DH 2 ओ के लिए पंजाब, पीएच 7.4 से 0.2 एम स्टॉक समाधान 21.8 जी ना 2 HPO 4 और 6.4 जी नः 2 4 पीओ। क्वांटम काफ़ी (QS) का उपयोग बनाओ
    2. पंजाब शेयर समाधान के 2.5 मिलीग्राम और 2.1 मिलीलीटर DH 2 ओ करने के लिए 50% glutaraldehyde के 400 μl जोड़े
  2. एक हिस्सा विसर्जित (कोई बड़ा 2 गएम 2) ऊतक के 4% glutaraldehyde समाधान में। नोट: छोटे टुकड़े भी इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन पर्याप्त आकार (कोई छोटे से अधिक 5 मिमी 2) आसानी से आदेश प्रोटोकॉल के बाद के चरणों की सुविधा के लिए आंखों से देखे जा करने के लिए किया जाना चाहिए।
  3. 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं, तो 4 डिग्री सेल्सियस पर अनिश्चित काल के लिए दुकान।

2. हृदय के ऊतकों की Decellularization

  1. ताजा 10% जलीय NaOH समाधान 10 ग्राम NaOH के छर्रों / 100 मिलीलीटर DH 2 ओ का उपयोग कर
    चेतावनी: NaOH समाधान संक्षारक कर रहे हैं और क्षार जलता पैदा कर सकता है, दस्ताने पहनते हैं।
  2. DH 2 ओ में ऊतक कुल्ला
  3. 6 के लिए कमरे के तापमान पर 10% NaOH समाधान में सेते - 10 दिन (जब तक बंद सफेद या सफेद करने के लिए लाल रंग से ऊतक परिवर्तन)।
  4. DH 2 हे में कुल्ला जब तक ऊतक पारदर्शी हो जाता है।
  5. कमरे के तापमान पर 4 घंटे के लिए 1% tannic एसिड में ऊतक विसर्जित कर दिया। 4 मिलीलीटर DH 2 ओ प्रति 1 मिलीलीटर 5% शेयर समाधान का प्रयोग करें
    चेतावनी: Tannic एसिडएक मजबूत अड़चन है, दस्ताने पहनते हैं।
  6. रात भर DH 2 हे में कुल्ला।

3. Osmication और हृदय के ऊतकों की निर्जलीकरण (सुरक्षा के लिए धूआं हुड में)

  1. 21.4 ग्राम सोडियम cacodylate, 10.0 ग्राम कैल्शियम क्लोराइड और 450 मिलीलीटर DH 2 ओ का उपयोग कर सोडियम cacodylate बफर के एक 0.2 एम स्टॉक समाधान करें मिक्स, तो हाइड्रोक्लोरिक एसिड के रूप में 7.4 पीएच को समायोजित करने के लिए जरूरी 500 मिलीलीटर DH 2 ओ के साथ जोड़ें। Qs
    चेतावनी: सोडियम cacodylate और हाइड्रोक्लोरिक एसिड, विषाक्त कर रहे हैं एक धूआं हुड में दस्ताने और काम पहनते हैं।
  2. 50 मिलीलीटर DH 2 ओ में 1 ग्राम आज़मियम tetroxide क्रिस्टल भंग द्वारा 2% जलीय शेयर सुरक्षा के लिए धूआं हुड में आज़मियम tetroxide का समाधान करें
    चेतावनी: आज़मियम tetroxide एक गंभीर खतरा है साँस लेना; बलगम झिल्ली या आंखों की वाष्प निर्धारण संभव है, इसलिए केवल दस्ताने के साथ धूआं हुड में संभाल। एक छप गार्ड की सिफारिश की है।
  3. 0.1 एम सोडियम cacodylate बफर में ऊतक कुल्ला (मिश्रण शेयर समाधान 1: 1 धनबाद के साथ
  4. पिछले चरण में दो बार दोहराएँ, तीन बफर rinses की कुल के लिए।
  5. 1 घंटे के लिए रोटेटर पर: 0.1 एम सोडियम cacodylate बफर (1 मिश्रण शेयर सोडियम cacodylate और शेयर आज़मियम tetroxide 1) में 1% आज़मियम tetroxide में ऊतक विसर्जित कर दिया।
  6. 5 मिनट के रोटेटर पर प्रत्येक के लिए 0.1 एम सोडियम cacodylate बफर में ऊतक कुल्ला 3 बार।
  7. रोटेटर पर 15 मिनट प्रत्येक के लिए इथेनॉल की बढ़ती सांद्रता (30%, 50%, 75%, 85%, 95%, और अंत में 100%) का उपयोग ऊतक कुल्ला।

