החלת העברת אנרגית תהודת קרינה (סריג) לבחינת יעילות טרנסלוקציה מפעיל ידי

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

חוקר את יחסי הגומלין בין חיידקים פתוגנים מארחיהם הוא אזור חשוב של מחקר ביולוגי. כאן אנו מתארים טכניקות צורך למדוד טרנסלוקציה מפעיל ידי burnetii Coxiella במהלך להשתקת גנים siRNA שימוש המצע כלאם.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Newton, P., Latomanski, E. A., Newton, H. J. Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing. J. Vis. Exp. (113), e54210, doi:10.3791/54210 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Burnetii Coxiella, הגורם הסיבתי של קדחת Q, הוא פתוגן תאיים שנשענת על סוג IV Dot / ICM הפרשת מערכת להקים נישה בשכפול הדנ"א. קבוצה של effectors הם translocated דרך המערכת הזאת לתוך התא המארח כדי לתפעל תהליכים המארח לאפשר את הקמתה של vacuole ליזוזום הנגזרות ייחודי עבור שכפול. השיטה המוצגת כאן כוללת שילוב של שתי טכניקות ומבוססות: להשתקת גנים ספציפית באמצעות siRNA ומדידה של טרנסלוקציה מפעיל באמצעות מצע סריג מבוסס המסתמך על פעילות β-lactamase. במסגרתו קיימים שתי גישות אלה, אנו יכולים להתחיל להבין את התפקיד של גורמים מארחים בתפקוד טרנסלוקציה מפעיל מערכת הפרשת חיידקים. במחקר זה בדקנו את התפקיד של Rab5A ו Rab7A, הוא רגולטורים חשובים של מסלול סחר endocytic. אנו מראים כי השתקת ביטוי גם בתוצאות חלבון לירידה מפעיל translocatioיעילות n. ניתן שיטות אלה לשנות בקלות לבחון פתוגנים תאיים תאיים אחרים כי גם לנצל מערכות הפרשה. בדרך זו, תמונה גלובלית של גורמי מארח מעורבים טרנסלוקציה מפעיל חיידק עשויה להתגלות.

Introduction

Burnetii Coxiella הוא פתוגן תאי ייחודי שגורם קדחת Q הידבקות בני אדם zoonotic. מחלה זו קשורה עם קשת רחבה של מצגות קליניות המשתרעות seroconversion אסימפטומטית לזיהום כרוני מסכנות החיים שבאו לידי לעתים קרובות ככל שנים אנדוקרדיטיס לאחר חשיפת 1. הדבקת בני אדם מתרחשת בעיקר באמצעות השאיפה של אירוסולים מזוהמים מעלי גירת המאגר העיקרי לזיהום, בפרט, פרות חולבות, כבשים ועזים. למרות זיהום Coxiella אצל בעלי חיים אלה הוא בדרך כלל תת-קליני, הזיהום עלול לגרום להפלה ואת עומס החיידקים ניכר בתוך נוזל שלית הלידה יכול לזהם בסביבה המקומית 1. דוגמה של זיהום כגון עומס עצום יכול להיות משני בריאות הציבור ועל ענף החקלאות נצפתה לאחרונה פרוץ קדחת Q שאירעו בהולנד 2. בין 2007 ו2010 למעלה מ -4,000 מקרים של בני אדם קדחת Q אובחנו פרוץ זה היה קשור זיהום משמעותי של חוות עיזים 3. בנוסף, Coxiella הוא נשק ביולוגי פוטנציאלי, כפי שסווג על ידי המרכז האמריקאי לבקרת מחלות ומניעתן, הודות ליציבות הסביבה של חיידקי מנת זיהומיות נמוכה צורך לגרום לתחלואה חמורה ולתמותה 4.

Coxiella קיים בשני שלבים: שלב א 'אורגניזמים, מבודדים ממקורות טבעיים, הם ארסיים מאוד Phase II אורגניזמים הם נחלשו מאוד in vivo. לדוגמא, לאחר קטעי מספר במבחנה של Coxiella burnetii תשע המייל Phase I אורגניזמים, שני חיידקי השלב הופקו המכילות מחיקה כרומוזומליות בלתי הפיכה ותוצאת lipopolysaccharide הקטום (LPS) 5. זן זה, ג burnetii NMII, הוא phenotypically דומה Phase I במודלים בתרבית רקמה ומספק במצב בטוחl לחוקרים ללמוד בפתוגנזה Coxiella במעבדות 5. בשנים האחרונות כמה פריצות דרך במהירות קידמו בתחום הגנטיקה Coxiella. בעיקר, התפתחות המדיה axenic (acidified בינוני ציסטאין ציטראט - ACCM-2) אפשר את הגידול ללא תאים של Coxiella בשני הנוזליים על תקשורת מוצקה 6,7. זה הביא לשיפור ישיר של כלים גנטיים זמינים Coxiella כולל מערכת ביטוי גנים מושרה, וקטורי הסעות ומערכות transposon אקראיים 8-11. לאחרונה, שתי שיטות איון גן ממוקד גם פותחו, לסלול את הדרך לבחינת מועמדים גנים ארסיות ספציפית 12.

בעקבות הפנמה על ידי מקרופאגים מכתשיים, Coxiella משכפל למספרים גבוהים בתוך תא קרום נכנס כינת Coxiella- המכיל vacuole (CCV). CCV דורש סחר endocytic מארח הendosomes המוקדם והמאוחר הגס עד שהוא מבשיל לכדי אברון נגזר ליזוזום 13. לאורך כל התהליך הזה, CCV רוכש גורמים מארחים כי גם מופיעים זמני או להישאר הקשורים vacuole, לרבות, אך לא רק, Rab5, Rab7, CD63 ו LAMP-1 13-15. שכפול של Coxiella בתוך תאי מארחים תלוי לחלוטין מערכת הפרשה Dot מתפקדת במלואה / ICM סוג IVB (T4SS) 8,16,17. מערכת ההפרשה זהו מבנה רב-חלבון הקשורים אבותיהם של מערכות נטייה והוא משתרע הוא ממברנות חיידקי vacuolar לספק חלבונים חיידקיים, כינת effectors, לתוך הציטופלסמה המארח 18. Coxiella T4SS מבחינה פונקציונלית מאוד דומה היטב את המערכת מאופיינת סוג IVB Dot / הפרשת ICM של הלגיונלה pneumophila 19,20. מעניין לציין, כי הפעלת טרנסלוקציה מפעיל T4SS ולאחר אינה מתרחשת עד Coxiella מגיע ליזוזום הנגזרות חומציאברון, כ 8 שעות לאחר הפגיעה 17,21. נכון להיום, מעל 130 effectors Dot / ICM זוהה 9,17,22-24. רבי effectors אלה לשחק תפקידים חשובים סבירים בעת שכפול של Coxiella בתוך תאי מארחים; עם זאת, effectors רק כמה מתאפיינים תפקודי 25-29.

במחקר זה אנו מנצלים assay טרנסלוקציה הקרינה מבוססי המסתמכת על המחשוף של המצע CCF2-AM סריג (להלן המכונה המצע כלאם) באמצעות פעילות β-lactamase בתוך הציטופלסמה התא המארח (איור 1). הגן של עניין הוא התמזג TEM-1 β-lactamase (בום) על פלסמיד כתב המספק ביטוי מכונן. מצע כלאם מורכב משני fluorophores (coumarin ו והעמסה) יוצרות זוג סריג. עירור של תוצאות coumarin ב סריג של וההעמסה ו פליטת קרינה ירוקה בהעדר טרנסלוקציה מפעיל; עם זאת, אם בלהM-מפעיל חלבון היתוך הוא translocated לתוך הציטופלסמה המארחת, כתוצאת β-lactamase פעילות וחותכת את טבעת β-לקטם של מצע כלאם, הפרדת זוג הסריג לייצר פליטת קרינה כחולה הבאות עירור. Assay טרנסלוקציה זה הוכח גם כגישה לזהות חלבונים מפעיל מתוך מגוון רחב של חיידקים תאיים תאיים שונים, כולל ג burnetii, L. pneumophila, L. longbeachae, trachomatis כלמידיה, וחיידק E. coli, סלמונלה Brucella 17,30-35.

כדי לקבוע את התפקיד של גורמי מארח ספציפיים על טרנסלוקציה מפעיל Coxiella אנו מנצלים שיטה מבוססת היטב עבור להשתקת גנים המכונית התערבות RNA, ב RNA התערבות הקטן במיוחד (siRNA). במקור מזוהה elegans Caenorhabditis, התערבות RNA היא תהליך הסלולר אנדוגני משומר המשמש defe המולדNSE מפני וירוסים כמו גם ויסות הגנים 36,37. לאחר עקדת siRNA רצף ספציפי, השפלה של mRNA מתרחשת דרך RISC (מורכב השתקה המושרה RNA) וכתוצאה מכך להשתקת גנים ספציפיים או 38 מציאה. במחקר זה, siRNA שמש למקד שני חלבונים מארחים, Rab5A ו Rab7A, אשר הם רגולטורים חשובים של מסלול endocytic. ההשפעה של השתקת Rab5A ו Rab7A על טרנסלוקציה מפעיל הוברר באמצעות ג burnetii pBlaM-CBU0077. CBU0077 נבחרה כפי שהוא הוצג בעבר להיות translocated ידי מערכת הפרשת Dot / ICM Coxiella של 17.

