क्रायो स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा रुक-खंडित पत्ता ऊतकों के भीतर संश्लेषक झिल्ली के Supramolecular संगठन का अध्ययन

Biology

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Charuvi, D., Nevo, R., Kaplan-Ashiri, I., Shimoni, E., Reich, Z. Studying the Supramolecular Organization of Photosynthetic Membranes within Freeze-fractured Leaf Tissues by Cryo-scanning Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (112), e54066, doi:10.3791/54066 (2016).

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Abstract

फ्रीज खंडित नमूनों की क्रायो स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) के पास मूल निवासी की स्थिति में जैविक संरचनाओं की जांच की अनुमति देता है। यहाँ, हम पत्ती के नमूने के भीतर संश्लेषक (thylakoid) झिल्ली के supramolecular संगठन के अध्ययन के लिए एक तकनीक का वर्णन है। यह पत्ता ऊतकों के उच्च दबाव ठंड, फ्रीज fracturing, डबल परत कोटिंग और अंत में क्रायो SEM इमेजिंग द्वारा हासिल की है। (> 100,000X) जमे हुए हाइड्रेटेड नमूने लिए कम से कम नुकसान किरण के साथ ही कम से कम चार्ज प्रभाव के साथ छवियों को दोहरी परत कोटिंग विधि के प्रयोग के उच्च वृद्धि प्राप्त करने की अनुमति देता है। वर्णित प्रक्रियाओं का प्रयोग हम photosystem और प्रकाश कटाई एंटीना प्रोटीन परिसरों कि पुनरुत्थान संयंत्र Craterostigma pumilum के निर्जलीकरण के दौरान जगह ले, सीटू के supramolecular वितरण में परिवर्तन की जांच की।

Introduction

Oxygenic प्रकाश संश्लेषण, प्राचीन cyanobacteria में उद्भव, एंडोसिम्बायोटक घटनाओं है कि क्लोरोप्लास्ट organelle के विकास के लिए नेतृत्व द्वारा शैवाल और भूमि पौधों से विरासत में मिला था। सभी आधुनिक दिन oxygenic phototrophs में, संश्लेषक इलेक्ट्रॉन परिवहन और प्रोटॉन मकसद बल की पीढ़ी और कम बिजली चपटा थैली की तरह पुटिकाओं में कहा 'thylakoid' झिल्ली के भीतर बाहर किया जाता है। ये झिल्ली प्रोटीन परिसरों कि प्रकाश संश्लेषण की रोशनी से चलने वाली प्रतिक्रियाओं बाहर ले जाने और ऊर्जा पारगमन के लिए एक माध्यम प्रदान करते हैं घर। पौधों और (कुछ) शैवाल की thylakoid झिल्ली दो अलग रूपात्मक डोमेन में भेदभाव कर रहे हैं: कसकर appressed झिल्ली क्षेत्रों 'Grana' और unstacked झिल्ली कि Grana आपस में कहा जाता है, 'स्ट्रोमा lamellae' कहा जाता है 1। संयंत्र और काई thylakoid झिल्ली के विभिन्न फ्रीज फ्रैक्चर के अध्ययन आयोजित किया गया है, 1970 के दशक में शुरू। जब फ्रीज की हड्डी टूट गई, झिल्ली, उनके हाइड्रोफोबिक कोर 2 के साथ विभाजित एक exoplasmic चेहरा (एफई) और एक पुरस-संबंधी चेहरा (पीएफ) पैदा सेलुलर डिब्बे पर निर्भर करता है जो आधे-झिल्ली सीमाओं, के रूप में मूल Branton एट अल द्वारा गढ़ा। । EFS, EFu, PFS और Pfu, क्रमशः, 'एस' और 'यू' denoting 'खड़ी' और 'unstacked' झिल्ली क्षेत्रों के साथ: 1975 में 3 संयंत्र और काई thylakoids चार अलग अलग फ्रैक्चर चेहरे हैं। झिल्ली प्रोटीन परिसरों, जो विभाजन या नहीं टूट रहे हैं, प्रवृत्ति या तो ई या झिल्ली के पी पक्ष के साथ रहने के लिए है। प्रारंभिक टिप्पणियों है कि thylakoids के विभिन्न फ्रैक्चर चेहरे विभिन्न आकार के कणों और घनत्व 4, और कई जांच है कि बाद के होते हैं, पहचान और मनाया कणों और झिल्ली प्रोटीन परिसरों कि प्रकाश प्रतिक्रियाओं को बाहर ले जाने के बीच संबंध के लिए नेतृत्व 5-13 (यह भी देखें समीक्षायें 14,15)।

frethylakoid झिल्ली के EZE-फ्रैक्चर प्रयोगों आम तौर पर क्लोरोप्लास्ट या अलग thylakoid झिल्ली की तैयारियों पर किया जाता है (लेकिन 16,17 देखें), संरचनात्मक और / या supramolecular संगठन में किसी भी परिवर्तन के खतरे को अलगाव की प्रक्रिया के दौरान हो सकता है पर। फ्रैक्चर के बाद, प्रतिकृतियां, तो कार्बन (सी) की एक मोटी परत से प्लैटिनम / कार्बन (पं / सी) के वाष्पीकरण द्वारा तैयार किया जाता है, और अंत में जैविक सामग्री 18 के पाचन। नकली संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (मंदिर) द्वारा कल्पना कर रहे हैं। प्रकाश, शर्तों 19-23 पारंपरिक फ्रीज फ्रैक्चर-प्रतिकृति तकनीक अलग करने के लिए संश्लेषक झिल्ली के supramolecular संगठन और उनके रूपांतरण के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है, जैसे के रूप में काम करने के लिए जारी है।।

Homoiochlorophyllous जी उठने संयंत्र Craterostigma pumilum 24 के हमारे हाल के एक अध्ययन में, हम supramolecular संगठन ओ में परिवर्तन की जांच करने के उद्देश्य सेएफ thylakoid झिल्ली, साथ ही में समग्र सेलुलर संगठन, निर्जलीकरण और पुनर्जलीकरण के दौरान। homoiochlorophyllous जी उठने प्रजातियों की विशिष्टता है कि वे अपने वनस्पति ऊतकों (पत्ते) में सुखाना की शर्तों के जीवित रहने के लिए, जबकि उनके संश्लेषक तंत्र को बनाए रखने में सक्षम हैं। एक बार पानी उपलब्ध है, इन पौधों को ठीक है और कुछ दिनों से 25 घंटे के भीतर संश्लेषक गतिविधि फिर से शुरू। इस अध्ययन के लिए, क्रायो स्कैनिंग ईएम (SEM) फ्रीज खंडित पत्ता नमूनों की इमेजिंग उच्च दबाव नमूना क्रायो स्थिरीकरण के लिए ठंड के साथ जोड़ दिया गया था। इन प्रक्रियाओं के एक राज्य को उनके मूल राज्य में 26 के करीब पर जमे हुए हाइड्रेटेड जैविक नमूने कल्पना करने के लिए एक साधन प्रदान करते हैं। एक मुख्य लाभ यह है कि नमूने फ्रीज फ्रैक्चर और कोई लगातार कदम के साथ कोटिंग के बाद सीधे जांच कर रहे है। के रूप में उनके हाइड्रेशन राज्य तैयारी के दौरान बनाए रखा है यह, विशेष रूप से अलग रिश्तेदार पानी सामग्री (RWC½) में पौधों की जांच के लिए प्रासंगिक है। किस तरहकभी एक महत्वपूर्ण नुकसान यह है कि जमे हुए हाइड्रेटेड नमूने जब उच्च आवर्धन, संश्लेषक परिसरों के आकार की सही माप के लिए आवश्यक पर स्कैन इमेजिंग के दौरान किरण नुकसान से पीड़ित हैं, विशेष रूप से हो सकता है। इस पर काबू पाने के लिए, एक विधि 'डबल परत कोटिंग' (डीएलसी) 27,28 के साथ विशिष्ट क्रायो SEM इमेजिंग शर्तों का उपयोग किया गया संयुक्त बुलाया। इन नमूनों कि काफी कम बीम के प्रति संवेदनशील हैं में हुई और संश्लेषक प्रोटीन supramolecular संगठन और जी उठने संयंत्र सी के अन्य सेलुलर घटक पर बहुमूल्य जानकारी की व्याख्या के लिए अनुमति दी बगल में उच्च आवर्धन पर pumilum।

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Protocol

1. उच्च दबाव ठंड से पत्ता ऊतकों की क्रायो-निर्धारण

नोट: इस खंड का वर्णन कैसे एक फ्रीज फ्रैक्चर प्रयोग के लिए पत्ती के ऊतकों के उच्च दबाव ठंड से बाहर ले जाने के लिए। संयंत्र के नमूने से संबंधित विचार के लिए 29 देखें। यह ऊतकों या कुछ संशोधन के साथ नमूने के अन्य प्रकार के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

  1. एक रेजर ब्लेड के कोने का उपयोग करना, एक 0.1 / 0.2 मिमी एल्यूमीनियम प्लेटलेट 0.1 मिमी गुहा के नीचे (चित्रा 1) खरोंच। कम से कम एक दर्जन से अधिक प्लेटलेट्स (6 नमूने) तैयार करें। डिस्क की परिधि पर चाकू के निशान बनाने के लिए नहीं सावधानी रखना।
    1. scratching के बाद, पूर्ण इथेनॉल में डिस्क धोने उन्हें सूखी और एक साफ पकवान में रहते हैं।
  2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार उच्च दबाव ठंड मशीन तैयार करें। isopropanol साथ उच्च दबाव ठंड मशीन की शराब चैम्बर भरें।
  3. एक घर का बना वैक्यूम की सहायता infiltratio तैयारn डिवाइस तरल के साथ पत्ती के ऊतकों में पाया गैस की जगह।
    1. कसकर एक 10 मिलीलीटर सिरिंज के अंत के लिए एक 200 μl विंदुक टिप कनेक्ट। टिप के ~ 1 सेमी से काट डाला। करने के लिए एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब की टोपी में एक छेद बनाओ कसकर कटौती टिप फिट बैठते हैं। वैक्यूम ट्यूब के अंदर सिरिंज के सवार खींच कर बनाया जा सकता है।
  4. एक रेजर ब्लेड का उपयोग संयंत्र से पत्ती का एक छोटा सा टुकड़ा काट और चिमटी के साथ 1-hexadecene के साथ आधा भरा एक microcentrifuge ट्यूब के अंदर पत्ती जगह है। धीरे निर्वात पैदा करने के लिए सवार खींच कर तरल के साथ पत्ती की कहनेवाला रिक्त स्थान घुसपैठ, के बारे में 30 सेकंड के लिए पकड़ है, और फिर धीरे धीरे सवार जारी।
  5. ट्यूब चिमटी का उपयोग करने से पत्ता टुकड़ा निकालें। एक रेजर ब्लेड मामले में यह 0.2 मिमी से अधिक गहरा है साथ पत्ती ट्रिम और एक छोटा सा टुकड़ा है कि एक प्लेटलेट में फिट होगा काटा।
  6. खरोंच पक्ष के साथ एक साफ प्लेटलेट ठंड मशीन के धारक में रखें और फिर le की कटौती टुकड़ा जगहप्लेटलेट में वायुसेना। 1-hexadecene साथ पत्ती आसपास के शेष अंतरिक्ष भरें। एक और प्लेटलेट का उपयोग कर सैंडविच बंद करें, पत्ती का सामना करना पड़ खरोंच के साथ।
  7. बंद करो और धारक को कसने और मशीन के कक्ष में डालें। फिर फ्रीज करने के लिए (~ 2100 300 के लिए बार - 500 मिसे) 'जेट' बटन दबाते हैं, और जल्दी से तरल नाइट्रोजन में धारक हस्तांतरण। ध्यान से पूर्व ठंडा चिमटी का उपयोग कर, देखभाल करने सैंडविच फ्रैक्चर के लिए नहीं धारक से जमे हुए सैंडविच निकाल दें।
    नोट: बंद जमे हुए सैंडविच तुरंत फ्रीज खंडित या बाद में उपयोग के लिए तरल नाइट्रोजन में रखा जा सकता है। सुरक्षात्मक कपड़े और चश्मों का प्रयोग करें जब तरल नाइट्रोजन से निपटने।

2. रुक-फ्रैक्चर और डबल परत कोटिंग 27,28

  1. फ्रीज फ्रैक्चर मशीन निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्लैटिनम / कार्बन (पं / सी) और कार्बन के वाष्पीकरण के लिए दोनों बंदूकों सहित, उपयोग के लिए तैयार करें। 45 डिग्री पर पं / सी बंदूक की जगह एकएन डी 90 डिग्री पर कार्बन बंदूक।
    1. पूर्व कार्यक्रम पं / सी (कोटिंग दर 0.02 - 0.04 एनएम / सेक) की एक 2-एनएम परत की एक परत योजना और कार्बन की एक 6 एनएम परत (~ में 0.1 एनएम / सेक)।
      1. फ्रीज फ्रैक्चर मशीन की स्क्रीन पर सेटअप दर्ज करें। जहां कोटिंग योजना का उद्धार होगा एक उपयोगकर्ता संख्या का चयन करें।
      2. 'परत 1' के लिए पं / सी का चयन करें। एक समय सीमा, का चयन करें, जैसे।, 5 मिनट (कोटिंग पूरा करने की जरूरत के लिए आवश्यक समय को पार करने के लिए)। 2 एनएम की मोटाई को परिभाषित करने के लिए ऊपर-नीचे तीर का प्रयोग करें।
      3. चुनिंदा कार्बन को छोड़कर, 2. दोहराएँ कदम 2.1.1.2 परत के लिए कदम और 6 एनएम की मोटाई को परिभाषित करने के लिए 'लेयर' बटन दबाएँ।
    2. टेस्ट और बंदूक आपरेशन समायोजित करें।
      1. चुनें 'लेयर 1'। 'GUN1' बटन दबाकर पं / सी बंदूक का चयन करें और फ्रीज फ्रैक्चर मशीन का वाष्पीकरण नियंत्रण इकाई पर 'पर' बटन दबाएँ। वाष्पीकरण की दर को मॉनिटर और UNT वोल्टेज और उत्सर्जन knobs का उपयोग इसे समायोजित0.04 एनएम / सेक - आईएल 0.02 की दर तक पहुंच गया। प्रेस 'बंद' पं / सी बंदूक बंद करने के लिए।
      2. चुनें 'परत 2'। 2.1.2.1 दोहराएँ, चुनें 'GUN2' को छोड़कर और ~ 0.1 एनएम / सेकंड एक वाष्पीकरण की दर के लिए समायोजित करें।
  2. (हाइड्रेटेड या निर्जलित पत्तियों के लिए, क्रमशः) -140 सी या -160 सी के लिए फ्रीज फ्रैक्चर प्रणाली चरण कूल। मशीन के लिए वैक्यूम क्रायो हस्तांतरण शटल देते हैं और तरल नाइट्रोजन के साथ अपने चैम्बर भरें। -7 8 x 10 मिलीबार - ठंडा फ्रीज फ्रैक्चर चैम्बर में दबाव आमतौर पर 1 के बीच है।
  3. लोड हो रहा है स्टेशन में एक फ्रीज fracturing नमूना धारक (3 मिमी प्लेटलेट्स के लिए उपयुक्त) डालें। तरल नाइट्रोजन के साथ लोडिंग स्टेशन चैम्बर बाढ़।
  4. उच्च परिशुद्धता ग्रेड चिमटी का उपयोग कर एक एक करके धारक एक पर दो जमे हुए सैंडविच लोड। धारक में पहली सैंडविच कसो और फिर यह है कि यह सुरक्षित जगह में फिट बैठता है की जाँच करने के धारक पर फ्लिप। दूसरी सैंडविच के लिए दोहराएँ।
  5. डीफ्रीज फ्रैक्चर मशीन से ठंडा शटल etach और यह लोडिंग स्टेशन से कनेक्ट। शटल वाल्व खोलने, धारक में सिमटने के हाथ मिलवा और यह जगह में ताला। शटल में धारक के साथ हाथ फिर से शुरू करने और लोडिंग स्टेशन का उपयोग कर घुंडी शटल वाल्व बंद कर दें। फ्रीज फ्रैक्चर मशीन के लिए शटल देते हैं और retracting हाथ के साथ कक्ष में धारक का परिचय। मशीन से शटल को अलग करें।
  6. ऊंचाई तक फ्रीज फ्रैक्चर microtome चाकू संरेखित ऐसी है कि यह सैंडविच के शीर्ष प्लेटलेट्स दस्तक देगा।
  7. microtome चाकू के साथ, जल्दी सैंडविच तुरंत तोड़ने, और फिर इसे चाकू को मलबे पकड़ से नमूने के प्रदूषण को रोकने के लिए ऊपर उठाना, और में पानी के अणुओं द्वारा संभावित संक्रमण से नमूने को ढाल नव उजागर विमान से ऊपर ठंडा शटर बारी कक्ष।
  8. कोट प्लेटिनम और कार्बन के साथ नमूने हैं।
    1. सुप्रीम कोर्ट पर 'लेयर 1' दर्जरीन। 'GUN1' बटन 'पर' बटन के बाद दबाकर पं / सी बंदूक चालू करें। वाष्पीकरण की दर की जांच करने और एक बार यह 0.02 तक पहुँच जाता है - 0.04 एनएम / सेकंड, एक साथ नमूनों को बेनकाब और जमा परत की मोटाई पर नजर रखने के लिए 'उपाय' बटन दबाएँ।
      नोट: जब मोटाई पूर्व चयनित मूल्य पर पहुँच गया है बंदूक स्वचालित रूप से बंद हो जाएगा।
    2. कवर शटर के साथ नमूने जब पं / सी वाष्पीकरण पूरा हो गया है।
    3. 'परत' बटन 'परत 2' के लिए स्थानांतरित करने के लिए दबाएँ। दोहराएँ 2.8.1 और 2.8.2 कदम, (कार्बन के लिए) 'GUN2' और ~ 0.1 एनएम / सेकंड एक वाष्पीकरण की दर का चयन करने के अपवाद के साथ।
  9. -120 सी के लिए फ्रीज फ्रैक्चर प्रणाली चरण गर्म।

3. क्रायो स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी

  1. क्रायो काम के लिए स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप तैयार करें।
    1. मुख्य मेनू और पुष्टि करने से स्टेज / चरण प्रारम्भ का चयन करें।
    2. चयन उपकरण / समझेहे पैनल, और सूची से चयन करके 'Airlock' पैनल खुला। 'बंद स्तंभ चैंबर वाल्व' बटन पर क्लिक करें। 'वैक्यूम' टैब के अंतर्गत वेंट बटन पर क्लिक करके खुर्दबीन कक्ष वेंट।
    3. चयन उपकरण / गोटो कक्ष, और 'स्टेज अंक सूची' पैनल खुला। नमूना धारक को स्वीकार करने के लिए उचित निर्देशांक करने के लिए मंच स्थानांतरित करने के लिए क्रायो मुद्रा स्थिति का चयन करें। नोट: 'क्रायो मुद्रा स्थिति' वैक्यूम हस्तांतरण इकाई की स्थिति के साथ संरेखण में होना करने के लिए पूर्व निर्धारित है।
    4. दस्ताने की एक जोड़ी के साथ स्वच्छ नमूना कक्ष खोलें और माइक्रोस्कोप के मुख्य मंच पर क्रायो चरण डालें। चैम्बर बंद और 'वैक्यूम टैब' के तहत पम्प बटन पर क्लिक करें।
    5. -120 सी के लिए माइक्रोस्कोप कूल। तरल नाइट्रोजन के साथ माइक्रोस्कोप देवर भरें। -120 सी के लिए क्रायो हस्तांतरण नियंत्रण इकाई पर गर्मी समारोह को सक्रिय चरण के तापमान नीचे चला जाता है एक बार -120 सी।
  2. Attमाइक्रोस्कोप के लिए क्रायो हस्तांतरण शटल आक और (2.5 कदम के रूप में) माइक्रोस्कोप क्रायो चरण में सिमटने के हाथ का उपयोग नमूना धारक हस्तांतरण। माइक्रोस्कोप से शटल को अलग करें।
  3. 'ओपन कॉलम चैंबर वाल्व' Airlock कक्ष में बटन पर क्लिक करें।
  4. जॉयस्टिक का उपयोग कर - ध्यान उद्देश्य लेंस (2 मिमी दूरी काम 1) के करीब नमूना धारक चलते हैं। 'छिद्र' टैब में एक 10 माइक्रोन एपर्चर का चयन करें। 'गन' टैब में EHT क्षेत्र डबल क्लिक करें। 10 EHT लक्ष्य के लिए (केवी) दर्ज करें और ठीक क्लिक करें। नीचे EHT टैब पर क्लिक करें और 'EHT पर'।
  5. 'डिटेक्टरों' टैब में डिटेक्टरों ड्रॉप-डाउन सूची से 'InLens' का चयन करें। इमेजिंग शर्तों (फोकस, चमक और विपरीत, किरण संरेखण, दृष्टिवैषम्य) के रूप में उपयुक्त अनुकूलन।
  6. 'स्कैन' टैब पर क्लिक करें। एक तेजी से स्कैन चुनें ( 'स्कैन गति = 1', 100 प्रति पिक्सेल NSEC की एक समय ध्यान केन्द्रित करने के लिए इसी) किरण नुकसान को कम करने के लिए, औरएक 'स्टोर संकल्प' 1024 x 768 पिक्सल की। 'शोर कटौती' ड्रॉप-डाउन सूची में चयन 'रेखा औसत'। खोज के लिए 30 लाइनों - 20 के लिए एन के मूल्य को समायोजित करें। 'सेंटर प्वाइंट' समारोह खंडित कोशिकाओं और क्लोरोप्लास्ट (आंकड़े 2A और 2 बी) के साथ क्षेत्रों के लिए खोज करने के लिए उपयोग कर (कीबोर्ड पर नियंत्रण-टैब दबाकर) नमूना ले जाएँ।
  7. (- 70 KX 50) (चित्रा -2 और 2 डी) कम आवर्धन पर खंडित क्लोरोप्लास्ट की छवियों मोल। दिलचस्प क्लोरोप्लास्ट फ्रैक्चर चेहरों में ज़ूम और उच्च आवर्धन पर छवियों को प्राप्त करने के लिए (कीबोर्ड पर नियंत्रण-Shift-टैब दबाकर) 'केंद्र फ़ीचर' समारोह का उपयोग (100 - 200 से KX, 3 आंकड़े और 4)। छवि अधिग्रहण के लिए 3.6 कदम के रूप में एक ही मापदंड का प्रयोग करें, लेकिन शोर कम करने के लिए 30 एन> 100 करने के लिए लाइन औसत मूल्य बदल जाते हैं।
    1. मुख्य माइक्रोस्कोप नियंत्रण इकाई पर या 'स्कैन' टैब में प्रेस रुक स्कैनिंग रोकने के लिए और बचाने के लिए'सहेजें झगड़ा' बटन दबाकर छवि।

4. छवि विश्लेषण

नोट: इस खंड में फ्रीज फ्रैक्चर SEM फिजी 31 खुला स्रोत पैकेज का उपयोग कर छवियों से झिल्ली कणों के विभाजन के लिए एक छोटी प्रक्रिया का वर्णन है। इसी तरह के परिणाम अन्य छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ प्राप्त किया जा सकता है।

  1. मुख्य प्रोग्राम विंडो में छवि फ़ाइल खींचकर फिजी के साथ खुला छवि। छवि / प्रकार / 8-बिट का चयन करके 8 बिट के लिए छवि परिवर्तित। छवि का चयन / / चमक / विपरीत समायोजित करें और के रूप में आवश्यक (चित्रा 5 ए) समायोजित करें।
  2. सीधी रेखा उपकरण का उपयोग, एक लाइन एम्बेडेड छवि पैमाने पर पट्टी के आकार आकर्षित। विश्लेषण / सेट स्केल का चयन करें। उचित पैमाने जानकारी (ज्ञात दूरी और लंबाई की इकाई) दर्ज करें और ठीक क्लिक करें। इस समायोजित बढ़ाया छवि को बचाओ।
  3. चयन प्रक्रिया / फ़िल्टर / गाऊसी कलंक (1.5 एनएम त्रिज्या) और ठीक क्लिक करें (चित्रा 5 ब)।
  4. छवि का चयन / समायोजन / Autओ स्थानीय थ्रेसहोल्ड (Niblack विधि का उपयोग) और ठीक क्लिक करें (चित्रा 5C)।
  5. चयन करें संपादित करें / पलटना और फिर इस प्रक्रिया / द्विआधारी / वाटरशेड (चित्रा 5 डी)।
  6. मुक्तहस्त चयन उपकरण के साथ ब्याज (आरओआई) के क्षेत्र के चारों ओर एक सीमा ड्रा। का चयन संपादित करें / चयन द्वारा रॉय प्रबंधक को चयन जोड़ें / प्रबंधक या 'टी' पर क्लिक करके जोड़ें।
  7. संपादन / साफ बाहर (चित्रा 5E) का चयन करें।
  8. विश्लेषण / सेट माप का चयन करें, उचित मानकों (जैसे, क्षेत्र, फिट अंडाकार) चुनें।
  9. विश्लेषण का चयन / कणों का विश्लेषण। कणों के आकार के लिए एक उचित सीमा में प्रवेश और निशान 'प्रदर्शन परिणाम', यदि आवश्यक हो तो 'प्रबंधक को जोड़ें' और, विकल्प 'किनारों पर छोड़ दें' और ठीक क्लिक करें। परिणाम चित्रा 5F में दिखाया गया है।
  10. बचाया पहुंचा imaged फ़ाइल (4.2 कदम) खोलें। 'सभी शो' का चयन करें और रॉय प्रबंधक में 'लेबल' अचयनित। समीक्षा में चयनित खासलेस मूल छवि पर रखी और मैन्युअल रूप से जोड़ने या 'जोड़ें' या 'हटाएँ' रॉय प्रबंधक का बटन का उपयोग करके चयन को हटा दें। मुक्तहस्त चयन उपकरण और 'अपडेट' रॉय प्रबंधक (आंकड़े 5G और 5H) के बटन का उपयोग करके आवश्यक किसी भी चयन सही।
  11. प्राप्त माप का उपयोग कर डेटा का विश्लेषण। परिणाम विंडो में, क्लिक करें परिणाम / प्राप्त करने के लिए संक्षेप में, उदाहरण के लिए मतलब एरिया, और मेजर और रॉय प्रबंधक में सूचीबद्ध कणों की माइनर कुल्हाड़ियों से मतलब है। , परिणाम / वितरण के लिए क्लिक करें (जैसे क्षेत्र के रूप में) एक पैरामीटर का चयन करें और इस पैरामीटर के लिए एक हिस्टोग्राम देखने के लिए क्लिक करें ठीक।

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Representative Results

चित्रा 1 उच्च दबाव जमे हुए, फ्रीज खंडित Craterostigma pumilum पत्ती टुकड़ों से युक्त प्लेटलेट्स की क्रायो SEM छवियों से पता चलता है। कुछ नमूनों में खंडित कोशिकाओं के बड़े क्षेत्रों (चित्रा 1 ए) प्राप्त कर रहे हैं। अन्य लोगों में, पत्ती टुकड़ा कसकर ऊपरी डिस्क के लिए बाध्य रहता है और इसके साथ (चित्रा 1 बी) के साथ बंद दस्तक दी है। हालांकि, यहां तक कि दूसरे मामले में, कुछ पत्ता ऊतक प्लेटलेट (चित्रा 1 बी, तीर) और डेटा की एक निष्पक्ष राशि पर चाकू खांचे अभी भी इमेजिंग पत्ती "अवशेष" द्वारा एकत्र किया जा सकता से जुड़ी रह सकती है, बशर्ते कि वे खंडित थे। बाद सफल फ्रैक्चर पाया जाता है, कोशिकाओं के कम बढ़ाई छवियों हित के क्षेत्रों की पहचान करने के लिए, इस मामले क्लोरोप्लास्ट (चित्रा 2) में अधिग्रहण कर रहे हैं।

सी में thylakoid झिल्ली के उच्च बढ़ाई छवियों pumilum पत्तियों आंकड़े 3 और 4 में दिखाया जाता है। चार अलग अलग फ्रैक्चर चेहरे, EFS, EFu, PFS और Pfu, प्रतिष्ठित किया जा सकता है (चित्रा 3)। Photosystem द्वितीय (PSII), जो सबसे बड़ा जटिल प्रोटीन झिल्ली में पाया जाता है, दोनों EFS (Grana) और EFu (स्ट्रोमा lamellae) में स्थित है। हाइड्रेटेड की स्थिति में, PSII घनत्व EFu (~ 1550 परिसरों माइक्रोन -2 बनाम ~ 550 माइक्रोन परिसरों -2, चित्रा 3) की तुलना में EFS में ~ 3 गुना अधिक है। यह इन दो लगातार चेहरों के बीच फर्क के लिए एक आधार है। एक और उनकी पृष्ठभूमि में अंतर है। EFS पृष्ठभूमि चिकनी प्रतीत होता है, EFu चेहरे किसी न किसी तरह है और छेद है कि अलग साई परिसरों, पूरक सामना करने के लिए जो फ्रैक्चर, pfu 10 (चित्रा 3) के पैरों के निशान हैं शामिल हैं। Thylakoid झिल्ली की EFS चेहरे से PSII परिसरों के विभाजन के लिए एक उदाहरण चित्रा 5 में दिखाया गया है।

ove_content "fo: रख-together.within-पेज =" 1 "> सी pumilum, Grana झिल्ली में PSII का घनत्व (EFS) के निर्जलीकरण के दौरान धीरे-धीरे कम हो जाती है, पर लगभग आधे (~ 700 माइक्रोन परिसरों -2 तक पहुँचने ~ 15 % हाइड्रेटेड की स्थिति (100% RWC, चित्रा 4 ए) में अपने घनत्व के RWC, चित्रा 4C) विशेष रूप से, आगे निर्जलीकरण पर, 5 -। 10% RWC, PSII परिसरों पंक्तियों और सरणियों में आयोजित (तीर, आंकड़े 4D और 4E)। पूरा डेटासेट के लिए, 24 से देखते हैं। इस तरह के PSII सरणियों का गठन जरूरी है कि उनके बाध्य एंटीना परिसरों में से कुछ, LHCII, PSII से अलग। (यह है कि संगठित PSII परिसरों का पूरक होगा PFS में पंक्तियों में आयोजित LHCII परिसरों के लिए एक उदाहरण EFS में ) चित्रा 4E (नोक) में दिखाया गया है। सरणियों में PSII परिसरों, साथ ही अलग LHCII, एक photochemically बुझती राज्य में होने की संभावना है, एक फोटो सुरक्षात्मक भूमिका में कार्यरत हैं। इन संरचनात्मक rearrangements हैं तंत्र जी उठने संयंत्र सी द्वारा उपयोग का हिस्सा निर्जलित राज्य 24 में खुद की रक्षा करने के लिए pumilum।

आकृति 1
रुक-खंडित सी के साथ प्लेटलेट्स की चित्रा 1. कम बढ़ाई क्रायो SEM छवियों pumilum पत्ता मोहरे। (ए) की हड्डी टूट गई कोशिकाओं का एक बड़ा क्षेत्र (धराशायी रूपरेखा) एक सी की pumilum पत्ती। (बी) पत्ती टुकड़ा शीर्ष प्लेटलेट के साथ बंद खटखटाया था, लेकिन कुछ पत्ता ऊतक संलग्न रह नीचे प्लेटलेट पर चाकू के निशान के लिए (तीर इनमें से कुछ निशान)। पत्ती टुकड़े आसपास के क्षेत्रों 1-hexadecene (तारक) जमे हुए हैं। स्केल सलाखों:। 200 माइक्रोन यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

ईएनटी "fo: रख-together.within-पेज =" 1 "> चित्र 2
चित्रा 2. क्लोरोप्लास्ट में Zooming। (ए) हाइड्रेटेड पत्ता ऊतक की हड्डी टूट संश्लेषक (पर्णमध्यक) कोशिकाओं (तारक) के एक समूह। सेल की मात्रा के अधिकांश एक बड़े केंद्रीय रिक्तिका के शामिल है, एक संकरी पट्टी में रिक्तिका आसपास के सभी घटकों के साथ cytoplasmic। (बी) के दो पड़ोसी खंडित कोशिकाओं - सेल दीवार (सीडब्ल्यू) कोशिकाओं के बीच सीमा के निशान। पांच क्लोरोप्लास्ट (ग) केवल एक है जो की हड्डी टूट गई है (खंडित विमान नोक द्वारा चिह्नित) छवि में स्पष्ट कर रहे हैं। (सी और डी) हाइड्रेटेड (सी) से ही खंडित क्लोरोप्लास्ट के लिए उदाहरण और निर्जलित (डी, ~ 15% सापेक्ष पानी की सामग्री [RWC]) पौधों। छोटे सफेद डॉट्स (जैसे, तीर) झिल्ली प्रोटीन क्लोरोप्लास्ट की thylakoid झिल्ली के भीतर पाया परिसरों हैं। नोट भारी vesiculation surrक्लोरोप्लास्ट निर्जलित पत्ती (डी) में पाया ounding। स्केल सलाखों: 10 माइक्रोन (ए); 1 माइक्रोन (बी); 200 एनएम (सी और डी)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. Supramolecular संयंत्र के ऊतकों के भीतर Thylakoid झिल्ली के संगठन के एक खंडित क्लोरोप्लास्ट जिसमें विभिन्न thylakoid फ्रैक्चर चेहरों को देखा जा सकता है:। दोनों खड़ी (EFS) और unstacked (EFu) झिल्ली क्षेत्रों के exoplasmic फ्रैक्चर चेहरे (एफई) photosystem द्वितीय शामिल (PSII) परिसरों; खड़ी क्षेत्रों के पुरस-संबंधी फ्रैक्चर चेहरा (PFS) PSII, LHCII के परिधीय प्रकाश कटाई एंटीना परिसरों होता है; Photosystem मैं (साई) और unstacked क्षेत्रों के पुरस-संबंधी फ्रैक्चर चेहरा (pfu) को एटीपी synthase फ्रैक्चर; साइटोक्रोम बी 6 एफ कृपया यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

चित्रा 4
4. द्वितीय Photosystem संगठन में परिवर्तन चित्रा सी का निर्जलीकरण के दौरान pumilum EFS अलग RWC पर पौधों की thylakoid झिल्ली का सामना करना पड़ता है: (ए) 100%, (बी) ~ 40%, (सी) ~ 15%, और (डी और ई) 5 - 10%।। निर्जलीकरण के दौरान, EFS में PSII के घनत्व का सामना धीरे-धीरे कम हो जाती है ~ 1,500 से परिसरों माइक्रोन -2 (ए) के ~ 700 माइक्रोन परिसरों -2 (~ 15% RWC, सी)। विशेष रूप से, सुखाने की मशीन की स्थिति में (5 - 10% RWC), कुछ पी.एस.द्वितीय परिसरों पंक्तियों और सरणियों (डी और ई, तीर) में आयोजन। नोक (ई) LHCII एंटीना भी पंक्तियों में आयोजित किया जा करने के लिए जो बीच PSII पंक्तियों पूरक EFS में पाया जाएगा में प्रदर्शित होने के साथ PFS चेहरे के निशान। इस डेटा पर अतिरिक्त जानकारी के लिए 24 देखें। स्केल सलाखों:। 100 एनएम कृपया यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5. एक उदाहरण द्वितीय Photosystem कण का विभाजन। फिजी खुला स्रोत पैकेज का उपयोग करने के लिए, प्रोटीन परिसरों छवियों से कुछ ही कदम (प्रोटोकॉल खंड के भाग 4 में पाया विस्तृत प्रक्रिया को पूरा) के साथ खंडित किया जा सकता है। छवियाँ (ए, मूल छवि) गाऊसी फिल्टर (बी) के साथ धुंधला कर रहे हैं; छवि एक ऑटो स्थानीय वीं का उपयोग कर thresholded हैreshold उपकरण (सी); चित्र को उलटा है और जलग्रहण एल्गोरिथ्म निकट संपर्क (डी) में पाया अलग वस्तुओं के क्रम में लागू किया जाता है; ब्याज की एक क्षेत्र का चयन किया जाता है और बाहर मंजूरी दे दी है (ई); कणों (एक उपयोगकर्ता द्वारा निर्धारित आकार सीमा के भीतर) कण विश्लेषक समारोह का उपयोग कर चयन कर रहे हैं। जिसके परिणामस्वरूप मुखौटा (एफ) में दिखाया गया है। कण रॉय प्रबंधक को जोड़ा गया और मूल छवि (G) पर मढ़ा त्रुटियों के लिए या दोषपूर्ण या चूक कणों के लिए जाँच करने के लिए कर रहे हैं। ROIs की सूची दस्ती रूप से संपादित किया जा सकता है, की जगह को हटाने या नए ROIs उनका कहना है, के रूप में उपयुक्त। अंतिम उपयोगकर्ता संपादित चयन (ज) में दिखाया गया है। स्केल पट्टी:। 200 एनएम कृपया यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

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Discussion

तकनीक इस पत्र में वर्णित क्रायो स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा अच्छी तरह से संरक्षित उच्च दबाव जमे हुए संयंत्र के ऊतकों के संदर्भ में फ्रीज खंडित झिल्ली की जांच की अनुमति देता है। इन प्रक्रियाओं का उपयोग करने का प्रमुख लाभ यह है कि नमूना तैयार विशुद्ध रूप से शारीरिक है; रसायन या निर्जलीकरण से जुड़े कोई कदम जरूरी हैं। इस प्रकार, यह एक के पास देशी राज्य 26,32 पर जैविक संरचनाओं का अध्ययन करने की अनुमति देता है। पत्ती के ऊतकों का उपयोग करने का लाभ यह है कि एक क्लोरोप्लास्ट के भीतर समग्र सेलुलर संगठन के बारे में जानकारी, साथ ही इस तरह के thylakoid झिल्ली के रूप में अध्ययन विशिष्ट झिल्ली, प्राप्त कर सकते हैं, उनके मूल शारीरिक संदर्भ में, यानी भीतर है। एक और लाभ, सी का अध्ययन करने के लिए जरूरी रिश्तेदार अलग पानी सामग्री (RWC½) पर pumilum पौधों, कि उनके हाइड्रेशन राज्य तैयारी के दौरान बदल नहीं है। इस के रूप में शुरू सामग्री के रूप में पृथक क्लोरोप्लास्ट या thylakoid झिल्ली का उपयोग करने का विरोध किया हैएक फ्रीज फ्रैक्चर प्रयोग के लिए। बाद में, एक भी ध्यान में रखना है कि कुछ संरचनात्मक और / या supramolecular परिवर्तन की संभावना organelle / झिल्ली अलगाव के दौरान जगह ले गया है।

संयंत्र के ऊतकों के नमूनों, जो अपेक्षाकृत मोटी हैं के साथ कार्य करना [> 50 - 100 माइक्रोन, और काफी मोटा ऊतक और प्रजातियों के प्रकार पर निर्भर हो सकता है], नमूना कांच में रूपांतर के लिए ठंड (HPF) उच्च दबाव का उपयोग पैदा करती है। उच्च दबाव [2,100 बार], जिस पर पानी के पिघलने के तापमान -22 डिग्री सेल्सियस के बारे में है, आवेदन की पानी की हाइड्रोजन बांड नेटवर्क ऐसी है कि यह बर्फ क्रिस्टल के गठन की दर को धीमा प्रभावित करता है। इसलिए, एक vitrified नमूना प्राप्त करने का मौका भी अपेक्षाकृत धीमी गति से ठंडा दरों पर उच्च है। HPF वर्तमान में केवल विधि मोटी के कांच में रूपांतर के लिए उपलब्ध है, अभी तक 200 से अधिक माइक्रोन, नमूने नहीं है। संयंत्र के ऊतकों की HPF के लिए एक महत्वपूर्ण कदम एक निष्क्रिय के साथ उनके कहनेवाला हवा रिक्त स्थान की घुसपैठ है4;। अंतरिक्ष पूरक "से पहले ठंड के लिए, उच्च दबाव के तहत ऊतक पतन को रोकने के लिए (समीक्षा 29,33 देखें) सी pumilum पत्ते, जिनकी मोटाई 1 मिमी तक हो सकता है के मामले में, पत्ते भी छंटनी की जा करने के लिए या HPF करने से पहले पतला।

खंडित-फ्रीज पत्ता ऊतकों मूलतः, प्रतिकृति तैयार करने में 18 की तकनीक को भी लागू किया जा सकता। हालांकि, हमारे अनुभव में, अक्षत खंडित क्षेत्रों के लिए पर्याप्त उपज प्राप्त नहीं किया गया था, के बाद से प्रतिकृतियां अक्सर छोटे टुकड़े करने के लिए टुकड़ा। इसके अलावा, इस तरह के क्लोरोप्लास्ट के रूप में ब्याज की एक विशेष क्षेत्र के लिए खोज संयंत्र के ऊतकों के खंडित प्रतिकृतियां भीतर अव्यावहारिक हो सकता है। यह मुख्य रूप से पर्णमध्यक (संश्लेषक) कोशिकाओं को एक संकरी पट्टी cytoplasmic (2A चित्रा) है, जो नाभिक, क्लोरोप्लास्ट और सभी अन्य अंगों में शामिल हैं से घिरा हुआ एक बड़े केंद्रीय रिक्तिका के शामिल हैं वजह से है। इस प्रकार, क्लोरोप्लास्ट की कुल खंडित क्षेत्र के केवल एक बहुत छोटा सा अंश का प्रतिनिधित्वपर्णमध्यक ऊतकों। फ्रीज खंडित नमूनों की क्रायो SEM इमेजिंग के बाद से नमूने सीधे निम्नलिखित फ्रैक्चर (और कोटिंग / ग्रहण) कल्पना कर रहे हैं इस समस्या का एक समाधान प्रदान करता है। हालांकि, इस पद्धति सीमा यह है कि जमे हुए हाइड्रेटेड नमूने उच्च आवर्धन आसानी से हर्जाना पहले स्कैन पर नमूना पर किरण के प्रति संवेदनशील है और इस तरह स्कैनिंग कर रहे हैं से ग्रस्त है। डबल परत कोटिंग (डीएलसी) 27,28 इस गंभीर खामी के लिए एक समाधान प्रदान करता है।

डीएलसी में, खंडित नमूनों का एक तरीका है कि वे किस तरह प्रतिकृति तैयार करने के लिए कर रहे करने के लिए इसी में लेपित हैं। सबसे पहले, एक पतली परत - पं / सी (1 3 एनएम) नमूना पर सुखाया जाता है, इसके विपरीत और चालकता प्रदान करते हैं। (- 10 एनएम 5) कार्बन की सुरक्षात्मक परत, यह एक मोटा द्वारा पीछा किया जाता है। एक बढ़ाने उच्च वोल्टेज (10 केवी) के साथ संयुक्त डीएलसी backscattered इलेक्ट्रॉन (बीएसई) का संकेत 28 का उपयोग कर छवि के नमूने के लिए इस्तेमाल किया गया था। बीएसई संकेत, प्लेटिनम परत से होने वाले कार्बन के माध्यम से सतह जानकारी प्राप्त करने की अनुमति देता हैऔर, संभवतः, जल वाष्प दूषित पदार्थों को परत है, जो उच्च त्वरण वोल्टेज पर व्यावहारिक रूप से बंबई शेयर बाजार को पारदर्शी हैं (जल प्रदूषण, प्रयोगों में जो एक वैक्यूम क्रायो हस्तांतरण इकाई नहीं किया जाता है और खंडित सतह वातावरण के संपर्क में है में जम जाता है यहां तक ​​कि अगर यह ) एक दूसरे के एक अंश के लिए है। इसके अलावा, बीएसई संकेत का उपयोग कर इमेजिंग प्रभाव जो माध्यमिक इलेक्ट्रॉन (एसई) का पता लगाने के 27 में स्पष्ट कर रहे हैं चार्ज की समस्या को कम से कम। पं / सी के 3 एनएम और कम को तेज वोल्टेज पर imaged - माइक्रोस्कोप यहाँ वर्णित सेटअप, 10 केवी पर लेंस एसई डिटेक्टर के साथ एसई संकेत के इमेजिंग के साथ प्राप्त जब नमूने 2 के साथ पूरी तरह से लेपित किया गया है कि सूचना के बराबर मिले। अंतर यह है कि के रूप में वर्णित डीएलसी द्वारा तैयार की और imaged नमूने काफी कम बीम के प्रति संवेदनशील थे। यह भी बार बार उच्च आवर्धन पर और कई मामलों में उन्हें स्कैन करने के लिए सक्षम है, और अनुमति संश्लेषक प्रोटीन supramolecul पर बहुमूल्य जानकारी प्राप्त करने केएआर संगठन और अन्य सेलुलर घटक (आंकड़े 2 - 4) 24।

अंत में, यहाँ वर्णित प्रक्रियाओं के नमूने के अन्य प्रकारों में संरचना और / या झिल्ली प्रोटीन संगठन का अध्ययन करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। हम सफलतापूर्वक cyanobacterial और काई कोशिकाओं में संश्लेषक झिल्ली के supramolecular संगठन का अध्ययन करने के लिए तकनीक कार्यरत है (Shperberg-अवनि एट अल। अप्रकाशित डेटा)। मुख्य विचार, संभव के रूप में पतली एक नमूना आदेश कांच में रूपांतर के लिए अवसर बढ़ाने के लिए, होने के बीच संतुलन को खोजने जबकि नमूना intactness रखे हुए है। नमूने के विभिन्न प्रकार है, जो निलंबन या पशु / संयंत्र के ऊतकों जा सकता है, अलग पैकेजिंग के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए (उदाहरण के लिए, उच्च दबाव ठंड के लिए उपयोग किया प्लेटलेट्स के प्रकार के मामले में)। एक बार सफल क्रायो स्थिरीकरण हासिल की है, फ्रीज फ्रैक्चर, डीएलसी और क्रायो SEM इमेजिंग के संयोजन सूचनाओं को प्राप्त करने के लिए एक उत्कृष्ट साधन प्रदान करता हैकम से कम बीम क्षति के साथ उच्च वृद्धि पर झिल्ली प्रोटीन संगठन पर सूचना।

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Acknowledgements

हम स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी इमेजिंग पर अपने उपयोगी सलाह के लिए एन्ड्रेस Kaech (ज्यूरिख विश्वविद्यालय) धन्यवाद। इस काम में संयुक्त राज्य अमेरिका-इजरायल Binational कृषि अनुसंधान और विकास निधि (। अनुदान कोई अमेरिका-4334-10, ZR), इसराइल विज्ञान फाउंडेशन (। अनुदान कोई 1034-1012, ZR), और मानव फ्रंटियर विज्ञान कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया (RGP0005 / 2013, ZR)। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी अध्ययन के Weizmann विज्ञान संस्थान में इरविंग और नैनो के लिए Cherna Moskowitz केंद्र और बायो-नैनो इमेजिंग में आयोजित की गई।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ethanol abs Bio-Lab 052505
Isopropanol Bio-Lab 162605
1-hexadecene Sigma-Aldrich H7009
0.1/0.2 Platelets Engineering Office M. Wohlwend GmbH, Switzerland 241 Platelets are of 3-mm diameter and 0.5-mm-thick (Type A) with 0.1/0.2-mm-deep cavities (of diamater 2 mm). Similar platelets can be obtained from Leica Microsystems.
High-precision-grade tweezers Electron Microscopy Sciences 72706-01 Dumont (Switzerland) Durostar style #5 tweezers; Can be substituted with other high-precision tweezers.
High-pressure freezing machine Bal-Tec HPM 010 High-pressure freezing alternatives: 1. HPF Compact 02, Wohlwend GmbH; 2. HPM 010, RMC Boeckeler; 3. EM PACT2, Leica Microsystems; 4. EM HPM 100, Leica Microsystems; 5. EM ICE, Leica Microsystems.
Freeze-fracture system Leica Microsystems EM BAF 060
Cryo preparation loading stage Leica Microsystems 16770228
Specimen holder for univeral freeze fracturing Leica Microsystems 16LZ04746VN Clamp holder for specimen carriers of diameter 3 mm
Vacuum cryo-transfer shuttle Leica Microsystems EM VCT 100
Scanning electron microscope Zeiss Ultra 055
Cryo SEM stage Leica Microsystems 16770299905
Image acquisiton software SmartSEM, Carl Zeiss Microscopy GmbH
Image analysis software Fiji/Image J, National Institute of Health http://fiji.sc/Fiji

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References

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