मानव आंत्र म्यूकोसा के एक बहुकोशिकीय तीन आयामी Organotypic मॉडल के विकास के सूक्ष्म गुरुत्वाकर्षण के अधीन हो

Bioengineering

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Summary

एक तीन आयामी (3-डी) के माहौल में बढ़ कोशिकाओं 2-डी वातावरण (जैसे, बोतल या बर्तन) में सेल की खेती पर एक उल्लेखनीय सुधार प्रतिनिधित्व करते हैं। यहाँ हम घूर्णन-दीवार पोत (RWV) बायोरिएक्टर द्वारा प्रदान की microgravity के तहत सुसंस्कृत मानव आंत्र म्यूकोसा के एक बहुकोशिकीय 3-डी organotypic मॉडल के विकास का वर्णन है।

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Salerno-Goncalves, R., Fasano, A., Sztein, M. B. Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity. J. Vis. Exp. (113), e54148, doi:10.3791/54148 (2016).

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Abstract

क्योंकि एक तीन आयामी (3-डी) के माहौल में बढ़ कोशिकाओं संभावित कई (जैसे।, बोतल या बर्तन) 2-डी वातावरण में सेल की खेती के अंतराल को पाटने के लिए किया है। वास्तव में, यह व्यापक रूप से मान्यता प्राप्त है कि बोतल या बर्तन में विकसित कोशिकाओं डे के अंतर और ऊतकों, जहां से वे प्राप्त किए गए की विशेष सुविधाओं खो देते हैं। (क) स्थिर मॉडल और (ख) मॉडल का उपयोग कर बायोरिएक्टर: वर्तमान में, वहाँ मुख्य रूप से मूल निवासी बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) नकल उतार जहां कोशिकाओं scaffolds में वरीयता प्राप्त कर रहे 3-डी संस्कृति सिस्टम के दो प्रकार के होते हैं। पहली सफलता स्थिर 3-डी मॉडल था। बायोरिएक्टर का उपयोग कर 3-डी मॉडल ऐसे घूर्णन-दीवार पोत के रूप में (RWV) बायोरिएक्टर में एक और अधिक हाल ही में विकास कर रहे हैं। RWV बायोरिएक्टर की मूल अवधारणा 1990 के दशक में नासा के जॉनसन स्पेस सेंटर में विकसित किया गया था और इस तरह hypoxic, परिगलित कोर के विकास के रूप में स्थिर मॉडल की सीमाओं को पार करने के लिए माना जाता है। RWV बायोरिएक्टर वें दरकिनार हो सकता हैद्रव गतिशीलता है कि पोषक तत्वों और ऑक्सीजन की कुशल प्रसार की अनुमति देने के लिए प्रदान करके समस्या है। ये बायोरिएक्टर एक रोटेटर आधार का समर्थन और कहा कि उनकी वातन स्रोत प्रकार से भिन्न संस्कृति वाहिकाओं के दो विभिन्न स्वरूपों को बारी बारी से करने के लिए कार्य करता है कि से मिलकर बनता है: (1) धीरे टर्निंग पार्श्व वेसल्स (STLVs) केंद्र में एक सह-अक्षीय oxygenator, या (2 ) उच्च पहलू अनुपात वेसल्स (HARVs) ऑक्सीजन के साथ एक फ्लैट, सिलिकॉन रबर गैस हस्तांतरण झिल्ली के माध्यम से। जबकि बुलबुला गठन और फलस्वरूप अशांति से बचने के इन जहाजों कुशल गैस हस्तांतरण की अनुमति है। इन शर्तों लामिना का प्रवाह और कम से कम कतरनी शक्ति है कि मॉडल संस्कृति पोत के अंदर कम हो गुरुत्व (microgravity) में परिणाम। यहाँ हम एक आंतों उपकला सेल लाइन और प्राथमिक मानव लिम्फोसाइट, endothelial कोशिकाओं और fibroblasts microgravity के तहत सुसंस्कृत RWV बायोरिएक्टर द्वारा प्रदान की रचना मानव आंत्र म्यूकोसा के एक बहुकोशिकीय 3-डी organotypic मॉडल के विकास का वर्णन है। </ P>

Introduction

एक 3-डी मॉडल के निर्माण में पहली सफलता 1980 के दशक के शुरू में बताया गया था जब वैज्ञानिकों अलग (जैसे।, Laminin, कोलेजन प्रकार मैं, कोलेजन चतुर्थ, और fibronectin) पाड़ के प्रकार और वृद्धि कारकों के कॉकटेल में सुधार करने के लिए जांच शुरू कर दिया सेल करने वाली सेल और "स्थिर" 3-डी मॉडल 1-7 से ईसीएम बातचीत। तब से, इन मॉडलों के साथ मुख्य समस्या यह पोषक तत्वों के स्थानांतरण और ऑक्सीजन मध्यम और ऊतक निर्माणों 8 के भीतर में सीमाओं की गई है। इन विवो वातावरण है कि रक्त वाहिकाओं के नेटवर्क के आसपास से पोषक तत्वों की एक सतत प्रवाह और ऑक्सीजन प्राप्त करने में कोशिकाओं के विपरीत, इन मॉडलों के स्थिर प्रकृति की कोशिकाओं के लिए उनमें से प्रभावी वितरण hinders। उदाहरण के लिए, इन विट्रो स्थिर मॉडल में उत्पन्न सेल समुच्चय है कि आकार में कुछ मिलीमीटर से अधिक सदा ही hypoxic, परिगलित कोर 9 का विकास होगा। RWV बायोरिएक्टर इस समस्या को दरकिनार कर सकता हैद्रव गतिशीलता है कि पोषक तत्वों और ऑक्सीजन 10-12 के कुशल प्रसार की अनुमति देने के लिए प्रदान करके। हालांकि, आज तक, RWV बायोरिएक्टर का उपयोग कर काम एक या दो प्रकार की कोशिकाओं 13-17 के शामिल किए जाने के लिए सीमित कर दिया है। इसके अलावा, देशी ऊतकों के समान एक स्थानिक उन्मुखीकरण के बजाय, उन कोशिकाओं सेल समुच्चय का गठन किया। इन सीमाओं के लिए मुख्य कारण एक पाड़ एक एकीकृत फैशन में कोशिकाओं को शामिल करने में सक्षम की कमी की गई है। तिथि करने के लिए RWV बायोरिएक्टर में इस्तेमाल scaffolds मुख्य रूप से सिंथेटिक microbeads, ट्यूबलर सिलेंडरों या छोटे शीट 13-15,19-23 से कुछ अपवादों के साथ 16-18 मिलकर बनता है,। ये कड़ा माल जिसका संरचना और लचीलापन नहीं चालाकी से किया जा सकता है, और करने के लिए जो कोशिकाओं उनकी सतह से जुड़ी हैं। इस प्रकार, यह संभावना नहीं है कि इन मॉडलों, जिसमें मूल्यांकन करने के लिए एक प्रणाली प्रदान करेगा एक एकीकृत फैशन में, इस तरह के stromal कोशिकाओं के रूप में विभिन्न सेल घटकों (जैसे।, Fibroblasts, प्रतिरक्षा और endothelial कोशिकाओं) कि sHould पाड़ के भीतर फैलाया जा बारीकी से मानव ऊतक नकल करने के लिए।

यहाँ हम एक आंतों उपकला सेल लाइन और प्राथमिक मानव लिम्फोसाइट, endothelial कोशिकाओं से बना मानव आंत्र म्यूकोसा के एक बहुकोशिकीय 3-डी organotypic मॉडल के विकास का वर्णन है, और fibroblasts 24। इन कोशिकाओं को सुसंस्कृत microgravity तहत RWV बायोरिएक्टर 13,25-30 द्वारा प्रदान किया गया। हमारे 3-डी मॉडल में, ईसीएम ऐसी संस्कृति के माध्यम से इसी तरह के एक परासरणीयता (जैसे।, संस्कृति दौरान नगण्य diffusional मजबूरी) और क्षमता कोशिकाओं और अन्य प्रासंगिक बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन को शामिल करने के रूप में कई अलग-अलग गुण,, साथ ही पास उचित कठोरता बायोरिएक्टर 24 में इस्तेमाल किया जाएगा। जैविक सिस्टम बहुत जटिल हैं, और पिछले कुछ वर्षों में, वहाँ उन isolatio में अध्ययन करने के बजाय अपने आसपास के साथ सेल बातचीत की परीक्षा की ओर श्लैष्मिक अनुसंधान के ध्यान में एक बदलाव किया गया हैएन। विशेष रूप से, आंतों सेल अस्तित्व और भेदभाव को प्रभावित करने में सेल सेल बातचीत के महत्व को अच्छी तरह से 31-34 प्रलेखित है। विशेष रूप से, उपकला कोशिकाओं और उनके आला बीच संचार उपकला सेल विस्तार और भेदभाव 35 पर गहरा प्रभाव है। वास्तव में, यह व्यापक रूप से स्वीकार किया है कि न केवल सेल करने वाली सेल लेकिन यह भी सेल करने वाली ईसीएम बातचीत 3-डी संस्कृति मॉडल में रखरखाव और उपकला कोशिकाओं के भेदभाव के लिए महत्वपूर्ण हैं। पिछले अध्ययनों में इस तरह के कोलेजन मैं 24,36,37, 38 laminin और fibronectin 39 मूल निवासी म्यूकोसा के समान स्थानिक उन्मुखीकरण के अधिग्रहण की आंतों उपकला कोशिकाओं को प्रभावित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है के रूप में है कि पेट ईसीएम प्रोटीन का प्रदर्शन किया है। इस प्रकार, नई प्रौद्योगिकियों के विकास, हमारे 3-डी मॉडल 24 की तरह है, कि अगर शोधकर्ताओं जटिल सेलुलर और संरचनात्मक वास्तुकला विश्राम करने का इरादा नकल कर सकते हैं पेट के प्ररूपी विविधता की आवश्यकता हैऔर आंत microenvironment के समारोह। इन मॉडलों के विकास और नए मौखिक दवाओं और वैक्सीन उम्मीदवारों के मूल्यांकन में एक महत्वपूर्ण उपकरण प्रतिनिधित्व करते हैं।

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Protocol

आचार बयान: सभी रक्त नमूनों स्वयंसेवकों है कि प्रोटोकॉल नंबर एचपी-00040025-1 में भाग लिया से एकत्र किए गए थे। मैरीलैंड संस्थागत समीक्षा बोर्ड के विश्वविद्यालय इस प्रोटोकॉल को मंजूरी दे दी है और अध्ययनों से इस पांडुलिपि में शामिल करने के लिए स्वस्थ स्वयंसेवकों से रक्त के नमूनों के संग्रह के लिए अधिकृत किया। इस अध्ययन का उद्देश्य स्वयंसेवकों को समझाया गया था, और सभी स्वयंसेवकों को सूचित दे दी है, रक्त ड्रॉ से पहले सहमति पर हस्ताक्षर किए।

नोट: मध्यम पूरक तैयारी के लिए 1 टेबल देखें। 3-डी संस्कृति मीडिया की तैयारी के लिए 2 टेबल देखें।

1. संस्कृति वाहिकाओं की तैयारी

  1. 50 मिलीलीटर-पोत का भरण बंदरगाह की टोपी खोलना और (जैसे।, RPMI) बाँझ संस्कृति के माध्यम से 50 मिलीलीटर के साथ भरें। एक लामिना हुड में बाँझ शर्तों के तहत सभी प्रक्रियाओं का प्रदर्शन।
  2. टोपी की जगह और 70% इथेनॉल के साथ किसी भी सतह पर किसी भी गिरा मध्यम पोंछ।
  3. पोत incub करने की अनुमति देंआरटी पर हे / एन करने के लिए कम से कम 15 मिनट के लिए खा लिया।
  4. संस्कृति के माध्यम त्यागने और 3-डी संस्कृति के माध्यम से 30 मिलीलीटर जोड़ने के लिए भरण बंदरगाह का प्रयोग करें।
  5. 70% इथेनॉल के साथ किसी भी सतह पर किसी भी गिरा मध्यम साफ कर लें।