ניצול הוא להשתקת גני siRNA ואת assay טרנסלוקציה fluorescencebased המתואר כאן, אנחנו מתחילים להקים לחיקוי עבור גורמי המארח טרנסלוקציה של חלבונים מפעילים ידי Coxiella. גישה זו ניתן ליישם במגוון רחב של שניהם חיידקים תאיים תאיים שיש להם secretio דומהמערכות n אחראיות טרנסלוקציה של חלבונים מפעילים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: כל הנהלים חוקר צמיחה או מניפולציה של Coxiella burnetii RSA439 NMII צריכות להתבצע בתוך רמת זיהום פיזית 2 מעבדה ובתוך ארון בטיחות ביולוגי בהתאם להנחיות מקומיות. תרשים סכמטי של זרימת העבודה assay transfection טרנסלוקציה הפוכה המתואר להלן מוצג באיור 2.

1. הכנת ג תרבות burnetii הבעת CBU0077 התמזגו בטא לקטמאז (pBlaM-CBU0077) (יום 1)

  1. כן 1X ACCM-2 6:
    1. מערבבים את המרכיבים המפורטים בטבלה 1. התאם ל- pH 4.75 עם 6 M NaOH לעקר מסנן (לא החיטוי). ACCM-2 יציב במשך כשלושה שבועות מאוחסנים 4 ° C.
  2. צור ג מניות pBlaM-CBU0077 burnetii.
    1. להדביק הלה 229 תאים עם ג זן burnetii נושאת pBlaM-CBU0077 ומעבר עד vacuol גדולes הם נצפו ברוב המכריע של תאים.
      1. לגדל את ג זן burnetii נושאת pBlaM-CBU0077 בתוך 20 מ"ל ACCM-2 3 מיקרוגרם / מ"ל chloramphenicol המכיל בבקבוק תרבות 75 ס"מ 2 רקמות עם כובע פרקו במשך 7 ימים ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2, 2.5% O 2.
      2. צנטריפוגה ג burnetii pBlaM-CBU0077 התרבות ב 15,000 × גרם במשך 15 דקות ב RT.
      3. Re- להשעות גלולה ב 20 מ"ל DMEM + 10% נסיוב עגל עוברית (FCS) + 3 מיקרוגרם / מ"ל ​​chloramphenicol (מדיה תחזוקה). הסר מדיה מבקבוקון 2% ומחוברות 50 75 ס"מ של תאים 229 הלה. תוספת מחדש מושעה ג burnetii לתאים הלה 229. דגירה של 2 ימים על 37 מעלות צלזיוס 2 5% CO לאפשר זיהום של תאים 229 הלה להקים.
      4. פיצול תאים לתוך הבקבוק בתרבית רקמה 175 ס"מ 2.
        1. הסר מדיה מהבקבוק 75 ס"מ 2 ולשטוף בשכבה פעמיים עם מ"ל 10 מחומם מראש PBS.
        2. הוסף 1 מ"ל of 0.05% טריפסין-EDTA פתרון ומקום התאים ב 37 ° C + 5% CO 2 עבור 3 - 5 דקות כדי לנתק תאים.
        3. Re להשעות תאים 10 מ"ל של התקשורת תחזוקה. הוסף 2 מ"ל של תאים מחדש מושעה לתוך בקבוק 175 ס"מ 2 המכיל 38 מ"ל של התקשורת תחזוקה.
        4. לדגור על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 למשך 3 נוסף - 5 ימים עד 100% confluency הוא הגיע vacuoles גדול הם נצפו.
    2. איסוף supernatant מהבקבוק 175 ס"מ 2, להוסיף 10 מ"ל DH 2 O כדי לכסות את התאים 229 הלה נגוע דגירה במשך 15 דקות כדי lyse התאים הנגועים.
    3. שלב supernatant ותאי lysed ו גלולה ב g 15,000 × במשך 15 דקות ב RT.
    4. Re- להשעות גלולה ב 10 מ"ל DH 2 O. Lyse תאים נוספת על ידי העברת מחדש ההשעיה שוב ושוב באמצעות מחט 23G מצורף מזרק 10 מ"ל לפחות פי 20. גלולה ב g 500 × במשך 5 דקות כדי להסיר פסולת הסלולר.
    5. <li> הסר supernatant גלולה ב 15,000 × גרם במשך 15 דקות ב RT לאסוף ג burnetii.
    6. מחדש להשעות ג burnetii ב DMEM + 10% FCS ולכמת מספר החיידקים לפי 4. לדלל את 1 × 10 9 הגנום / ml באמצעות DMEM + 10 FCS% + 10% sulfoxide דימתיל (DMSO), מניות aliquot 50 μl לתוך צינורות microfuge ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס.
  3. לחסן 10 מ"ל של טרום התחמם chloramphenicol ACCM-2 המכיל 3 מיקרוגרם / מ"ל עם 20 μl של ג burnetii pBlaM-CBU0077 זן 17 (מתוך מניות שנוצרו 1.2 מאוחסן ב -80 מעלות צלזיוס) בבקבוק תרבות 25 סנטימטר 2 רקמות עם כובע פרקו. לגדול התרבות חיידקים למשך 7 ימים ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2, 2.5% O 2.

2. Transfection ההפוך של siRNA וזריעה של הלה 229 תאים (יום 4)

  1. בעת שימוש siRNA הניסיון בפעם הראשונה להכיןsiRNA כדלקמן:
    1. בקצרה בצנטריפוגה siRNA lyophilized על מנת להבטיח כי גלולת siRNA נאספה בתחתית של התחתית.
    2. Re- להשעות את siRNA pelleted לריכוז מניות סופי של 20 מיקרומטר ידי pipetting הנפח המתאים של חיץ siRNA 1x (טבלה 2).
    3. פיפטה הפתרון מעלה ומטה 3 - 5 פעמים כדי לערבב ומניחים על מערבל מסלולית במשך 30 דקות ב RT, צינור היפוך כל 5 - 10 דקות.
    4. בקצרה צנטריפוגות צינור כדי להבטיח את siRNA נאסף בתחתית של התחתית.
    5. Aliquot siRNA לתוך 50 aliquots μl צינורות microfuge ולאחסן ב -20 ° C עד הנדרשים.
    6. כדי ליצור 1 מיקרומטר עובד ריכוז siRNA, פיפטה 950 μl של siRNA 1X חיץ לתוך המניה aliquot 50 μl (20 מיקרומטר) בעת הצורך. הערה: זה ריכוז 1 מיקרומטר עובד ניתן להקפיא מופשר מספר פעמים עבור transfections חזר.
  2. מניחים DMEM + 10% FCS,; 0.05% טריפסין-EDTA ו PBS באמבט מים 37 ° C (או שווה ערך) למשך 30 דקות כדי לחמם לפני השימוש.
  3. הכנת רכיבי transfection:
    ההערה: הפרוטוקול הבא כבר אופטימיזציה עבור הלה 229 תאי microplate 96-היטב עם קירות שחורים תחתית שטוחה, שקופה. אופטימיזציה של כמות מגיב transfection, ריכוז של siRNA וזריעת צפיפות של תאים עשויה להיות נחוצה עבור שורות תאים שונות.
    1. עבור כל טוב, השתמש 0.1 מגיבים transfection μl, 15.9 μl מופחת סרום בינוני (מדיה חיונית מינימאלית המשמשת transfections, עיין בטבלה של חומרים) ו -4 μl של 1 מיקרומטר siRNA (וכתוצאה מכך ריכוז siRNA סופי של 40 ננומטר). השתמש צינורות microfuge נפרד עבור OTP, PLK1, Rab5A ו Rab7A. מדוד כל תנאי assay בשלושה עותקים. דוגמה של פריסת צלחת 96-היטב מוצג באיור 3.
      הערה: פרוטוקול זה משלבת את השימוש שני פקדים: OTP ו PLK1. OTP הואמורכב siRNA ארבע וקיווה כי כבר מותאמת לצמצום השפעות מחוץ יעד ובכך OTP משמש כביקורת שלילית, ללא מיקוד. גם מקושקש siRNA יכול לשמש כביקורת שלילית. פסד של תוצאות ביטוי PLK1 במות תא נרחב בכמה שורות תאים על ידי גרימת מסלולים פרו-אפופטוטיים ולכן siRNA PLK1 משמש כביקורת חיובית עבור transfection שבו מות תא וקושר ליעילות transfection.
      1. עבור כל transfection siRNA הניסיון, לשלב 0.4 מגיבים transfection μl ו 63.6 μl מופחת סרום בינוני בצינור microfuge פרט. וורטקס כל צינורות microfuge ולאפשר רכיבים מורכבים במשך 5 דקות ב RT.
      2. להוסיף 16μl של siRNA כל ניסיוני אל הצינורות המקבילים microfuge המכילים את מורכבות transfection. וורטקס דגירה במשך 20 דקות ב RT. הערה: חשוב שלא יעלה על 30 דקות, כמו יעילות transfection יקטן.
  4. במהלך 20 דקות incubation (2.3.1.2) להוסיף 20 μl של מגיב transfection בינוני + סרום מופחת + siRNA לערבב לתוך הבארות המתאימות של מגש 96-היטב תחתון ברור שטוח, שחור סטרילי.
  5. ברגע תקופת דגירת 20 דקות יושלם, זרע הלה 229 תאים בצפיפות של 3.92 × 10 3 תאים / טוב.
    1. קציר הלה 229 תאים מתוך ומחוברות או תת-ומחוברות 75 ס"מ 2 בקבוק תרבות רקמה DMEM מראש חימם + 10% FCS מחדש להשעות התאים הצפיפות הסופית של 4.9 × 10 4 תאים / מ"ל לפי שיטות סטנדרטיות. כדי להבטיח transfection היעילה לא נפגעת, להכין תאים במהלך תקופת הדגירה 20 דקות (2.3.1.2).
      1. שטפו את בשכבה של הלה 229 התאים פעמיים עם 10 מ"ל של PBS מחומם מראש.
      2. הוסף 1 מ"ל של תמיסת 0.05% טריפסין-EDTA ומקום הלה 229 התאים ב 37 ° C + 5% CO 2 עבור 3 - 5 דקות כדי לנתק תאים.
      3. ולאסוף תאים 9 מ"ל של DMEM מחומם מראש + 10% FCס ספירת תאים באמצעות haemocytometer ולהכין תאי צפיפות סופית של 4.9 × 10 4 תאים / מיליליטר באמצעות DMEM + 10% FCS.
    2. פיפטה 80 μl של הלה 229 תאים בצפיפות של 4.9 × 10 4 תאים / מ"ל לבאר כל שמכילה את מגיב transfection + תערובת בינוני + siRNA מופחתת בסרום. זה מתאים צפיפות תאים של 3.92 × 10 3 תאים / טוב.
      הערה: חיסור רקע נדרש עבור מצע כלאם.
      1. אל תוסיף תאים או siRNA כדי "ריקות" בארות (איור 3). במקום זאת, הוסף 80 μl של DMEM + 10% FCS לבארות אלה להגדיר בשלושה עותקים.
    3. דגירה של 24 שעות ב 37 ° C + 5% CO 2.

3. מדיה שינוי (יום 5)

  1. לאחר 24 שעות, להסיר תקשורת באמצעות מתאם רב המחובר למקור ואקום או ידני עם טפטפת רב ערוצית, ולהחליף עם 100 μl של prewarm הטריed DMEM + 10% FCS.
  2. דגירה במשך שעה 48 נוסף על 37 מעלות צלזיוס + 5% CO 2.
  3. בשלב זה, לבדוק את הכדאיות של תאים באמצעות חזותי מיקרוסקופ אור רגילה. אם transfection ההפוכה הצליחה, מוות תאי משמעותי יקוים ב הבארות המכילות PLK1 siRNA לעומת OTP siRNA.

4. כימות הזנים Coxiella burnetii pBlaM-CBU0077 באמצעות qPCR (יום 7)

  1. לאחר 7 ימים של צמיחה ב ACCM-2 על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2, 2.5% O 2 (1.3), צנטריפוגה 10 מ"ל ג burnetii pBlaM-CBU0077 התרבות ב 15,000 × גרם במשך 15 דקות ב RT.
  2. Re- להשעות את גלולה חיידקי 10 מ"ל של טרום חימם DMEM + 10% FCS. כן 1:10 ו 1: 100 דילולים של התרבות (מדגם) באמצעות DH 2 O.
  3. הגדר את הרכיבים הנדרשים עבור qPCR.
    הערה: מיצוי gDNA יכול להתבצע מראש ולאחסן ב -20 ° C until הנדרש.
    1. הכנת תקנים:
      1. חלץ gDNA מ Coxiella burnetii RSA439 NMII זן סוג בר הגדלים ACCM-2 על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2, 2.5% O 2 למשך 7 ימים באמצעות ערכת חילוץ gDNA, לפי הוראות היצרן.
      2. מדדו את הריכוז gDNA (ז / μl) באמצעות Nanodrop (או שווה ערך) לעבר ספיגת של 260 ננומטר.
      3. חישוב מספר העותקים הגנום לכל μl באמצעות הנוסחה הבאה להלן, ולהמיר למספר של הגנום / מ"ל.
        משוואה
      4. התאם את מספר מ"ל / הגנום עד 10 9 / מ"ל (בנפח סופי של 100 μl) בצינור microfuge חדש באמצעות DH 2 O. זה יכול להיות מבושל במשך 10 דקות ומאוחסן ב -20 ° C עד נדרשים.
      5. ביום של הזיהום, לייצר 10 מתקפלים דילולים סידוריים של 10 מיליליטר 8 הגנום / 10 מיליליטר 5 הגנום / מן הגנום 10 9s / ml המלאי.
        1. פיפטה 10 μl של 10 9 הגנום / מ"ל לתוך 90 μl של DH 2 O לייצר 10 8 הגנום / מ"ל. וורטקס לערבב. פיפטה 10 μl של 10 8 הגנום / מ"ל לתוך 90 μl של DH 2 O לייצר 10 7 הגנום / מ"ל. וורטקס וחזור עד 10 מ"ל 5 הגנום /.
    2. הגדרת התגובה qPCR. צור תערובת אב 25 בארות לתת דין וחשבון על כל שגיאות pipetting. עבור כל טוב, השתמש 10 מיקס μl qPCR מאסטר; 2 μl של תערובת פריימר ompA (4.3.2.2) ו -3 μl של DH 2 O.
      הערה: OmpA הוא חלבון חיצוני-קרום של ג burnetii '39 וכן סעיף 82-בסיס-זוג בתוך אזור השמור ביותר נבחר לשימוש כמו בדיקה כפי שתואר לעיל 40.
      1. הגדרת כל תקן (DH 2 O, 10 5, 10 6, 10 7, 10 8, 10 9 הגנום / מ"ל) מדגם (1:10 ו 1: 100 דילול) בתוך 96 היטב PCR להנתק צלחת (לא מרופדת) בשני עותקים או בשלושה עותקים, בהתאמה. הוסף 5 μl של מדגם או רגיל לתוך הבארות המתאימות.
      2. שימוש DH 2 O, לדלל הן פריימר קדימה ompA (5'-CAGAGCCGGGAGTCAAGCT-3 ') ו ompA לאחור תחל (5'-CTGAGTAGGAGATTTGAATCGC-3') לריכוז סופי של 4 מיקרומטר ולשלב לתוך הצינור אותו microfuge.
        הערה: שילוב פריימר ompA ניתן להכין מראש ולאחסן ב -20 ° C עד הנדרשים.
      3. מערבבים 250 μl מיקס מאסטר qPCR, 50 μl תערובת פריימר ompA, 75 μl DH 2 O ו מערבולת לערבב. הוסף 15 μl של תמהיל אמן זה לבארות המכילות גם סטנדרטים או דוגמאות.
      4. מניח כמוסות רצועת 8-מכסת PCR על בארות המתאימים צנטריפוגות דופק צינורות PCR כדי לוודא שהכל נאספו בתחתית הצינורות.
      5. הגדר את התוכנית הבאה על ma PCR כמותיChine: 50 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ואחריו 45 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס במשך 1 שניות ו -60 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות (איור 4 א).
    3. נתח את ה- CT (סף מחזור) ערכים מן qPCR:
      1. מעבירים את ערכי ה- CT כדי גיליון אלקטרוני באמצעות פונקציית הייצוא של התוכנית.
      2. צור scatterplot של התקנים 10 5 הגנום / מיליליטר עד 10 מיליליטר 9 הגנום / (מבוטא ערכי יומן). לבטל את כל חריגות ברורות בין הדגימות בשלושה עותקים. צור קו מגמת לוגריתמים ולקבוע את המשוואה של הגרף.
      3. חשב את המספר הכולל של הגנום / מיליליטר במדגם באמצעות המשוואה שנוצרה 4.3.3.2. אל תשכחו לתת דין וחשבון על הדילול הראשוני (1:10 ו 1: 100) של הדגימות.

5. תאים transfected זיהום של היפוך (יום 7)

  1. לאחר חישוב מ"ל / הגנום סך ג ספחתnetii pBlaM-CBU0077 תרבות לשמש זיהום, להתאים תרבית החיידקים מחדש מושעה להדביק תאים בכל משרד הפנים של 300 בנפח סופי של 50 μl / גם באמצעות prewarmed DMEM + 10% FCS.
    הערה: הצפיפות הצפויה של תאי הלה 229 זורעים עם זמן הכפלה רגיל לאחר 72 שעות היא 3.136 × 10 4 תאים / היטב. כמות החיידקים נדרש להדביק בכל משרד הפנים של 300 הוא 9.408 × 10 6 ב 50 μl, אשר משווה ל 1.88 × 10 8 מ"ל / חיידקים.
    1. בעזרת הערך שנמדד (ml / הגנום) qPCR (4.3.3.3), לדלל את החיידקים מחדש מושעה באמצעות FCS מראש חמם ​​DMEM + 10% בנפח סופי של 2 מיליליטר להדביק את תאי transfected ההפוכות.
  2. הסר את המדיה הקיימת מן ריק הפוך תאי transfected.
  3. הוסף 50 μl של החיידקים המדוללים (1.88 × 10 8 חיידקים / מיליליטר) כדי הבארות המתאימות. הוסף 50 μl של DMEM + 10% FCS הוא ריק uבארות ninfected.
  4. דגירה של 24 שעות ב 37 ° C + 5% CO 2.

תוספת 6. של כלאם מצע כדי לקבוע את הרמה של טרנסלוקציה (יום 8)

  1. הכן את הפתרונות לפתרון טעינת 6x המצע כלאם.
    הערה: פתרון A, B ו- C ניתן בתוך ערכת מצע כלאם (עיין בטבלה של חומרים). B פתרון עלול להיווצר משקע ב RT. לחמם את הפתרון הזה על 37 מעלות צלזיוס לפני השימוש ואת המשקע צריך לפזר.
    1. כאשר השימוש בערכה בפעם הראשונה, להוסיף 185 μl של DMSO (מסופק עם ערכת מצע כלאם) אל א הפתרון המיובש בהמשך, לאחסן את הפתרון מחדש מושעה ב -20 ° C.
    2. הכן פתרון 0.1 M Probenicid מראש ולאחסן 1 aliquots מ"ל ב -20 ° C עד לרגע השימוש.
      1. כן 0.4 M NaOH (1.6 גרם ב O 100 מיליליטר DH 2).
      2. כן 100 חיץ פוספט מ"מ Na pH 8 (1.56 גרם לאא 2 PO 4 .2H 2 HPO 4 O 100 מ"ל DH 2).
      3. ממיסים 1.25 גרם של Probenicid ב 22 מ"ל של 0.4 M NaOH ידי תסיסה נמרצת.
      4. להוסיף 22 מ"ל 100 במאגר פוספט מ"מ Na pH 8 (פתרון יהפוך מעונן) ומערבבים לפזר את המשקע שצורות.
      5. התאם את ה- pH עד 8 (במידת הצורך) באמצעות -1 M NaOH / HCl.
      6. מערבב נמרץ ומחממי מעטה (<50 מעלות צלזיוס) עד הפתרון הוא בעיקר ברור.
      7. מסנן (גודל נקבובי 0.2 מיקרומטר) ו aliquot ב 1 מיליליטר כרכים. aliquots חנות ב -20 ° C.
  2. עבור כל טוב, השתמש 0.06 μl פתרון, 0.54 B פתרון μl, 7.9 μl C פתרון ו -1.5 μl 0.1 M Probenicid. צור מיקס מאסטר עבור 30 בארות על ידי שילוב הראשון 1.8 μl של פתרון A ו- 16.2 μl של פתרון B יחד בתוך שפופרת microfuge. מערבב היטב בעזרת מערבולת. להוסיף 237 μl פתרון של C ו -45 μl של 0.1 M Probenicid. וורטקס לשלב כל components.
    הערה: הפתרון טעינת 6x יציב לתקופה של עד 4 שעות (בחשיכה) אבל צריכים להיות מוכנים קרוב ככל האפשר לפני השימוש.
  3. הוסף 10 μl של פתרון טעינת 6x ישירות לתוך כל הבארות ריקות הפוך טרנספקציה מבלי להסיר את המדיה הקיימת.
  4. דגירה את הצלחת על RT עבור 2 שעות בחושך.
  5. כדי לקבוע את רמת טרנסלוקציה, לכמת את כמות הקרינה באמצעות קורא microplate.
    שים לב: ההליך הבא הוא ספציפי קורא microplate ClarioSTAR. קוראי microplate Equivalent יכולים להיות מנוצלים גם.
    1. צור פרוטוקול עוצמת קרינה חדש באמצעות נקודת קצה כמצב הקריאה.
    2. כוונו את הפרמטרים הבסיסיים כדלקמן:
      1. בחר microplate 96-היטב.
      2. תחת הגדרות אופטיות, בחר 2 multichromatics עם הגדרות המוגדרים על ידי המשתמש הבא: (1) קלט 410-10 עירור ננומטר פליטת ננומטר 520-10. (2) קלט 410-10 עירור ננומטר 450-10 פליטה ננומטר. ודא היטב multichromatics נבחרה.
      3. בחר מיצוע מסלולית בקוטר של 3 מ"מ.
      4. תחת אופטי, בחר אופטי תחתון.
      5. תחת מהירות ודיוק, בחר מדויק. זה מתאים לשמונה אזורים לכל טוב.
    3. התאם את פריסת הצלחת על ידי בחירת הבארות המתאימות כמו דגימות.
    4. מדידת התחלה בחר.
    5. הסר את המכסה והנח את המגש לתוך קורא הצלחת. כדי למנוע מצב שבו יגיע ערכי קרינה מרביים, להבטיח את הערך הרווח מותאם. לשם כך, בצע התאמה רווחת באחת הבארות הנגועות כי כבר transfected הפוך עם siRNA OTP. זו תואמת את טרנסלוקציה הצפויה הגבוהה ביותר.
    6. מדידת ההתחלה בוחרת למדוד כל בארות המתאימים באמצעות קרינה תחתונה לעבר עירור של 410 ננומטר פליטה של ​​שני 450 ננומטר ו 520 ננומטר עבור קרינה כחולה וירוקה, בהתאמה.

7. ניתוח תוצאות:

  1. חשב את היחסשל 450 ננו-מטר ל 520 ננומטר (מכחול לירוק) עבור כל הדגימות הבאות הפחתה ריקה ולהביע יחסית מדגם OTP הנגוע.
    הערה: השלבים הבאים הניתוח מסופקים תכנית גיליונות אלקטרונית פשוטה.
    1. באמצעות פונקציית הייצוא על הקורא microplate, להעביר את ערכי הקרינה גלם המתקבלים עבור שני 520 ננומטר ו -450 ננומטר אורכי גל הפליטה (6.5) לתוך גיליון אלקטרוני.
    2. החישוב הממוצע של קריאות "ריקה" (מדיה בלבד, ללא תאים) עבור אורך גל 520 ננומטר על-ידי הוספת ערכי קרינת גלם 520 ננומטר וחלוקתו במספר הבארות (3). חזור באמצעות הערכים 450 ננומטר אורך גל הריק. ערכים אלה מייצגים את קרינת הרקע בשל הצלחת 96 היטב בתקשורת.
    3. הפחת את קרינת הרקע. באמצעות הערכים שהתקבלו ב 7.1.2 להפחית את הממוצע של אורך גל 520 ננומטר הריק מכל ערכי קרינת ננומטר מדגם 520. חזור על ערכים גל 450 ננומטר.
    4. כדי להשיג את 450: יחס ננומטר 520 להשתמש הערכים המתוקנים הריקים (7.1.3). מחלקים כל ערך קרינה מדגם 450 ננומטר על ידי שלה מקביל 520 ערך ננומטר.
    5. החישוב הממוצע של ערכי היחס OTP נגוע על ידי הוספת 450: ערכי יחס ננומטר 520 (מ 7.1.4) וחלוקתו במספר הבארות (3).
    6. חשב את היחס בין הדגימות ביחס נגוע OTP ידי חלוקת 450: יחס ננומטר -520 מחושב ב 7.1.4 על ידי הממוצע של ערך יחס OTP הנגוע מחושב ב 7.1.5.

תוספת 8. כתם גרעינים לקביעת מספר סלולרי לאחר Assay טרנסלוקציה (יום 8)

  1. בעקבות כימות של קרינה, סר מדיה המכילה פתרון טעינת 6x מכל הבארות או באמצעות מתאם רב ערוצית המחובר למקור ואקום או ידני באמצעות פיפטה רב ערוצים.
  2. הוסף 50 μl של 4% PFA (paraformaldehyde) פתרוןב PBS לכל הבארות המתאימות כדי לתקן תאים. לדגור על RT במשך 20 דקות.
  3. הסר 4% פתרון PFA PBS (לפי 8.1) ולשטוף תאים פעמיים עם 75 μl PBS של.
  4. הוסף 50 μl של כתם גרעיני חדיר תאים עבור DAPI למשל ( '4, 6-diamidino-2-phenylindole), זה טוב. לרכוש תמונות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ולכמת את מספר הגרעינים נוכחיים בכל טוב לאחר טיפול siRNA באמצעות תוכנת ניתוח תמונה מתאימה, כגון 41 ImageJ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

לצורך המחקר הזה, ג burnetii זן pBlaM-CBU0077 נבחר CBU0077 הוכח בעבר להיות מפעיל translocated של מערכת הפרשת Coxiella Dot / ICM 17. לפני ההדבקה, המספר הכולל של ml / הגנום של ג שבעה ימים תרבות burnetii pBlaM-CBU0077 הייתה מנויים באמצעות qPCR. איור 4 מדגי דוגמא של סף המחזור (CT) ערכים צפויים משני תקני הדגימות הבאים qPCR. ערכי CT (המיוצגים בעלילת ההגברה (האיור 4B) ומספרית (איור 4C)) יוצאו ונותחו כמתואר 4.3.3. בהתבסס על נתונים נציג לעין, היו 2.31 ​​× 10 8 הגנום / מ"ל ב 10 מ"ל מחדש תלויה תרבית החיידקים (איור 4D). כדי להפיק את הדילול בקטריאלי המתאים (1.88 × 10 8 הגנום / מיליליטר in 2 מ"ל), 1.63 מ"ל של חיידקים resuspended התווסף 370 μl של FCS טרי, מחומם מראש DMEM + 10%. תאים הפוכים טרנספקציה עם siRNA נדבקו כתוצאה מכך עם ג burnetii pBlaM-CBU0077 ב משרד הפנים של 300 למשך 24 שעות.

לאחר דגירה של ההפך תאים נגועים טרנספקציה עם כימות המצע כלאם של טרנסלוקציה מפעיל ניתן לקבוע באמצעות קורא צלחת פלואורסצנטי. בעקבות ניתוח כמתואר 7, כל הערכים ייחסו כי כבר מנורמלים הנגוע OTP יכולים גם להיות מנורמלים הנגוע OTP. רמת טרנסלוקציה מפעיל אחרי שדכאתי של גני מארח יכולה להיות מקובצת לשלוש תוצאות לאחר השוואה לשליטת OTP נגועה: (1) ללא שינוי; (2) גברת טרנסלוקציה מפעיל; (3) ירד טרנסלוקציה מפעיל. ניתוח סטטיסטי לאחר, למשל מבחן t הסטודנטים, שניתן להשתמש בהם כדי לקבוע את המשמעות של כל t ההבדל שנצפהo נגוע שליטה OTP. תוצאת השתקה או Rab5A או Rab7A על טרנסלוקציה מפעיל משלושה ניסויים עצמאיים מוצג באיור 5A. ירידה משמעותית ברמת טרנסלוקציה בום-CBU0077 התרחשו במהלך השתקה שניהם Rab5A ו Rab7A לעומת קבוצת ביקורת OTP (ערך p = 0.0088 (Rab5A) וערך p = 0.0059 (Rab7A), זיווג, מבחן t הסטודנטים). ההשפעה של טיפול siRNA על כדאיות התא גם הוקמה. בעקבות assay טרנסלוקציה, התאים היו קבועים, מוכתם בכתם גרעינים ובהמשך לכמת. כפי שניתן לראות בתרשים 5 ג, למרות טיפול עם או תוצאות Rab5A או Rab7A לירידה כדאיות התא לעומת קבוצת ביקורת OTP (12% ו -31%, בהתאמה), ירידה זו היא לא חמורה כמו PLK1 (97%), בגן הידוע מוות של תאים כדי לגרום (p-value = 0.0102 (Rab5A); p-value = 0.0081 (Rab7A); p-value <0.0001 (PLK1), זיווג, סטודנטים מבחן t). תוצאות אלו מראות כיצד השתקה של המארח geנוס באמצעות siRNA יכול לשנות את הרמות שליליות של טרנסלוקציה מפעיל חיידקים.

איור 1
איור 1. את מנגנון הפעולה של מצע כלאם במהלך הדבקה. ג burnetii מופנם על ידי תאי מארחים ויוצר vacuole נגזר-ליזוזום כינת vacuole Coxiella המכיל. 24 שעות לאחר ההדבקה, תאים נטענים עם המצע כלאם חדיר קרום שיש לה שני fluorophores להרכיב זוג סריג (א). בהעדר β-lactamase כלומר, לא טרנסלוקציה של מפעיל בום-CBU0077, עירור של coumarin ב 410 תוצאות ננומטר סריג וההעמסה, ציינו כאיתות פלואורסצנטי ירוקה (520 ננומטר) (B). במקרה של מערכת הפרשת Dot / ICM פונקציונלית, חלבון ההיתוך בום-CBU0077 יהיה translocated לתוך התא המארח יהיה CLeave מצע כלאם, אגב פעילות β-lactamase, גרימת הפרדת שני הצבעים וכתוצאה מכך שיבוש סריג ו אות קרינה כחולה (450 ננומטר) לאחר העירור ב 410 ננומטר (C). שני אותות הקרינה הירוקים וכחול יכולים להיות זוהה באמצעות קורא צלחת פלואורסצנטי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
. איור 2. סקירה סכמטית של Transfection הפוך טרנסלוקציה Assay Workflow יום 1: הכן את ג burnetii pBlaM-CBU0077 תרבות יום 4:. transfect היפוך באמצעות 40 ננומטר siRNA זרע הלה 229 תאים בצפיפות סופית של 3.92 × 3 תאים 10 / גם לתוך מגש 96-גם יום 5:. Chהתקשורת ange יום 7:. לכמת את מ"ל / הגנום הכולל של ג burnetii pBlaM-CBU0077 תרבות באמצעות qPCR ובהמשך להדביק תאי transfected הפוך עם משרד פנים של 300. יום 8:. להוסיף צבע טעינת 6x, מודד קרינה ולכמת מספר סלולארי אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. פריסת פלייט 96-גם משמשת הגדרת Transfection הפוך והזריעה של הלה 229 תאים. הבארות "הריקות" (באדום) מכילים מדיה בלבד ואינו צריך תוספת של או siRNA או הלה 229 תאים. SiRNA OTP (בכחול אור עבור בארות נגועות וכחול כהה עבור בארות נגועות) משמש כביקורת ללא מיקוד, שכן הוא כבר מותאםיש פחות תופעות מחוץ היעד. והחום של הבארות ירוקות לייצג את Rab5A ו Rab7A siRNA, בהתאמה. PLK1 siRNA (בצבע צהוב) משמש כמדד ליעילות transfection כאובדן ביטוי PLK1 יכול לגרום מסלולים פרו-אפופטוטיים מוות של תאים נרחבים בתוך רוב מכריע של שורות תאים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4. ערכים נציג qPCR Ct משמש לכמת את המספר הכולל של הגנום / מ"ל ב C. burnetii pBlaM-CBU0077 תרבות. (א) התנאים מחזור המשמש qPCR למנות את מספר מ"ל / הגנום בתרבויות Coxiella. ערכי Ct לשני תקני דגימות מיוצגים גרפי (B) ו נומרית (C)פורמטים. (ד) ערכי ה- CT הרגילים היו בממוצע, בגרף לבין קו מגמת לוגריתמי חושב. באמצעות המשוואה ואת הממוצעים של המדגם Ct מעריך את המספר הכולל של מיליליטר / הגנום של ג burnetii תרבות pBlaM-CBU0077 היה נחוש בדעתו להיות 2.31 ​​× 8 10. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
טרנסלוקציה איור 5. ה DOT / ICM מפעיל בום-CBU0077 במהלך siRNA השתקת Rab5A ו Rab7A. הלה 229 תאים היו transfected הפוכה עם siRNA הספציפי Rab5A (ברים חומים), Rab7A (פסים ירוקים), OTP (סורגים כחולים) או PLK1 (פסים צהובים) וטופחו במשך 72 שעות לפני ההדבקה עם ג burnetii זן pBlaM-CBU0077 ב משרד הפנים של 300 למשך 24 שעות. לאחר tהוא התוספת של מצע כלאם, קרינה נמדד באמצעות קורא microplate (א) הטבלה מדגימה את ערכי קרינת גלם המתקבלים בניסוי יחיד לצד 450:. ביחס יחס 520 ננומטר לשליטת OTP נגוע לאחר הפחתת הערכים הריקים (מדיה רק, לא תאים). רמת טרנסלוקציה (B) ואת כדאיות התא (C) מוצגים כאחוז ממוצע ± סטיית התקן ביחס לתאים נגועים טרנספקציה הפוכה OTP משלושה ניסויים עצמאיים. * P-value <0.05; **-ערך p <0.01; **** P-value <0.0001 (זיווג, -test t סטודנטים). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

רְכִיב ריכוז אונג>
חוּמצַת לִימוֹן 13.4 מ"מ
נתרן ציטרט 16.1 מ"מ
פוספט אשלגן 3.67 מ"מ
מגנזיום כלוריד 1 מ"מ
סידן כלורי 0.02 מ"מ
סולפט ברזל 0.01 מ"מ
נתרן כלורי 125.4 מ"מ
L- ציסטאין 1.5 מ"מ
neopeptone 0.1 גר '/ ל
חומצות casamino 2.5 גר '/ ל
cyclodextrin בטא מתיל 1 גר '/ ל
RPMI 125 מ"ל / L

טבלה 1. הרכיבים הנדרשים כדי להפוך 1x ACCM-2.

xt.within-page = "תמיד">

נפח טבלת 2. של siRNA 1x כרית הון הנדרש עבור הידרציה Lyophilized siRNA לריכוז המתאים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מערכות הפרשה, ואת החלבונים מפעילים חיידק תחבורת מערכות אלה לתוך הציטופלסמה של תאי מארחים, הם מרכיב חשוב ארסיות שרב חיידקים פתוגניים לנצל להקים זיהום בתוך נישות בשכפול הדנ"א ייחודיות. ההתמקדות של קבוצות מחקר רבות כבר לחקור את יחסי הגומלין בין effectors חיידקי חלבונים מארחים ואת ההשפעה שיש effectors אלה על מסלולים הסלולר מארחים. מחקר מצומצם מאוד, אם בכלל, בדק את פוטנציאל חלבונים מארחים להיות הכרחיים עבור טרנסלוקציה מפעיל חיידק מוצלח.

במחקר זה השתמשנו לחייב, burnetii Coxiella הפתוגן התאי, הגורם הסיבתי של קדחת Q zoonotic. לאחר כניסתו תאי מארח, vacuole Coxiella המכיל traffics סביל דרך מסלול endocytic הקנונית עד השגת vacuole ליזוזום נגזרות חומצי, שם הוא משכפל למספר גבוה מאוד. מלבד לקיחת advantage של מסלול סחר מארח הנורמלי, את היכולת של Coxiella להקים נישה בשכפול הדנ"א מוצלחת גם מסתמך על מערכת הפרשת IVB סוג תפקודי (T4SS) טרנסלוקציה מפעיל עוקב 8,17. מערכת הפרשה זה מבחינה פונקציונלית מקבילה T4SS Dot / ICM היטב המאופיין של הלגיונלה. הדבר בא לידי ביטוי בצורה הולמת על ידי המשלים מוטציות ספציפיות נקודה / ICM של הלגיונלה עם גני Coxiella שלהם 19,20. למרות T4SSs של שתי הלגיונלה ו Coxiella חיוני עבור שכפול, העיתוי כאשר מערכות אלה מופעלות שונה לגמרי ומשקף את טבעה מסתעף הנישות בשכפול הדנ"א שלהם. הלגיונלה T4SS מופעלת מייד במגע עם תאים מארחים ושל טרנסלוקציה המהירה של effectors מאפשר לחיידקים להימנע מסלול endosomal-ליזוזומלית מחדל ובמקום ליצור vacuo בשכפול נגזרות מיון ייחודיle 42. לעומת זאת, T4SS של Coxiella אינו מופעל עד כ -8 שעות לאחר הפגיעה, לאחר חיידקים להגיע 21 ליזוזום הנגזרות vacuole חומצי.

בהתחשב בכך Coxiella transits סביל דרך מסלול endocytic ומערכת טרנסלוקציה אינו מופעל עד שהוא מגיע ליזוזום, הזדמנות ייחודית להציג את עצמה להשתמש Coxiella ככלי ללמוד התבגרות endocytic. הדרישה עבור CCV כדי להיות acidified לפני effectors הוא translocated עולה כי מספר החלבונים המארחים חשוב טרנסלוקציה של חלבונים מפעילים לתוך הציטופלסמה המארח, בפרט, אך לא רק, חלבונים מעורבים מסלול סחר endocytic. ניצול siRNA באופן ממוקד ספציפי אנו יכולים להתחיל להבהיר את התפקיד של חלבוני שורה מסוימים ב טרנסלוקציה מפעיל. במחקר זה התמקדנו בשני חלבונים המווסתים את trafficki endocytic איקריוטייםng מסלול, ומכאן נחזו לחולל טרנסלוקציה של Coxiella מפעיל CBU0077. Rab5A ואיחוי קרום Rab7A שליטה עם endosomes המוקדם והמאוחר, בהתאמה. השתקה או של חלבונים אלה באמצעות siRNA הביאה לירידה משמעותית יעיל טרנסלוקציה של CBU0077 כאשר לעומת השליטה OTP siRNA (איור 5 ב). תוצאות הנציגים המוצגות כאן משקפות הממצאים המתפרסמים הקודמים שלנו 21 ולספק לתיקוף נוסף לחשיבות של החלבונים ראב האנושיות האלה טרנסלוקציה מפעיל Coxiella. טכניקה זו גם הועסקה כדי לאפיין את ההשפעה של תהליכים מארחים אחרים טרנסלוקציה מפעיל Coxiella Dot / ICM. מתחם retromer נמצא חשוב שכפול תאיים של Coxiella. ידי השתקת רכיבים retromer, באמצעות siRNA, ולאחר מכן עורכים assay טרנסלוקציה שנוכל להראות retromer הנדרש כדי ליצור את הסביבה שגורםCoxiella מפעיל טרנסלוקציה 43.

למרות שהתוצאות נציג המוצג כאן הוא השוואה בין שליטה OTP נגוע siRNA מיקוד Rab5A ו Rab7A, הפרוטוקול ניתן לשנות בהתאם לצרכים ניסיוניים. לדוגמה, רמת טרנסלוקציה מפעיל יכול גם להיות לעומת תאים transfected עם siRNA מקושקשות או תאי-טרנספקציה שאינם.

מוקד המחקר המסוים הזה היה ג הפתוגן לחייב, תאיים burnetii וחלבונים המעורבים בסחר endocytic, אולם השיטות שתוארו בתוך ניתן להתאים בקלות פתוגנים תאיים תאיים אחרים העושים שימוש במערכות הפרשת עבור ארסיות. ואכן, assay טרנסלוקציה מבוסס פלורסנט המסתמך על פעילות β-lactamase בתוך הציטופלסמה מארח משמש כאן, כבר נעשה שימוש נרחב על פני מגוון של פתוגנים 30-32,35,44. באופן טבעי, תנאי הזיהום שלשורות תאים ספציפיים בשימוש צריך להיות מותאם על מנת לשקף את דרישות זיהום של חיידקים מסויימים. בנוסף, מפעיל אנדוגני ידוע התמזג בטא לקטמאז הוא בעל חשיבות עליונה להצלחה בשיטות המתוארות בתוך. שיקול חשוב אחת עבור יישום מוצלח של הפרוטוקול הסביר כאן הוא ההשפעה השתקת מטרת שורה מסוימת יכול להיות על כניסת חיידקים שכפול הבא. הנה, טרנסלוקציה מפעיל ידי Coxiella נמדד 24 שעות שלאחר זיהום. במקרה זה, ועל חיידקים תאיים אחרים, את היכולת של האורגניזם כדי לקבל כניסה לתוך תאי מארחים חיונית. בנוסף, להשתקת גנים ספציפית יכולה להשפיע שכפולת חיידקים ולפיכך שינוי ברמה של טרנסלוקציה ציינה. אישור כי השתקת siRNA אינה משפיעה כניסת חיידקים משמעותית ו / או שכפול וכתוצאה מכך יעילה טרנסלוקציה, יכול להיות מושג גם באמצעות מיקרוסקופ או ספרור של חיידקים. טרנסלוקציהנתונים אז יכול להיות מנורמל למספר תאים נגועים בכל טיפול siRNA. שכפול חיידקים לא מבולבל בנתונים המוצגים כאן Coxiella עובר לא מעט על מנת שכפול במהלך תקופת הדגירה 24 שעות.

שיטה זו דורשת transfection יעיל של siRNA לתאי המארח כדי להבטיח השתקה מספקת של הגן של עניין. עם זאת בחשבון, בחירת מגיב transfection הנכונה היא חשובה מאוד. מלבד מגיב ותנאי שימוש במחקר המסוים הזה, אשר עבר אופטימיזציה עבור הלה 229 תאים, יש חומרים כימיים רבים אחרים לבחירה. יעילות המציאה באמצעות ריאגנטים transfection שונים ניתן לכמת באמצעות RT-qPCR כדי להבטיח ששני המגיב המתאים ביותר נבחר וכי siRNA נבחר במיוחד מטרות תמליל העניין. אמנם לא הציג במחקר זה, אנו הוכחנו בעבר את יעילות המציאה של שני Rab5A ו Rab7A באמצעות RT-qPCR 21. בנוסף, השימוש של נוגדנים כנגד המטרה של עניין ואישור על ידי כתם המערבי יכול גם לאשר השתקת siRNA של מטרות ספציפיות.

שני שיקולים חשובים אחרים לשים לב בעת שימוש siRNA כוללים את האפשרות של השפעות חוץ-היעד ואת כדאיות התא של תאים transfected. מחוץ יעד תופעות להתרחש כאשר מטרות מכוונות גם נהרסות. זה יכול להוביל שינויים פנוטיפי ועלול לגרום חיוביות שגויות. במחקר זה השתמשנו מאגר של ארבעה דופלקסים siRNA להשתיק יעד לארח אחת. אם השתקת מטרה מסוימת גורמת להקטנת יעילות טרנסלוקציה, אימות כי תוצאה זו היא לא בשל תופעות-היעד את יכולה להיות מושגת על ידי הפרדת ארבעת דופלקסים siRNA ולחזור על assay טרנסלוקציה. לפחות שתיים מתוך ארבעה דופלקסים siRNA צריך להפגין פנוטיפ דומה לברכת siRNA המקורית. עם תוצאה זו, אפשר להיות בטוח מאוד כי tr שנצפהיעילות anslocation אינה בשל השפעות חוץ-יעד. תוקפו של תוצאות טרנסלוקציה מיוצר תלוי גם כדאיות התא. היישום של כתם גרעינים לאחר assay טרנסלוקציה מאפשרת ספירה של כדאיות התא הבאים השתקת siRNA. במקרה של PLK1, מוות של תאים משמעותי ניתן להבחין בקלות ללא מכתים; עם זאת, באמצעות epifluorescence מיקרוסקופיה ייצוג מדויק יותר ניתן להשיג. אם על ידי השתקת מות תא משמעותי בפרט יעד מארח הוא ציין, למשל 50% לעומת השליטה, אין זה סביר כי תמונה מדויקת ניתן להסיק לגבי החשיבות של זה חלבון שורה מסוים אל טרנסלוקציה של effectors. כפי שניתן לראות במחקר זה, למרות השתקה או Rab5A או Rab7A יש השפעה קלה על כדאיות התא (איור 5 ג), הפחתה זו אינה בולטת מספיק כדי לבטל את תוקפה של נתונים טרנסלוקציה ציין. שיקול נוסף לגבי foll כדאיות התאבשל השתקת siRNA היא האבחנה מוות של תאים משמעותי לעתים קרובות מוביל לעלייה של יחס טרנסלוקציה. זו באה לידי ביטוי בצורה הולמת על ידי נתוני טרנסלוקציה ודווחו PLK1 (איור 5 א). מספר תאי מופחת התוצאה היא מגמת עלייה של משקל הריבוי של זיהום. זה יגביר את קצב הזיהום ומכאן יחס טרנסלוקציה.

אמנם לא הציג במחקר זה, ויזואליזציה של טרנסלוקציה מפעיל יכול גם להניב תוצאה כמותית חינם. באמצעות מיקרוסקופ epifluorescent מצויד במראה dichroic ארוך לעבור לאור עירור והפליטה נפרד יכול לספק תצפית ויזואלית של קרינת מצע כלאם תאית. חלופה אפשרית למערכת כתב β-lactamase היא לנצל את מערכת הכתב-cyclase adenylate. בדומה למערכת הכתב המתוארת כאן, הגן של עניין הוא התמזג גן cyclase adenylate calmodulin התלוי (cyaA שעלת Bordetella. טרנסלוקציה מפעיל יכול להימדד על ידי כימות (cAMP) תאיים המחזורי AMP באמצעות ערכת ELISA immunoassay. מאז פעילות של CyaA תלויה לחלוטין calmodulin התא המארח, אשר שוהה רק cytosol המארח, טרנסלוקציה מפעיל אושר על ידי עלייה ברמות cAMP. אמנם שיטה זו גם שמשה בהצלחה למדוד טרנסלוקציה מפעיל עבור מגוון רחב של חיידקים 45-47, כימות של cAMP התאי מסתמכת על תמוגה של תאי המארחים לחלץ cAMP, תהליך שהוא יותר timeconsuming לעומת השיטה המתוארת בתוך. מדידת טרנסלוקציה מפעיל באמצעות מערכת כתב הסריג מבוסס β-lactamase היא יעילה יותר מאז מצע כלאם ניתן להוסיף ישירות אל תאי קרינה ניתן למדוד בתוך שעות. בנוסף, השיטה המתוארת כאן ניתן להתאים בקלות רבה יותר כדי ליצור תוצאות תפוקה גבוהה, במיוחד בצורה 96-היטבבְּ.

חיידקים פתוגנים רב תלויים במערכות טרנסלוקציה החלבון להציג חלבונים מפעילים לתוך תאי מארחים המאפשרים אפנון של פונקציות תא מארח להיטיב עם הפתוגן. מערכות IV הפרשת סוג נמצאות בשימוש על ידי חיידקים תאיים כגון הלגיונלה, Coxiella ו Brucella וסוג III מערכות הפרשה מנוצלות על ידי מגוון של פתוגנים כולל כלמידיה, הצמדה ולמחיקת E. coli ו סלמונלה. על ידי השוואת השפעת ביטוי השתקה של חלבונים מארחים ספציפיים על טרנסלוקציה מפעיל על ידי מגוון של פתוגנים, הבנה של גורמי מארח הכרחיים טרנסלוקציה מפעיל על ידי סוגים מסוימים של מערכות הפרשה או ספציפי לאחד הפתוגן שהיחיד יוכל הובהרה. זה מספק גישה ייחודית ללמוד את המורכבות של אינטראקציות בין מאכסן לפתוגן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

ריכוז יעד
1μM 5 מיקרומטר 10μM 20 מיקרו-מטר
החל שומות
1 nmol 1 מ"ל 200 μl 100 μl 50 μl
2 nmol 2 מ"ל 400 μl 200 μl 100 μl
5 nmol 5 מ"ל 1 מ"ל 500 μl 250 μl
10 ננומול 10 מ"ל 2 מ"ל 1 מ"ל 500 μl
20 ננומול 20 מ"ל 4 מ"ל 2 מ"ל מ"ל 1
Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Citric acid Sigma C0759 ACCM-2 medium component
Sodium citrate Sigma S4641 ACCM-2 medium component
Potassium phosphate Sigma 60218 ACCM-2 medium component
Magnesium chloride Calbiochem 442611 ACCM-2 medium component
Calcium chloride Sigma C5080 ACCM-2 medium component
Iron sulfate Fisher S93248 ACCM-2 medium component
Sodium chloride Sigma S9625 ACCM-2 medium component
L-cysteine Sigma C6852 ACCM-2 medium component
Bacto-neopeptone BD 211681 ACCM-2 medium component
Casamino acids Fisher BP1424 ACCM-2 medium component
Methyl beta cyclodextrin Sigma C4555 ACCM-2 medium component
RPMI + Glutamax ThermoFisher Scientific 61870-036 ACCM-2 medium component
Chloramphenicol Sigma C0378 For bacterial culture
ON-TARGETplus Non-targeting Control Pool (OTP) Dharmacon D-001810-10-05 Non-targeting control
siGENOME Human PLK1 (5347) siRNA - SMARTpool Dharmacon M-003290-01-005 Causes cell death; measure of transfection efficiency
siGENOME Human RAB5A (5968) siRNA - SMARTpool Dharmacon M-004009-00-0005
siGENOME Human RAB7A (7879) siRNA - SMARTpool Dharmacon M-010388-00-0005
5x siRNA buffer Dharmacon B-002000-UB-100 Use sterile RNase-free water to dilute 5x siRNA buffer to 1x siRNA buffer
DharmaFECT-1 Transfection Reagent Dharmacon T-2001-01 For transfection
Opti-MEM + GlutaMAX ThermoFisher Scientific 51985-034 Reduced-serum medium used for transfection
DMEM + GlutaMAX ThermoFisher Scientific 10567-014 For cell culture and infection
Heat-inactivated fetal calf serum (FCS) Thermo Scientific SH30071.03 Can use alternate equivalent product
DMSO Sigma D8418 For storage of Coxiella strain
PBS For cell culture
0.05% Trypsin + EDTA ThermoFisher Scientific 25300-054 For cell culture
dH2O For dilution of samples and standards for qPCR
Quick-gDNA Mini Prep ZYMO Research D3007 Can use alternate equivalent product to extract gDNA
SensiFAST SYBR No-ROX Kit Bioline BIO-98020 Can use alternate equivalent qPCR master mix product for qPCR reaction
LiveBLAzer FRET-B/G Loading kit with CCF2-AM Invitrogen K1032 For measurement of translocation using fluorescence and generation of the 6X loading solution (contains Solution A, B, C and DMSO)
Sodium hydroxide Merck 106469 Probenicid solution component
Sodium phosphate monobasic Sigma 71505 Probenicid solution component
di-Sodium hydrogen orthophosphate Merck 106586 Probenicid solution component
Probenicid Sigma P8761 Probenicid solution component
DRAQ5 Fluorescent Probe Solution (5 mM) ThermoFisher Scientific 62251 Nuclei stain to determine cell viablity. Use 1:4000 diluted in PBS. 
4% PFA (paraformaldehyde) solution in PBS Sigma P6148 Fixing solution for HeLa 229 cells
25 cm2 tissue culture flask with vented cap Corning 430639 For growth of bacterial strain
96 Well Flat Clear bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually wrapped, with Lid, Sterile Corning 3603
75 cm2 tissue culture flask with vented cap Corning 430641 For growth of HeLa 229 cells
175 cm2 tissue culture flask with vented cap Corning 431080 For growth of HeLa 229 cells
Haemocytometer For quantification of HeLa 229 cells
Tear-A-Way 96 Well PCR plates 4titude 4ti-0750/TA For qPCR reaction
8-Lid chain, flat Sarstedt 65.989.002 For qPCR reaction
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Bench top microfuge
Bench top vortex
Orbital mixer
Centrifuge Eppendorf 5810 R For pelleting bacterial culture
Nanodrop For gDNA quantification
Mx3005P QPCR machine Aligent Technologies 401456 For quantification of Coxiella genomes in 7 day culture
ClarioSTAR microplate reader BMG LabTech For measurement of fluorescence

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Delsing, C. E., Warris, A., Bleeker-Rovers, C. P. Q fever: still more queries than answers. Adv Exp Med Biol. 719, 133-143 (2011).
  2. Delsing, C. E., Kullberg, B. J., Bleeker-Rovers, C. P. Q fever in the Netherlands from 2007 to. Neth J Med. 68, 382-387 (2010).
  3. van der Hoek, W., et al. Epidemic Q fever in humans in the Netherlands. Adv Exp Med Biol. 984, 329-364 (2012).
  4. Madariaga, M. G., Rezai, K., Trenholme, G. M., Weinstein, R. A. Q fever: a biological weapon in your backyard. Lancet Infect Dis. 3, 709-721 (2003).
  5. Hoover, T. A., Culp, D. W., Vodkin, M. H., Williams, J. C., Thompson, H. A. Chromosomal DNA deletions explain phenotypic characteristics of two antigenic variants, phase II and RSA 514 (crazy), of the Coxiella burnetii nine mile strain. Infect Immun. 70, 6726-6733 (2002).
  6. Omsland, A., et al. Isolation from animal tissue and genetic transformation of Coxiella burnetii are facilitated by an improved axenic growth medium. Appl Environ Microbiol. 77, 3720-3725 (2011).
  7. Omsland, A., et al. Host cell-free growth of the Q fever bacterium Coxiella burnetii. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4430-4434 (2009).
  8. Beare, P. A., et al. Dot/Icm type IVB secretion system requirements for Coxiella burnetii growth in human macrophages. MBio. 2, e00175-e00111 (2011).
  9. Chen, C., et al. Large-scale identification and translocation of type IV secretion substrates by Coxiella burnetii. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 21755-21760 (2010).
  10. Voth, D. E., et al. The Coxiella burnetii cryptic plasmid is enriched in genes encoding type IV secretion system substrates. J Bacteriol. 193, 1493-1503 (2011).
  11. Beare, P. A., Sandoz, K. M., Omsland, A., Rockey, D. D., Heinzen, R. A. Advances in genetic manipulation of obligate intracellular bacterial pathogens. Front Microbiol. 2, 97 (2011).
  12. Beare, P. A., Larson, C. L., Gilk, S. D., Heinzen, R. A. Two systems for targeted gene deletion in Coxiella burnetii. Appl Environ Microbiol. 78, 4580-4589 (2012).
  13. Howe, D., Shannon, J. G., Winfree, S., Dorward, D. W., Heinzen, R. A. Coxiella burnetii phase I and II variants replicate with similar kinetics in degradative phagolysosome-like compartments of human macrophages. Infect Immun. 78, 3465-3474 (2010).
  14. Heinzen, R. A., Scidmore, M. A., Rockey, D. D., Hackstadt, T. Differential interaction with endocytic and exocytic pathways distinguish parasitophorous vacuoles of Coxiella burnetii and Chlamydia trachomatis. Infect Immun. 64, 796-809 (1996).
  15. Romano, P. S., Gutierrez, M. G., Beron, W., Rabinovitch, M., Colombo, M. I. The autophagic pathway is actively modulated by phase II Coxiella burnetii to efficiently replicate in the host cell. Cell Microbiol. 9, 891-909 (2007).
  16. Beare, P. A. Genetic manipulation of Coxiella burnetii. Adv Exp Med Biol. 984, 249-271 (2012).
  17. Carey, K. L., Newton, H. J., Luhrmann, A., Roy, C. R. The Coxiella burnetii Dot/Icm system delivers a unique repertoire of type IV effectors into host cells and is required for intracellular replication. PLoS Pathog. 7, e1002056 (2011).
  18. Segal, G., Shuman, H. A. Possible origin of the Legionella pneumophila virulence genes and their relation to Coxiella burnetii. Mol Microbiol. 33, 669-670 (1999).
  19. Zamboni, D. S., McGrath, S., Rabinovitch, M., Roy, C. R. Coxiella burnetii express type IV secretion system proteins that function similarly to components of the Legionella pneumophila Dot/Icm system. Mol Microbiol. 49, 965-976 (2003).
  20. Zusman, T., Yerushalmi, G., Segal, G. Functional similarities between the icm/dot pathogenesis systems of Coxiella'burnetii and Legionella pneumophila. Infect Immun. 71, 3714-3723 (2003).
  21. Newton, H. J., McDonough, J. A., Roy, C. R. Effector Protein Translocation by the Coxiella burnetii Dot/Icm Type IV Secretion System Requires Endocytic Maturation of the Pathogen-Occupied Vacuole. PLoS One. 8, e54566 (2013).
  22. Lifshitz, Z., et al. Computational modeling and experimental validation of the Legionella and Coxiella virulence-related type-IVB secretion signal. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, E707-E715 (2013).
  23. Voth, D. E., et al. The Coxiella burnetii ankyrin repeat domain-containing protein family is heterogeneous, with C-terminal truncations that influence Dot/Icm-mediated secretion. J Bacteriol. 191, 4232-4242 (2009).
  24. Weber, M. M., et al. Identification of C. burnetii type IV secretion substrates required for intracellular replication and Coxiella-containing vacuole formation. J Bacteriol. (2013).
  25. Klingenbeck, L., Eckart, R. A., Berens, C., Luhrmann, A. The Coxiella burnetii type IV secretion system substrate CaeB inhibits intrinsic apoptosis at the mitochondrial level. Cell Microbiol. 15, (4), 675-678 (2013).
  26. Larson, C. L., Beare, P. A., Howe, D., Heinzen, R. A. Coxiella burnetii effector protein subverts clathrin-mediated vesicular trafficking for pathogen vacuole biogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, E4770-E4779 (2013).
  27. Luhrmann, A., Nogueira, C. V., Carey, K. L., Roy, C. R. Inhibition of pathogen-induced apoptosis by a Coxiella burnetii type IV effector protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 18997-19001 (2010).
  28. Newton, H. J., et al. A screen of Coxiella burnetii mutants reveals important roles for Dot/Icm effectors and host autophagy in vacuole biogenesis. PLoS Pathog. 10, (2014).
  29. Pan, X., Luhrmann, A., Satoh, A., Laskowski-Arce, M. A., Roy, C. R. Ankyrin repeat proteins comprise a diverse family of bacterial type IV effectors. Science. 320, 1651-1654 (2008).
  30. Charpentier, X., Oswald, E. Identification of the secretion and translocation domain of the enteropathogenic and enterohemorrhagic Escherichia coli effector Cif, using TEM-1 beta-lactamase as a new fluorescence-based reporter. J Bacteriol. 186, 5486-5495 (2004).
  31. de Felipe, K. S., et al. Legionella eukaryotic-like type IV substrates interfere with organelle trafficking. PLoS Pathog. 4, e1000117 (2008).
  32. de Jong, M. F., Sun, Y. H., den Hartigh, A. B., van Dijl, J. M., Tsolis, R. M. Identification of VceA and VceC, two members of the VjbR regulon that are translocated into macrophages by the Brucella type IV secretion system. Mol Microbiol. 70, 1378-1396 (2008).
  33. Raffatellu, M., et al. Host restriction of Salmonella enterica serotype Typhi is not caused by functional alteration of SipA, SopB, or SopD. Infect Immun. 73, 7817-7826 (2005).
  34. Wood, R. E., Newton, P., Latomanski, E. A., Newton, H. J. Dot/Icm Effector Translocation by Legionella longbeachae Creates a Replicative Vacuole Similar to That of Legionella pneumophila despite Translocation of Distinct Effector Repertoires. Infect Immun. 83, 4081-4092 (2015).
  35. Mueller, K. E., Fields, K. A. Application of beta-lactamase reporter fusions as an indicator of effector protein secretion during infections with the obligate intracellular pathogen Chlamydia trachomatis. PLoS One. 10, (2015).
  36. Agrawal, N., et al. RNA interference: biology, mechanism, and applications. Microbiol Mol Biol Rev. 67, 657-685 (2003).
  37. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  38. Lam, J. K., Chow, M. Y., Zhang, Y., Leung, S. W. siRNA Versus miRNA as Therapeutics for Gene Silencing. Mol Ther Nucleic Acids. 4, e252 (2015).
  39. Martinez, E., Cantet, F., Fava, L., Norville, I., Bonazzi, M. Identification of OmpA, a Coxiella burnetii protein involved in host cell invasion, by multi-phenotypic high-content screening. PLoS Pathog. 10, e1004013 (2014).
  40. Jaton, K., Peter, O., Raoult, D., Tissot, J. D., Greub, G. Development of a high throughput PCR to detect Coxiella burnetii and its application in a diagnostic laboratory over a 7-year period. New Microbes New Infect. 1, 6-12 (2013).
  41. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
  42. Prashar, A., Terebiznik, M. R. Legionella pneumophila: homeward bound away from the phagosome. Curr Opin Microbiol. 23C, 86-93 (2014).
  43. McDonough, J. A., et al. Host Pathways Important for Coxiella burnetii Infection Revealed by Genome-Wide RNA Interference Screening. MBio. 4, (1), e00606-e00612 (2013).
  44. Farfan, M. J., Toro, C. S., Barry, E. M., Nataro, J. P. Shigella enterotoxin-2 is a type III effector that participates in Shigella-induced interleukin 8 secretion by epithelial cells. FEMS Immunol Med Microbiol. 61, 332-339 (2011).
  45. Al-Khodor, S., Price, C. T., Habyarimana, F., Kalia, A., Abu Kwaik, Y. A Dot/Icm-translocated ankyrin protein of Legionella pneumophila is required for intracellular proliferation within human macrophages and protozoa. Mol Microbiol. 70, 908-923 (2008).
  46. Geddes, K., Worley, M., Niemann, G., Heffron, F. Identification of new secreted effectors in Salmonella enterica serovar Typhimurium. Infect Immun. 73, 6260-6271 (2005).
  47. Sory, M. P., Boland, A., Lambermont, I., Cornelis, G. R. Identification of the YopE and YopH domains required for secretion and internalization into the cytosol of macrophages, using the cyaA gene fusion approach. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 11998-12002 (1995).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics