Studera den supramolekylära organisationen av foto membran i Freeze-brutna bladvävnader av Cryo-svepelektronmikroskopi

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Charuvi, D., Nevo, R., Kaplan-Ashiri, I., Shimoni, E., Reich, Z. Studying the Supramolecular Organization of Photosynthetic Membranes within Freeze-fractured Leaf Tissues by Cryo-scanning Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (112), e54066, doi:10.3791/54066 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Cryo-svepelektronmikroskop (SEM) av fryst brutna prov innebär undersökning av biologiska strukturer på nära nativa betingelser. Här beskriver vi en teknik för att studera den supramolekylära organisationen av foto (tylakoid) -membran inom bladprover. Detta uppnås genom högtrycks frysning av bladvävnader, frysfrakturering, dubbelskiktsbeläggning och slutligen Cryo-SEM-avbildning. Användning av dubbla lager beläggning metod gör det möjligt att förvärva hög förstoring (> 100,000X) bilder med minimal stråle skador på frysta hydrerad prover samt minimala laddningseffekter. Användning av de beskrivna förfarandena vi undersökte förändringar i supramolekylära fördelningen av fotosystem och ljus skörd antenn proteinkomplex som äger rum under dehydratisering av uppståndelsen anläggningen Craterostigma pumilum, in situ.

Introduction

Syrehaltig fotosyntes, med ursprung i forntida cyanobakterier, ärvdes av alger och landväxter genom endosymbiotiska händelser som ledde till utvecklingen av kloroplasten organell. I alla dagens syrehaltig fotoautotrof är fotoelektrontransport och generering av proton-drivkraft och minska effekt genomföras inom utplattade säckliknande vesiklar kallas "tylakoid" membran. Dessa membran hysa proteinkomplex som utför de ljusdrivna reaktioner av fotosyntes och tillhandahåller ett medium för energiomvandling. De tylakoid membran av växter och (vissa) alger differentieras till två distinkta morfologiska domäner: tätt appressed membranregioner som kallas "grana" och är kumulativa membran som kopplar den grana, som kallas "stroma lameller" 1. Olika frysfraktur utvecklade av vegetabiliskt och alger tylakoid membran har genomförts, med start i början av 1970-talet. När fryst fraktur, membrandelas längs deras hydrofoba kärnan 2, som genererar en exoplasmic yta (EF) och en protoplasma face (PF), beroende på den cellulära fack som de halvmembran gränserna som ursprungligen myntades av Branton et al. . 1975 3 Maskiner och alger tylakoider har fyra olika brottytor: EF, efu, PFS och PFU, med "s" och "u" betecknar "staplade" och "är kumulativa" membranregioner, respektive. Membranproteinkomplex, som inte delas eller sönderdelade, har en tendens att stanna kvar med antingen E- eller P-sidan av membranet. De första observationerna att de olika brottytorna hos tylakoider innehåller partiklar av olika storlekar och densiteter 4, och de många utredningar som följde ledde till identifiering och korrelation mellan de observerade partiklarna och membranproteinkomplex som utför de ljusreaktioner 5-13 (se också igenom 14,15).

Freeze-fraktur experiment tylakoid membran utförs vanligtvis på beredningar av kloroplaster eller isolerade tylakoid membran (men se 16,17), med risk för någon förändring i strukturell och / eller supra organisation som kan uppstå under isoleringsförfarandet. Följande fraktur, är repliker bereddes genom indunstning av platina / kol (Pt / C), sedan av ett tjockt lager av kol (C), och slutligen klyvning av det biologiska materialet 18. Repliker kan göras synliga genom transmissionselektronmikroskopi (TEM). Den traditionella frysfraktur replik teknik fortsätter att fungera som ett viktigt verktyg för att studera den supramolekylära organisationen av fotosyntetiska membran och deras anpassning till olika, t ex., Ljus, villkor 19-23.

I vår senaste studie av homoiochlorophyllous uppståndelsen växt Craterostigma pumilum 24, som syftar vi att undersöka förändringarna i den supramolekylära organisationen of tylakoid membran, liksom i total cellulär organisation, under uttorkning och vätskeersättning. Det unika med homoiochlorophyllous uppståndelse arter är att de kan överleva uttorkningsförhållanden i sina vegetativa vävnader (blad), men behåller sin fotosyntetiska apparaten. När vatten är tillgänglig, dessa växter återhämta sig och återuppta fotosyntetisk aktivitet inom några timmar till några dagar 25. För denna studie kryo-scanning EM (SEM) avbildning av fryst brutna bladprover i kombination med högtrycks frysning för prov Cryo-immobilisering. Dessa förfaranden ger ett medel för att visualisera frysta hydratiserade biologiska prover i ett tillstånd nära deras naturliga tillstånd 26. En viktig fördel är att prover undersöks direkt efter frysfraktur och beläggning utan successiva steg. Detta är särskilt relevant för utredningen av växter vid olika relativa vatteninnehåll (RWC), eftersom deras hydrering tillstånd upprätthålls under beredning. Hurnågonsin, är en kritisk nackdel att frysta hydrerad prover kan drabbas av strålen skador under avbildning, särskilt när scannas vid höga förstoringar, som krävs för noggrann mätning av storleken på foto komplex. Att övervinna detta, en metod som kallas "dubbel-skiktsbeläggning" (DLC) 27,28 kombinerat med specifika Cryo-SEM-avbildningsbetingelser användes. Dessa resulterade i prover som är betydligt mindre balk känslig och gjorde det möjligt att klarlägga värdefull information om foto protein supra organisation och andra cellulära beståndsdelar i uppståndelsen växt C. pumilum vid höga förstoringar på plats.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Cryo-fixering av bladvävnader från Högtrycks Frysning