2. कोशिकाओं की तैयारी

  1. मानव उपकला कोशिका लाइन (HCT-8) 24,40।
    1. RPMI में संस्कृति कोशिकाओं 100 यू / एमएल पेनिसिलिन, 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन, 50 माइक्रोग्राम / एमएल जेंटामाइसिन, 2 मिमी एल glutamine, 1 मिमी सोडियम पाइरूवेट, 10 मिमी HEPES बफर और 10% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS के साथ पूरक ) (पूरक 1)। 70% confluency पर, 1 के अनुपात में विभाजित कोशिकाओं: 5।
  2. मानव colonic fibroblasts (सीसीडी-18Co कोशिकाओं) 24,41।
    1. बेसल ईगल मध्यम पूरक 1 के साथ समृद्ध संस्कृति में कोशिकाओं confluency पर, 1 के अनुपात में विभाजित कोशिकाओं:। 3।
  3. मानव नाल की शिरा endothelial (HUVEC) कोशिकाओं
  4. Endothelial बेसल मध्यम (ईबीएम) में संस्कृति कोशिकाओं मध्यम 100 माइक्रोग्राम / एमएल हेपरिन, 3 माइक्रोग्राम / एमएल Endothelial सेल के विकास अनुपूरक (ईसीजी) के साथ समृद्ध है, और 1 के पूरक 70% confluency, 1 के अनुपात में विभाजित कोशिकाओं में:। 2।
  • लिम्फोसाइटों / Monocytes
    1. मानक तकनीक का उपयोग करते हुए 43 घनत्व ढाल centrifugation द्वारा खून से परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear (PBMC) अलग।
      1. संक्षेप में, एक 10 मिलीलीटर-पिपेट का उपयोग कर, ध्यान से पतला रक्त के 30 मिलीलीटर जोड़ने (1: 1 रक्त: फॉस्फेट खारा बफर (पीबीएस)) घनत्व centrifugation मीडिया के 10 मिलीग्राम से युक्त एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में। centrifugation कदम के बाद, लिम्फोसाइटों और monocytes घनत्व centrifugation मीडिया और प्लाज्मा परतों के बीच "" सफेद परत में बसे रहेंगे।
      2. सफेद परत एक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग कर लीजिए। घनत्व centrifugation मीडिया के संग्रह को सीमित करके granulocyte संक्रमण से बचने। 43 धोने के बाद, यूके रूप में एसई PBMC है या तरल एन 2 में cryopreserved।
        नोट: यह उजागर करने के लिए काफी हद तक कि PBMC वृक्ष के समान कोशिकाओं और अन्य प्रकार की कोशिकाओं के एक छोटे से अनुपात के साथ, लिम्फोसाइटों और monocytes के होते महत्वपूर्ण है।
  • 5% सीओ 2 के माहौल में 37 डिग्री सेल्सियस पर मानक संस्कृति की शर्तों के तहत सभी कोशिकाओं को विकसित।
  • 3. कोलेजन-एम्बेडेड कोशिकाओं की तैयारी