4. SEM के लिए क्रॉस धारा भूतल तैयारी

  1. भी 100% इथेनॉल युक्त एक उथले पेट्री डिश के लिए 100% इथेनॉल में ऊतक स्थानांतरण।
  2. दो बहुत तेज रेज़र ब्लेड पकड़ो कि इस तरह के पक्षों के फ्लैटों नमूना ऊपर एक समभुज त्रिकोण के दो पक्षों के लिए फार्म एक दूसरे के और काटने किनारों क्रॉस के साथ संपर्क में हैं। इसे पूरा करने के बाएँ हाथ का उपयोग नमूना का अभी तक सही पक्ष पर एक ब्लेड के लिए जगह औरकटौती बाई ओर। एक ही समय में, दूर नमूना और टुकड़ा दाहिनी ओर के छोड़ दिया पर दूसरा ब्लेड जगह के लिए दाहिने हाथ का उपयोग करें। इस प्रकार, ब्लेड विपरीत दिशाओं से एक दूसरे के खिलाफ गिरावट हो जाएगा एक भी चिकनी कटौती करने के लिए।
  3. एक दूसरे के खिलाफ फ्लैट ब्लेड पक्षों स्लाइड नमूना को नुकसान पहुँचाए बिना अधिमानतः संभव के रूप में बड़े रूप में एक सतह क्षेत्र को उजागर कम से कम विरूपण या बल फाड़ साथ नमूना के एक बहुत साफ कटौती करने के लिए।
  4. प्रत्येक नमूना के लिए दोहराएँ SEM में परीक्षा के लिए बेनकाब करने के लिए साफ संभव क्रॉस सेक्शन सतहों।

हृदय के ऊतकों की 5. महत्वपूर्ण बिंदु सुखाने (सीपीडी)

  1. , महत्वपूर्ण बिंदु ड्रायर (सीपीडी) का नमूना धारक के लिए ऊतक हस्तांतरण करने के लिए सुनिश्चित करना है कि ऊतक हर समय 100% इथेनॉल में रहता है एक रंग या चिमटी का प्रयोग करें। सुनिश्चित करें कि धारक इथेनॉल में और है कि हस्तांतरण कुछ ही सेकंड से अधिक नहीं के लिए हवा के संपर्क में ऊतक के साथ हासिल की है डूब जाता है।
  2. हमें प्रति सीपीडी प्रचालनएर मैनुअल 3 शुद्ध और भरने को पूरा करने के चक्र तरल कार्बन डाइऑक्साइड के साथ इथेनॉल की जगह।
  3. उपयोगकर्ता मैनुअल प्रति सीपीडी प्रचालन के नमूनों की महत्वपूर्ण बिंदु सुखाने को प्राप्त करने और सीओ 2 के नियंत्रित निकाल साथ वायुमंडलीय दबाव करने के लिए उन्हें वापस जाने के लिए।

6. SEM के लिए हृदय के ऊतकों नमूने के बढ़ते

  1. एल्यूमीनियम ठूंठ के ऊपर की सतह को एक कार्बन चिपकने वाला टैब पालन करने से, प्रत्येक नमूना के लिए एक SEM नमूना ठूंठ तैयार करें।
  2. एक stereomicroscope की सहायता के साथ, ध्यान से सामना करना पड़ रहा (टैब, दृश्य से दूर) ब्याज के पार अनुभाग की सतह के साथ चिपकने वाला टैब के लिए नमूना पालन करना है, और संभव के रूप में बंद नमूना ठूंठ सतह के विमान के साथ समानांतर। जांच या ब्याज की सतह को छूने मत करो।
  3. एक लकड़ी के applicator छड़ी तोड़ एक पतला ब्रश, रंग आवेदन के लिए आदर्श को प्राप्त करने के लिए। आधार और नमूना के पक्ष में चांदी या कार्बन पेंट लागू करें, ठूंठ के पालन में सुधार होगा।
  4. ब्याज की सतह के एक किनारे करने के लिए रंग, जमीन के लिए ब्याज की सतह से एक प्रभारी पथ प्रदान करने के लिए चांदी या कार्बन की एक बहुत पतली रेखा बढ़ाएँ।
  5. जमीन के लिए कार्बन टैब की परिधि के आसपास चांदी या कार्बन रंग के 2 या 3 छोटे dabs लागू करें, धातु ठूंठ को कार्बन टैब की सतह से एक प्रवाहकीय पथ प्रदान करने के लिए और इस तरह।
  6. प्रवाहकीय रंग दो घंटे के लिए शुष्क करने की अनुमति दें।
  7. उपयोगकर्ता के मैनुअल के अनुसार धूम coater संचालित एक अपेक्षाकृत भारी कोटिंग (30 का लक्ष्य रेंज - 40 एनएम) लागू करने के लिए सोने पैलेडियम मिश्र धातु या सोने की। लगभग 0.1 मिलीबार के लिए नमूना कक्ष पंप, 40 सेकंड के लिए टाइमर सेट। 8:00 स्थिति (मध्यम आर्गन गैस का प्रवाह) के लिए खुला वाल्व सेट। प्रेस शुरू 30 मा पर धूम कोटिंग आरंभ करने के लिए। बैंगनी चमक निर्वहन नमूना कक्ष में दिखाई जानी चाहिए।

7. हृदय के ऊतकों नमूने के SEM परीक्षा

  1. अपेक्षाकृत कम को बढ़ाने वोल्टेज पर स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी इमेजिंग पी को कम से कम करने के लिए प्रदर्शननमूने में गरीब प्रभारी लंपटता के साथ जुड़े roblems (चार्ज)। सुझाए गए प्रारंभिक इमेजिंग हालत कर रहे हैं: 5 केवी वोल्टेज में तेजी, 10 मिमी दूरी काम।
  2. एक अनुभवी ऑपरेटर की सहायता के साथ, रोजगार दूरी काम इमेजिंग शर्तों कई फोकल विमानों में फाइबर, फाइबर या जेड आयाम में काफी लंबाई के लिए विस्तार देने का ध्यान केंद्रित की आवश्यकता होती है में क्षेत्र की गहराई का विस्तार करने के लिए वृद्धि हुई है।
    1. यहां इस्तेमाल माइक्रोस्कोप के लिए ऊपरी सही पर नेविगेशन टैब यूजर इंटरफेस का उपयोग में (सामग्री की तालिका देखें)।
    2. स्टेज मेनू से निर्देशांक टैब पर पहुँचें। काम दूरी बढ़ाने के लिए, तो जाओ पर क्लिक समन्वय टैब के लिए प्रवेश दूरी काम करने के लिए नमूना चरण स्थानांतरित करने के लिए Z के लिए मिलीमीटर में एक बड़ा मान दर्ज करें।
  3. एक अनुभवी ऑपरेटर की सहायता के साथ, इलेक्ट्रॉन बीम के लिए ब्याज orthogonal की सतह की स्थिति के लिए नमूना झुकाव और रोटेशन को रोजगार। 10 से 30 degr के अतिरिक्त झुकावEES इस स्थिति से अवलोकन और मैट्रिक्स संरचना के दस्तावेज सुधार हो सकता है।
    1. यहां इस्तेमाल माइक्रोस्कोप के लिए (सामग्री की तालिका देखें), यूजर इंटरफेस में, तो छोड़ दिया है या सही स्लाइड पर क्लिक करें और सही माउस बटन पकड़ ब्याज की तैयार की सतह विमान की परिधि के पास नमूना ध्यान केंद्रित करने के लिए, ध्यान केंद्रित काम दूरी टिप्पण ।
    2. मैनुअल यूजर इंटरफेस जॉयस्टिक के साथ नेविगेट सतह और दोहराने ध्यान देने का विरोध किनारे के पास स्थानांतरित करने के लिए। तो दूरी काम पहले की स्थिति के लगभग बराबर नहीं है, झुकाव नमूना स्टेज मेनू के निर्देशांक टैब का उपयोग (7.2 देखें) और टी में एक झुकाव मूल्य के समन्वय दर्ज कर दोनों स्थानों पर अनुमानित समझौते को प्राप्त करने के लिए।
    3. नमूना घुमाएँ नब्बे डिग्री (आर में मान दर्ज समन्वय क्षेत्र) और इस प्रक्रिया को दोहराएँ जब तक सभी पदों के लिए लगभग एक ही काम दूरी पर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं।
      नोट: चर दबाव SEM प्रभारी लंपटता में सुधार करने के लिए नियोजित किया जा सकता हैअगर उपलब्ध हो। उच्च वैक्यूम स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए मानक संचालन विधा है।

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Representative Results

प्रकाश डाला तकनीक एक अप्रयुक्त मानव हृदय प्रत्यारोपण दाता (चित्रा 1), प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ताओं, जंगली प्रकार और dystrophic चूहों (चित्रा 3) से दिल से explanted ऊतकों से हृदय के ऊतकों को लागू किया गया था, और एक सूअर से पोस्ट-रोधगलन दिल के नमूनों में दिल की चोट के मॉडल (चित्रा 2)। जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है, मानव हृदय मैट्रिक्स पार से जुड़े प्रोटीन है कि एक छत्ते की तरह पैटर्न प्रदर्शित जब पार अनुभाग में देखा की एक जटिल बुनाई है। प्रत्येक 'मधुमक्खी के छत्ते' संरचना लगभग 40 माइक्रोन चौड़ा, सामान्य रूप से एक भी myocyte circumventing, जब चित्रा 1 में तलीय दृश्य पर विचार। जब intercalated डिस्क से जुड़ा हुआ है, कई cardiomyocytes एक छड़ी जब रूपक 'सुरंग' के माध्यम से लंबाई में चलाने के रूप में कल्पना की जा सकती है तीन dimensionality लिए बढ़ा दिया है। चित्रा 1 भी प्रकाश डाला गयाकाटने की प्रक्रिया का महत्व है, अधिक से अधिक सटीक अधिक revelatory स्थलाकृतिक डेटा उपज के साथ (चित्रा 1, ऊपर बाएं) वर्गों है कि काटने की प्रक्रिया (चित्रा 1, शीर्ष सही) के दौरान "तोड़ी" कर रहे हैं की तुलना में।

निवासी हृदय कोशिकाओं, रक्त वाहिकाओं, और SEM प्रसंस्करण के लिए पूर्व संचार कोशिकाओं को हटाने अतिरिक्त अल्ट्रा संरचनात्मक जानकारी है कि पूरे हृदय के ऊतकों ब्लॉक के SEM से कम प्रशंसनीय होगा uncovers। प्रत्येक व्यक्ति श्लेषजनउत्पादी "अकड़", उदाहरण के लिए (चित्रा 1, नीचे पैनल) जाहिरा तौर पर नियमित अंतराल पर गठबंधन और sarcomeres myofibril को सीधा है। इस व्यवस्था के संकुचन और विश्राम चक्र के दौरान लगाए गए काउंटर से अभिनय विकृतियों, वस्त्रों की 'ताने और बाने' है कि खींच के खिलाफ कपड़े शरीर और फार्म को बनाए रखने में मदद करता है के लिए इसी तरह से दिल की संरचना को बनाए रखने में मदद करने के लिए उपयुक्त है।

fo: रख-together.within-पेज = "1"> आकृति 1
चित्रा 1:। Decellularized बाएं निलय ऊतक में बाह्य मैट्रिक्स के तीन आयामी व्यवस्था अप्रयुक्त मानव दाता दिल से प्राप्त की प्रतिनिधि स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन micrographs शीर्ष दो पैनलों, कम बढ़ाई (बार = 500 माइक्रोन) पर क्रॉस सेक्शन में मैट्रिक्स दिखाने सामान्य मानव हृदय के ऊतकों की वास्तुकला का हवाई दृश्य प्रदान करते हैं। उच्च बढ़ाई, एक बेहतर सहायक फाइबर कि (क्रमशः बीच छोड़ दिया और सही पैनल सलाखों = 100 माइक्रोन और 50 माइक्रोन,) नियमित रूप से स्थान दिया गया है myofibers लिए यांत्रिक सहायता प्रदान की खासियत छत्ते की तरह संरचना का निरीक्षण कर सकते हैं। करीब निरीक्षण पर, प्रत्येक 'मधुमक्खी के छत्ते' फाइबर कि निवासी cardiomyocytes (नीचे बाएँ और दाएँ पैनल सलाखों = 10 माइक्रोन और 5 माइक्रोन, क्रमशः) के लिए सीधा एक दूसरे जबकि साथ समानांतर में आयोजित कर रहे हैं से बना है।ttps: //www.jove.com/files/ftp_upload/54005/54005fig1large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

संरचनात्मक जानकारी प्रदान करने के अलावा, decellularized ऊतकों के SEM चोट या कार्डियोमायोपैथी के गैर हानिकारक रूपों के जवाब में बाह्य मैट्रिक्स परिवर्तन की सार्थक, गुणात्मक मूल्यांकन अनुमति दे सकते हैं। उदाहरण के लिए, इस तकनीक को हाल ही में पोस्ट-infarcted स्वाइन हृदय के ऊतकों 43 के बाह्य matrices जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। इस बड़े पशु प्रयोग के दौरान विशेष रूप से डिजाइन दिल की विफलता, बाद infarcted स्वाइन जो नसों में एनआरजी-1β प्रशासन प्राप्त करने के लिए एक संभावित चिकित्सीय रूप एनआरजी-1β के GGF2 isoform की प्रभावकारिता का आकलन करने के हृदय मैट्रिक्स में परिवर्तन हड़ताली प्रदर्शन किया , बाद infarcted जानवरों का इलाज हृदय के ऊतकों की तुलना में। इन परिणामों के बाद 43 प्रकाशित किए गए थे, और तेchnique इस प्रारंभिक, serendipitous खोज पर निर्माण के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण बनी हुई है। चित्रा 2 उदाहरण micrographs, कि अध्ययन के दौरान उत्पादन किया है, जो इलाज और एनआरजी-1β इलाज matrices के बीच कठोर मैट्रिक्स मतभेदों को उजागर भी शामिल है।

चित्र 2
चित्रा 2:। अनुपचारित और एनआरजी -1 β -treated सूअरों में बाएं निलय बाह्य मैट्रिक्स के प्रतिनिधि स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन micrographs, NaOH थकावट के बाद क्रॉस सेक्शन में मैट्रिक्स इलाज के बाद रोधगलन में फाइबर की नियमित स्थानिक व्यवस्था पर प्रकाश डाला गया (बाद एमआई) सूअरों (ऊपर बाएं), बाद एमआई एनआरजी-1β इलाज जानवरों (शीर्ष सही) की तुलना में। जब देशांतर में देखी, इलाज स्वाइन में मैट्रिक्स एक मोटी, मैट की तरह उपस्थिति (नीचे बाएँ), एनआरजी-1β इलाज सूअरों के मैट्रिक्स जबकि दर्शाती(ठीक नीचे) फाइबर की नियमित स्थानिक व्यवस्था को प्रदर्शित करता है। सफेद पट्टी = 40 माइक्रोन (सभी चार पैनलों)। अधिक विस्तृत परिणाम और आंकड़े जुड़े पांडुलिपि 43 में शामिल हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

मैट्रिक्स परिवर्तन है कि dystrophic दिलों में होने का अन्वेषण भी प्रगति और Duchenne पेशी dystrophy कार्डियोमायोपैथी (डीएमडी) का एक पशु मॉडल के विकास में गुणात्मक अंतर्दृष्टि प्राप्त हुए है। MDX चूहों, डीएमडी का इस्तेमाल आमतौर पर माउस मॉडल में, वहाँ जंगली प्रकार और MDX दिलों जब निर्धारण और NaOH के उपचार के बाद SEM द्वारा देखी बीच महत्वपूर्ण और उम्र पर निर्भर मतभेद हैं। के रूप में 3 चित्र में दिखाया, मैट्रिक्स घटकों 6 सप्ताह पुरानी MDX कमी सामान्य चूहों के लिए कार्यात्मक dystrophin रिश्तेदार दिलों में अपेक्षाकृत सामान्य थे। अधिक interesting, बाह्य मैट्रिक्स संगठन स्पष्ट रूप से बाधित किया गया था या शायद युवा MDX चूहों की तुलना में पुराने dystrophin की कमी चूहों में अपमानित, दिल में डीएमडी के प्रगतिशील प्रकृति को दर्शाता हुआ। इतना गहरा मतभेद की उम्मीद नहीं कर रहे थे, क्योंकि MDX चूहों तथ्य यह है कि वे एक बहुत मामूली कार्डियोमायोपैथी phenotype और डीएमडी 48 के साथ मनुष्य की तुलना में धीमी मृत्यु दर का प्रदर्शन करने के कारण मानव डीएमडी कार्डियोमायोपैथी के खराब प्रतिनिधि हैं। यह पता चलता है कि दिल समारोह में भी छोटे परिवर्तन इस पांडुलिपि में प्रस्तुत दृश्य तकनीक का उपयोग कर कब्जा कर लिया जा सकता है। इस पद्धति भी आसानी से अन्य अंगों के बाह्य matrices, जिसके लिए कोई वर्तमान में उपलब्ध फाइब्रोसिस को लक्षित उपचारों वैसे ही हैं के लिए अनुकूल होना चाहिए।

चित्र तीन
चित्रा 3: वाम वेंचर के प्रतिनिधि स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन micrographsजंगली प्रकार MDX चूहे बनाम में tricular बाह्य मैट्रिक्स। प्रकार के जंगली चूहों में बाएं निलय हृदय मैट्रिक्स (शीर्ष पैनल) अन्य प्रजातियों में मनाया के समान है। उम्र के 6 सप्ताह में MDX चूहों में मैट्रिक्स अपेक्षाकृत सामान्य, उपस्थिति (मध्यम पैनल) में हालांकि थोड़ा "शराबी" लग रहा है। इसके विपरीत, पुराने MDX चूहों के हृदय मैट्रिक्स गंभीर रूप से degenerated (नीचे पैनल) प्रतीत होता है, यह दर्शाता है कि dystrophic प्रक्रिया गुणात्मक तय, NaOH-macerated ऊतकों में SEM का उपयोग पर कब्जा कर लिया जा सकता है। सफेद पट्टी = 10 माइक्रोन (सभी तीन पैनलों)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

क्रॉस सेक्शन सतह तैयारी प्रोटोकॉल के दौरान सबसे महत्वपूर्ण कदम है। ठीक संरचना की रक्षा करने के लिए, निर्जलित नमूनों हर समय 100% इथेनॉल में ही रहना चाहिए जब तक महत्वपूर्ण बिंदु सुखाने की प्रक्रिया के लिए पेश किया। इसलिए प्राप्त करने के लिए नमूनों में से टुकड़ा करने की क्रिया है, जबकि नमूनों एक उथले डिश में इथेनॉल में पानी में डुबोया जाता है ईएम परीक्षा के लिए सतहों किया जाना चाहिए। यह भी महत्वपूर्ण है कि उजागर सतह को छुआ या बाद से निपटने के दौरान जांच नहीं कर रही है। कोई प्रमुख संशोधनों, इसी तरह मैट्रिक्स टिप्पणियों के लिए अन्य प्रकार के ऊतकों के लिए इस तकनीक के आवेदन के लिए प्रत्याशित रहे हैं, हालांकि प्रोटोकॉल के SEM भाग नमूना मूल की परवाह किए बिना बुनियादी इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी समस्या निवारण की आवश्यकता हो सकती है। रेशेदार नमूनों से एकत्र छवियों गरीब प्रभारी लंपटता ( "चार्ज") द्वारा शुरू की कलाकृतियों से ग्रस्त हैं। चार्ज समस्याओं को आमतौर पर (समय ध्यान केन्द्रित करना भी बुलाया स्कैन गति बढ़ती वोल्टेज में तेजी को कम करने, द्वारा कम किया जा सकता है) और इलेक्ट्रॉन बीम के स्थान आकार को कम करने। कई स्कैन की एकता जल्दी प्रभारी कलाकृतियों से बचने के लिए एक धीमी, उच्च गुणवत्ता वाले एक स्कैन छवि में मौजूद प्रभारी कलाकृतियों के बिना शोर गुणवत्ता के लिए तुलनीय संकेत की एक छवि का उत्पादन होगा पर्याप्त एकत्र।

इस तकनीक को स्वाभाविक गुणात्मक है और इस तरह जब मात्रात्मक मापन (जैसे, मेसन के trichrome या picoserius लाल धुंधला, hydroxyproline सामग्री, मास स्पेक्ट्रोमेट्री और RNASeq की माप) का पता लगाने के लिए कैसे कल्पना की संरचनात्मक मतभेद विभिन्न विकासात्मक या रोग राज्यों से संबंधित हो सकता है के साथ माना पूरक। हालांकि, इस सीमा के बावजूद, विधि हृदय फाइब्रोसिस विशेष रूप से परे महत्वपूर्ण है, क्योंकि बाह्य मैट्रिक्स शरीर में लगभग हर अंग का एक आवश्यक घटक है। दिल में, हृदय मैट्रिक्स निरंतर जटिल की विशेषता पम्पिंग खींच, घुमा और डेफ के लिए महत्वपूर्ण यांत्रिक सहायता प्रदान करता हैormation, जो> 2.5 अरब धड़कता औसत मानव उम्र से अधिक होती है कि के लिए इष्टतम प्रवेश और ऑक्सीजन और ऑक्सीजन रहित रक्त 49 के तपका प्रदान करता है। हृदय के ऊतकों की बेहद कम पुनर्योजी क्षमता को देखते हुए, एक गतिशील मैट्रिक्स है कि प्रासंगिक जरूरतों के हिसाब से remodeled किया जा सकता तार्किक समझ में आता है। केवल कल्पना की एक मामूली खिंचाव के साथ, एक अनुमान हो सकता है मैट्रिक्स remodeling से छेड़छाड़ के घाव भरने की प्रक्रिया को बढ़ाने के लिए चिकित्सकीय लक्ष्यों कि वहां मौजूद है, जबकि प्रतिकूल फाइब्रोसिस सीमित। कम से कम प्रदर्शन तकनीक के आवेदन परिष्कार और हृदय मैट्रिक्स की सुंदरता को दर्शाना होगा और ऐसा करने में आगे अपनी कार्यात्मक महत्व को रेखांकित करता है।

जबकि मात्रात्मक उपायों के मूल्य में व्यावहारिक रूप से सभी प्रयोगात्मक अध्ययन के मूल्यांकन के लिए एक प्रमुख सिद्धांत है तकनीक है कि यहाँ न केवल मानक मैट्रिक्स माप के पूरक गुणात्मक ultrastructural रूपों प्रकट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता प्रकाश डालालेकिन वैकल्पिक रास्तों का सुझाव खोजी मौलिक जैव रासायनिक परिवर्तन है कि गुणात्मक परिवर्तन को रेखांकित समझने के लिए हो सकता है। इस तकनीक के प्रत्याशित भविष्य अनुप्रयोगों हृदय रोग मॉडल और मैट्रिक्स परिवर्तन का आकलन करने के लिए एक पूरक उपकरण के रूप में मानव ऊतकों में इसके उपयोग, साथ ही चौड़ी उपयोग अन्य अंगों जिसके लिए मैट्रिक्स परिवर्तन रोग की प्रक्रिया का एक घटक है अध्ययन करने के लिए कर रहे हैं।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Calcium Chloride Electron Microscopy Sciences 12340 100 g
Carbon Adhesive Electron Microscopy Sciences 12664 30 g
Carbon Adhesive Tabs Electron Microscopy Sciences 77825 order to fit stubs
Double Edge Razor Blades Stainless Steel Ted Pella, Inc 121-6 250/pkg
Ethanol Electron Microscopy Sciences 15055 450 ml
Gluteraldehyde, 50% Solution Electron Microscopy Sciences 16310 EM grade, distillation purified
Hydrochloric Acid Electron Microscopy Sciences 16760 or 16770 100 ml
Monosodium Phosphate NaH2PO4 Sigma-Aldrich S9251-250G 250 g
Osmium Tetroxide Electron Microscopy Sciences 19100 1 g
Silver Conductive Adhesive Electron Microscopy Sciences 12686-15 15 g
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich S8045-1KG 1 kg
Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) Sigma-Aldrich S3264-500G 500 g
Tannic Acid, 5% Aqueous  Electron Microscopy Sciences 21702-5 500 ml
Trihydrate Sodium Cacodylate Electron Microscopy Sciences 12300 100 g
Gold-palladium Alloy or Gold Refining Systems, Inc.  varies specific to the sputter coater make and model
Critical Point Dryer Electron Microscopy Sciences 850
Plain Wooden Applicators Fisher Scientific 23-400-102
Quanta 250 Environmental SEM FEI Q250 SEM
Sputter Coater Cressington Scientific Instruments Ltd. Model 108
Alluminum SEM Sample Stubs Electron Microscopy Sciences 75220-12 specific to the miscroscope

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References

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