Obs: Detta avsnitt beskriver hur man utför högtrycks frysning av bladvävnader för en frysfraktur experiment. För överväganden i samband med växtprover se 29. Detta kan anpassas för andra typer av vävnader eller prover med viss modifiering.

  1. Med användning av hörnet av ett rakblad, skrapa botten av 0,1 mm kavitet av en 0,1 / 0,2 mm aluminiumblodplättar (figur 1). Bered minst ett dussin plättar (6 prover). Ta försiktig att inte skapa kniv märken på periferin av skivan.
    1. Efter repor, tvätta skivor i absolut etanol, låt dem torka och hålla i en ren skål.
  2. Förbereda högtrycksfrysmaskin enligt tillverkarens instruktioner. Fyll högtrycksfrys maskinens alkohol kammare med isopropanol.
  3. Förbered en hemmagjord vakuumassisterad infiltration enhet för att ersätta gas som finns i bladvävnaden med vätska.
    1. Tätt ansluta en 200 mikroliter pipettspets för att i slutet av en 10 ml spruta. Avskurna ~ 1 cm från spetsen. Göra ett hål i locket på en 1,5 ml mikrocentrifugrör att tätt passa den skurna spetsen. Vakuum kan skapas inuti röret genom att dra kolven av sprutan.
  4. Skär en liten bit av blad från växten med ett rakblad och med pincett placera bladet i ett mikrocentrifugrör halvfylld med en-hexadeken. Infiltrera intercellulära utrymmena i blad med vätskan genom att försiktigt dra kolven att skapa vakuum, håller i ungefär 30 sekunder, och sedan långsamt släppa kolven.
  5. Ta bladet bit från röret med hjälp av pincett. Trimma blad med ett rakblad i fall det är tjockare än 0,2 mm och skär en liten bit som passar in i en trombocyter.
  6. Placera en ren blodplättar med repad sidan uppåt i frys maskinens hållare och sedan placera den skurna bit leAF i trombocyter. Fyll det återstående utrymmet som omger blad med en-hexadeken. Stänga sandwich med användning av en annan blodplättar, med repor som vetter mot bladet.
  7. Stäng och dra åt hållaren och sätt in den i maskinen kammare. Tryck sedan på "Jet" för att frysa (~ 2100 barer för 300-500 ms), och snabbt överföra hållaren i flytande kväve. Försiktigt bort den frusna smörgås från hållaren med nedkylda pincett, noga med att inte spräcka smörgås.
    Obs: Stängt frysta smörgåsar kan vara frys sprucken omedelbart eller förvaras i flytande kväve för senare användning. Använd skyddskläder och skyddsglasögon vid hantering av flytande kväve.

2. Frys fraktur och dubbelskiktsbeläggning 27,28

  1. Förbered frysfrakturmaskin för användning, inklusive både pistoler för förångning av platina / kol (Pt / C) och kol, i enlighet med tillverkarens instruktioner. Placera Pt / C pistol vid 45 grader ennd kolet pistolen mot 90 grader.
    1. Förprogrammera ett beläggningssystem av en 2-nm skikt av Pt / C (beläggningshastighet 0,02-0,04 nm / s) och en 6-nm skikt av kol (vid ~ 0,1 nm / s).
      1. Ange inställningar på frysfraktur maskinens skärm. Välj ett användarnummer där beläggningssystemet kommer att sparas.
      2. Välj Pt / C "Layer 1". Välj en tidsram, t ex., 5 min (för att överstiga den nödvändiga tiden för att fullborda beläggningen). Använd upp och ner pilarna för att definiera en tjocklek av 2 nm.
      3. Tryck på "Layer" för att gå till nivå 2. Upprepa steg 2.1.1.2, utom väljer kol och definiera en tjocklek av 6 nm.
    2. Testa och justera pistol drift.
      1. Välj "Layer 1". Välj Pt / C pistol genom att trycka på "GUN1" och tryck på "ON" -knappen på avdunstning styrenhet frysfraktur maskin. Övervaka avdunstningshastigheten och justera den med spänning och utsläpps knoppar until nå en hastighet av 0,02-0,04 nm / sek. Tryck på 'OFF' för att stänga av Pt / C pistol.
      2. Välj "Layer 2". Upprepa 2.1.2.1, utom väljer "GUN2" och justera för en förångningshastighet på ~ 0,1 nm / sek.
  2. Kyl frys spricksystemet skede -140 C eller -160 C (för hydratiserade eller torkade blad, respektive). Fäst vakuum Cryo transfer till maskinen och fylla sin kammare med flytande kväve. Trycket i den kylda frysfrakturkammaren är vanligtvis mellan 1-8 x 10 -7 mbar.
  3. Sätt en frys sprickbildning provhållare (lämplig för 3 mm trombocyter) i laddningsstationen. Svämma laddningsstationen kammaren med flytande kväve.
  4. Ladda två frysta smörgåsar på hållaren en efter en med hög precision kvalitet pincett. Dra den första sandwich i hållaren och sedan vända hållaren över för att kontrollera att den sitter säkert på plats. Upprepa för den andra smörgås.
  5. Detach den kylda shuttle från frysfraktur maskinen och anslut den till laddningsstationen. Öppna slidventilen införa upprullningsarmen i hållaren och lås den på plats. Återinföra armen med hållaren i skytteln och stänga slidventilen med hjälp av laddningsstationen ratten. Fäst transfer till frysfraktur maskin och införa hållaren in i kammaren med upprullningsarmen. Lossa skytteln från maskinen.
  6. Rikta frysfraktur mikrotom kniv till en sådan höjd att den kommer att slå ut de bästa trombocyter av smörgåsar.
  7. Med mikrotomen kniv, snabbt bryta smörgåsar, och sedan omedelbart lyfta upp det för att förhindra kontaminering av proverna av skräp fast vid kniven och vrid den kylda slutaren över den nyligen exponerade planet för att skydda proverna från eventuella föroreningar av vattenmolekyler i kammaren.
  8. Coat proverna med platina och kol.
    1. Ange "Layer 1" på screen. Slå på Pt / C pistol genom att trycka på "GUN1" -knappen följt av "ON" -knappen. Undersök avdunstningshastigheten och när den når 0,02-0,04 nm / sek, samtidigt utsätta proverna och tryck på "Measure" för att övervaka tjockleken av det avsatta skiktet.
      Obs: Gun stängs av automatiskt när tjockleken har nått förvalda värde.
    2. Täck proverna med slutaren när Pt / C förångning är klar.
    3. Tryck på "Layer" för att gå till "Layer 2". Upprepa steg 2.8.1 och 2.8.2, med undantag för att välja "GUN2" (för kol) och en avdunstningshastighet av ~ 0,1 nm / sek.
  9. Värm frys spricksystemet scenen till -120 C.

3. Cryo-svepelektronmikroskopi

  1. Förbered svepelektronmikroskop för Cryo arbete.
    1. Välj Stage / Stage Initiera från huvudmenyn och bekräfta.
    2. Välj Verktyg / GotO-panelen, och öppna "luftslussen" panel genom att välja den i listan. Klicka på "Close Kolumn Chamber Valve" -knappen. Vent mikroskop kammaren genom att klicka på Vent knappen under "Vacuum fliken.
    3. Välj Verktyg / Goto Panelen och öppna "Stage Points List 'panel. Välj Cryo-utbyte läge att flytta scenen till rätt koordinater för att acceptera provhållaren. Obs: Den "Cryo-utbyte ställning" är förinställd för att vara i linje med positionen för vakuumöverföringsenheten.
    4. Öppna provkammaren med en ren par handskar och sätt i Cryo-scenen på stora scenen i mikroskop. Stäng kammaren och klicka på Pump-knappen under "Vacuum fliken.
    5. Kyla mikroskop för att -120 C. Fyll mikroskop Dewar med flytande kväve. Aktivera värmefunktionen på Cryo-överföringsstyrenheten till -120 ˚C när temperaturen på scenen sjunker under -120 C.
  2. ATTACH Cryo-transfer till mikroskopet och överför provhållaren med hjälp av upprullnings armen i mikroskop Cryo scenen (som i steg 2,5). Lossa skytteln från mikroskopet.
  3. Klicka på "Open Kolumn Chamber Valve" -knappen i luftslussen Panelen.
  4. Flytta försiktigt provhållaren nära objektivlinsen (arbetsavstånd 1-2 mm) med joysticken. Välj en 10-um öppning i "Öppningar" Tab. Dubbelklicka på EHT fältet på fliken "Gun". Ange 10 (kV) för EHT mål och klicka på OK. Klicka på fliken botten EHT och välj "EHT On".
  5. Välj "InLens" från detektorerna listrutan på fliken "Detektorer". Optimera avbildningsförhållanden (fokus, ljusstyrka och kontrast, ljushöjden, astigmatism) när så är lämpligt.
  6. Klicka på fliken "Scanning". Välj en snabb skanning (Scan Speed ​​= 1 ', motsvarande en uppehållstid av 100 ns per pixel) för att minimera strålen skada, ochen "butik upplösning" av 1024 x 768 pixlar. Välj "Linje Avg" i "Noise Reduction" rullgardinslistan. Justera värdet på N till 20 - 30 rader för sökning. Flytta provet med hjälp av "Centre Point" funktion (genom att trycka på kontrollfliken på tangentbordet) för att söka efter regioner med brutna celler och kloroplaster (figurerna 2A och 2B).
  7. Förvärva bilder av brutna kloroplaster vid låga förstoringar (50-70 KX) (Figur 2C och 2D). Använd "Centre har" funktion (genom att trycka på kontroll-skift-fliken på tangentbordet) för att zooma in intressanta kloroplast brottytor och få bilder vid höga förstoringar (100-200 KX figurerna 3 och 4). Använd samma parametrar som i steg 3,6 för bildtagning, men ändra linje Avg värde till N> 100 för att minska 30 buller.
    1. Tryck Freeze på huvud mikroskop styrenheten eller i fliken "Skanna" för att stoppa skanning och sparabilden genom att trycka på "Spara TIFF" -knappen.

4. Bildanalys

Obs: Detta avsnitt beskriver en kort procedur för segmentering av membranpartiklar från fryst fraktur SEM-bilder med hjälp av Fiji 31 öppen källkod paket. Liknande resultat kan erhållas med andra bildanalysmjukvara.

  1. Öppna bild med Fiji genom att dra bildfilen i programmets huvudfönster. Konvertera bilden till 8-bitars genom att välja Bild / Typ / 8-bit. Välj Bild / Justeringar / ljusstyrka / kontrast och justera vid behov (Figur 5A).
  2. Använda den raka linjen verktyget, dra en linje storleken på den inbäddade bildskalan bar. Välj Analysera / Set Scale. Ange rätt skala informationen (Känd avstånd och Enhet längd) och klicka på OK. Spara detta justeras skalas bilden.
  3. Välj Process / Filter / gaussisk oskärpa (1,5 nm radie) och klicka på OK (Figur 5B).
  4. Välj Bild / Justeringar / Auto lokal Threshold (med Niblack metoden) och klicka på OK (Figur 5C).
  5. Välj Redigera / inverterad och sedan Process / Binary / Watershed (figur 5D).
  6. Rita en ram runt regionen av intresse (ROI) med verktyget Freehand Selection. Lägg markeringen till ROI manager genom att välja Redigera / Val / Lägg till Manager eller genom att klicka på "t".
  7. Välj Redigera / Clear Outside (Figur 5E).
  8. Välj Analysera / Set Mätningar, välja lämpliga parametrar (t.ex. område, passform ellips).
  9. Välj Analyze / analysera partiklar. Ange ett lämpligt område för storleken på partiklar och markera "Visa resultat", "Lägg till Manager" och, om nödvändigt, Uteslut på kanterna "och klicka på OK. Resultatet visas i fig 5F.
  10. Öppna den sparade skalas avbildade fil (steg 4,2). Välj "Visa alla" och avmarkera "etiketter" i ROI Manager. Granska valda particles läggs på den ursprungliga bilden och manuellt lägga till eller ta bort markeringar genom att använda "Lägg till" eller "Ta bort" knapparna på ROI Manager. Rätta till eventuella val som krävs med hjälp av Freehand markeringsverktyget och "Update" -knappen på ROI chef (figurerna 5G och 5H).
  11. Analysera data med hjälp av de erhållna mätningarna. I resultatfönstret klickar Resultat / Sammanfatta för att få till exempel, den genomsnittliga området, och menar större och mindre axlar partiklarna som anges i ROI Manager. Klicka Resultat / Distribution, välj en parameter (t.ex. Area) och klicka på OK för att visa ett histogram för denna parameter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1 visar Cryo-SEM-bilder av blodplättar som innehåller högtrycks fryst, fryst brutna Craterostigma pumilum bladbitar. I vissa prover, används stora regioner av brutna celler erhållna (Figur 1A). I andra, förblir bladstycket hårt bundna till den övre skivan och är satt av längs med det (Figur 1B). Men även i det andra fallet, en del bladvävnad kan sitta kvar till kniven spåren på blodplättar (Figur 1B, pilspetsar) och en hel del data kan fortfarande samlas in av att avbilda blad "rester", under förutsättning att de var bruten. Efter en lyckad fraktur hittas är låg förstoring bilder av celler som förvärvats för att identifiera områden av intresse, i detta fall kloroplaster (Figur 2).

Högre förstoring bilder av tylakoid membran i C. pumilum Bladen är visade i figurerna 3 och 4. De fyra olika fraktur ansikten, EF, efu, PFS och Pfu, kan särskiljas (figur 3). Fotosystem II (PSII), som är den största proteinkomplex som finns i membranen, är beläget i både EF (grana) och efu (stroma lameller). Vid hydratiserade förhållanden, är PSII densitet ~ 3 gånger högre i EFs än i efu (~ 1550 komplex pm -2 jämfört med ~ 550 komplex pm -2, Figur 3). Detta är en grund för att skilja mellan dessa två kontinuerliga ansikten. Ett annat är skillnaden i deras bakgrund. Medan EFS bakgrunden förefaller jämn, är efu ansikte grov och innehåller hål som är fotspår fristående PSI komplex, vilket brott till den komplementära ansiktet, PFU 10 (Figur 3). Ett exempel för segmentering av PSII-komplex från EF inför den tylakoid membranet visas i figur 5.

ove_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Under uttorkning av C. pumilum, tätheten av PSII i Grana membran (EFS) minskar gradvis och når ungefär hälften (~ 700 komplex pm -2 på ~ 15 % RWC, figur 4C) av densiteten vid hydratiserade förhållanden (100% RWC, Figur 4A) Särskilt efter ytterligare uttorkning, till 5 -. 10% RWC, PSII komplex organisera sig i rader och arrayer (pilar, figurer 4D och 4E). för fullständig datamängd, se 24. Bildandet av sådana PSII arrayer kräver att en del av deras bundna antennkomplex, LHCII, lossna från PSII. Ett exempel på LHCII komplex organiserade i rader i PFS som skulle vara ett komplement till organiserade PSII komplex (i EFS ) visas i figur 4E (pilspets). PSII komplex i matriser, samt fristående LHCII, kommer sannolikt att vara i en fotokemiskt kylda tillstånd, som betjänar en foto skyddande roll. Dessa strukturella omdisponeringar är en del av de mekanismer som används av uppståndelsen anläggningen C. pumilum att skydda sig i det dehydratiserade tillståndet 24.

Figur 1
Figur 1. låg förstoring Cryo-SEM-bilder av blodplättar med Freeze-brutna C. pumilum bladbitar. (A) En stor region av brutna celler (streckad kontur) av en C. pumilum blad. (B) Blad lappar knackade bort med den övre trombocyter, men vissa bladvävnad förblev fästa vid kniv märken på botten av blodplättar (pilspetsar markerar några av dessa). Regionerna kring bladbitarna fryses en-hexadecen (asterisker). Skala barer. 200 um klicka god här för att se en större version av denna siffra.

ent "fo: keep-together.within-page =" 1 "> figur 2
Figur 2. zoom in Chloroplasts. (A) En grupp bruten foto (mesophyll) celler (asterisker) hydratiserad bladvävnad. De flesta av cellvolymen består av en stor central vakuol, med alla cytoplasmiska beståndsdelar som omger vakuolen i en smal remsa. (B) Två angränsande brutna celler - cellväggen (CW) markerar gränsen mellan cellerna. Fem kloroplaster (c) är uppenbara i bilden, av vilka endast en har brutits (fractured planet markeras med pilspets). (C och D) Exempel på enstaka brutna kloroplaster från hydrerad (C) och torkade (D, ~ 15% relativ vattenhalt [RWC]) växter. De små vita prickar (t.ex. pilspetsar) är membranproteinkomplex inom de tylakoid membranen i kloroplasten. Observera den massiva blåsbildning SURRounding kloroplasten finns i den dehydratiserade blad (D). Skalstrecken: 10 ^ m (A); 1 | j, m (B); 200 nm (C och D). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. Supraorganisation tylakoid Membran inom växtvävnader En fraktur kloroplast där de olika tylakoid brottytor kan ses. De exoplasmic brottytorna (EF) av de båda staplade (EFS) och är kumulativa (efu) membran regioner innehåller fotosystem II (PSII) komplex; Den protoplasmic fraktur ansikte staplade regioner (PFS) innehåller de perifera ljus skörd antenn komplex av PSII, LHCII; Foto I (PSI) och ATP-syntas fraktur till protoplasma fraktur ansikte är kumulativa regioner (PFU); Cytokrom bs 6 f Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 4
Figur 4. Förändringar i Fotosystem II Organisation under uttorkning C. pumilum EF ansikten av tylakoid membran av växter vid olika RWC: (a) 100%, (B) ~ 40%, (C) ~ 15%, och (D och E) 5-10%.. Under uttorkning, tätheten av PSII i EFS möter gradvis minskar från ~ 1500 komplex pm -2 (A) till ~ 700 komplex pm -2 (~ 15% RWC, C). Främst i torrare förhållanden (5-10% RWC), några PSII komplex organisera sig i rader och matriser (D och E, pilar). Pilspetsen (E) markerar den PFS ansiktet, med LHCII antenn som ser ut att också att anordnas i rader, mellan vilka PSII rader skulle finnas i de komplementära EF. För ytterligare information om dessa data se 24. Skala barer. 100 nm Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 5
Figur 5. Ett exempel på segmentering av Fotosystem II Partiklar. Använda Fiji öppen källkod paket, proteinkomplex kan delas från bilderna med några steg (slutföra detaljerat förfarande som finns i del 4 i protokollet avsnitt). Bilder (A, original image) är suddiga med Gaussfiltret (B); bilden tröskel med hjälp av en automatisk lokal threshold verktyget (C); bilden är inverterad och vattendelare algoritmen tillämpas för att separata objekt som finns i nära kontakt (D); ett område av intresse väljs och utsidan rensas (E); partiklar (inom en användardefinierad storleksintervall) väljs med hjälp av partikel analysator funktionen. Den resulterande masken visas i (F). Partiklar tillsätts till ROI Manager och överlagras på den ursprungliga bilden (G) för att söka efter fel eller felaktiga eller uteblivna partiklar. Listan över ROI kan redigeras manuellt, ersätta, ta bort eller lägga till nya ROI, när så är lämpligt. Den slutliga användaren redigerade urvalet visas i (H). Skala bar:. 200 nm Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den teknik som beskrivs i detta dokument tillåter undersökning av fryst brutna membran inom ramen för välbevarade högtrycks fryst växtvävnader genom kryo-svepelektronmikroskopi. Den stora fördelen med att använda dessa förfaranden är att provberedningen är rent fysisk; inga åtgärder som rör kemikalier eller uttorkning är nödvändig. Således tillåter det att studera biologiska strukturer på ett nästan naturliga tillstånd 26,32. Fördelen med att använda bladvävnader är att man kan få information om den totala cellulära organisation, samt undersöka specifika membran, såsom tylakoid membran, inom sitt eget fysiologiskt sammanhang, det vill säga inom kloroplasten. En annan fördel, absolut nödvändigt att studera C. pumilum växter vid olika relativa vatteninnehåll (RWC), är att deras hydrering tillstånd inte förändras under framställningen. Detta är i motsats till användning av isolerade kloroplaster eller tylakoid membran som utgångsmaterialför en frysfraktur experiment. I det senare har man också ta hänsyn till att vissa strukturella och / eller supramolekylära förändringar sannolikt ske under organell / membranisolering.

Att arbeta med växtvävnadsprover, som är relativt tjocka [> 50-100 um, och kan vara betydligt tjockare beroende på vilken typ av vävnad och arter], dikterar användningen av högtrycks frysning (HPF) för prov förglasning. Applicering av högt tryck [2100 bar], vid vilken smälttemperaturen för vatten är ca -22 ° C, påverkar vätebindningsnätverk av vattnet så att den saktar ner hastigheten för iskristallbildning. Därför är chansen att få en förglasat prov hög även vid relativt långsamma kylningshastigheter. HPF är för närvarande den enda metod som finns för vitrifiering av tjock, men högst 200 pm, prover. Ett kritiskt steg för HPF av växtvävnader är infiltration av deras interluftspalter med en inert4;. Utrymme filler "före frysning, för att förhindra vävnad kollaps under högt tryck (se recensioner 29,33) När det gäller C. pumilum blad, vars tjocklek kan vara upp till 1 mm, bladen har också trimmas eller tunnas före HPF.

I huvudsak kan även appliceras tekniken med replika beredning 18 för att frys fractured bladvävnader. Men i vår erfarenhet, tillräcklig avkastning av intakta brutna områden erhölls ej, eftersom repliker fragmentera ofta små bitar. Dessutom kan söka efter en specifik region av intresse, såsom kloroplaster vara opraktiskt inom fragmenterad kopior av växtvävnader. Detta beror främst på att mesophyll (foto) celler består av en stor central vacuole omgiven av en smal cytoplasma remsa (figur 2A), vilket inkluderar kärnan, kloroplaster och alla andra organeller. Således, kloroplaster endast utgör en mycket liten del av den totala brutna områdetmesophyll vävnader. Cryo-SEM-avbildning av fryst brutna prover erbjuder en lösning på detta problem, eftersom proverna direkt visualiseras efter fraktur (och beläggning / skuggning). Emellertid lider denna metod från den begränsningen att frysta hydrerad prover balk känsliga och därmed scanning vid höga förstoringar lätt skadar provet på första genomsökningen. Dubbelskiktsbeläggning (DLC) 27,28 erbjuder en lösning på detta allvarlig nackdel.

I DLC är brutna prover belagda på ett sätt som liknar hur de är för replika beredning. Först, ett tunt skikt - är (en 3 nm) av Pt / C indunstades på provet, som ger kontrast och ledningsförmåga. Detta följs av en tjockare (5-10 nm), skyddande skikt av kol. DLC i kombination med en hög accelerationsspänning (10 kV) användes för att bildprover med signalen 28 återspridda elektron (BSE). BSE signal, som härrör från platinaskikt tillåter erhålla information yta genom koletoch, eventuellt, vattenånga föroreningsskikt, som är praktiskt taget transparenta för BSE vid höga accelerationsspänningar (vattenförorening ackumuleras i experiment där en vakuum Cryo överföringsenheten inte används och den brutna ytan utsätts för atmosfären, även om detta är för en bråkdel av en sekund). Dessutom avbildning med BSE signal minimeras problemet med laddningseffekter som framgår i sekundär elektron (SE) upptäckt 27. Med mikroskopet inställningar som beskrivs här, avbildning av SE-signalen med In-objektivet SE detektor vid 10 kV gav information som motsvarar den som erhålls när proverna belades med enbart 2-3 nm Pt / C och avbildas vid låg accelererande spänningar. Skillnaden är att prover framställda av DLC och avbildas som beskrivs var betydligt mindre balk känsliga. Detta gjorde det möjligt att skanna dem vid höga förstoringar och i många fall även vid upprepade tillfällen, och tillät få värdefull information om fotoprotein supramolecular organisation och andra cellbeståndsdelar (Figurerna 2 - 4) 24.