    1. सम्मिलित की संख्या का निर्धारण प्रयोगात्मक शर्तों की संख्या के आधार पर की जरूरत सेट अप किया जाएगा। 6 अच्छी तरह से थाली के कुओं में सम्मिलित की उपयुक्त संख्या में रखें।
    2. HUVEC और fibroblasts के निलंबन की तैयारी:
      1. बोतल पीबीएस में दो बार धोएं और 0.05% trypsin tetrasodium ethylenediaminetetraacetate (trypsin-EDTA) के साथ trypsin, 0.25% (1x) का उपयोग कोशिकाओं को अलग। सेल संस्कृति सतह क्षेत्र की संपूर्णता को कवर करने के लिए पर्याप्त trypsin समाधान जोड़ें। टुकड़ी आमतौर पर 15 मिनट के लिए 5 के भीतर होता है
      2. लीजिएएक 50 मिलीलीटर-ट्यूब Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) -30% FBS के माध्यम के 30 मिलीलीटर युक्त में अलग कोशिकाओं।
      3. 10 मिनट के लिए 500 XG पर ट्यूब अपकेंद्रित्र।
      4. DMEM-30% FBS के माध्यम के 30 मिलीलीटर में कोशिकाओं Resuspend।
      5. Trypan नीले रंग की डाई के 20 μl के साथ resuspended कोशिकाओं के 20 μl गिराए द्वारा व्यवहार्य कोशिकाओं की कुल संख्या की गणना। सेल मिश्रण के साथ hemocytometer लोड। व्यवहार्य PBMCs सफेद स्पष्ट हो जाएगा; nonviable PBMC डाई अधिग्रहण और नीला हो जाएगा।
        1. 8 x 10 7 कोशिकाओं मिलीलीटर - - 5 की एकाग्रता में DMEM-30% FBS के माध्यम में प्रत्येक कोशिका प्रकार Resuspend 1।
    3. सेल युक्त कोलेजन जैल तैयार
      नोट: प्रत्येक पोत सेल युक्त कोलेजन जेल की ~ 5 मिलीलीटर की तैयारी की आवश्यकता होगी।
      1. एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में 1 एक्स DMEM मीडिया, 50 माइक्रोग्राम / एमएल जेंटामाइसिन, 2 मिमी एल glutamine और 10% गर्मी inactivat के साथ पूरक जोड़कर कोलेजन मिश्रण तैयारएड FBS प्लस 3 मिलीग्राम / एमएल गोजातीय कोलेजन-मैं, 10 माइक्रोग्राम / एमएल laminin, 40 माइक्रोग्राम / एमएल कोलेजन चतुर्थ, 10 माइक्रोग्राम / एमएल fibronectin, 2 माइक्रोग्राम / एमएल हेपरिन सल्फेट proteoglycan और 15 मिमी NaOH (शारीरिक पीएच तक पहुंचने के लिए)।
      2. ट्यूब बंद करो और कई बार inverting जब तक मिश्रण पूरी तरह से homogenized है द्वारा मिश्रण। बुलबुला गठन से बचें।
        महत्वपूर्ण: gelification को रोकने के लिए बर्फ पर मिश्रण रखें।
        1. महत्वपूर्ण कदम: मिश्रण एक अम्लीय उपस्थिति (पीले रंग) विकसित हैं, तो मिश्रण को बेअसर करने के लिए बाँझ 1 एन NaOH की कुछ बूँदें जोड़ें।
      3. क्रमशः समृद्ध कोलेजन मिश्रण (ऊपर वर्णित है) के लिए 2.0 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल, - 1.2 और 1.5 - 1.0 के घनत्व पर केंद्रित HUVEC और fibroblasts जोड़ें। ट्यूब बंद करें और कई बार inverting जब तक मिश्रण पूरी तरह से homogenized है द्वारा मिश्रण। बुलबुला गठन से बचें। महत्वपूर्ण: gelification को रोकने के लिए बर्फ पर मिश्रण रखें।
      4. सेल युक्त कोलेजन के 5 मिलीलीटर - 4 जोड़ेप्रत्येक डालने के लिए जेल, पहले एक 6 अच्छी तरह से थाली में भरी हुई है, और 1 घंटे के लिए कम या कोई आंदोलन के साथ हुड में gelify की अनुमति दी।
      5. 2 अतिरिक्त घंटे - 1 घंटे के बाद, 1 के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर 6 अच्छी तरह से थाली हस्तांतरण।
      6. हुड के लिए 6 अच्छी तरह से थाली लौटें, और एक बाँझ संदंश की मदद से और डालने झिल्ली से सेल युक्त जेल detaching से झिल्ली काट-छुरी aseptically। छोटे वर्गों में अलग जेल (~ 5 एक्स 5 मिमी) में कटौती।
      7. छोटे सेल युक्त चौकों भरने बंदरगाह का उपयोग कर एक 50 मिलीलीटर हार्व में जोड़ें।
    4. HCT-8 उपकला कोशिकाओं के निलंबन की तैयारी:
      1. बोतल पीबीएस में दो बार धोने और trypsin EDTA के उपचार के साथ trypsin, 0.25% (1x) का उपयोग कोशिकाओं को अलग। सेल संस्कृति सतह क्षेत्र की संपूर्णता को कवर करने के लिए पर्याप्त trypsin समाधान जोड़ें। टुकड़ी आमतौर पर 10 से 15 मिनट के भीतर होता है।
      2. DMEM-30% FBS के माध्यम के 30 मिलीलीटर में अलग कोशिकाओं लीजिए।
      3. Centrifuge DMEM-30% FBS के 10 मिनट के लिए 500 XG पर ट्यूब युक्त मध्यम।
      4. DMEM-30% FBS के माध्यम के 30 मिलीलीटर में कोशिकाओं Resuspend।
      5. व्यवहार्य कोशिकाओं की कुल संख्या की गणना 3.2.5 में वर्णित है।
      6. 10 7 कोशिकाओं एमएल की एकाग्रता में DMEM-30% FBS के माध्यम में HCT-8 उपकला कोशिकाओं Resuspend - 1।
      7. भरने के बंदरगाह का उपयोग कर 50 मिलीलीटर हार्व में केंद्रित HCT-8 उपकला कोशिकाओं के 1 मिलीलीटर जोड़ें।
    5. भरण बंदरगाह का उपयोग करके, अतिरिक्त 3-डी संस्कृति मध्यम (20 मिलीलीटर ~) जोड़ने जब तक पोत लगभग भरा हुआ है।
    6. टोपी की जगह और 70% इथेनॉल के साथ भरने के बंदरगाह के होंठ साफ कर लें।
    7. RWV के प्रत्येक सिरिंज बंदरगाह में एक सिरिंज की जगह: जगह एक 5 मिलीलीटर सिरिंज-3 से युक्त - 4 एक बंदरगाह में 3-डी संस्कृति के माध्यम से मिलीग्राम और अन्य बंदरगाह में एक 5 मिलीलीटर-खाली सिरिंज।
    8. जबकि लगभग मध्यम का एक ही मात्रा अन्य सिरिंज पोर्ट के माध्यम से इंजेक्ट किया जाता है खाली सिरिंज में खींच कर किसी भी दृश्य बुलबुले निकालें।
    9. Ves रखेंsels बायोरिएक्टर में, सत्ता पर बारी और प्रति मिनट के बारे में 13 से 14 घुमाव को गति निर्धारित किया है।
      नोट: महत्वपूर्ण कदम: रोटेशन दर कोशिकाओं, पोत के भीतर परिक्रमा जिससे वाहिनियों की दीवारों के साथ संपर्क से बचने बनाए रखने के लिए एक प्रयोग के दौरान एक बार कुछ समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है।
    10. 37 डिग्री सेल्सियस, microgravity तहत 5% सीओ 2 संस्कृति कोशिकाओं, RWV बायोरिएक्टर द्वारा प्रदान की।
    11. संस्कृति के माध्यम से बदलें हर 3 - 4 दिन ताजा 3-डी संस्कृति के माध्यम से लगभग 30 मिलीलीटर की जगह से।
    12. 4 दिन (± 1 दिन) के बाद, बायोरिएक्टर से जहाजों को हटा दें और वाहिकाओं (2 एक्स 10 7 / पोत) को लिम्फोसाइट / monocytes जोड़ें।
    13. एक अतिरिक्त 5 दिन (± 1 दिन) के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 बायोरिएक्टर में वापस वाहिकाओं रखें।
    14. अतिरिक्त 5 दिन (संस्कृति के 9 दिन) के बाद, वाहिकाओं (2 एक्स 10 7 / पोत) को लिम्फोसाइट / monocytes जोड़ने के लिए और करने के लिए 12 दिनों के लिए अतिरिक्त संस्कृतियों जारी है। संस्कृति के माध्यम से बदलें हर 3 - 4 दिन ताजा 3-डी संस्कृति के माध्यम से लगभग 30 मिलीलीटर की जगह से।

    4. कटाई 3-डी प्रोटोकॉल के लिए संस्कृतियों

    1. एक हस्तांतरण पिपेट फसल की सहायता के प्रत्येक छोटे जेल टुकड़ा, अब कहा जाता है "का निर्माण," एक छह अच्छी तरह से थाली 10% formalin बफर के 10 मिलीलीटर युक्त में साथ। आरटी पर 3 घंटे के लिए छोड़ दें या 12 के लिए - 4 डिग्री सेल्सियस पर 16 घंटा।
    2. लेबलिंग और प्रत्येक कैसेट में बायोप्सी फोम पैड के दो टुकड़े जोड़कर ऊतक प्रसंस्करण और एम्बेडिंग कैसेट तैयार करें।
    3. 10% formalin बफर में कैसेट विसर्जित कर दिया।
    4. संदंश की सहायता के साथ दो फोम पैड के बीच तय की निर्माणों जगह है।
    5. 10% formalin बफर में कैसेट विसर्जित कर दिया।
    6. , Embedding सेक्शनिंग, और धुंधला 44 के लिए मानक प्रक्रियाओं के साथ आगे बढ़ें।

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    Representative Results

    पहले हम एक आंतों उपकला सेल लाइन और प्राथमिक मानव लिम्फोसाइट, endothelial कोशिकाओं और fibroblasts microgravity की स्थिति 24 (चित्रा 1) के तहत सुसंस्कृत के शामिल मानव आंत्र म्यूकोसा के एक बहुकोशिकीय 3-डी organotypic मॉडल इंजीनियर है। Fibroblasts और endothelial कोशिकाओं को एक कोलेजन मैं अतिरिक्त पेट तहखाने झिल्ली प्रोटीन 45 (अर्थात्।, Laminin, कोलेजन चतुर्थ, फ़ाइब्रोनेक्टिन और हेपरिन सल्फेट proteoglycan) के साथ समृद्ध मैट्रिक्स में एम्बेडेड और बायोरिएक्टर RWV करने के लिए जोड़ा गया था। 10 के बाद - 15 दिन, ऊतकीय धुंधला विश्लेषण निर्माणों में अंकुर संरचनाओं की तरह की उपस्थिति का प्रदर्शन किया। लगभग 60 - इन उपकला कोशिकाओं के 80% उनके नाभिक ईसीएम, जो अच्छी तरह से विभेदित कोशिकाओं (चित्रा 2) की एक प्रमुख विशेषता है के पास एक बेसल स्थिति में स्थित साथ ध्रुवीकरण कोशिकाओं की एक monolayer के रूप में आयोजित किया गया।

    ईएनटी "fo: रख-together.within-पेज =" 1 "> आकृति 1
    चित्रा 1: 3-डी मॉडल के निर्माण का आरेख। चार चरण 3-डी प्रणाली का निर्माण करने के लिए आवश्यक हैं। सबसे पहले, कोशिकाओं की अपेक्षित संख्या प्राप्त करने के लिए 3-डी मॉडल, एक मानव आंतों enterocyte उपकला कोशिका लाइन (HCT-8) और प्राथमिक मानव endothelial कोशिकाओं और fibroblasts 2-डी मिला हुआ monolayers के रूप में बड़े हो रहे हैं उत्पन्न करने के लिए। दूसरा, से बना ईसीएम कोलेजन मैं अतिरिक्त पेट तहखाने झिल्ली प्रोटीन के साथ समृद्ध मैट्रिक्स (अर्थात्।, Laminin, कोलेजन चतुर्थ, फ़ाइब्रोनेक्टिन और हेपरिन सल्फेट proteoglycan) तैयार किया जाता है। तीसरा, fibroblasts और endothelial कोशिकाओं एक कोलेजन मैं मिश्रण में एम्बेडेड और इसके अलावा HCT-8 उपकला कोशिकाओं के द्वारा पीछा बायोरिएक्टर RWV करने के लिए जोड़ रहे हैं। चौथा, प्राथमिक लिम्फोसाइट दिन 4 और 9 (± 1 दिन) पर संस्कृति से जोड़ रहे हैं।"> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्र 2
    चित्रा 2: के बीच सामान्य मानव आंत और Organotypic मॉडल तुलना करें। Hematoxylin और 3-डी microgravity मॉडल में संवर्धित कोशिकाओं के eosin धुंधला: ऊतकों बैंगनी दाग ​​थे और पाड़ दाग गुलाबी। 3-डी मॉडल से कोशिकाओं सुसंस्कृत थे के लिए 14 ( 'ए' और 'बी') और 20 दिन (ग)। बीस दिन बोने के बाद, कुल सेल नंबर रखा जाता है, और कोशिकाओं में अच्छी तरह से विभेदित दिखा अंकुर-जैसी सुविधाओं के थे। छवियाँ 100X पर प्रदर्शित कर रहे हैं ( 'ए' और 'बी') और 40X ( "सी") बढ़ाई। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    उत्पाद का नाम Pkg। आकार पुनर्गठन काम एकाग्रता भंडारण
    Fibroblast वृद्धि कारक-बेसिक (bFGF) 25 मिलीग्राम 25 माइक्रोग्राम / एमएल शेयर समाधान तैयार करने के लिए; (RPMI प्लस 1% एफसीएस) बाँझ माध्यम से 1 मिलीलीटर, चक्कर आने, भंग 100 μl / विभाज्य जोड़ने के लिए में FGF का 25 माइक्रोग्राम जोड़ने 5 एनजी / एमएल पाउडर -20 सी, काम कर aliquots -20 सी, दोहराने से बचने फ्रीज / पिघलना
    स्टेम सेल फैक्टर (एससीएफ) 10 मिलीग्राम 10 माइक्रोग्राम / एमएल शेयर समाधान तैयार करने के लिए; (RPMI प्लस 1% एफसीएस) बाँझ माध्यम से 1 मिलीलीटर, चक्कर आने, भंग 250 μl / विभाज्य जोड़ने के लिए में एससीएफ की 10 माइक्रोग्राम जोड़ने 5 एनजी / एमएल पाउडर -20 सी, काम कर aliquots -20 सी, दोहराने से बचने फ्रीज / पिघलना
    Hepatocyte ग्रोथ फैक्टर (HGF) 5 मिलीग्राम 5 माइक्रोग्राम / एमएल शेयर समाधान तैयार करने के लिए; (RPMI प्लस 1% एफसीएस) बाँझ माध्यम से 1 मिलीलीटर, चक्कर आने, भंग 200 μl / विभाज्य जोड़ने के लिए में HGF के 5 माइक्रोग्राम जोड़ने 2 एनजी / एमएल पाउडर -20 सी, काम कर aliquots -20 सी, दोहराने से बचने फ्रीज / पिघलना
    endothelin 3 50 मिलीग्राम 50 माइक्रोग्राम / एमएल शेयर समाधान तैयार करने के लिए; (RPMI प्लस 1% एफसीएस) बाँझ माध्यम से 1 मिलीलीटर, चक्कर आने, भंग 100 μl / विभाज्य जोड़ने के लिए में Endotelin की 50 ग्राम जोड़ने 10 एनजी / एमएल पाउडर -20 सी, काम कर aliquots -20 सी, दोहराने से बचने फ्रीज / पिघलना
    laminin 1 मिलीग्राम 2 पर धीरे-धीरे गला लें - 8 सी, चक्कर आने और 100 μl / विभाज्य जोड़ने 10 मिलीग्राम / एमएल तरल -20 सी, काम कर aliquots -20 सी, दोहराने से बचने freEZE / पिघलना
    संवहनी endothelial वृद्धि कारक (VEGF) 10 मिलीग्राम 5 माइक्रोग्राम / एमएल शेयर समाधान तैयार करने के लिए; बाँझ पानी के 2 मिलीलीटर में वीईजीएफ़ के 10 माइक्रोग्राम जोड़ने, चक्कर आने, भंग 100 μl / विभाज्य जोड़ने के लिए 1 एनजी / एमएल पाउडर -20 सी, काम कर aliquots -20 सी, दोहराने से बचने फ्रीज / पिघलना
    लेकिमिया निरोधात्मक कारक (LIF) 50 मिलीग्राम 20 माइक्रोग्राम / एमएल शेयर समाधान तैयार करने के लिए; बाँझ पानी की 2.5 मिलीलीटर में lif की 50 ग्राम जोड़ने के लिए, चक्कर आने, भंग 100 μl / विभाज्य जोड़ने के लिए 4 एनजी / एमएल पाउडर -20 सी, काम कर aliquots -20 सी, दोहराने से बचने फ्रीज / पिघलना
    adenine 25 ग्राम 0.18 एम स्टॉक समाधान तैयार करने के लिए; 0.05 एम एचसीएल की 50 मिलीलीटर) (पानी की 50 मिलीलीटर में 37.1% एचसीएल के 250 μl) में 121.5 मिलीग्राम और adedine जोड़ने, भंवर भंग करने के लिए, फिल्टर बाँझ और1 मिलीलीटर जोड़ने / विभाज्य 1.8 x 10 -3 एम पाउडर 4 सी, काम aliquots -20 सी, दोहराने से बचने फ्रीज / पिघलना
    इंसुलिन 50 मिलीग्राम 5 मिलीग्राम / एमएल शेयर समाधान तैयार करने के लिए; ), भंवर भंग, फिल्टर बाँझ और 0.5 मिलीलीटर जोड़ने के लिए (पानी की 10 मिलीलीटर में 5 37.1% की μl एचसीएल) 0.005 एम एचसीएल के 10 मिलीलीटर में इंसुलिन के 50 मिलीग्राम / जोड़ने विभाज्य 5 मिलीग्राम / मिलीलीटर पाउडर -20 सी, काम कर aliquots -20 सी, दोहराने से बचने फ्रीज / पिघलना
    T3 100 मिलीग्राम 2 एक्स 10 -8 एम स्टॉक समाधान तैयार करने के लिए; 1 एम NaOH के 25 मिलीलीटर में T3 के 3.4 मिलीग्राम जोड़ने के लिए, पीबीएस के 9.9 मिलीलीटर में इस समाधान के 0.1 मिलीलीटर पतला, पीबीएस के 9.9 मिलीलीटर में फिर से पतला इस समाधान के 0.1 मिलीलीटर, भंग करने के लिए चक्कर आने, फिल्टर बाँझ और 0.5 मिलीग्राम / जोड़ने विभाज्य 2 एक्स 10 -11 एम पाउडर -20 सी, काम कर aliquots -20 <sup> ओ सी, दोहराने से बचने फ्रीज / पिघलना
    हैजा विष 5 मिलीग्राम 10 -7 एम स्टॉक समाधान तैयार करने के लिए; 5 मिलीलीटर में हैजा विष की 5 मिलीग्राम जोड़ने बाँझ DDH 2 हे (-20 सी में दुकान); 5 मिलीलीटर DDH 2 हे में इस समाधान के 50 μl पतला, चक्कर आने homogenise करने के लिए, फिल्टर बाँझ और 0.5 मिलीग्राम / विभाज्य जोड़ने 10 -10 एम पाउडर 4 - 8 सी, काम कर aliquots -20 सी, दोहराने से बचने फ्रीज / पिघलना
    फ़ाइब्रोनेक्टिन 1 मिलीग्राम 1 मिलीग्राम / एमएल शेयर समाधान तैयार करने के लिए; बाँझ distiled पानी की 1 मिलीलीटर में फ़ाइब्रोनेक्टिन के 1 मिलीग्राम जोड़ें। 30 मिनट की अनुमति दें। सामग्री के लिए समाधान में जाने के लिए। आंदोलन या चक्कर आने नहीं है। 100 μl / विभाज्य जोड़े 10 मिलीग्राम / एमएल पाउडर 4 - 8 सी, काम कर aliquots -20 सी, दोहराने से बचने फ्रीज / पिघलना
    APO-Transferrin 100 मिलीग्राम 5 मिलीग्राम / एमएल शेयर समाधान तैयार करने के लिए (1,000x); भंग करने के लिए पीबीएस ज़ुल्फ़ के 20 मिलीलीटर में transferrin के 100 मिलीग्राम जोड़ने के लिए, फिल्टर बाँझ और 0.5 मिलीग्राम / विभाज्य जोड़ने 5 मिलीग्राम / मिलीलीटर पाउडर -20 सी, काम कर aliquots -20 सी, दोहराने से बचने फ्रीज / पिघलना
    हेपरिन 50 केयू 50 मिलीग्राम / एमएल शेयर समाधान तैयार करने के लिए (1,000x); पानी चक्कर आने के 1 मिलीलीटर भंग करने में हेपरिन के 50 मिलीग्राम जोड़ने के लिए, फिल्टर बाँझ और 1 मिलीग्राम / विभाज्य जोड़ने 0.1 मिलीग्राम / मिलीलीटर पाउडर -20 सी, काम कर aliquots -20 सी, दोहराने से बचने फ्रीज / पिघलना
    Heparan सल्फेट proteoglycan 1 मिलीग्राम 0.1 मिलीग्राम / एमएल शेयर समाधान तैयार करने के लिए; बाँझ पानी भंवर भंग करने के 10 मिलीलीटर में Heparan सल्फेट के 1 मिलीग्राम जोड़ने के लिए, और 0.2 मिलीलीटर जोड़ने / विभाज्य 2 मिलीग्राम / एमएल पाउडर -20 सी, काम कर aliquots -20 सी, से बचनेदोहराएँ / फ्रीज पिघलना
    कोलेजन चतुर्थ 5 मिलीग्राम 2 मिलीग्राम / एमएल शेयर solutin तैयार: बाँझ 0.25% एसिटिक एसिड के 2.5 मिलीलीटर में कोलेजन वी के 2 मिलीग्राम जोड़ें। 2 समाधान में जाने के लिए सामग्री के लिए मानव संसाधन बेहतर dillution के लिए भंवर - 1 की अनुमति दें।। जोड़े 400 μl / विभाज्य 80 मिलीग्राम / मिलीलीटर पाउडर -20 सी, काम कर aliquots -20 सी, दोहराने से बचने फ्रीज / पिघलना

    तालिका 1: परिभाषित माध्यम अनुपूरक तैयार करना।

    F-12 मध्यम के साथ पूरक
    अभिकर्मक शेयर समाधान अंतिम समाधान रकम
    भ्रूण बछड़ा सीरम 10% 50 मिलीलीटर
    सोडियम पाइरूवेट 100 मिमी 1 मिमी 5 मिलीलीटर
    एल Glutamine 200 मिमी 2 मिमी 5 मिलीलीटर
    Hepes 1 एम 10 मिमी 5 मिलीलीटर
    जेंटामाइसिन 50 मिलीग्राम / मिलीलीटर 50 माइक्रोग्राम / एमएल 500 μl
    पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन 10,000 यू / एमएल / 10 मिलीग्राम / एमएल 100 यू / एमएल / 100 माइक्रोग्राम / एमएल 5 मिलीलीटर
    इंसुलिन 5 मिलीग्राम / मिलीलीटर 5 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर 500 μl
    T3 2 एक्स 10 - 8 एम 2 एक्स 10 -11 एम 500 μl
    adenine 1.8 x 10 - 1 एम 1.8 x 10 - 3 एम 5 मिलीलीटर
    transferrin 5 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर 500 μl
    हेपरिन 50 मिलीग्राम / मिलीलीटर 0.1 मिलीग्राम / मिलीलीटर 1 मिलीलीटर
    ईसीजी 3 मिलीग्राम / एमएल 3 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर 5 मिलीलीटर
    bFGF 25 माइक्रोग्राम / एमएल 5 एनजी / एमएल 100 μl
    एससीएफ 10 माइक्रोग्राम / एमएल 5 एनजी / एमएल 250 μl
    HGF 5 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर 2 एनजी / एमएल 200 μl
    endothelin 3 50 माइक्रोग्राम / एमएल 10 एनजी / एमएल 200 μl
    LIF 20 माइक्रोग्राम / एमएल 4 एनजी / एमएल 100 μl
    वीईजीएफ़ 5 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर 1 एनजी / एमएल 100 μl
    Choleran विष 10 -7 एम 10 -10 एम 500 μl </ Td>
    नोट: राशि से ऊपर उद्धृत 3-डी संस्कृति मीडिया की 500 मिलीलीटर की तैयारी के लिए है। मीडिया में कोई अधिक से अधिक 2 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए

    तालिका 2: 3-डी संस्कृति मीडिया की तैयारी।

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    Discussion

    इस पांडुलिपि में, हम प्राथमिक मानव लिम्फोसाइट, fibroblasts, और endothelial कोशिकाओं, साथ ही आंतों उपकला सेल लाइनों 24 सहित कई गुना प्रकार की कोशिकाओं के शामिल मानव आंत्र म्यूकोसा के एक bioengineered मॉडल के विकास का वर्णन है। यह 3-डी मॉडल में, कोशिकाओं microgravity की स्थिति 24 के तहत एक कोलेजन अमीर बाह्य मैट्रिक्स के भीतर सुसंस्कृत हैं।

    पहले से वर्णित के रूप में, इस मॉडल की प्रमुख विशेषताएं इस प्रकार हैं: (i) उपकला ऊतक monolayer संगठन की नकल करने की क्षमता है, (ii) उपकला कोशिकाओं, तंग जंक्शनों, डेस्मोसोम और microvilli की उचित polarity के प्रेरण, (iii) एक लंबे समय अवधि संस्कृति (20 दिन) प्राथमिक कोशिकाओं की उच्च व्यवहार्यता (अर्थात्।, fibroblasts और endothelial कोशिकाओं) के साथ, (iv) अभिव्यक्ति के ऊतकों की तरह villin, cytokeratin, ई cadherin और म्यू सहित भेदभाव मार्करोंसीआईएन (v) की क्षमता साइटोकिन्स की काफी मात्रा में उत्पादन करने के लिए (जैसे।, आईएल 8) और प्रतिजनी उत्तेजना पर alkaline फॉस्फेट, (vi) (जैसे ग्लूकोज के रूप में पोषक तत्वों अर्थात्।, disaccharidases की अभिव्यक्ति के परिवहन, और चीनी की उपस्थिति ट्रांसपोर्टरों), और (सात) आंतों उपकला कोशिकाओं (अर्थात्।, अवशोषण enterocyte, globet और एम कोशिकाओं), 24 की बहु-वंश भेदभाव।

    इसे उजागर करने के लिए है कि हमारे 3-डी मॉडल अन्वेषक का उपयोग कर अच्छी सेल संस्कृति के दिशा-निर्देशों 46-48 का पालन करना होगा प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। यह व्यवस्थित व्यवहार्यता, माइकोप्लाज्मा संदूषण और सेल के विकास के व्यवहार में परिवर्तन के लिए कोशिकाओं को नियंत्रित करने के लिए महत्वपूर्ण है। एक समस्या की पहचान की है, तो पहले यह सुनिश्चित करें कि कोई अनधिकृत परिवर्तन को प्रोटोकॉल के लिए पेश किया गया है। समस्या बनी रहती है, विभिन्न मध्यम घटकों (सीरम सहित) और / के एक नए बैच के लिए स्विचया कोशिकाओं। हमारे 3-डी मॉडल की एक सीमा है tumorigenic HCT-8 उपकला कोशिका लाइन का इस्तेमाल होता है। हालांकि, यह विचार करने के लिए HCT-8 लाइन की उपस्थिति व्यावसायिक रूप से उपलब्ध होने का लाभ प्रदान करता है कि महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, इन उपकला कोशिकाओं को व्यक्त नहीं करते हैं तो शास्त्रीय या गैर शास्त्रीय मानव ल्युकोसैट प्रतिजन (एचएलए) श्रेणी मैं 49,50 अणुओं। इस प्रकार, वे अलग एचएलए वर्ग मैं उपकला सेल PBMC alloreactivity के अभाव में haplotypes की PBMC साथ उपकला कोशिकाओं की संस्कृति अनुमति देते हैं। इसके अलावा, जब इस तरह के पेट स्टेम सेल organoids 51-53 के रूप में सिस्टम के साथ इस प्रणाली की तुलना, इस मॉडल में कई लाभ प्रदान करता है। पेट स्टेम सेल organoids कोशिका जीव विज्ञान और आंतों भेदभाव 51-53 के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं अमूल्य हालांकि, इस मॉडल पोषक तत्वों, दवाओं और रोगजनकों के लिए सीधी शिखर जोखिम परमिट। यह मॉडल भी ल्यूमिनल सामग्री इस तरह के विरोधी माइक्रोबियल पेप्टाइड और साइटोकिन्स के लिए आसान पहुँच प्रदान करता है। इसके विपरीत, organoids कॉम्पैक्ट हैं संयुक्त राष्ट्रएक ल्यूमिनल सतह अंदर की ओर का सामना करना पड़ के साथ अपने। नतीजतन, वहाँ उत्पाद के एक प्रतिबंधित राशि है कि 54 लुमेन organoid में पेश किया जा सकता है।

    हम मानते हैं कि हमारे बहुकोशिकीय 3-डी मानव आंत्र म्यूकोसा के organotypic मॉडल दोनों स्वास्थ्य और रोग में खोज के लिए एक उपकरण है, रोगज़नक़ों के साथ बातचीत, प्रतिजन की तस्करी, और भड़काऊ और चयापचय की प्रक्रिया 24 सहित के रूप में व्यापक क्षमता है। अंत में, हमारे 3-डी मॉडल की बहुकोशिकीय प्रकृति के कारण, हमारे मॉडल gain- और घाटे में पढ़ाई के प्रतिरक्षा सेल प्रकार है कि इन विवो में उपकला कोशिका व्यवहार को प्रभावित करने की संभावना है का उपयोग कर सक्षम हो सकता है।

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    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Quad Rotator/Independent Rotating Wall Vessel (RWV) bioreactor  Synthecon RCCs-4DQ For up to 4 vessels. Models with more or less vessels are also available.
    Disposable 50 ml-vessel Synthecon D-405 Box with 4 vessels
    HCT-8 epithelial cells  ATCC CCL-244
    CCD-18Co Fibroblasts  ATCC CRL-1459
    Human Umbilical Vein Endothelial Cells ATCC CRL-1730 HUVEC
    Fibroblast Growth Factor-Basic  Sigma F0291 bFGF
    Stem Cell Factor  Sigma S7901 SCF
    Hepatocyte Growth Factor  Sigma H1404 HGF
    Endothelin 3 Sigma E9137
    Laminin Sigma L2020 Isolated from mouse Engelbreth-Holm-Swarm tumor
    Vascular Endothelial Growth Factor  Sigma V7259 VEGF
    Leukemia Inhibitory Factor  Santa Cruz sc-4377 (LIF
    Adenine Sigma A2786
    Insulin Sigma I-6634
    3,3',5-triiodo-L-thyronine  Sigma T-6397 T3
    Cholera Toxin Sigma C-8052
    Fibronectin BD 354008 Isolated from human plasma
    apo-Transferrin Sigma T-1147
    Heparin Sigma H3149
    Heparan sulfate  proteoglycan Sigma H4777 Isolated from basement membrane of mouse  Engelbreth-Holm-Swarm tumor
    Collagen IV Sigma C5533 Isolated from human placenta
    Heat-inactivated fetal bovine serum  Invitrogen 10437-028
    D-MEM, powder Invitrogen 12800-017
    10% formalin–PBS  Fisher Scientific SF100-4
    Bovine type I collagen  Invitrogen A1064401
    Trypsin-EDTA  Fisher Scientific MT25-052-CI
    Sodium pyruvate Invitrogen 11360-070
    Gentamicin  Invitrogen 15750-060
    Penicillin/streptomincin  Invitrogen 15140-122
    L-Glutamine Invitrogen 25030-081
    Hepes Invitrogen 15630-080
    Ham's F-12 Invitrogen 11765-054
    Basal Medium Eagle Invitrogen 21010-046 BME
    RPMI-1640 Invitrogen 11875-093
    Endothelial Basal Medium Lonza CC-3156 EBM-2
    Endothelial cell growth supplement Millipore 02-102 ECGS

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

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