使用多色荧光检测液滴微流控光纤

1Department of Pharmaceutical Chemistry, University of California, San Francisco, 2Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, California Institute for Quantitative Biosciences, University of California, San Francisco
Published 5/05/2016
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Bioengineering

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Summary

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Cole, R. H., Gartner, Z. J., Abate, A. R. Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers. J. Vis. Exp. (111), e54010, doi:10.3791/54010 (2016).

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Abstract

Introduction

液滴的微流体通过在大量悬浮在载体油1水性液滴的compartmentalizing实验提供用于高通量生物学的平台。液滴已被用于应用程序作为不同的单细胞分析2中 ,数字聚合酶链反应(PCR)3,和酶进化4。荧光测定法检测的液滴的微流体的标准模式下,作为其亮信号和快速响应时间与在千赫速率检测子纳升液滴体积兼容。许多应用需要荧光检测用于同时至少两种颜色。例如,我们的实验室通常进行的PCR活化使用一个检测信道为一个化验结果液滴排序的实验中,并使用二次背景染料,使测定阴性液滴可数5。

液滴微流体典型检测站BAsed的上表面荧光显微镜,并需要复杂的光操作计划,以从自由空间激光引入激励光成显微镜被聚焦在样品上。荧光从液滴射出后,所发射的荧光的光进行滤波,使得每个检测信道利用中心波长频带设为一光电倍增管(PMT)。落射荧光显微镜基于光学检测系统,由于其费用,复杂性提供了一个进入门槛,并要求维修。光纤提供的装置构造的简化和健壮检测方案,由于纤维可以手动插入微流体装置,除去基于镜面光路由的需要,并且允许光路用光纤连接器相连接。

在本文中,我们描述了一个紧凑的模块化方案的组装和验证,利用光纤的阵列进行多色荧光检测DA单光电探测器6。光纤被耦合到单独的激光和被插入垂直于一个L形的流动通道以规则的空间偏移。的荧光收集纤维取向平行于激励区域,并连接到一个单独的PMT。因为液滴穿过在不同的时间的激光束,由光电倍增管记录的数据显示了一个时间偏移,允许用户向液滴由每个不同的激光束激发后发出的荧光区分。这个时间偏移消除了需要发射的光分离成使用一系列分色镜和带通滤波器的分离的光电倍增管。以验证检测器的效能,我们定量液滴种群包封不同颜色和浓度的染料的荧光。该系统的灵敏度进行了研究为单色荧光检测,并示出了以检测与浓度液滴向下至0.1nM,一个200×灵敏度曝光的能力ovement相比,在文献7日报道最近的基于光纤的方法为。

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Protocol

1. SU8主制造

  1. 设计使用设计软件三层制造微流体结构并通过在电路板胶片供应商与10微米的分辨率打印的设计。装置设计的细节都在所附的参考6给出的信道的几何形状在图1所示的层应包括对准标记,以帮助从每个制造层8并置的功能。
  2. 放置在旋涂机的预清洗3英寸直径的硅晶片,并开启真空将其固定到卡盘。申请1毫升SU8-3050在晶片和自旋的中心为20秒在500rpm,然后在30秒在1750转,提供80μm的层厚度。
  3. 取出晶片并在135℃加热板上烘烤30分钟。允许在移动到下一步骤之前,晶片冷却至室温。
  4. 暴露涂覆的晶片到1层面具下的准直190米W,365纳米LED 3分钟。曝光后,放置在一个135℃热板上的晶片1分钟,然后冷却至RT在进行下一步骤之前。
  5. 放置在旋涂机在晶片和打开真空将其固定到卡盘。申请1毫升SU8-3050在晶片和自旋的中心为20秒在500rpm,然后在30秒以5,000rpm,导致提供的40微米的附加厚度的层。
  6. 移动到下一步骤之前,取出晶片并烘烤上的135℃热板上进行30分钟,然后冷却至室温。
  7. 对准第二层掩模上在1.3图案化的几何形状和涂布的晶片暴露于准直的190毫瓦,365纳米LED 3分钟。曝光后,放置在135℃的热板4分30秒,然后冷却至RT在进行下一步骤之前。
  8. 放置在旋涂机在晶片和打开真空将其固定到卡盘。申请1毫升SU8-3050在晶片和自旋的中心为20秒在500rpm,然后在30秒,以1,000rpm,导致提供100μm的附加厚度的层。
  9. 移动到下一步骤之前,取出晶片并烘烤上的135℃热板上进行30分钟,然后冷却至室温。
  10. 对准第三层掩模上在1.3图案化的几何形状和涂布的晶片暴露于准直的190毫瓦,365纳米LED 3分钟。曝光后,放置在135℃的热板9分钟,然后冷却至RT在进行下一步骤之前。
  11. 通过在丙二醇单甲基醚乙酸酯的搅拌浴中浸渍30分钟,开发的掩模。洗在异丙醇和烘烤晶片上的135℃热板上进行1分钟。放置开发大师100毫米培养皿聚二甲基硅氧烷(PDMS)成型。

2. PDMS器件制造

  1. 加入50克聚硅氧烷基的与5g在塑料杯中的固化剂的组合1的PDMS:准备10。用安装有搅拌棒旋转工具混合内容物。度如30分钟干燥器内的混合物,或直到所有的气泡都被删除。
  2. 倒入PDMS,得到厚度3mm以上的主站和放回干燥器进一步脱气。一旦所有的气泡除去,烘烤设备在80℃80分钟。
  3. 削减清洁表面与图案化侧使用解剖刀和地点从模具装置上,并与一个0.75毫米活检穿孔冲流体的入口和出口。该设备必须被切割,以使120微米和220微米高的几何形状是从该装置的一侧触及。
  4. 等离子体处理装置,具有特征面朝上,一个预净化2英寸3英寸载玻片沿着在1毫巴 O 2等离子体在一个300瓦的等离子体清洁器20秒。通过将PDMS设备的图案化侧到玻璃载片的等离子体处理面上粘合PDMS设备。请将设备在80℃的烤箱烤组装设备40分钟。
  5. 渲染通道通过使用注射器冲洗用氟化表面处理流体的装置疏水性的。在80℃立即烘烤设备10分钟以蒸发溶剂。

3.光学元件的制备

  1. 通过从最后5mm的105微米芯,125微米包层的去除绝缘制备激光激发纤维,NA = 0.22的光纤。
  2. 通过重复3.1的第二相同纤维准备第二彩色激光激发光纤。
  3. 制备纤维为通过重复3.1 200微米芯,225微米包层收集荧光信号,NA = 0.39的光纤。
  4. 检查所有的光纤的尖端 - 如果提示不平坦的表面端,再切割用纤维划线的两端。
  5. 附加一个激光光纤耦合到一个50毫瓦,405 nm激光和附加105微米芯纤维在激光中的一个。直接剥离端处激光功率的传感器计,并使用激光耦合器的微调最大化激光功率。
  6. 重复3.5为50毫瓦,473纳米的激光。
  7. 安装在使用透镜套管挡住激光并传输发射的荧光的PMT一个446/510/581/703纳米四带通滤波器。安装光纤耦合器,使光通过过滤器击中PMT前移动。
  8. 从3.3光纤连接到3.7组装单元。

4.离线混合乳化代

  1. 获得具有60微米×60微米孔的流动聚焦微流体dropmaker设备。
  2. 填充1ml注射器与HFE 7500油,用2%的离子氟表面活性剂9。
  3. 填一系列1毫升注射器与(FITC)荧光素的以下组合和葡聚糖 - 缀合的蓝色染料(CB)的PBS:1nM的FITC / 10nM的CB,为10nM FITC / 10nM的CB,1nM的FITC / 100nM的CB,和10nM FITC / 100nM的CB。
  4. 安装dropmaker设备上倒百万分之一的阶段应付和注射泵将水和油的注射器。夫妇注射器使用PE-2管道设备。
  5. 在500微升/小时的油和250微升/小时的水溶液运行注射器泵,创建的从4.3含有溶液80μm的液滴的混合物。对于每种类型的水样中,使用新鲜的dropmaker装置,以消除交叉污染。收集约200微升每个染料组合乳液到一个空的注射器。
  6. 4液滴类型已经在单个收集注射器收集后,通过反复转动注射器混合该乳液。
  7. 用含有0.1,1,10和100nM FITC标记的PBS水溶液重复步骤4.2-4.6。

5.光纤插入

  1. 放置在步骤2上加上能<100微秒的快门速度的数字相机的倒置显微镜的阶段制造的微流体芯片。
  2. 从侧面看,樱雪请小心操作室温联接到473纳米的激光光纤进入的最远上游120微米通道,小心不要通过穿刺到主流动通道。
  3. 将连接到405 nm激光光纤到最下游120微米高端通道,提供300微米的纤维间隔。
  4. 插入光电倍增管偶联纤维进入垂直于两个激光激发光纤220微米高的信道。

6.混合乳液的荧光检测

  1. 装入5毫升注射器填充有HFE 7500,用2%的离子氟表面活性剂的检测装置的隔离物进油口,用PE-2管。
  2. 装入含有关于使用PE-2管垂直取向的注射器泵和联接到该设备的液滴回注入口混合的FITC / CB乳剂注射器。从装置出口到废物容器连接的PE-2管道的长度。
  3. 灌注设备由1000微升/小时运行的每个泵,直至两根油和液滴看到在装置定期组合和下游流动。
  4. 调节流速,使得所述间隔物油运行在6000微升/小时,并在100微升/小时的液滴,提供液滴通过检测区行进之间显著间距。
  5. 开启激光器,启动数据采集程序,并调整PMT增益提供了比100倍基线噪声基底多个信号。调整激光功率以使所有双峰峰是清晰可见的单一,线性缩放timetrace。
  6. 获取的PMT电压timetrace 60秒以至少20千赫​​。将数据导入计算机程序如Matlab和衡量使用自定义计算程序脚本记录的双峰峰的高度。
    注意:这是作为补充信息。
  7. 使用4.7创建的FITC只混合乳化,用405 nm激光关闭,重复步骤6.2-6.7。

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Representative Results

一个PDMS设备,其允许光纤的插入的制造需要多步光刻过程,以创建不同的高度( 图1)的信道。首先,SU-8的80微米高的层被旋涂到硅晶片并使用掩模来创建流体处理几何图案。接着,附加40微米层的SU-8的旋涂在晶片上,并使用第二掩模来创建功能,将形成120微米高的激光光纤插入通道图案化。最后,100微米以上的SU-8旋涂在晶片上,并形成图案,得到220微米高的检测纤维插入通道。主开发和用于模塑PDMS设备,其反过来结合到载玻片。最终制造包含80微米高的流动几何形状,通过在该装置和120微米和220微米高的光纤信道通过的侧访问的顶部冲孔访问设备。

用于检测的装置的几何形状被示出在图2中。外部生成的80微米的乳剂被重新注入一滴回灌端口和它们流入L形检测信道之前通过垫片油隔开。两个激光耦合光纤插入120μm的高大通道在该流道的离散空间位置提供激励。因为插入这些通道中的多模光纤具有125μm的外部直径和105微米的纤芯直径,流动通道的整个横截面由激光照射。在我们的装置中检测流动通道使得最后激光激发区域之后突然90度转弯来创建用于检测发出的荧光一个225微米的外径光纤附近的光接入。较大的纤维的使用,因为它的高数值孔径(NA = 0.39),这是类似于标准显微镜物镜。

流经检测通道的液滴在每个激光耦合光纤( 图3A)的前面遇到离散激发区域。单个PMT耦合到发射的荧光与时间偏移的映射到激发源的检测光纤的记录。对于包含激发在473处( 图3A中区域“1”)和在405nm处(在图3B中区域“2”)染料的液滴,所产生的光电倍增管的信号包含具有峰分离,与相 ​​关的信号双峰花费的时间的液滴移动从一个激发区域到下一个。通过在时间上进行编码以这种方式的光谱数据,则需要进一步滤光,并为每个荧光颜色分离光电倍增管被消除。 图3B示出信号双峰4液滴具有不同染料组合的列车。在双对应的第一个峰s至由473 nm激光在区域“1”和第二峰值激发后发出的荧光对应的405纳米激光在区域“2”激发后的荧光发射。

检测方案的功效通过检测含有该激发在405nm(葡聚糖 - 缀合的蓝色,CB),并在473纳米(荧光素,FITC)染料的液滴的混合乳剂测试。液滴通过检测区域以大约50赫兹流入和数据被记录为60秒,然后用计算程序脚本进行后处理。该数据在图4中绘制和显示了四个重新注入液滴类型之间清楚的分离。因为该检测系统不不同颜色的发射光的区分,每个液滴由其最大总荧光是在区域“1”兴奋(峰1)之后和在区域2(峰2)中所述。

图5)的影响。数据显示,以检测染料浓度范围从0.1至100nM FITC与同一检测设置单个检测器上的能力。

图1
图1.多层光刻 。微流体装置是由三个不同的特征的高度创建主制造。首先,SU-8的80微米高的层被旋涂并使用用于流体通道的掩模形成图案。接着,为40μm以上的SU-8旋涂和120微米高的特征图案与第二掩模通过两个对SU-8层的产生几何形状以容纳125微米高的光纤。在此之后,100微米更SU-8被旋涂,并用第三掩模图案化,得到225微米高的特征。开发,PDMS成型,等离子体结合到玻璃后,得到的设备包含从侧面光纤插入访问,除了标准的封闭流体通道的大通道。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2
图2的设备的设计和光学布局 。该装置的流体的部分是由一个小滴再喷射和油垫片,连接到L形通道。耦合至个别的激光器纤维被插入垂直于流动的方向。的检测光纤为了收集荧光灯插入垂直于激光纤维。这种光通过过滤ABandpass过滤器,由一个单一的PMT被发现了。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3
图3.多色信息时空编码(A)的液滴在不同的时间流经励磁区域“1”和“2”,提供时间偏移,允许所发射的光的识别。从流经检测通道4不同液滴的列车(B)的数据。各为双峰的第一个峰对应于区域“1”的激励,并在每个双对应于在区域“2”激发后发出的荧光的第二峰值后所发出的荧光。滴峰的高度是在一个比例染料兴奋量定的波长,当光谱泄放发生由于使用的染料的激发光谱重叠除外。峰的宽度由时间,它需要一个液滴遍历激发区域的量来决定。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4
图4.多色检测的混合液滴人口 。示出了由473 nm激光(峰1)的激发和发射后的混合液滴人口最大液滴强度散点图和405nm激光(峰2)。液滴在纳米浓度含有荧光素(FITC)和级联蓝(CB)的组合。 请点击此处查看这个大版本数字。

图5
图上多种多样液滴人口5.单颜色检测 。含有荧光0.1-100纳米由473 nm激光激发后的混合液滴人口的排放量直方图。 请点击此处查看该图的放大版本。

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Discussion

光纤检测需要的光纤相对于流体通道的取向。因为我们的器件利用具有多层光刻制造导槽,以相对于彼此的掩模放置是非常重要的。如果光纤导槽太靠近流体通道,对于流体泄漏的可能性;如果导向通道位于太远或错位,由检测纤维收集的荧光信号可以显著减少。适当的对准可以通过设计对准标记,例如同心圆入口罩相片图案形成过程中共同定位来辅助。此外,光纤的手动插入装置是具有打破装置内的纤维的前端,使它们不可用的潜在一个微妙的过程。抑制针对键合到PDMS设备载玻片纤维并缓慢插入纤维,同时用显微镜观察被键SUCCessful纤维插入。预形成的乳液的最后,再注入应该以最小的处理发生。理想地,一旦该乳液是由和直接沉积到一个空的注射器,它不应该被传送,直到它被用于液滴回注。

多色检测要求在信号双峰的峰值是不同于彼此和从连续液滴的信号不会重叠。我们在这里使用的检测设置使用的一对125微米处的中心到中心的距离为300微米的分离光纤,激发区域之间提供〜175微米的非照射区域。这使得一个80微米的液滴,以仅由一个光源在一个时间被激发并确保每个在一个双峰的峰完全是一种类型的激光激发的结果。设计中的激发区域之间的间隔是类似于液滴直径给予有问题的信号具有重叠发射峰的双峰。 ŧ他宽度的信号双峰关联到所花费的液滴的前缘进入第一激发区域的时间液滴的后缘离开该最终激发区域,〜500微米的中距离时的设备我们形容。为了维持相邻检测液滴的特异性,信号双峰需要由一个低信号区域的至少一样宽的信号双峰间隔开。对于这里所描述的结构中,80微米的液滴被间隔开至少1毫米。

虽然多色检测用单个光检测器允许在成本和复杂性相比标准技术而言显著积蓄,存在鲁棒性的某些损失,因为发射的光不被波长过滤。检测包含该激励在相同波长的多个荧光的液滴时,由于荧光源是无法区分这可能会产生问题。这些限制可以OVERC青梅通过用不重叠激发型材进行实验,或通过设计实验,其中谱法流血以上不会发生成在正在执行的一个敏感的测定法“通道”。这是与许多液滴的微流体检测的应用,其中在明亮的背景染料是用来表示液滴的存在兼容,第二荧光团用于报告一个分子生物学测定10,11的结果。

相比标准技术,我们的方法具有两个主要优点:1)在空间上注册激发区域消除复杂滤光的需要,和2)使用光纤消除了一个显微镜和光学硬件直接光的需要。因为我们解决与微流控检测系统常见的技术问题,以前的研究者开发的方法来解决类似的担忧。例如,Martini等频率编码荧光多色记录由通过独特图案“条码”伸出的激发源的单个检测器滤波器12。我们的光纤阵列的使用允许相似的时间编码方案使用标准的利用率,现成的部件。文献显示了更多的控制,该简单纤维插入我们描述光学众多的光耦合技术。布利斯使用液体填充的光波导用于从特定微通道的位置13,Martinez的Vasquez的光的仔细控制输送和收集用波导激光蚀刻到熔融二氧化硅基片以提供激励光14和Vishnubhatla 是能够精确地制造使用激光照射和化学蚀刻15的组合纤维插入通道。每个这些技术需要超出使用额外的步骤来制造microfl的基座流体结构uidic芯片。虽然这些制造过程可能是必要的高灵敏度的检测应用中,我们已发现,纤维插入一模制的PDMS通道是足够的大多数在我们的实验室的日常应用的。该检测系统能检测下来FITC浓度为100分在80微米的水滴,大致相当于检测〜17000荧光分子。这种敏感性是足够的目前使用基于萤光的系统,其中最常见的正的PCR活化含有10 6荧光分子11的等价测定阳性微滴的细胞分选在我们的实验室中最检测应用。检测灵敏度也比较有利,以最近报道其它基于光纤的系统的灵敏度-例如,它是200倍比> 100微米的液滴7报道的Alexa Fluor 488的20纳米的检测极限更敏感。

W¯¯E具有提出了一个紧凑和模块化液滴的微流体的多色检测方案来代替更昂贵的,复杂的,并且笨重的落射荧光显微镜为基础的系统。这里使用的必要的检测组件(激光,光纤,光纤适配器,筛选和PMT)可以购买<$ 10,000,使得多色墨滴检测访问调查的大量,并允许个别调查人员承担多个检测站在实验室。该系统还删除了一些基于专业的准入门槛,作为一个程度的了解,才能在与落射荧光显微镜结合对准自由空间光系统。此外,该检测安装程序的体积小巧,非常适合便携式和诊断应用。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Photomasks CadArt Servcies
3" silicon wafers, P type, virgin test grade University Wafers 447
SU-8 3035 Microchem Y311074
SU-8 2050 Microchem Y111072
Sylgard 184 silicone elastomer kit Krayden 4019862
1 ml syringes BD 309628
10 ml syringes BD 309604
27 gaugue needles BD 305109
PE 2 polyethylene tubing Scientific Commodities, Inc. B31695-PE/2
Novec 7500 Fisher Scientific 98-0212-2928-5 Commonly knowns as HFE 7500
Ionic Krytox Surfactant Synthesis instructions in ref #10
Dextran-conjugated cascade blue dye Life Technologies D-1976
Fluorescein sodium salt Sigma 28803
Quad bandpass filter Semrock FF01-446/510/581/703-25
PMT Thorlabs PMM02
Fiber port Thorlabs PAFA-X-4-A
lens tube Thorlabs SM1L05
Patch cable with 200 μm core / 225 μm cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connector Thorlabs Custom
Patch cable with 105 μm core / 125 μm cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connector Thorlabs Custom
125 μm fiber stripping tool Thorlabs T08S13
225 μm fiber stripping tool Thorlabs T10S13
laser fiber adapter OptoEngine FC/PC Adapter
405 nm CW laser at 50 mW OptoEngine MDL-III-405 Distributor for CNI lasers
473 nm CW laser at 50 mW OptoEngine MLL-FN-473-50

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References

  1. Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. Droplet microfluidics. Lab Chip. 8, 198-220 (2008).
  2. Mazutis, L., Gilbert, J., Ung, W. L., Weitz, D. A., Griffiths, A. D., Heyman, J. A. Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics. Nat Protocol. 8, (5), 870-891 (2013).
  3. Hindson, B. J., Ness, K. D. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Anal Chem. 83, 8604-8610 (2011).
  4. Agresti, J. J., Antipov, E. Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution. Proc Nat Acad Sci USA. 107, (14), 4004 (2010).
  5. Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. Picoinjection Enables Digital Detection of RNA with Droplet RT-PCR. PLOS ONE. 8, (4), (2013).
  6. Cole, R. H., de Lange, N., Gartner, Z. J., Abate, A. R. Compact and modular multicolour fluorescence detector for droplet microfluidics. Lab Chip. 15, (13), 2754-2758 (2015).
  7. Guo, F., Lapsley, M. I. A droplet-based, optofluidic device for high-throughput, quantitative bioanalysis. Anal Chem. 84, 10745-10749 (2012).
  8. Lithography. Available from: https://www.memsnet.org/mems/processes/lithography.html (2015).
  9. DeJournette, C. J., Kim, J., Medlen, H., Li, X., Vincent, L. J., Easley, C. J. Creating Biocompatible Oil-Water Interfaces without Synthesis: Direct Interactions between Primary Amines and Carboxylated Perfluorocarbon Surfactants. Anal Chem. 85, (21), (2013).
  10. Fallah-Araghi, A., Baret, J. C., Ryckelynck, M., Griffiths, A. D. A completely in vitro ultrahigh-throughput droplet-based microfluidic screening system for protein engineering and directed evolution. Lab Chip. 12, 882 (2012).
  11. Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. Ultrahigh-Throughput Mammalian Single-Cell Reverse-Transcriptase Polymerase Chain Reaction in Microfluidic Drops. Anal Chem. 85, (16), 8016-8021 (2013).
  12. Martini, J., Recht, M. I., Huck, M., Bern, M. W., Johnson, N. M., Kiesel, P. Time encoded multicolor fluorescence detection in a microfluidic flow cytometer. Lab Chip. 12, (23), 5057-5062 (2012).
  13. Bliss, C. L., McMullin, J. N., Backhouse, C. J. Rapid fabrication of a microfluidic device with integrated optical waveguides for DNA fragment analysis. Lab Chip. 7, (10), 1280-1287 (2007).
  14. Martinez Vazquez, R., Osellame, R. Optical sensing in microfluidic lab-on-a-chip by femtosecond-laser-written waveguides. Anal Bioanal Chem. 393, 1209-1216 (2009).
  15. Vishnubhatla, K. C., Bellini, N., Ramponi, R., Cerullo, G., Osellame, R. Shape control of microchannels fabricated in fused silica by femtosecond laser irradiation and chemical etching. Opt Express. 17, (10), 8685-8695 (2009).

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