Slutligen kan de förfaranden som beskrivs här modifieras för att studera strukturen och / eller membranprotein organisation i andra typer av prover. Vi har framgångsrikt använts tekniken för att studera den supramolekylära organisationen av fotosyntetiska membran i cyanobakterier och algceller (Shperberg-Avni et al. Opublicerade data). Det viktigaste skälet är att hitta balansen mellan att ha en så tunn prov som möjligt, för att öka chansen för vitrifiering, samtidigt som prov intactness. För olika typer av prover, som kan vara suspensioner eller djur / växtvävnader, bör olika förpackningar användas (t.ex. när det gäller den typ av blodplättar som används för högtrycks frysning). Tidigare framgångsrik Cryo-immobilisering uppnås, ger ett utmärkt medel för att erhålla infor kombinationen av frysning-fraktur, DLC och Cryo-SEM imagingtion om membranprotein organisation med hög förstoring med minimal stråle skador.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Vi tackar Andres Kaech (universitetet i Zürich) för hans råd om svepelektronmikroskopi avbildning. Detta arbete stöddes av USA och Israel binationella jordbruksforskning och utvecklingsfonden (bevilja nr. US-4334-10, ZR), Israel Science Foundation (bevilja nr. 1034/12, ZR) och Human Frontier Science Program (RGP0005 / 2013, ZR). De elektronmikroskopi studier genomfördes vid Irving och Cherna Moskowitz Centrum för Nano och Bio-Nano Imaging vid Weizmann Institute of Science.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ethanol abs Bio-Lab 052505
Isopropanol Bio-Lab 162605
1-hexadecene Sigma-Aldrich H7009
0.1/0.2 Platelets Engineering Office M. Wohlwend GmbH, Switzerland 241 Platelets are of 3-mm diameter and 0.5-mm-thick (Type A) with 0.1/0.2-mm-deep cavities (of diamater 2 mm). Similar platelets can be obtained from Leica Microsystems.
High-precision-grade tweezers Electron Microscopy Sciences 72706-01 Dumont (Switzerland) Durostar style #5 tweezers; Can be substituted with other high-precision tweezers.
High-pressure freezing machine Bal-Tec HPM 010 High-pressure freezing alternatives: 1. HPF Compact 02, Wohlwend GmbH; 2. HPM 010, RMC Boeckeler; 3. EM PACT2, Leica Microsystems; 4. EM HPM 100, Leica Microsystems; 5. EM ICE, Leica Microsystems.
Freeze-fracture system Leica Microsystems EM BAF 060
Cryo preparation loading stage Leica Microsystems 16770228
Specimen holder for univeral freeze fracturing Leica Microsystems 16LZ04746VN Clamp holder for specimen carriers of diameter 3 mm
Vacuum cryo-transfer shuttle Leica Microsystems EM VCT 100
Scanning electron microscope Zeiss Ultra 055
Cryo SEM stage Leica Microsystems 16770299905
Image acquisiton software SmartSEM, Carl Zeiss Microscopy GmbH
Image analysis software Fiji/Image J, National Institute of Health http://fiji.sc/Fiji

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Anderson, J. M. Insights into the consequences of grana stacking of thylakoid membranes in vascular plants: a personal perspective. Aust. J. Plant Physiol. 26, (7), 625-639 (1999).
  2. Branton, D. Fracture Faces of Frozen Membranes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 55, (5), 1048-1056 (1966).
  3. Branton, D., et al. Freeze-Etching Nomenclature. Science. 190, (4209), 54-56 (1975).
  4. Goodenough, U. W., Staehelin, L. A. Structural Differentiation of Stacked and Unstacked Chloroplast Membranes - Freeze-Etch Electron Microscopy of Wild-Type and Mutant Strains of Chlamydomonas. J. Cell Biol. 48, (3), 594-619 (1971).
  5. Simpson, D. J. Freeze-Fracture Studies on Barley Plastid Membranes .6. Location of the P700-Chlorophyll a-Protein-1. Eur. J. Cell Biol. 31, (2), 305-314 (1983).
  6. Staehelin, L. A. Reversible Particle Movements Associated with Unstacking and Restacking of Chloroplast Membranes. Invitro. J. Cell Biol. 71, (1), 136-158 (1976).
  7. Miller, K. R. A Chloroplast Membrane Lacking Photosystem-I - Changes in Unstacked Membrane Regions. Biochim. Biophys. Acta. 592, (1), 143-152 (1980).
  8. Miller, K. R., Cushman, R. A. Chloroplast Membrane Lacking Photosystem-II - Thylakoid Stacking in the Absence of the Photosystem-II Particle. Biochim. Biophys. Acta. 546, (3), 481-497 (1979).
  9. Miller, K. R., Staehelin, L. A. Analysis of Thylakoid Outer Surface - Coupling Factor Is Limited to Unstacked Membrane Regions. J. Cell Biol. 68, (1), 30-47 (1976).
  10. Simpson, D. J. Freeze-Fracture Studies on Barley Plastid Membranes .3. Location of the Light-Harvesting Chlorophyll-Protein. Carlsberg Res. Commun. 44, (5), 305-336 (1979).
  11. Olive, J., Recouvreur, M., Girardbascou, J., Wollman, F. A. Further Identification of the Exoplasmic Face Particles on the Freeze-Fractured Thylakoid Membranes - a Study Using Double and Triple Mutants from Chlamydomonas-Reinhardtii Lacking Various Photosystem-Ii Subunits and the Cytochrome B6/F Complex. Eur. J. Cell Biol. 59, (1), 176-186 (1992).
  12. Olive, J., Vallon, O., Wollman, F. A., Recouvreur, M., Bennoun, P. Studies on the Cytochrome B6/F Complex .2. Localization of the Complex in the Thylakoid Membranes from Spinach and Chlamydomonas-Reinhardtii by Immunocytochemistry and Freeze-Fracture Analysis of B6/F Mutants. Biochim. Biophys. Acta. 851, (2), 239-248 (1986).
  13. Armond, P. A., Staehelin, L. A., Arntzen, C. J. Spatial Relationship between Light Harvesting Complex and Photosystem-1 and Photosystem-2 in Stacked and Unstacked Chloroplast Membranes. J. Cell Biol. 70, (2), 400-418 (1976).
  14. Staehelin, L. A. Chloroplast structure: from chlorophyll granules to supra-molecular architecture of thylakoid membranes. Photosynth. Res. 76, (1-3), 185-196 (2003).
  15. Nevo, R., Charuvi, D., Tsabari, O., Reich, Z. Composition, architecture and dynamics of the photosynthetic apparatus in higher plants. Plant J. 70, (1), 157-176 (2012).
  16. Platt, K. A., Oliver, M. J., Thomson, W. W. Membranes and Organelles of Dehydrated Selaginella and Tortula Retain Their Normal Configuration and Structural Integrity - Freeze-Fracture Evidence. Protoplasma. 178, (1-2), 57-65 (1994).
  17. Platt-Aloia, K. A., Thomson, W. W. Advantages of the use of intact plant tissues in freeze-fracture electron microscopy. J. Electron Microsc. Tech. 13, (4), 288-299 (1989).
  18. Carson, J. L. Fundamental technical elements of freeze-fracture/freeze-etch in biological electron microscopy. J. Vis. Exp. (91), e51694 (2014).
  19. Kirchhoff, H., et al. Low-light-induced formation of semicrystalline photosystem II arrays in higher plant chloroplasts. Biochemistry. 46, (39), 11169-11176 (2007).
  20. Johnson, M. P., et al. Photoprotective Energy Dissipation Involves the Reorganization of Photosystem II Light-Harvesting Complexes in the Grana Membranes of Spinach Chloroplasts. Plant Cell. 23, (4), 1468-1479 (2011).
  21. Kirchhoff, H., Tremmel, I., Haase, W., Kubitscheck, U. Supramolecular photosystem II organization in grana thylakoid membranes: evidence for a structured arrangement. Biochemistry. 43, (28), 9204-9213 (2004).
  22. Belgio, E., Ungerer, P., Ruban, A. V Light-harvesting superstructures of green plant chloroplasts lacking photosystems. Plant Cell Environ. (2015).
  23. Goral, T. K., et al. Light-harvesting antenna composition controls the macrostructure and dynamics of thylakoid membranes in Arabidopsis. Plant J. 69, (2), 289-301 (2012).
  24. Charuvi, D., et al. Photoprotection Conferred by Changes in Photosynthetic Protein Levels and Organization during Dehydration of a Homoiochlorophyllous Resurrection Plant. Plant Physiol. 167, (4), 1554-1565 (2015).
  25. Farrant, J. M., Brandt, W., Lindsey, G. G. An Overview of Mechanisms of Desiccation Tolerance in Selected Angiosperm Resurrection Plants. Plant Stress. 1, (1), 72-84 (2007).
  26. Walther, P. High-resolution cryoscanning electron microscopy of biological samples. Biological Low-Voltage Scanning Electron Microscopy. Schatten, H., Pawley, J. B. Springer. New York. 245-261 (2008).
  27. Walther, P., Müller, M. Double-layer coating for field-emission cryo-scanning electron microscopy--present state and applications. Scanning. 19, (5), 343-348 (1997).
  28. Walther, P., Wehrli, E., Hermann, R., Müller, M. Double-layer coating for high-resolution low-temperature scanning electron microscopy. J. Microsc. 179, (Pt 3) 229-237 (1995).
  29. Hess, M. W. Cryopreparation methodology for plant cell biology. Cell. Electron Microsc. 79, 57-100 (2007).
  30. Schertel, A., et al. Cryo FIB-SEM: Volume imaging of cellular ultrastructure in native frozen specimens. J. Struct. Biol. 184, (2), 355-360 (2013).
  31. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, (7), 676-682 (2012).
  32. Walther, P. Recent progress in freeze-fracturing of high-pressure frozen samples. J. Microsc. 212, (1), 34-43 (2003).
  33. Nevo, R., et al. Architecture of Thylakoid Membrane Networks. Lipids Photosynth. 30, 295-328 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics