光ファイバを用いて、液滴マイクロフルイディクスのための多色蛍光検出

1Department of Pharmaceutical Chemistry, University of California, San Francisco, 2Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, California Institute for Quantitative Biosciences, University of California, San Francisco
Published 5/05/2016
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Bioengineering

You must be subscribed to JoVE to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit," you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Cole, R. H., Gartner, Z. J., Abate, A. R. Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers. J. Vis. Exp. (111), e54010, doi:10.3791/54010 (2016).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

液滴マイクロフルイディクスは、キャリアオイル1に懸濁水性液滴の多数の実験を区画化することにより、高スループット生物学のためのプラットフォームを提供します。液滴は、単一細胞分析2、デジタルポリメラーゼ連鎖反応(PCR)3のように変化させるような用途に使用され、進化4酵素されています。彼らの明るい信号と高速時間応答がキロヘルツのレートでサブナノリットルの液滴の体積を検出すると互換性があるとして蛍光アッセイは、液滴マイクロ流体の検出の標準モードです。多くのアプリケーションは同時に、少なくとも2色のための蛍光検出を必要とします。例えば、私たちの研究室では、一般的に、アッセイの結果を一つの検出チャネルを使用した実験をソートPCR活性化液滴を行い、アッセイ陰性滴可算5にするために、二次背景染料を使用しています。

液滴マイクロ流体のための典型的な検出局はBAです落射蛍光顕微鏡上のsed、およびサンプルに集中するために、顕微鏡に自由空間レーザからの励起光を導入するために、複雑な光の操作スキームを必要とします。蛍光を液滴から出射された後、各検出チャンネル一光電子増倍管(PMT)は、波長帯を中心に利用するように、放出された蛍光を光がフィルタリングされます。落射蛍光顕微鏡ベースの光検出システムは、それらの費用、複雑さに参入障壁を提供し、メンテナンスを必要としました。光ファイバは、ファイバが手でマイクロ流体デバイスに挿入することができるので、ミラーベースの光経路の必要性を除去し、簡略化された堅牢な検出スキームを構築する手段を提供し、光路は、光ファイバコネクタを使ってインターフェースされることを可能にします。

本稿では、光学ファイバのアレイを利用することにより、多色蛍光検出を実行するためのコンパクトなモジュラー方式の組み立てと検証を記述しますダ単一の光検出器6。光ファイバは、個々のレーザに結合され、規則的な空間的オフセットでL字型の流路に垂直に挿入されます。蛍光収集ファイバは、励起領域に平行に配向され、単一のPMTに接続されています。液滴が異なる時間にレーザービームを通過するため、PMTによって記録されたデータは一時的にそのユーザが液滴がそれぞれ別個のレーザ光により励起された後に放出される蛍光とを区別することを可能にするオフセットを示しています。この時間的なシフトは、ダイクロイックミラーとバンドパスフィルタのシリーズを使用して、別個のPMTへの光を分離する必要がなくなります。検出器の有効性を検証するために、我々は、異なる色や濃度の染料をカプセル化液滴集団で蛍光を定量します。システムの感度は、単一色の蛍光検出のために調査、および0.1 nMの、200倍感度インプレッションまでの濃度で液滴を検出する能力を示してい文献7に報告され、最近の光ファイバベースの手法と比較してovement。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. SU8マスター製作

  1. 設計ソフトウェアを使用して、3層の製造のためのマイクロ流体構造を設計し、10μmの分解能で回路基板フィルム上のベンダーによって印刷されたデザインを持っています。デバイス設計の詳細は、添付文献6に記載されているチャネルの形状は、 図1に示されている。層は、各製造層8の機能を連結するために役立つ位置合わせマークを含むべきです。
  2. スピンコーター上の予め清浄3インチ径のシリコンウェハを置き、チャックに固定するために真空をオンにします。 80ミクロンの層の厚さを提供し、1750 rpmで、その後30秒間、500rpmで20秒間ウェハとスピンの中心にSU8-3050の1ミリリットルを適用します。
  3. ウェハを取り外し、30分間135℃のホットプレート上で焼きます。ウエハは、次のステップに進む前に室温まで冷却します。
  4. コリメートさ190メートル下の1 番目のレイヤーマスクに塗布されたウェハを公開W、365 nmのは、3分間のLED。露光後、次のステップに進む前に、室温まで冷却、1分間135℃のホットプレート上にウエハを配置します。
  5. スピンコーターにウェハを置き、チャックに固定するために真空をオンにします。 40ミクロ​​ンの追加の厚さを提供する層で、その結果、5,000 rpmで、その後30秒間、500rpmで20秒間ウェハとスピンの中心にSU8-3050の1ミリリットルを適用します。
  6. 次のステップに移動する前に室温に冷却後、ウエハを取り出して、30分間、135℃のホットプレート上で焼きます。
  7. 1.3にパターニングジオメトリ上に2 番目のレイヤーマスクの位置を合わせ、3分間LED nmのコリメート190ミリワット、365に塗布されたウェハを公開します。露光の後、4分30秒135℃のホットプレート上の場所は、次のステップに進む前に、室温まで冷却。
  8. スピンコーターにウェハを置き、チャックに固定するために真空をオンにします。その後、500rpmで20秒間ウェハとスピンの中心に30をSU8-3050の1ミリリットルを適用します秒は1000rpmで、100μmの追加の厚さを提供する層が得られます。
  9. 次のステップに移動する前に室温に冷却後、ウエハを取り出して、30分間、135℃のホットプレート上で焼きます。
  10. 1.3にパターニングジオメトリ上に第3層マスクの位置を合わせ、3分間LED nmのコリメート190ミリワット、365に塗布されたウェハを公開します。露光の後、9分間135℃のホットプレート上の場所は、次のステップに進む前に、室温まで冷却。
  11. 30分間のプロピレングリコールモノメチルエーテルアセテートの撹拌浴に浸漬して、マスクを作成します。 1分間135℃のホットプレート上でイソプロパノールとベークでウエハを洗浄します。ポリジメチルシロキサン(PDMS)成形用の100ミリメートルペトリ皿に開発されたマスターを配置します。

2. PDMSデバイスの製造

  1. プラスチック製のカップに硬化剤5gでシリコーンベースの50グラムを組み合わせることにより、1 PDMS:10を準備します。攪拌棒を取り付けた回転工具で内容を混ぜます。 DEG30分間、デシケータ内部に混合物として、または全ての気泡が除去されるまで。
  2. マスターの上に3ミリメートルの厚さを与え、さらにガス抜きのために戻ってデシケーターに配置するためにPDMSを注ぎます。一旦全ての気泡が除去され、80分間80℃でデバイスを焼きます。
  3. パターン化された面を上にして清浄な表面上メスと場所を使用して、金型からデバイスをカットし、0.75ミリメートル生検パンチで流体入口と出口をパンチ。 120μmから220μmの背の高い形状は、デバイスの側からアクセス可能であるように、デバイスを切断しなければなりません。
  4. プラズマは、300 Wのプラズマクリーナーで20秒間1ミリバールのO 2プラズマで3インチのガラススライドにより予め洗浄2インチと共に、機能面を上にして、デバイスを扱います。スライドガラスのプラズマ処理面上にPDMSデバイスのパターン形成された側を配置することによってPDMSデバイスを結合。 80℃のオーブンにデバイスを配置し、40分間組み立てられた装置を焼きます。
  5. チャンネルをレンダリングフッ素化された表面処理液を用いてデバイスを洗い流すために、注射器を用いて、疎水性。 10分、溶媒を蒸発させるために直ちに80℃でデバイスを焼きます。

光学部品の調製

  1. 105μmのコア、125μmのクラッド、NA = 0.22の光ファイバの最後の5ミリメートルから絶縁体を除去することにより、レーザ励起光ファイバを準備します。
  2. 2 回目の同一の繊維3.1を繰り返すことにより、2 番目のカラーレーザー励起ファイバーを準備します。
  3. 200μmのコア、225μmのクラッド、NA = 0.39の光ファイバ用の3.1を繰り返すことにより、蛍光信号を収集するための光ファイバを準備します。
  4. 先端が平らな面で終わっていない場合は、ファイバスクライブと端を再切断する - 全ての繊維の先端を点検します。
  5. 50 mWのにレーザーファイバーカプラを接続し、405 nmのレーザー、レーザーに105ミクロンコアファイバの1を添付してください。レーザパワーのセンサーでストリッピング終了を指示メータは、レーザパワーを最大化するためにレーザカプラの微調整を使用します。
  6. 50ミリワット、473 nmのレーザーのために3.5を繰り返します。
  7. レーザー光を遮断し、放出される蛍光を送信するために、レンズチューブを使用して、PMT上446/510/581/703 nmのクワッドバンドパスフィルタをマウントします。光はPMTに到達する前にフィルタを通過するように、ファイバカプラを取り付けます。
  8. 3.3から3.7に組み立てられたユニットに光ファイバを接続します。

4.オフライン混合乳剤の生成

  1. 60ミクロン×60ミクロンのオリフィスを有するフロー焦点マイクロ流体dropmaker装置を得ます。
  2. 2%のイオン性フッ素系界面活性剤9とHFE 7500油と1ミリリットル注射器を埋めます。
  3. PBS中で1ミリリットルフルオレセインの次の組み合わせでシリンジ(FITC)およびデキストランコンジュゲートの青色色素(CB)のシリーズを埋める:1 nMのFITC / 10 nMのCB、10 nMのFITC / 10 nMのCB、1 nMのFITC / 100 nMでCB、および10nMのFITC / 100 nmのCB。
  4. 反転マイクロ​​のステージにdropmakerデバイスをマウント対処とシリンジポンプに水と油の注射器。カップルPE-2のチューブを使用して、デバイスへの注射器。
  5. 油のための500μL/ hrであり、水溶液のための250μL/時でシリンジポンプを実行して、4.3からソリューションを含む80ミクロン液滴の混合物を作成します。水性試料の種類ごとに、交差汚染を除去するために、新鮮なdropmakerデバイスを使用します。空のシリンジに各色素の組み合わせからエマルジョンの〜200μLを収集します。
  6. 4滴型は単一収集シリンジに収集された後、繰り返し注射器を回転させることによってエマルションを混合します。
  7. 繰り返し水溶液はPBS中0.1、1、10、及び100nMのFITCを含有する4.2〜4.6ステップ。

5.光ファイバの挿入

  1. <100マイクロ秒のシャッタースピードの可能なデジタルカメラと接続された倒立顕微鏡のステージ上のステップ2で作製したマイクロ流体チップを置きます。
  2. 側から慎重に作業し、inse主流路にを通して穿刺しないように注意しながら、最も遠い上流120μmのチャネルに473 nmのレーザーに結合された繊維を室温。
  3. 300ミクロンの繊維間隔を提供し、最下流120μmでハイサイドチャネルに405 nmのレーザーに結合された光ファイバを挿入します。
  4. 2レーザー励起繊維に通常の220μmの背の高いチャネルにPMT結合繊維を挿入します。

混合エマルジョンの6蛍光検出

  1. PE-2のチューブで検出装置のスペーサーオイル入口に​​2%のイオン性フッ素系界面活性剤とHFE 7500を充填した5ミリリットル注射器を取り付けてください。
  2. PE-2のチューブを使用してデバイスの液滴再注入入口に垂直に配向されたシリンジポンプやカップルでの混合FITC / CBエマルジョンを含む注射器をマウントします。廃棄物容器にデバイスの出口からPE-2チューブの長さを接続します。
  3. 総理の両方まで、千マイクロリットル/時間でポンプのそれぞれを実行して、デバイス石油や液滴は、定期的にデバイスに結合し、下流に流れるされるように見られています。
  4. スペーサーオイルが検出領域を通って移動する液滴との間に有意な間隔を提供し、6000μL/ hrで、100μlの/時の液滴で実行されるように流量を調整します。
  5. 、レーザーをオンにするデータ収集プログラムを起動し、ベースラインのノイズ・フロアを100倍以上ある信号を提供するためにPMTのゲインを調整します。二重ピークのすべてが単一の、直線的にスケーリングされたtimetraceにはっきりと見えるようにレーザーパワーを調整します。
  6. 少なくとも20kHzでPMT電圧timetraceの60秒を取得します。 MATLABなどのコンピューティングのプログラムにデータをインポートし、カスタム・コンピューティング・プログラム・スクリプトを使用して記録ダブレットのピークの高さを測定します。
    注:これは、補足情報として提供されます。
  7. 繰り返しは、405 nmレーザーをオフにし、4.7で作成されたFITC-のみの混合エマルジョンを使用して6.2から6.7を繰り返します。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

光ファイバの挿入を可能にするPDMSデバイスの製造は、種々の高さ( 図1)のチャネルを作成するために、多段階のフォトリソグラフィ手順を必要とします。まず、SU-8の80μmの背の高い層は、シリコンウェハ上にスピンコートし、流体ハンドリングジオメトリを作成するために、マスクを用いてパターニングされます。次に、SU-8の追加の40μmの層がウェハ上にスピンコートし、120μmの背の高いレーザファイバ挿入チャネルを形成する機能を作成するために第2のマスクを用いてパターニングされます。最後に、100ミクロン以上のSU-8は、ウェハ上にスピンコートし、220ミクロントール検出ファイバ挿入路を与えるようにパターニングされます。マスターが開発され、今度はスライドガラスに接着されたPDMSデバイスを成形するために使用されます。最終的な製造は、デバイスの上部にパンチ穴と120ミクロンとの側面を介してアクセスさ220μmの背の高い光ファイバ・チャネルを介してアクセス、80μmの背の高い流動形状が含まれていますデバイス。

検出のために使用される装置の形状は、 図2に示されている。外部で生成された80μmのエマルジ ​​ョンは、液滴の再注入ポートに再注入し、それらがL字状の検出チャネルに流入する前に、スペーサ油によって離間されています。 120μmの背の高いチャネルが流路内の離散的な空間位置での励起を提供するに二つのレーザ結合繊維が挿入されています。これらのチャンネルに挿入されたマルチモードファイバは125μmの外径105μmでコア径を有しているので、流路の断面全体は、レーザ光により照明されます。我々の装置では検出流路は、放出された蛍光を検出するために使用される225ミクロンのOD繊維のクローズ光アクセスを作成するための最後のレーザ励起領域の後に突然90度回転します。より大きな繊維があるため、標準的な顕微鏡の対物レンズに似て、その高開口数(NA = 0.39)、の使用されています。

検出チャネルを流れる液滴がレーザー結合された光ファイバ( 図3A)のそれぞれの前に離散した励起領域を検出しました。単一のPMTは、励起源に時間的シフトマップで蛍光を放出された検出ファイバーレコードに結合されました。 473 nmの( 図3Aの領域「1」)で励起する色素を含有し、405 nmの( 図3Bの領域「2」)で、得られたPMT信号と相関ピーク分離と信号ダブレットを含んでいる小滴用時間は1励起領域から次へと移動するための液滴を取ります。一時的にこのようにスペクトルデータを符号化することにより、さらに光フィルタと、各蛍光体の色に対して別々のPMTの必要性が排除される。 図3Bは、異なる染料の組み合わせで4滴の列車のための信号ダブレットを示しています。二重対応の最初のピーク地域の473 nmレーザーにより励起した後に放出される蛍光秒 "1"及び第2のピークが領域」2」で405 nmレーザーにより励起した後に放出される蛍光に相当します。

検出方式の有効性を、405nm(デキストラン共役ブルー、CB)で励起し、473 nmの(フルオレセイン、FITC)に色素を含む液滴の混合エマルションを検出することによって試験しました。液滴は、およそ50Hzで検出領域を介して流した後、データは、演算プログラムスクリプトを使用して後処理60秒間、記録しました。データを図4にプロットし、4再注入された液滴型の間の明確な分離を示しています。検出システムは、放射された光の異なる色を区別しないので、各液滴が2(ピーク2)(ピーク1)の領域「1」で励起された後、地域の最大総蛍光によって記載されています。

図5)を含むエマルションの蛍光を測定することによって調べました。データは、同じ検出設定で単一の検出器に0.1から100 nMのFITCの範囲で色素濃度を検出する能力を示しています。

図1
1.マルチレイヤフォトリソグラフィ図 。マイクロ流体デバイスは、3つの異なる特徴の高さを有するマスターを作成することによって製造されます。まず、SU-8の80μmの背の高い層が上にスパンし、流体チャネルのためのマスクを用いてパターニングされます。次に、40ミクロンよりSU-8がスピンオンされ、120μmの背の高い機能は125μmで背の高い光ファイバを収容するために形状を得るために、SU-8層の両方を通って2でパターン化NDマスクされています。この後、100ミクロンよりSU-8は、上でスピンし、225μmの背の高い機能を得るために、3 番目のマスクでパターン化されます。ガラスに、PDMS成形、プラズマボンディングを開発した後、得られた素子は、標準的な囲まれた流体チャネルに加えて、ファイバ挿入用の側からアクセス可能な大規模なチャンネルが含まれています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
図2.デバイスの設計および光学配置 。装置の流体部分は、液滴reinjectorオイルスペーサからなるL字状のチャネルに結合されています。個々のレーザに結合された繊維は、流れの方向に垂直に挿入されています。検出ファイバーは蛍光を収集するために、レーザーファイバーに垂直に挿入されます。この光は、ABを介して濾過され、andpassフィルタ、単一のPMTによって検出される前に。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
多色情報の3時間符号化を図(A)液滴が放出された光の同定を可能にするタイムシフトを提供し、異なる時間に「1」と「2」の励起領域を通って流れます。検出チャネルを流れる4つの異なる液滴列から(B)のデータ。各ダブレットの最初のピークは「1」領域における励起および「2」領域での励起後に放出される蛍光に各二重対応における第二のピークの後に放出される蛍光に相当します。液滴のピークの高さはで、色素の励起の量を比例していますスペクトルブリードは、励起スペクトルが重複する染料の使用に起因し発生した場合を除いて、波長が与えられました。ピークの幅は、それが励起領域を横断する液滴のにかかる時間の量によって決定されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4
混合液滴の人口の4多色検出図 。 473 nmレーザー(ピーク1)によって励起および発光後の混合液滴の人口の最大液滴強度を示す散布図および405 nmレーザー(ピーク2)。液滴は、nMの濃度でフルオレセイン(FITC)およびカスケードブルー(CB)の組み合わせを含有する。 これの拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。図。

図5
非常に多様な液滴人口5.シングル色検出図 。 473 nmレーザーにより励起した後、フルオレセインの0.1から100 nMのを含有する混合液滴の人口による排出量のヒストグラム。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

光ファイバ検出は、流体チャネルに対する光ファイバの位置合わせを必要とします。我々のデバイスは、多層フォトリソグラフィーで作製ガイドチャネルを利用しているので、互いに対するマスクの配置が非常に重要です。ファイバガイドチャネルは、流体チャネルに近づきすぎている場合、流体の漏れの可能性があります。ガイドチャネルが離れすぎて配置又はずれている場合、検出ファイバーによって集め蛍光シグナルが著しく減少することができます。適切な位置合わせは、フォトパターニング時に同じ場所に配置されるマスクに例えば同心円として、アライメントマークを設計することによって支援することができます。さらに、デバイスへの光ファイバーの手動挿入が使用できなく、それらをレンダリング、デバイス内の繊維の先端を破壊する可能性を秘めた繊細なプロセスです。 PDMSデバイスに結合したスライドガラスに対して繊維を拘束し、顕微鏡で観察しながら、ゆっくりと繊維を挿入するSUCCするキーですessfulファイバ挿入。予め形成されたエマルジョンの最後、再注入は、取り扱いを最小限に抑えて発生する必要があります。エマルションが作られ、空のシリンジに直接堆積された後、それは液滴再注入のために使用されるまで理想的には、それが転送されるべきではありません。

多色検出は、信号ダブレットのピークが互いにと連続した液滴からの信号が重複していないことを区別できることが必要です。ここで使用した検出設定は、励起領域の間〜175ミクロンの非照射領域を提供する、300ミクロンの中心間距離で分離125μmの光ファイバのペアを使用しています。これは、一度に80ミクロンの液滴が一つの光源によって励起することができ、二重のピークのそれぞれを単独でレーザ励起のタイプの結果であることを保証します。励起領域との間の分離は、液滴の直径に類似している設計は、発光ピークダブレットが重複する問題の信号を与えます。 T彼はそれが最終的な励起領域を残すために時間に、液滴の後縁を第1の励起領域を入力するために、液滴の前縁のために要する時間、中〜500μmの距離に相関信号ダブレットの幅デバイス我々は説明します。隣接する検出液滴の明瞭さを維持するために、信号ダブレット信号ダブレットと少なくとも同じ広低信号領域によって離間される必要があります。ここで説明する構成では、80μmの液滴が離れて、​​少なくとも1ミリメートルの間隔を置いて配置されています。

単一の光検出器を有するマルチカラー検出は、標準的な技術と比較して、コストと複雑さの点で大幅な節約を可能にするが発せられた光は波長によってフィルタリングされていないため、ロバスト性のいくらかの損失があります。蛍光源は区別できないので、同じ波長で励起し、複数のフルオロフォアを含む液滴を検出する際に問題となり得ます。これらの制限はovercすることができます青梅重複しない励起プロファイルを用いた実験を行うことによって、または高感度のアッセイが行われている「チャネル」には発生しませんオーバーブリード分光実験を設計することもできます。これは、明るい背景の色素は、液滴の存在を示すために使用される多くの液滴マイクロ流体検出アプリケーションと互換性があり、そして第二のフルオロフォアは、分子生物学アッセイ10,11の結果を報告するために使用されます。

標準的な技術と比較して、我々のアプローチは、2つの主な利点ました:1)空間的に登録された励起領域が複雑な光フィルタリングの必要性を排除し、2)光ファイバの使用は、直接光に顕微鏡や光学ハードウェアの必要性を除去します。我々は、マイクロ流体検出システムと共通の技術的な問題に対処するため、以前の研究者らは、同様の懸念に対処するための方法を開発しました。例えば、マティーニらは 、周波数エンコード多色蛍光を記録します一意にパターニングされた「バーコード」のフィルター12を介して励起源を投影することにより、単一の検出器による。光ファイバアレイの私達の使用は、シェルフコンポーネントから、標準を使用して、同様の時間的な符号化方式の利用を可能にします。文献には、より多くの私たちが説明し、単純なファイバ挿入ように制御された光の多数の光結合技術を示しています。励起光14、およびVishnubhatla らを配信するために、溶融シリカ基板にエッチングブリスマルティネスバスケス特定 ​​のマイクロチャネルの位置13からの光の慎重に制御された送達および収集のための液体充填された光導波路を使用しています。使用する導波路レーザあります正確にレーザー照射および化学エッチング15の組み合わせを用いて、ファイバ挿入チャネルを作製することができます。これらの技術のそれぞれは、microflのベース流体アーキテクチャーを製造するために使用されるものを超えて追加の手順が必要ですuidicチップ。これらの製造手順は、高感度の検出用途のために必要かもしれないが、我々は、成形PDMSチャネルへのファイバ挿入は、私たちの研究室での日常のアプリケーションのほとんどは適切であることを見出しました。検出システムは、〜17000発蛍光団分子の検出とほぼ同じ、80μmの液滴中100 PMにダウンFITC濃度を検出することができました。この感度は、現在10 6フォア分子11と同等のものを含むアッセイ陽性の液滴の細胞選別をPCR-活性化される最も一般的なものは、エピ蛍光ベースのシステムを使用して、我々の研究室で最も検出用途に適しています。検出感度もに匹敵最近、他の光ファイバベースのシステムの感度を報告した-たとえば、それは>100μmの液滴7で報告されたアレクサフルオロ488の20 nMの検出限界よりも200倍より敏感です。

Weは、より費用のかかる複雑で、かさばる落射蛍光顕微鏡ベースのシステムに代わるものとして、コンパクトでモジュール式の液滴マイクロ流体のマルチカラー検出方式を提示しています。ここで使用される、必要な検出コンポーネント(レーザ、ファイバー、ファイバーアダプタ、フィルタ、およびPMT)は<$ 10,000で購入することができ、研究者の大多数にマルチカラーの滴検出がアクセスできるようにし、個々の研究者は、複数の検出ステーションを買う余裕することができます実験室インチ親しみの程度は、落射蛍光顕微鏡と組み合わせて、自由空間光学系を整列させるために必要とされるようなシステムはまた、エントリにいくつかの専門知識ベースの障壁を取り除きます。さらに、検出設定の小さなフットプリントは、ポータブルおよび診断アプリケーションに理想的に適しています。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Photomasks CadArt Servcies
3" silicon wafers, P type, virgin test grade University Wafers 447
SU-8 3035 Microchem Y311074
SU-8 2050 Microchem Y111072
Sylgard 184 silicone elastomer kit Krayden 4019862
1 ml syringes BD 309628
10 ml syringes BD 309604
27 gaugue needles BD 305109
PE 2 polyethylene tubing Scientific Commodities, Inc. B31695-PE/2
Novec 7500 Fisher Scientific 98-0212-2928-5 Commonly knowns as HFE 7500
Ionic Krytox Surfactant Synthesis instructions in ref #10
Dextran-conjugated cascade blue dye Life Technologies D-1976
Fluorescein sodium salt Sigma 28803
Quad bandpass filter Semrock FF01-446/510/581/703-25
PMT Thorlabs PMM02
Fiber port Thorlabs PAFA-X-4-A
lens tube Thorlabs SM1L05
Patch cable with 200 μm core / 225 μm cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connector Thorlabs Custom
Patch cable with 105 μm core / 125 μm cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connector Thorlabs Custom
125 μm fiber stripping tool Thorlabs T08S13
225 μm fiber stripping tool Thorlabs T10S13
laser fiber adapter OptoEngine FC/PC Adapter
405 nm CW laser at 50 mW OptoEngine MDL-III-405 Distributor for CNI lasers
473 nm CW laser at 50 mW OptoEngine MLL-FN-473-50

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. Droplet microfluidics. Lab Chip. 8, 198-220 (2008).
  2. Mazutis, L., Gilbert, J., Ung, W. L., Weitz, D. A., Griffiths, A. D., Heyman, J. A. Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics. Nat Protocol. 8, (5), 870-891 (2013).
  3. Hindson, B. J., Ness, K. D. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Anal Chem. 83, 8604-8610 (2011).
  4. Agresti, J. J., Antipov, E. Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution. Proc Nat Acad Sci USA. 107, (14), 4004 (2010).
  5. Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. Picoinjection Enables Digital Detection of RNA with Droplet RT-PCR. PLOS ONE. 8, (4), (2013).
  6. Cole, R. H., de Lange, N., Gartner, Z. J., Abate, A. R. Compact and modular multicolour fluorescence detector for droplet microfluidics. Lab Chip. 15, (13), 2754-2758 (2015).
  7. Guo, F., Lapsley, M. I. A droplet-based, optofluidic device for high-throughput, quantitative bioanalysis. Anal Chem. 84, 10745-10749 (2012).
  8. Lithography. Available from: https://www.memsnet.org/mems/processes/lithography.html (2015).
  9. DeJournette, C. J., Kim, J., Medlen, H., Li, X., Vincent, L. J., Easley, C. J. Creating Biocompatible Oil-Water Interfaces without Synthesis: Direct Interactions between Primary Amines and Carboxylated Perfluorocarbon Surfactants. Anal Chem. 85, (21), (2013).
  10. Fallah-Araghi, A., Baret, J. C., Ryckelynck, M., Griffiths, A. D. A completely in vitro ultrahigh-throughput droplet-based microfluidic screening system for protein engineering and directed evolution. Lab Chip. 12, 882 (2012).
  11. Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. Ultrahigh-Throughput Mammalian Single-Cell Reverse-Transcriptase Polymerase Chain Reaction in Microfluidic Drops. Anal Chem. 85, (16), 8016-8021 (2013).
  12. Martini, J., Recht, M. I., Huck, M., Bern, M. W., Johnson, N. M., Kiesel, P. Time encoded multicolor fluorescence detection in a microfluidic flow cytometer. Lab Chip. 12, (23), 5057-5062 (2012).
  13. Bliss, C. L., McMullin, J. N., Backhouse, C. J. Rapid fabrication of a microfluidic device with integrated optical waveguides for DNA fragment analysis. Lab Chip. 7, (10), 1280-1287 (2007).
  14. Martinez Vazquez, R., Osellame, R. Optical sensing in microfluidic lab-on-a-chip by femtosecond-laser-written waveguides. Anal Bioanal Chem. 393, 1209-1216 (2009).
  15. Vishnubhatla, K. C., Bellini, N., Ramponi, R., Cerullo, G., Osellame, R. Shape control of microchannels fabricated in fused silica by femtosecond laser irradiation and chemical etching. Opt Express. 17, (10), 8685-8695 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats