लागू करने प्रतिदीप्ति प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) द्वारा प्रेरक translocation क्षमता की जांच करने के लिए

Immunology and Infection

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Summary

बैक्टीरियल रोगज़नक़ों और उनकी सेनाओं के बीच बातचीत की जांच जैविक अनुसंधान का एक महत्वपूर्ण क्षेत्र है। यहाँ, हम siRNA जीन Blam सब्सट्रेट का उपयोग मुंह बंद करने के दौरान Coxiella burnetii द्वारा प्रेरक translocation को मापने के लिए आवश्यक तकनीक का वर्णन है।

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Newton, P., Latomanski, E. A., Newton, H. J. Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing. J. Vis. Exp. (113), e54210, doi:10.3791/54210 (2016).

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Abstract

Coxiella burnetii, क्यू बुखार की प्रेरणा का एजेंट, एक intracellular रोगज़नक़ है कि एक प्रकार चतुर्थ डॉट / आईसीएम स्राव प्रणाली पर निर्भर करता है एक replicative आला स्थापित करने के लिए है। प्रभावोत्पादक का एक पलटन मेजबान प्रक्रियाओं में हेरफेर और नकल के लिए एक अनूठा lysosome व्युत्पन्न रिक्तिका की स्थापना की अनुमति देने के लिए मेजबान सेल में इस प्रणाली के माध्यम से translocated रहे हैं। विशिष्ट जीन मुंह बंद siRNA का उपयोग कर और एक झल्लाहट आधारित सब्सट्रेट कि β-lactamase गतिविधि पर निर्भर करता है का उपयोग कर प्रेरक स्थानान्तरण के माप: यहां प्रस्तुत विधि दो अच्छी तरह से स्थापित तकनीक के संयोजन शामिल है। इन दोनों के दृष्टिकोण को लागू करने के लिए, हम बैक्टीरियल स्राव प्रणाली समारोह और प्रेरक translocation में मेजबान कारकों की भूमिका को समझने के लिए शुरू कर सकते हैं। इस अध्ययन में हम Rab5A और Rab7A, दोनों endocytic की तस्करी मार्ग के महत्वपूर्ण नियामकों की भूमिका की जांच की। हम प्रेरक translocatio में कमी में या तो प्रोटीन परिणामों की अभिव्यक्ति का मुंह बंद दिखाना है किn दक्षता। इन विधियों को आसानी से अन्य intracellular और बाह्य रोगज़नक़ों कि भी स्राव प्रणाली का उपयोग जांच करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। इस तरह, बैक्टीरियल प्रेरक translocation होस्ट में शामिल कारकों में से एक वैश्विक तस्वीर से पता चला जा सकता है।

Introduction

Coxiella burnetii एक अनूठा intracellular रोगज़नक़ कि जूनोटिक मानव संक्रमण क्यू बुखार का कारण बनता है। यह रोग स्पर्शोन्मुख सेरोकनवर्सन से जीवन के लिए खतरा पुराने संक्रमण है कि अक्सर जोखिम के बाद 1 अन्तर्हृद्शोथ साल के रूप में प्रकट होता है के लिए बढ़ा नैदानिक ​​प्रस्तुतियों की एक व्यापक स्पेक्ट्रम के साथ जुड़ा हुआ है। मानव संक्रमण मुख्य रूप से जुगाली करने वाले पशुओं के संक्रमण के लिए प्रमुख जलाशय, विशेष रूप से, डेयरी गाय, भेड़ और बकरियों में से दूषित एयरोसौल्ज़ के साँस के माध्यम से होता है। हालांकि इन पशुओं में संक्रमण आम तौर पर Coxiella उपनैदानिक ​​है, संक्रमण गर्भपात को गति प्रदान कर सकते हैं और birthing तरल पदार्थ और प्लेसेंटा के भीतर काफी बैक्टीरियल लोड स्थानीय पर्यावरण 1 दूषित कर सकते हैं। भारी बोझ इस तरह के प्रदूषण का एक उदाहरण दोनों सार्वजनिक स्वास्थ्य और कृषि उद्योग के हाल ही में क्यू बुखार के प्रकोप है कि नीदरलैंड में हुई 2 में मनाया गया था पर हो सकता है। 2007 और बीच2010, क्यू बुखार के 4,000 से अधिक मामलों का निदान किया गया और इस प्रकोप बकरी खेतों 3 के महत्वपूर्ण संदूषण से जुड़ा हुआ था। इसके अतिरिक्त, Coxiella एक संभावित जैविक हथियार के रूप में बैक्टीरिया और कम संक्रामक खुराक आवश्यक के पर्यावरणीय स्थिरता गंभीर रुग्णता और मृत्यु दर 4 कारण की वजह से अमेरिकी केंद्र रोग नियंत्रण और रोकथाम के लिए, द्वारा वर्गीकृत है।

Coxiella दो चरणों में मौजूद है: मैं चरण जीवों, प्राकृतिक स्रोतों से अलग, बेहद ज़हरीले होते हैं और द्वितीय चरण जीवों अत्यधिक विवो में तनु रहे हैं। उदाहरण के लिए, Coxiella burnetii नौ माइल मैं चरण जीवों की कई इन विट्रो मार्ग के बाद, द्वितीय चरण बैक्टीरिया का उत्पादन किया गया है कि एक अपरिवर्तनीय गुणसूत्र विलोपन छोटा lipopolysaccharide में जिसके परिणामस्वरूप होते हैं (एलपीएस) 5। इस तनाव, सी burnetii NMII, टिशू कल्चर मॉडल में मैं चरण के लिए phenotypically समान है और एक सुरक्षित मोड प्रदान करता हैशोधकर्ताओं प्रयोगशालाओं 5 में Coxiella रोगजनन का अध्ययन करने के लिए एल। हाल के वर्षों में कई सफलताओं तेजी से Coxiella आनुवांशिकी के क्षेत्र उन्नत है। सबसे विशेष रूप से, axenic मीडिया के विकास (अम्लीय साइट्रेट सिस्टीन मध्यम - ACCM -2) दोनों में तरल और ठोस मीडिया पर 6.7 Coxiella की सेल मुक्त वृद्धि की अनुमति दी गई है। यह एक inducible जीन अभिव्यक्ति प्रणाली, शटल वैक्टर और यादृच्छिक transposon सिस्टम 8-11 सहित Coxiella के लिए उपलब्ध आनुवंशिक उपकरणों के प्रत्यक्ष सुधार के परिणामस्वरूप। अभी हाल ही में लक्षित जीन निष्क्रियता के लिए दो तरीकों में भी विकसित किया गया है, विशिष्ट डाह जीन उम्मीदवारों 12 की जांच के लिए रास्ता साफ हो गया।

वायुकोशीय मैक्रोफेज द्वारा internalization के बाद, Coxiella एक झिल्ली ही सीमित डिब्बे के भीतर उच्च संख्या के लिए प्रतिकृति Coxiella- युक्त रिक्तिका (CCV) करार दिया। CCV मेजबान endocytic की तस्करी वीं की आवश्यकता हैकिसी न किसी तरह जल्दी और देर endosomes जब तक यह एक lysosome व्युत्पन्न organelle 13 में परिपक्व होती है। इस प्रक्रिया के दौरान, CCV मेजबान कारकों है कि या तो क्षणिक दिखाई देते हैं या रिक्तिका के साथ जुड़े रहते हैं, जिनमें शामिल हैं, लेकिन करने के लिए, Rab5, Rab7, CD63 और दीपक -1 13-15 सीमित नहीं प्राप्त कर लेता है। मेजबान कोशिकाओं के भीतर Coxiella की प्रतिकृति पूरी तरह से एक पूरी तरह कार्यात्मक डॉट / आईसीएम प्रकार IVB स्राव प्रणाली (T4SS) 8,16,17 पर निर्भर है। यह स्राव प्रणाली ancestrally विकार प्रणाली से संबंधित एक बहु प्रोटीन संरचना है और दोनों बैक्टीरियल और vacuolar झिल्ली तक फैला बैक्टीरियल प्रोटीन देने के लिए, प्रभावोत्पादक करार दिया मेजबान कोशिका द्रव्य 18 में। Coxiella T4SS कार्यात्मक बहुत अच्छी तरह से होती प्रकार IVB डॉट / आईसीएम स्राव लीजोनेला pneumophila 19,20 की व्यवस्था करने के समान है। दिलचस्प बात यह है T4SS और बाद में प्रेरक स्थानान्तरण के सक्रियण उत्पन्न नहीं होती है जब तक Coxiella अम्लीय lysosome व्युत्पन्न पहुंचता हैorganelle, लगभग 8 घंटे के बाद संक्रमण 17,21। तिथि करने के लिए, 130 से अधिक डॉट / आईसीएम प्रभावोत्पादक 9,17,22-24 पहचान की गई है। इन प्रभावोत्पादक से कई की संभावना मेजबान कोशिकाओं के भीतर Coxiella की प्रतिकृति के दौरान महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं; हालांकि, केवल कुछ ही प्रभावोत्पादक कार्यात्मक 25-29 विशेषता किया गया है।

इस अध्ययन में हम एक प्रतिदीप्ति आधारित परख कि CCF2-AM झल्लाहट सब्सट्रेट (इसके बाद Blam सब्सट्रेट के रूप में) मेजबान कोशिका कोशिका द्रव्य के भीतर β-lactamase गतिविधि के माध्यम से (चित्रा 1) की दरार पर निर्भर करता है का उपयोग। ब्याज की जीन मंदिर 1 करने के लिए एक संवाददाता प्लाज्मिड कि विधान अभिव्यक्ति प्रदान करता है पर β-lactamase (Blam) जुड़े हुए है। Blam सब्सट्रेट दो fluorophores (coumarin और fluorescein) है कि एक झल्लाहट जोड़ी फार्म से बना है। fluorescein और प्रेरक स्थानान्तरण के अभाव में हरी प्रतिदीप्ति उत्सर्जन की झल्लाहट में कूमेरिन परिणामों की उत्तेजना; हालांकि, अगर Blaएम प्रेरक संलयन प्रोटीन मेजबान कोशिका द्रव्य में translocated है, उसके एवज में β-lactamase गतिविधि cleaves Blam सब्सट्रेट के β लस्टम अंगूठी, झल्लाहट नीले प्रतिदीप्ति उत्सर्जन उत्तेजना निम्न उत्पादन जोड़ी अलग। यह अच्छी तरह से परख के लिए एक दृष्टिकोण अलग intracellular और बाह्य बैक्टीरिया की एक श्रृंखला, सी सहित से प्रेरक प्रोटीन की पहचान के रूप में साबित किया गया है burnetii, एल pneumophila, एल longbeachae, क्लैमाइडिया ट्रैकोमैटिस, enteropathogenic ई कोलाई, साल्मोनेला और ब्रूसिला 17,30-35।

Coxiella प्रेरक translocation पर विशिष्ट मेजबान कारकों की भूमिका का निर्धारण करने के लिए हम जीन आरएनए हस्तक्षेप के रूप में जाना जाता मुंह बंद करने के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित विधि का उपयोग, विशेष रूप से छोटे दखल शाही सेना में (siRNA)। मूलतः Caenorhabditis एलिगेंस में पहचान, आरएनए हस्तक्षेप जन्मजात defe के लिए इस्तेमाल एक संरक्षित अंतर्जात सेलुलर प्रक्रिया हैवायरस के खिलाफ एनएसई के साथ ही जीन विनियमन 36,37। अनुक्रम विशिष्ट siRNA के बंधन के बाद, mRNA की गिरावट (आरएनए प्रेरित मुंह बंद जटिल) RISC के माध्यम से होता विशिष्ट जीन मुंह बंद करने या पछाड़ना 38 में जिसके परिणामस्वरूप। इस अध्ययन में, siRNA दो मेजबान प्रोटीन, Rab5A और Rab7A, जो endocytic मार्ग के महत्वपूर्ण नियामकों हैं निशाना बनाने के लिए इस्तेमाल किया गया था। प्रेरक translocation पर Rab5A और Rab7A मुंह बंद के प्रभाव का उपयोग करते हुए सी का पता लगाया गया था burnetii pBlaM-CBU0077। के रूप में यह पहले से Coxiella 17 डॉट / आईसीएम स्राव प्रणाली द्वारा translocated होना दिखाया गया था CBU0077 चुना गया था।

दोनों siRNA जीन मुंह बंद करने और fluorescencebased परख यहाँ वर्णित का उपयोग, हम Coxiella द्वारा प्रेरक प्रोटीन के translocation में मेजबान कारकों के लिए एक रोल स्थापित करने की शुरुआत कर रहे हैं। यह दृष्टिकोण दोनों intracellular और बाह्य बैक्टीरिया है कि इसी तरह secretio अधिकारी की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए लागू किया जा सकताn प्रेरक प्रोटीन के translocation के लिए जिम्मेदार प्रणालियों।

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Protocol

नोट: विकास या Coxiella burnetii RSA439 NMII के हेरफेर से जुड़े सभी प्रक्रियाओं एक शारीरिक रोकथाम स्तर 2 प्रयोगशाला में और स्थानीय दिशा निर्देशों के अनुपालन में एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट के भीतर किया जाना चाहिए। रिवर्स अभिकर्मक और परख कार्यप्रवाह नीचे वर्णित के एक योजनाबद्ध आरेख चित्रा 2 में दिखाया गया है।

1. सी की तैयारी burnetii संस्कृति CBU0077 इनकार जताते बीटा लैक्टमेज़ (pBlaM-CBU0077) के दिन (1)

  1. तैयार 1X ACCM-2 6:
    1. 1 टेबल में सूचीबद्ध घटकों का मिश्रण। 6 एम NaOH के साथ 4.75 पीएच और फिल्टर बाँझ समायोजित (आटोक्लेव नहीं है)। ACCM-2 से 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत लगभग तीन सप्ताह के लिए स्थिर है।
  2. सी उत्पन्न burnetii pBlaM-CBU0077 शेयरों।
    1. सी के साथ हेला 229 कोशिकाओं को संक्रमित burnetii pBlaM-CBU0077 और पारित होने को ले जाने के लिए बड़े vacuol तक तनावतों कोशिकाओं के बहुमत में मनाया जाता है।
      1. सी बढ़ो burnetii pBlaM-CBU0077 5% सीओ 2, 2.5% ओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर 7 दिनों के लिए निकाल टोपी के साथ एक 75 सेमी 2 टिशू कल्चर फ्लास्क में 20 मिलीलीटर ACCM -2 युक्त 3 माइक्रोग्राम / एमएल chloramphenicol में ले जाने के तनाव।
      2. सी अपकेंद्रित्र पर आरटी पर 15 मिनट के लिए 15,000 × burnetii pBlaM-CBU0077 संस्कृति।
      3. पुनः निलंबित 20 मिलीलीटर DMEM + 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस) + 3 माइक्रोग्राम / एमएल chloramphenicol (रखरखाव मीडिया) में गोली। एक 50% मिला हुआ 75 सेमी 2 हेला 229 कोशिकाओं की कुप्पी से मीडिया निकालें। फिर से निलंबित सी जोड़े हेला 229 कोशिकाओं को burnetii। 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 दिनों के लिए सेते हेला 229 कोशिकाओं के संक्रमण की स्थापना के लिए अनुमति देने के लिए।
      4. 175 सेमी 2 टिशू कल्चर फ्लास्क में कोशिकाओं को विभाजित।
        1. 75 सेमी 2 कुप्पी से मीडिया निकालें और 10 मिलीलीटर पूर्व गर्म पीबीएस के साथ दो बार monolayer धो लें।
        2. जोड़े 1 मिलीलीटर ओएफ 37 डिग्री सेल्सियस + 5% सीओ 2 3 के लिए 0.05% trypsin EDTA समाधान और जगह कोशिकाओं - 5 मिनट कोशिकाओं को अलग करने के लिए।
        3. रखरखाव मीडिया के 10 मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित। फिर से निलंबित कोशिकाओं के 2 मिलीलीटर एक 175 सेमी 2 रखरखाव मीडिया के 38 मिलीग्राम से युक्त कुप्पी में जोड़ें।
        4. एक और 3 के लिए 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं - 5 दिन तक 100% confluency तक पहुँच जाता है और बड़े रिक्तिकाएं मनाया जाता है।
    2. 175 सेमी 2 कुप्पी से सतह पर तैरनेवाला लीजिए, संक्रमित हेला 229 कोशिकाओं को कवर और 15 मिनट के लिए सेते संक्रमित कोशिकाओं lyse करने के लिए 10 मिलीलीटर DH 2 हे जोड़ें।
    3. आरटी पर 15 मिनट के लिए कम से 15,000 × तैरनेवाला और lysed कोशिकाओं और गोली का मिश्रण।
    4. पुनः निलंबित 10 मिलीलीटर DH 2 ओ में गोली Lyse बार बार एक 23G एक 10 मिलीलीटर सिरिंज में कम से कम 20 गुना से जुड़ी सुई के माध्यम से फिर से निलंबन से गुजर रहा आगे कोशिकाओं। पर 5 मिनट के लिए 500 × गोली सेलुलर मलबे को हटाने के लिए।
    5. <li> निकालें और आरटी पर 15 मिनट सी इकट्ठा करने के लिए गोली सतह पर तैरनेवाला 15,000 × पर burnetii।
    6. फिर से निलंबित सी DMEM + 10% एफसीएस में burnetii और 4 प्रतिशत के रूप में बैक्टीरिया की संख्या यों। 1 × 10 9 जीनोम / -80 डिग्री सेल्सियस पर DMEM + 10% + 10% एफसीएस डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO), विभाज्य 50 μl शेयरों microfuge ट्यूबों में और दुकान का उपयोग करने के लिए मिलीलीटर पतला।
  3. सी के 20 μl के साथ पूर्व गर्म ACCM -2 युक्त 3 माइक्रोग्राम / एमएल chloramphenicol के 10 मिलीलीटर टीका लगाना निकाल टोपी के साथ एक 25 सेमी 2 टिशू कल्चर फ्लास्क में burnetii pBlaM-CBU0077 तनाव 17 (1.2 -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत में उत्पन्न शेयरों से)। 5% में 37 डिग्री सेल्सियस पर 7 दिनों के लिए जीवाणु संस्कृति विकसित सीओ 2, 2.5% 2 हे।

2. siRNA के रिवर्स अभिकर्मक और हेला की सीडिंग 229 कोशिकाओं (4 दिन)

  1. पहली बार के लिए प्रयोगात्मक siRNA का उपयोग करते हैं तैयारsiRNA इस प्रकार है:
    1. संक्षेप में lyophilized siRNA अपकेंद्रित्र सुनिश्चित करने के लिए कि siRNA गोली ट्यूब के नीचे एकत्र किया जाता है।
    2. 1x siRNA बफर (तालिका 2) की उचित मात्रा pipetting द्वारा 20 माइक्रोन की अंतिम शेयर एकाग्रता के लिए pelleted siRNA फिर से निलंबित।
    3. समाधान पिपेट और नीचे 3 - 5 बार आरटी पर 30 मिनट के लिए एक कक्षीय मिक्सर पर मिश्रण और जगह पर, ट्यूब हर 5 inverting - 10 मिनट।
    4. संक्षिप्त ट्यूब सुनिश्चित करने के लिए siRNA ट्यूब के नीचे एकत्र किया जाता है अपकेंद्रित्र।
    5. -20 डिग्री सेल्सियस पर microfuge ट्यूब और दुकान में 50 μl aliquots में siRNA विभाज्य जब तक की आवश्यकता है।
    6. 1 कार्य siRNA की एकाग्रता सुक्ष्ममापी उत्पन्न करने के लिए, पिपेट 1X siRNA के 950 μl एक 50 μl विभाज्य शेयर (20 माइक्रोन) में बफर जब आवश्यक है। नोट: यह 1 माइक्रोन काम कर एकाग्रता जा दोहराया transfections के लिए कई बार फ्रीज thawed कर सकते हैं।
  2. जगह DMEM + 10% एफसीएस,; 0.05% trypsin EDTA और पीबीएस 30 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान (या समकक्ष) में उपयोग करने से पहले गर्म करने के लिए।
  3. अभिकर्मक घटकों की तैयारी:
    नोट: निम्न प्रोटोकॉल काली दीवारों और फ्लैट, पारदर्शी नीचे के साथ एक 96 अच्छी तरह से microplate में 229 कोशिकाओं हेला के लिए अनुकूलित किया गया है। अभिकर्मक अभिकर्मक की राशि का अनुकूलन, कोशिकाओं की siRNA की एकाग्रता और बोने घनत्व अलग सेल लाइनों के लिए आवश्यक हो सकता है।
    1. प्रत्येक अच्छी तरह से, 0.1 μl अभिकर्मक अभिकर्मक उपयोग के लिए, 15.9 μl कम सीरम मध्यम (न्यूनतम आवश्यक मीडिया transfections के लिए, प्रयुक्त सामग्री की तालिका देखें) और 1 माइक्रोन siRNA (40 एनएम के एक अंतिम siRNA एकाग्रता में जिसके परिणामस्वरूप) के 4 μl। ओटीपी, PLK1, Rab5A और Rab7A के लिए अलग microfuge ट्यूबों का प्रयोग करें। तीन प्रतियों में प्रत्येक परख हालत उपाय। एक 96 अच्छी तरह से थाली लेआउट का एक उदाहरण 3 चित्र में दिखाया गया है।
      नोट: ओटीपी और PLK1: इस प्रोटोकॉल दो नियंत्रण के उपयोग को शामिल किया गया। ओटीपी हैचार जमा siRNA कि बंद लक्ष्य प्रभाव को कम करने के लिए अनुकूलित किया गया है और इस तरह ओटीपी एक नकारात्मक, गैर लक्षित कर नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता है की रचना की। तले हुए siRNA भी एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। समर्थक apoptotic रास्ते उत्प्रेरण और इसलिए PLK1 siRNA अभिकर्मक जहां कोशिका मृत्यु अभिकर्मक दक्षता के लिए इसे संबद्ध के लिए सकारात्मक नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता है द्वारा सेल लाइनों की संख्या में व्यापक कोशिका मृत्यु में PLK1 अभिव्यक्ति परिणामों की हानि।
      1. प्रत्येक प्रयोगात्मक siRNA अभिकर्मक के लिए, एक व्यक्ति microfuge ट्यूब में 0.4 μl अभिकर्मक अभिकर्मक और 63.6 μl कम सीरम मध्यम गठबंधन। भंवर सभी microfuge ट्यूब और आरटी पर 5 मिनट के लिए जटिल करने के लिए घटकों की अनुमति है।
      2. अभिकर्मक जटिल युक्त इसी microfuge ट्यूबों के लिए प्रत्येक प्रयोगात्मक siRNA के 16μl जोड़ें। भंवर और आरटी पर 20 मिनट के लिए सेते हैं। नोट: यह 30 मिनट से अधिक नहीं होना महत्वपूर्ण है, के रूप में अभिकर्मक दक्षता में कमी होगी।
  4. 20 मिनट के दौरान उद्योग जगतubation (2.3.1.2) अभिकर्मक अभिकर्मक के 20 μl + कम सीरम मध्यम जोड़ने + siRNA एक बाँझ काले, फ्लैट स्पष्ट नीचे 96 अच्छी तरह से ट्रे के उचित कुओं में मिला लें।
  5. जैसे ही 20 मिनट ऊष्मायन अवधि / अच्छी तरह से 3.92 × 10 3 कोशिकाओं के घनत्व पर 229 कोशिकाओं हेला पूरा, बीज है।
    1. हार्वेस्ट हेला पूर्व गर्म DMEM में मिला हुआ या उप मिला हुआ 75 सेमी 2 टिशू कल्चर कुप्पी से 229 कोशिकाओं + 10% एफसीएस और मानक तरीकों के अनुसार 4.9 × 10 4 कोशिकाओं / एमएल के एक अंतिम घनत्व के लिए कोशिकाओं को फिर से निलंबित। अभिकर्मक दक्षता समझौता नहीं किया है सुनिश्चित करने के लिए 20 मिनट ऊष्मायन अवधि (2.3.1.2) के दौरान कोशिकाओं को तैयार करते हैं।
      1. हेला की monolayer पूर्व गर्म पीबीएस के 10 मिलीलीटर के साथ 229 कोशिकाओं में दो बार धोएं।
      2. 37 डिग्री सेल्सियस + 5% सीओ 2 0.05% trypsin EDTA समाधान और जगह हेला 229 कोशिकाओं के 1 मिलीलीटर जोड़ें 3 के लिए - 5 मिनट कोशिकाओं को अलग करने के लिए।
      3. पूर्व गर्म DMEM + 10% एफसी के 9 मिलीलीटर में कोशिकाओं को ले लीजिएएस ए रुधिरकोशिकामापी का उपयोग कोशिकाओं की गणना और 4.9 × 10 4 कोशिकाओं / DMEM + 10% एफसीएस का उपयोग कर मिलीलीटर की एक अंतिम घनत्व के लिए कोशिकाओं को तैयार।
    2. पिपेट 80 प्रत्येक अच्छी तरह से है कि अभिकर्मक अभिकर्मक + कम सीरम मध्यम + siRNA मिश्रण होता है में 4.9 × 10 4 कोशिकाओं / एमएल के घनत्व में 229 कोशिकाओं हेला के μl। यह अच्छी तरह / 3.92 × 10 3 कोशिकाओं के एक सेल घनत्व से मेल खाती है।
      नोट: पृष्ठभूमि घटाव Blam सब्सट्रेट के लिए आवश्यक है।
      1. कोशिकाओं या siRNA न जोड़ें करने के लिए "रिक्त" कुओं (चित्रा 3)। इसके बजाय, इन कुओं तीन प्रतियों में स्थापित करने के लिए DMEM + 10% एफसीएस के 80 μl जोड़ें।
    3. 37 डिग्री सेल्सियस + 5% सीओ 2 पर 24 घंटे के लिए सेते हैं।

3. परिवर्तन मीडिया (5 दिन)

  1. 24 घंटे के बाद, एक मल्टीचैनल एडाप्टर के एक मल्टी चैनल विंदुक के साथ एक वैक्यूम स्रोत या मैन्युअल से जुड़ी का उपयोग कर मीडिया को हटाने, और ताजा prewarm के 100 μl के साथ बदलेंएड DMEM + 10% एफसीएस।
  2. 37 डिग्री सेल्सियस + 5% सीओ 2 में एक और 48 घंटे के लिए सेते हैं।
  3. इस बिंदु पर, नेत्रहीन एक मानक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग कोशिकाओं की व्यवहार्यता की जाँच करें। रिवर्स अभिकर्मक सफल रहा है, तो महत्वपूर्ण कोशिका मृत्यु ओटीपी siRNA की तुलना में PLK1 siRNA युक्त कुओं में मनाया जाएगा।

4. Coxiella burnetii pBlaM-CBU0077 तनाव की मात्रा qPCR का उपयोग कर (7 दिन)

  1. 5% से 10 मिलीलीटर सी में सीओ 2, 2.5% ओ 2 (1.3), सेंट्रीफ्यूज 37 डिग्री सेल्सियस पर ACCM -2 में विकास के 7 दिनों के बाद पर आरटी पर 15 मिनट के लिए 15,000 × burnetii pBlaM-CBU0077 संस्कृति।
  2. पूर्व गर्म DMEM + 10% एफसीएस के 10 मिलीलीटर में बैक्टीरिया गोली फिर से निलंबित। 1:10 और 1 तैयार: संस्कृति (नमूना) DH 2 ओ का उपयोग कर के 100 dilutions
  3. qPCR के लिए आवश्यक घटक सेट करें।
    नोट: gDNA निकासी के अग्रिम में किया जा सकता है और कम से -20 डिग्री सेल्सियस UNT संग्रहीतइल की आवश्यकता है।
    1. मानकों की तैयारी:
      1. Coxiella burnetii RSA439 NMII जंगली प्रकार 7 दिनों एक gDNA निकासी किट का उपयोग कर, निर्माता के निर्देशों के अनुसार के लिए 5% सीओ 2, 2.5% ओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर ACCM -2 में उगाया तनाव से gDNA निकालें।
      2. gDNA एकाग्रता (छ / μl) 260 एनएम के एक absorbance में एक Nanodrop (या समतुल्य) का उपयोग उपाय।
      3. नीचे दिए गए निम्न सूत्र का उपयोग μl प्रति जीनोम प्रतियों की संख्या की गणना, और जीनोम / एमएल की संख्या में बदलने का।
        समीकरण
      4. DH 2 ओ का उपयोग कर एक नया microfuge ट्यूब में 10 9 / एमएल (100 μl के अंतिम मात्रा में) जीनोम / एमएल की संख्या को समायोजित इस 10 मिनट के लिए उबला हुआ और जब तक आवश्यक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
      5. संक्रमण के दिन, 10 गुना धारावाहिक 10 9 जीनोम से 10 5 जीनोम / एमएल 10 8 जीनोम / एमएल के dilutions उत्पन्नएस / मिलीलीटर शेयर।
        1. पिपेट DH 2 हे के 90 μl में 10 9 जीनोम / एमएल के 10 μl 10 8 जीनोम / एमएल उत्पन्न करते हैं। भंवर मिश्रण करने के लिए। पिपेट DH 2 हे के 90 μl में 10 8 जीनोम / एमएल के 10 μl 10 7 जीनोम / एमएल उत्पन्न करते हैं। भंवर और 10 5 जीनोम / एमएल जब तक दोहराएँ।
    2. qPCR प्रतिक्रिया सेट करें। 25 कुओं किसी भी pipetting त्रुटियों के लिए खाते में करने के लिए एक मास्टर मिश्रण बनाएं। प्रत्येक के लिए अच्छी तरह से, 10 μl qPCR मास्टर मिश्रण का उपयोग करें; OMPA प्राइमर मिश्रण के 2 μl (4.3.2.2) और DH 2 ओ के 3 μl
      नोट: OMPA सी के एक बाहरी झिल्ली प्रोटीन होता है के रूप में पहले 40 में वर्णित burnetii '39 और एक अत्यधिक संरक्षित क्षेत्र के भीतर एक 82 आधार जोड़ी खंड एक जांच के रूप में उपयोग के लिए चुना गया था।
      1. प्रत्येक मानक (DH 2 हे, 10 5, 10 6, 10 7, 10 8, 10 9 जीनोम / एमएल) और नमूना (1 सेट करें:10 और 1: 100 कमजोर पड़ने) में एक 96 अच्छी तरह से पीसीआर डुप्लिकेट या तीन प्रतियों में प्लेट (गैर skirted) दूर आंसू, क्रमशः। उचित कुओं में नमूना या मानक के 5 μl जोड़ें।
      2. DH 2 हे का उपयोग करना, दोनों OMPA आगे प्राइमर (5'-CAGAGCCGGGAGTCAAGCT -3 ') और प्राइमर रिवर्स OMPA (5'-CTGAGTAGGAGATTTGAATCGC-3') 4 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता के लिए पतला और एक ही microfuge ट्यूब में गठबंधन।
        नोट: OMPA प्राइमर मिश्रण अग्रिम में तैयार किया जा सकता है और जब तक आवश्यक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत।
      3. 250 μl qPCR मास्टर मिक्स, 50 μl OMPA प्राइमर मिश्रण, 75 μl DH 2 हे और मिश्रण करने के भंवर जुडा है। या तो मानकों या नमूने युक्त वेल्स को इस मास्टर मिश्रण के 15 μl जोड़ें।
      4. 8-ढक्कन पीसीआर पट्टी टोपियां उचित कुओं और नाड़ी सेंट्रीफ्यूज सब कुछ सुनिश्चित करने के लिए पीसीआर नलियों ट्यूबों के नीचे में एकत्र किया जाता है पर रखें।
      5. एक मात्रात्मक पीसीआर एमए पर निम्न प्रोग्राम सेट अपसिलसिला: 2 मिनट, 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, 1 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के 45 चक्र और 20 सेकंड (चित्रा -4 ए) के लिए 60 डिग्री सेल्सियस के द्वारा पीछा के लिए 50 डिग्री सेल्सियस।
    3. विश्लेषण सीटी (चक्र दहलीज) qPCR से मान:
      1. एक स्प्रेडशीट कार्यक्रम का निर्यात समारोह का उपयोग करने के लिए सीटी मूल्यों स्थानांतरण।
      2. 10 9 के लिए जीनोम / एमएल (लॉग मूल्यों के रूप में व्यक्त) के माध्यम से मानकों 10 5 जीनोम / एमएल के एक scatterplot बनाएँ। तीन प्रतियों के नमूने के बीच किसी भी स्पष्ट outliers त्यागें। एक लघुगणक ट्रेंडलाइन पैदा करते हैं और ग्राफ के समीकरण का निर्धारण।
      3. 4.3.3.2 में उत्पन्न समीकरण का उपयोग करके नमूने में जीनोम / एमएल की कुल संख्या की गणना। नमूनों की: (100 1:10 और 1) प्रारंभिक कमजोर पड़ने के लिए खाते में मत भूलना।

5. रिवर्स के संक्रमण ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं (7 दिन)

  1. सी में कुल जीनोम / एमएल की गणना के बाद बरnetii pBlaM-CBU0077 संस्कृति के संक्रमण के लिए इस्तेमाल किया जाएगा, 50 μl / अच्छी तरह से उपयोग कर prewarmed DMEM + 10% एफसीएस के अंतिम मात्रा में 300 के एक MOI में कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए फिर से निलंबित जीवाणु संस्कृति को समायोजित।
    नोट: 72 घंटे के बाद एक सामान्य दुगनी समय के साथ वरीयता प्राप्त हेला 229 कोशिकाओं की उम्मीद है और घनत्व में अच्छी तरह से 3.136 × 10 4 कोशिकाओं / है। 300 के एक MOI में संक्रमित करने के लिए आवश्यक बैक्टीरिया की मात्रा 50 μl, जो 1.88 × 10 8 बैक्टीरिया / एमएल के लिए equates में 9.408 × 10 6 है।
    1. मूल्य की गणना qPCR (जीनोम / एमएल) से (4.3.3.3) का उपयोग करना, 2 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा में पूर्व गर्म DMEM + 10% एफसीएस का उपयोग कर रिवर्स ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए फिर से निलंबित बैक्टीरिया पतला।
  2. खाली से मौजूदा मीडिया निकालें और ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं रिवर्स।
  3. उचित कुओं को पतला जीवाणु (1.88 × 10 8 बैक्टीरिया / एमएल) के 50 μl जोड़ें। दोनों खाली और यू करने के लिए DMEM + 10% एफसीएस के 50 μl जोड़ेninfected कुओं।
  4. 37 डिग्री सेल्सियस + 5% सीओ 2 पर 24 घंटे के लिए सेते हैं।

6. Blam सब्सट्रेट के अलावा स्थानान्तरण के स्तर का निर्धारण करने के लिए (दिन 8)

  1. Blam सब्सट्रेट 6x लोड हो रहा है समाधान के लिए समाधान तैयार करें।
    नोट: समाधान ए, बी और सी Blam सब्सट्रेट किट (सामग्री की तालिका देखें) के भीतर प्रदान की जाती हैं। समाधान बी आरटी पर एक वेग फार्म सकता है। उपयोग करने से पहले और वेग को भंग कर देना चाहिए 37 डिग्री सेल्सियस के लिए इस समाधान गर्म।
    1. पहली बार के लिए किट का उपयोग करते समय, बाद में सूखा समाधान ए के लिए DMSO के 185 μl (Blam सब्सट्रेट किट की आपूर्ति) जोड़ने -20 डिग्री सेल्सियस पर फिर से निलंबित समाधान एक दुकान।
    2. जब तक आवश्यक -20 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिलीलीटर aliquots में अग्रिम और दुकान में 0.1 एम Probenicid समाधान तैयार है।
      1. 0.4 एम NaOH (100 मिलीलीटर DH 2 हे में 1.6 जी) तैयार करें।
      2. 100 मिमी ना फॉस्फेट बफर पीएच 8 (1.56 छ नः 2 4 पीओ .2H तैयार 2 100 मिलीलीटर DH 2 हे में HPO 4)।
      3. जोरदार आंदोलन से 0.4 एम NaOH के 22 मिलीलीटर में Probenicid की 1.25 ग्राम भंग।
      4. 100 मिमी ना फॉस्फेट बफर पीएच 8 से 22 मिलीलीटर (समाधान बादल बंद हो जाएगा) और वेग कि रूपों को भंग करने के लिए हलचल जोड़ें।
      5. पीएच करने के लिए 8 (यदि आवश्यक हो) 1 एम NaOH / एचसीएल का उपयोग कर समायोजित करें।
      6. तेजी से हलचल और हल्का गर्मी (<50 डिग्री सेल्सियस) जब तक समाधान मुख्य रूप से साफ है।
      7. फ़िल्टर (0.2 माइक्रोन ताकना आकार) और विभाज्य 1 मिलीलीटर की मात्रा में। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर aliquots।
  2. प्रत्येक अच्छी तरह से, 0.06 μl समाधान ए, 0.54 μl समाधान बी, 7.9 μl समाधान सी और 1.5 μl 0.1 एम Probenicid का उपयोग करें। पहले एक microfuge ट्यूब में एक साथ समाधान ए के 1.8 μl और समाधान बी का 16.2 μl के संयोजन से 30 कुओं के लिए एक मास्टर मिश्रण बनाएं। अच्छी तरह मिक्स एक भंवर का उपयोग। समाधान सी के 237 μl और 0.1 एम Probenicid के 45 μl जोड़ें। भंवर सभी componen गठबंधन करने के लिएटीएस।
    नोट: 6x लोड हो रहा है समाधान के लिए 4 घंटा के लिए ऊपर (अंधेरे में) स्थिर है लेकिन उपयोग करने से पहले संभव के रूप में बंद के रूप में तैयार किया जाना चाहिए।
  3. मौजूदा मीडिया को हटाने के बिना सीधे सभी खाली और ट्रांसफ़ेक्ट रिवर्स कुओं में 6x लोड हो रहा है समाधान के 10 μl जोड़ें।
  4. अंधेरे में 2 घंटे के लिए आरटी पर थाली सेते हैं।
  5. स्थानान्तरण के स्तर का निर्धारण करने के लिए, एक microplate रीडर का उपयोग कर प्रतिदीप्ति की राशि यों।
    नोट: निम्न प्रक्रिया ClarioSTAR microplate रीडर के लिए विशिष्ट है। समतुल्य microplate पाठकों को भी उपयोग किया जा सकता है।
    1. एक नए प्रतिदीप्ति तीव्रता पढ़ने मोड के रूप में समापन बिंदु का उपयोग कर प्रोटोकॉल बनाएँ।
    2. इस प्रकार के रूप में बुनियादी मानकों को समायोजित करें:
      1. 96 अच्छी तरह से microplate का चयन करें।
      2. 410-10 एनएम उत्तेजना और 520-10 एनएम उत्सर्जन (1) इनपुट: ऑप्टिक सेटिंग्स के अंतर्गत, निम्न उपयोगकर्ता परिभाषित सेटिंग्स के साथ 2 multichromatics का चयन करें। (2) इनपुट 410-10 एनएम उत्तेजना और 450-10 एनएम उत्सर्जन। सुनिश्चित करें अच्छी तरह से multichromatics चयन किया जाता है।
      3. 3 मिमी की एक व्यास के साथ कक्षीय औसत का चयन करें।
      4. ऑप्टिक के तहत, नीचे ऑप्टिक का चयन करें।
      5. गति और सटीक तहत, सटीक चयन करें। यह अच्छी तरह से प्रति आठ क्षेत्रों से मेल खाती है।
    3. नमूने के रूप में उचित कुओं का चयन करके प्लेट लेआउट समायोजित करें।
    4. प्रारंभ माप का चयन करें।
    5. ढक्कन निकालें और प्लेट रीडर में ट्रे जगह है। अधिकतम प्रतिदीप्ति मूल्यों तक पहुँचने से बचने के लिए, यह सुनिश्चित लाभ मूल्य निकाला जाता है। ऐसा करने के लिए, संक्रमित कुओं कि रिवर्स ओटीपी siRNA साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया है में से एक पर एक लाभ समायोजन प्रदर्शन करते हैं। यह उच्चतम उम्मीद translocation से मेल खाती है।
    6. चयन प्रारंभ माप 410 एनएम के एक उत्तेजना और दोनों 450 एनएम और नीले और हरे रंग की रोशनी के लिए 520 एनएम के उत्सर्जन पर नीचे प्रतिदीप्ति का उपयोग कर सभी उचित कुओं को मापने के लिए, क्रमशः।

7. परिणाम का विश्लेषण:

  1. अनुपात की गणनासभी नमूनों के लिए 520 एनएम (हरे रंग के लिए नीला) के लिए 450 एनएम के रिक्त कमी के बाद और असंक्रमित ओटीपी नमूना के सापेक्ष व्यक्त करते हैं।
    नोट: निम्न विश्लेषण कदम एक साधारण स्प्रेडशीट कार्यक्रम के लिए प्रदान की जाती हैं।
    1. Microplate रीडर पर निर्यात समारोह का उपयोग करना, दोनों 520 एनएम और एक स्प्रेडशीट में 450 एनएम उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य (6.5) के लिए प्राप्त कच्चे प्रतिदीप्ति मूल्यों हस्तांतरण।
    2. कच्चे 520 एनएम प्रतिदीप्ति मूल्यों को जोड़ने और कुओं की संख्या से विभाजित करके 520 एनएम तरंगदैर्ध्य के लिए "रिक्त" रीडिंग (मीडिया ही नहीं, कोई कोशिकाओं) के औसत की गणना (3)। खाली 450 एनएम तरंगदैर्ध्य मूल्यों का उपयोग दोहराएँ। इन मूल्यों को 96 अच्छी तरह से थाली और मीडिया की वजह से पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति प्रतिनिधित्व करते हैं।
    3. पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति घटाएँ। मूल्यों 7.1.2 में प्राप्त का उपयोग कर सभी नमूना 520 एनएम प्रतिदीप्ति मूल्यों से खाली 520 एनएम तरंगदैर्ध्य की औसत घटाना। 450 एनएम तरंगदैर्ध्य मूल्यों के लिए दोहराएँ।
    4. प्राप्त करने के लिए 450: 520 एनएम अनुपात खाली सुधारा मूल्यों का उपयोग (7.1.3)। अपनी इसी 520 एनएम मूल्य द्वारा प्रत्येक नमूना 450 एनएम प्रतिदीप्ति मूल्य फूट डालो।
    5. (7.1.4) से 520 एनएम अनुपात मूल्यों और (3) कुओं की संख्या से विभाजित: 450 जोड़कर असंक्रमित ओटीपी अनुपात मूल्यों के औसत की गणना।
    6. 520 एनएम अनुपात 7.1.5 में गणना असंक्रमित ओटीपी अनुपात मूल्य की औसत से 7.1.4 में गणना: 450 विभाजित करके नमूने असंक्रमित ओटीपी के सापेक्ष के अनुपात की गणना।

परख के बाद सेल नंबर निर्धारित करने के लिए 8. नाभिक दाग के अलावा (दिवस 8)

  1. प्रतिदीप्ति की मात्रा का ठहराव के बाद, का उपयोग करते हुए सभी कुओं या तो एक मल्टी चैनल एडाप्टर के एक मल्टी चैनल विंदुक के साथ एक वैक्यूम स्रोत या मैन्युअल से जुड़ी से 6x लोड हो रहा है समाधान युक्त मीडिया को हटा दें।
  2. 4% पीएफए ​​(paraformaldehyde) समाधान के 50 μl जोड़ेपीबीएस में सभी उचित कुओं के लिए कोशिकाओं को ठीक करने के लिए। 20 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं।
  3. (के रूप में प्रति 8.1) 4% पीएफए ​​पीबीएस समाधान निकालें और पीबीएस के 75 μl के साथ कोशिकाओं को दो बार धो लें।
  4. एक सेल पारगम्य परमाणु दाग ​​के 50 μl प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए, उदाहरण के DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) के लिए, जोड़ें। छवियों को एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के साथ मोल और ऐसे ImageJ 41 के रूप में, उचित छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रत्येक में मौजूद नाभिक में अच्छी तरह से siRNA उपचार के बाद की संख्या यों।

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Representative Results

इस अध्ययन के लिए, सी के रूप में पहले से CBU0077 Coxiella डॉट / आईसीएम स्राव प्रणाली 17 के एक translocated प्रेरक होना दिखाया गया है burnetii pBlaM-CBU0077 तनाव चुना गया था। संक्रमण के लिए पहले, सात दिन सी में जीनोम / एमएल की कुल संख्या burnetii pBlaM-CBU0077 संस्कृति qPCR का उपयोग कर प्रगणित गया था। चित्रा 4 चक्र सीमा का एक उदाहरण यह दर्शाता है (सीटी) मूल्यों qPCR निम्न दोनों मानकों और नमूनों से उम्मीद है। सीटी मूल्यों (प्रवर्धन साजिश (चित्रा 4 बी) और संख्यानुसार (चित्रा 4C) में रेखांकन प्रतिनिधित्व) का निर्यात किया और विश्लेषण किया गया 4.3.3 में वर्णित है। दिखाए प्रतिनिधि डेटा के आधार पर, वहाँ 10 मिलीलीटर फिर से निलंबित जीवाणु संस्कृति (चित्रा 4D) में 2.31 ​​× 10 8 जीनोम / एमएल थे। उचित बैक्टीरियल कमजोर पड़ने उत्पन्न करने के लिए (1.88 × 10 8 जीनोम / एमएल मैं2 n एमएल), resuspended बैक्टीरिया के 1.63 मिलीलीटर ताजा, पूर्व गर्म DMEM + 10% एफसीएस के 370 μl करने के लिए जोड़ा गया है। प्रकोष्ठों siRNA साथ ट्रांसफ़ेक्ट रिवर्स बाद में सी से संक्रमित थे 24 घंटे के लिए 300 के MOI पर burnetii pBlaM-CBU0077।

रिवर्स की ऊष्मायन के बाद प्रेरक स्थानान्तरण के Blam सब्सट्रेट मात्रा का ठहराव के साथ ट्रांसफ़ेक्ट संक्रमित कोशिकाओं एक प्रतिदीप्ति प्लेट रीडर का उपयोग निर्धारित किया जा सकता है। विश्लेषण 7 में वर्णित के रूप में के बाद, सभी अनुपात मूल्यों है कि असंक्रमित ओटीपी के लिए सामान्यीकृत किया गया है भी संक्रमित ओटीपी के लिए सामान्यीकृत जा सकता है। मेजबान जीन का मुंह बंद करने के बाद प्रेरक स्थानान्तरण के स्तर संक्रमित ओटीपी नियंत्रण की तुलना के बाद तीन परिणामों में बांटा जा सकता है: (1) कोई परिवर्तन नहीं; (2) प्रेरक translocation वृद्धि हुई; (3) प्रेरक translocation में कमी। बाद में सांख्यिकीय विश्लेषण, उदाहरण के एक छात्र टी परीक्षण के लिए, किसी भी मनाया अंतर टी के महत्व को निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकताओ ओटीपी नियंत्रण संक्रमित। तीन स्वतंत्र प्रयोगों से प्रेरक translocation पर या तो Rab5A या Rab7A मुंह बंद करने का परिणाम चित्रा 5 ए में दिखाया गया है। Blam-CBU0077 स्थानान्तरण के स्तर में एक महत्वपूर्ण कमी ओटीपी नियंत्रण (पी मूल्य = 0.0088 (Rab5A) और पी मूल्य = 0.0059 (Rab7A), बनती, छात्र टी परीक्षण) की तुलना में दोनों Rab5A और Rab7A का मुंह बंद करने के दौरान हुई। सेल व्यवहार्यता पर siRNA उपचार के प्रभाव को भी स्थापित किया गया था। परख के बाद, कोशिकाओं, तय किया गया एक नाभिक दाग के साथ दाग और बाद में मात्रा निर्धारित किया। चित्रा 5C में दिखाया गया है, हालांकि ओटीपी नियंत्रण (12% और 31% क्रमशः) की तुलना में सेल व्यवहार्यता में कमी या तो Rab5A या Rab7A परिणामों के साथ उपचार, इस कमी PLK1 (97%), एक जीन के रूप में जाना के रूप में गंभीर नहीं है के रूप में कोशिका मृत्यु का कारण करने के लिए (पी मूल्य = 0.0102 (Rab5A); पी मूल्य = 0.0081 (Rab7A); पी मूल्य <0.0001 (PLK1), बनती, छात्र टी परीक्षण)। इन परिणामों के प्रदर्शन कैसे जीई मेजबान का मुंह बंदsiRNA का उपयोग कर एनईएस नकारात्मक बैक्टीरियल प्रेरक स्थानान्तरण के स्तर को बदल सकते हैं।

आकृति 1
चित्रा 1 संक्रमण के दौरान Blam सब्सट्रेट की कार्रवाई की व्यवस्था। सी burnetii मेजबान कोशिकाओं से भली भाँति और एक lysosome व्युत्पन्न रिक्तिका Coxiella युक्त रिक्तिका करार दिया रूपों है। 24 घंटा के बाद संक्रमण, कोशिकाओं की झिल्ली पारगम्य Blam सब्सट्रेट है कि एक झल्लाहट जोड़ी (ए) के गठन के दो fluorophores के पास। Β-lactamase यानी, Blam-CBU0077 प्रेरक का कोई translocation, पर कूमेरिन की उत्तेजना के अभाव में से भरी हुई हैं fluorescein को झल्लाहट में 410 एनएम परिणाम, एक हरे रंग की रोशनी संकेत (520 एनएम) (बी) के रूप में मनाया। एक कार्यात्मक डॉट / आईसीएम स्राव प्रणाली की घटना में, Blam-CBU0077 संलयन प्रोटीन मेजबान सेल में translocated हो जाएगा और सीएल होगाBlam सब्सट्रेट eave, β-lactamase गतिविधि के माध्यम से, दो रंगों के अलग होने के कारण और झल्लाहट व्यवधान और 410 एनएम (सी) पर उत्तेजना के बाद एक नीले रंग की रोशनी संकेत (450 एनएम) में जिसके परिणामस्वरूप। दोनों हरे और नीले रंग की रोशनी का संकेत हो सकता है एक प्रतिदीप्ति प्लेट रीडर का उपयोग का पता चला। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2 रिवर्स अभिकर्मक और परख कार्यप्रवाह के योजनाबद्ध अवलोकन दिन 1: सी तैयार burnetii pBlaM-CBU0077 संस्कृति दिवस 4:। उल्टा transfect एक 96 अच्छी तरह से ट्रे में 3.92 × 10 3 कोशिकाओं के अंतिम घनत्व में 40 एनएम siRNA और बीज हेला 229 कोशिकाओं का उपयोग / अच्छी तरह से दिन 5:। चौधरीAnge मीडिया दिन 7: सी। की कुल जीनोम / एमएल यों burnetii pBlaM-CBU0077 संस्कृति qPCR का उपयोग करते हुए और बाद में 300 दिवस 8 के MOI के साथ रिवर्स ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं को संक्रमित। जोड़े 6x लोडिंग डाई, प्रतिदीप्ति मापने के लिए और सेल नंबर यों यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. 96 अच्छी तरह से थाली लेआउट रिवर्स अभिकर्मक और हेला 229 प्रकोष्ठों के सीडिंग सेट अप करने के लिए इस्तेमाल किया। "खाली" वेल्स (लाल रंग में दिखाया गया है) केवल मीडिया होते हैं और या तो siRNA या हेला 229 कोशिकाओं के अलावा जरूरत नहीं है। क्योंकि यह करने के लिए अनुकूलित किया गया है ओटीपी siRNA (असंक्रमित कुओं और संक्रमित कुओं के लिए गहरे नीले रंग के लिए हल्के नीले रंग में दिखाया गया है), एक गैर-लक्ष्य नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता हैकम बंद लक्ष्य प्रभाव है। लाल रंग और हरी कुओं Rab5A और Rab7A siRNA, क्रमशः प्रतिनिधित्व करते हैं। PLK1 siRNA (पीले रंग में दिखाया गया है) के रूप में PLK1 अभिव्यक्ति की हानि सेल लाइनों की एक विशाल बहुमत में समर्थक apoptotic रास्ते और व्यापक कोशिका मृत्यु पैदा कर सकते हैं अभिकर्मक दक्षता का एक उपाय के रूप में प्रयोग किया जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. प्रतिनिधि qPCR सीटी मूल्यों quantitate करने के लिए कुल सी में जीनोम / एमएल की संख्या burnetii pBlaM-CBU0077 संस्कृति। (ए) चक्र की स्थिति qPCR में इस्तेमाल Coxiella संस्कृतियों में जीनोम / एमएल की संख्या की गणना करने में। दोनों मानकों और नमूने के लिए सीटी मूल्यों चित्रमय (बी) और संख्यात्मक (सी) में प्रतिनिधित्व कर रहे हैंप्रारूपों। (डी) मानक सीटी मूल्यों, औसतन थे रेखांकन और एक लघुगणक ट्रेंडलाइन गणना की गई। समीकरण और नमूने के औसत का उपयोग सीटी सी में जीनोम / एमएल की कुल संख्या मानों burnetii pBlaM-CBU0077 संस्कृति 2.31 ​​× 10 8 होने के लिए निर्धारित किया गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
Rab5A की siRNA मुंह बंद करने और Rab7A। हेला 229 कोशिकाओं के दौरान डॉट / आईसीएम प्रेरक Blam-CBU0077 की चित्रा 5. translocation रिवर्स siRNA विशिष्ट Rab5A करने के लिए (लाल रंग की सलाखों), Rab7A (हरे रंग की सलाखों), ओटीपी (नीले सलाखों) या PLK1 साथ ट्रांसफ़ेक्ट थे (पीला बार) और सी के साथ संक्रमण से पहले 72 घंटे के लिए incubated 24 घंटे के लिए 300 के MOI पर burnetii pBlaM-CBU0077 तनाव। टी के बादवह Blam सब्सट्रेट के अलावा, प्रतिदीप्ति एक microplate रीडर का उपयोग मापा गया था (ए) के साथ तालिका 450 एक ही प्रयोग से प्राप्त कच्चे प्रतिदीप्ति मूल्यों को दर्शाता है:। 520 एनएम अनुपात असंक्रमित ओटीपी नियंत्रण के लिए रिक्त मूल्यों के घटाव के बाद रिश्तेदार (मीडिया केवल, कोई कोशिकाओं)। Translocation (बी) और सेल व्यवहार्यता (सी) के स्तर को प्रतिशत के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं इसका मतलब यह तीन स्वतंत्र प्रयोगों से ओटीपी रिवर्स ट्रांसफ़ेक्ट संक्रमित कोशिकाओं को ± मानक विचलन रिश्तेदार। * पी मूल्य 0.05 <; ** पी मूल्य 0.01 <; **** पी मूल्य <0.0001 (बनती, छात्र टी -Test)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

अंग एकाग्रता
साइट्रिक एसिड 13.4 मिमी
सोडियम साइट्रेट 16.1 मिमी
पोटेशियम फास्फेट 3.67 मिमी
मैग्नीशियम क्लोराइड 1 मिमी
कैल्शियम क्लोराइड 0.02 मिमी
लौह सल्फेट 0.01 मिमी
सोडियम क्लोराइड 125.4 मिमी
एल सिस्टीन 1.5 मिमी
neopeptone 0.1 ग्राम / एल
casamino एसिड 2.5 ग्राम / एल
मिथाइल बीटा cyclodextrin 1 जी / एल
RPMI 125 मिलीग्राम / एल

टेबल 1. घटकों की आवश्यकता 1x ACCM -2 बनाने के लिए।

तालिका 2 1x siRNA बफर की मात्रा उचित एकाग्रता के लिए हाइड्रेटिंग Lyophilized siRNA के लिए आवश्यक है।

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Discussion

स्राव सिस्टम, और बैक्टीरियल प्रेरक प्रोटीन मेजबान कोशिकाओं की कोशिका द्रव्य में इन प्रणालियों परिवहन, एक महत्वपूर्ण घटक है कि कई डाह रोगजनक बैक्टीरिया अद्वितीय replicative आलों के भीतर एक संक्रमण की स्थापना के लिए उपयोग कर रहे हैं। कई अनुसंधान समूहों का ध्यान केंद्रित बैक्टीरियल प्रभावोत्पादक और मेजबान प्रोटीन और प्रभाव मेजबान सेलुलर रास्ते पर इन प्रभावोत्पादक के बीच परस्पर क्रिया की जांच करने के लिए किया गया है। बहुत सीमित अनुसंधान, यदि कोई हो, के लिए मेजबान प्रोटीन सफल बैक्टीरियल प्रेरक translocation के लिए आवश्यक होने की क्षमता की जांच की गई।

इस अध्ययन में हम लाचार, intracellular रोगज़नक़ Coxiella burnetii, जूनोटिक क्यू बुखार की प्रेरणा का एजेंट इस्तेमाल किया। मेजबान कोशिकाओं में प्रवेश करने के बाद, Coxiella युक्त रिक्तिका निष्क्रिय एक अम्लीय lysosome व्युत्पन्न रिक्तिका, जहां यह बहुत अधिक संख्या के लिए प्रतिकृति तक पहुँचने तक विहित endocytic मार्ग के माध्यम से traffics। इसके अलावा एडवांटा लेने सेसामान्य मेजबान की तस्करी मार्ग के जीई, एक सफल replicative आला स्थापित करने के लिए Coxiella की क्षमता भी एक कार्यात्मक प्रकार IVB स्राव प्रणाली (T4SS) और बाद में प्रेरक translocation 8,17 पर निर्भर करता है। यह स्राव प्रणाली कार्यात्मक लीजोनेला की अच्छी तरह से विशेषता डॉट / आईसीएम T4SS के अनुरूप है। यह जिसे उपयुक्त उनके संबंधित Coxiella जीन 19,20 साथ लीजोनेला के विशिष्ट डॉट / आईसीएम म्यूटेंट के पूरक के द्वारा प्रदर्शन किया गया। हालांकि दोनों लीजोनेला और Coxiella की T4SSs प्रतिकृति के लिए आवश्यक हैं, जब इन पद्धतियों सक्रिय कर रहे हैं के समय काफी अलग है और उनके संबंधित replicative आलों की अलग-अलग प्रकृति को दर्शाता है। लीजोनेला T4SS तुरंत मेजबान कोशिकाओं और प्रभावोत्पादक का तेजी से translocation के साथ संपर्क पर शुरू हो रहा है बैक्टीरिया डिफ़ॉल्ट endosomal-लाइसोसोमल मार्ग से बचने के बजाय एक अनूठा ईआर व्युत्पन्न replicative vacuo बनाने के लिए अनुमति देता हैLe 42। इसके विपरीत, Coxiella की T4SS लगभग 8 घंटे के बाद संक्रमण जब तक सक्रिय नहीं है, के बाद बैक्टीरिया अम्लीय lysosome व्युत्पन्न रिक्तिका 21 तक पहुँचते हैं।

यह देखते हुए कि Coxiella निष्क्रिय endocytic मार्ग और स्थानान्तरण प्रणाली के माध्यम से संक्रमण सक्रिय नहीं है, जब तक यह lysosome पहुँचता है, एक अनूठा अवसर एक उपकरण के रूप में उपयोग करने के Coxiella endocytic परिपक्वता अध्ययन करने के लिए खुद को प्रस्तुत करता है। पहले प्रभावोत्पादक translocated रहे हैं CCV के लिए आवश्यकता अम्लीय बनने के लिए इंगित करता है कि मेजबान प्रोटीन की एक संख्या मेजबान कोशिका द्रव्य में प्रेरक प्रोटीन के translocation के लिए महत्वपूर्ण है, विशेष रूप से, लेकिन सीमित नहीं हैं, endocytic तस्करी के मार्ग में शामिल प्रोटीन। एक विशिष्ट लक्षित तरीके में siRNA का उपयोग हम प्रेरक translocation पर विशेष मेजबान प्रोटीन की भूमिका को स्पष्ट करने के लिए शुरू कर सकते हैं। इस अध्ययन में हम दो प्रोटीन है कि यूकेरियोटिक endocytic trafficki को विनियमित करने पर ध्यान केंद्रितएनजी मार्ग है, और इसलिए Coxiella प्रेरक CBU0077 की translocation लागू करने के लिए भविष्यवाणी की थी। जल्दी और देर endosomes साथ Rab5A और Rab7A नियंत्रण झिल्ली संलयन, क्रमशः। इन siRNA का उपयोग कर सकते हैं या तो प्रोटीन का मुंह बंद करने के CBU0077 translocation दक्षता में एक महत्वपूर्ण कमी के परिणामस्वरूप जब नियंत्रण ओटीपी siRNA (चित्रा 5 ब) की तुलना में। यहाँ दिखाया प्रतिनिधि परिणाम हमारे पिछले प्रकाशित निष्कर्ष 21 प्रतिबिंबित और Coxiella प्रेरक translocation करने के लिए इन मानव रब प्रोटीन के महत्व को आगे की मान्यता प्रदान करते हैं। इस तकनीक को भी Coxiella डॉट / आईसीएम प्रेरक translocation पर अन्य मेजबान प्रक्रियाओं के प्रभाव को चिह्नित करने के लिए नियोजित किया गया है। Retromer जटिल Coxiella के intracellular प्रतिकृति के लिए महत्वपूर्ण होने के लिए मिला था। , Retromer घटकों मुंह बंद siRNA का उपयोग कर, और उसके बाद का आयोजन एक परख हम दिखा सकता है कि retromer वातावरण है कि लाती बनाने के लिए आवश्यक है के द्वाराCoxiella प्रेरक translocation 43।

हालांकि यहाँ दिखाया प्रतिनिधि परिणाम संक्रमित ओटीपी नियंत्रण और siRNA को निशाना Rab5A और Rab7A के बीच एक तुलना है, प्रोटोकॉल प्रयोगात्मक जरूरतों के हिसाब से संशोधित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, प्रेरक स्थानान्तरण के स्तर पर भी तले siRNA या गैर ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं की तुलना में किया जा सकता है।

इस विशेष अध्ययन का ध्यान केंद्रित लाचार, intracellular रोगज़नक़ सी थी burnetii और endocytic तस्करी में शामिल प्रोटीन, तथापि, के भीतर वर्णित विधि आसानी से अन्य intracellular और बाह्य रोगज़नक़ों कि डाह के लिए स्राव प्रणाली का उपयोग करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। दरअसल, फ्लोरोसेंट आधारित परख है कि मेजबान यहां इस्तेमाल कोशिका द्रव्य के भीतर β-lactamase गतिविधि पर निर्भर करता है, पहले से ही बड़े पैमाने पर रोगजनकों 30-32,35,44 की एक सीमा के पार इस्तेमाल किया गया है। स्वाभाविक रूप से, के संक्रमण की स्थितिविशेष सेल का इस्तेमाल किया लाइनों विशेष बैक्टीरिया के संक्रमण की आवश्यकताओं को प्रतिबिंबित करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। इसके अतिरिक्त, एक ज्ञात अंतर्जात प्रेरक बीटा लैक्टमेज़ के भीतर वर्णित विधि की सफलता के लिए सर्वोपरि है भूल जाते हैं। प्रोटोकॉल के सफल कार्यान्वयन के लिए एक महत्वपूर्ण विचार यहाँ समझाया प्रभाव एक विशेष मेजबान लक्ष्य मुंह बंद जीवाणु प्रवेश और बाद प्रतिकृति पर हो सकता है। इधर, Coxiella द्वारा प्रेरक translocation 24 घंटे बाद संक्रमण मापा जाता है। इस उदाहरण में, और अन्य intracellular बैक्टीरिया के लिए, जीव की क्षमता मेजबान कोशिकाओं में प्रवेश पाने के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अतिरिक्त, विशिष्ट जीन मुंह भी बैक्टीरियल प्रतिकृति को प्रभावित करती है इसलिए मनाया स्थानान्तरण के स्तर में फेरबदल हो सकता है। पुष्टि है कि siRNA मुंह बंद करने के लिए काफी जीवाणु प्रवेश और / या प्रतिकृति है, और फलस्वरूप translocation दक्षता प्रभावित नहीं करता है, या तो माइक्रोस्कोपी या बैक्टीरिया के संख्यान का प्रयोग कर प्राप्त किया जा सकता है। translocationडाटा तो siRNA इलाज के प्रति संक्रमित कोशिकाओं की संख्या के लिए सामान्यीकृत हो सकता है। बैक्टीरियल प्रतिकृति यहाँ प्रस्तुत डेटा चकित नहीं के रूप में Coxiella 24 घंटा ऊष्मायन अवधि के दौरान कोई प्रतिकृति करने के लिए छोटी से होकर गुजरती है गया है।

इस विधि के हित के जीन की पर्याप्त मुंह बंद सुनिश्चित करने के लिए मेजबान कोशिकाओं में siRNA के कुशल अभिकर्मक की आवश्यकता है। इसे ध्यान में रखते, सही अभिकर्मक अभिकर्मक चुनने के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण है। इसके अलावा अभिकर्मक और इस विशेष अध्ययन है, जो हेला 229 कोशिकाओं के लिए अनुकूलित किया गया है में इस्तेमाल की स्थिति से, वहाँ से चुनने के लिए कई अन्य अभिकर्मकों हैं। पछाड़ना दक्षता अलग अभिकर्मक अभिकर्मकों का उपयोग RT-qPCR का उपयोग सुनिश्चित करने के लिए है कि दोनों के लिए सबसे उपयुक्त अभिकर्मक चयन किया जाता है और मात्रा निर्धारित किया जा सकता है siRNA विशेष रूप से चुना ब्याज की प्रतिलिपि है कि लक्ष्य। हालांकि इस अध्ययन में प्रस्तुत नहीं, हम पहले दोनों Rab5A की पछाड़ना दक्षता का प्रदर्शन किया है और Rab7A आर टी का उपयोग कर-qPCR 21। इसके अतिरिक्त, ब्याज और पश्चिमी धब्बा द्वारा पुष्टि के लक्ष्य के मुकाबले एंटीबॉडी का उपयोग भी विशिष्ट लक्ष्यों की siRNA मुंह बंद करने की पुष्टि कर सकते हैं।

दो अन्य महत्वपूर्ण विचार जब siRNA का उपयोग कर के नोट लेने के लिए बंद लक्ष्य प्रभाव की संभावना है और ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के सेल व्यवहार्यता शामिल हैं। बंद लक्ष्य प्रभाव होते हैं जब अनायास ही लक्ष्य भी नष्ट कर रहे हैं। इस प्ररूपी परिवर्तन करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं और झूठी सकारात्मक हो सकती है। इस अध्ययन में हम एक भी मेजबान लक्ष्य को चुप करने के लिए चार siRNA duplexes का एक पूल का उपयोग किया। एक विशेष लक्ष्य मुंह बंद translocation दक्षता, सत्यापन में एक कमी है कि इस परिणाम को बंद लक्ष्य प्रभाव के कारण चार siRNA duplexes को अलग करने और परख दोहरा द्वारा प्राप्त किया जा सकता है नहीं है का कारण बनता है। दो कम से कम चार siRNA duplexes के बाहर कम से मूल siRNA पूल के लिए एक समान phenotype का प्रदर्शन करना चाहिए। इस परिणाम के साथ, एक अत्यधिक विश्वास किया जा सकता है कि मनाया टीआरanslocation दक्षता बंद लक्ष्य प्रभाव के कारण नहीं है। उत्पादित translocation परिणाम की वैधता भी सेल व्यवहार्यता पर निर्भर है। परख के बाद एक नाभिक दाग के आवेदन siRNA मुंह बंद करने के बाद सेल व्यवहार्यता की गणना सक्षम बनाता है। PLK1 के मामले में महत्वपूर्ण कोशिका मृत्यु आसानी से धुंधला बिना देखा जा सकता है; हालांकि, का उपयोग कर epifluorescence माइक्रोस्कोपी एक और अधिक सटीक प्रतिनिधित्व प्राप्त किया जा सकता है। एक विशेष मेजबान लक्ष्य महत्वपूर्ण कोशिका मृत्यु मुंह बंद मनाया जाता है, उदाहरण के लिए 50% नियंत्रण की तुलना द्वारा, यह संभावना नहीं है, तो एक सही तस्वीर प्रभावोत्पादक की translocation करने के लिए है कि विशेष मेजबान प्रोटीन के महत्व के रूप में अनुमान लगाया जा सकता है। जैसा कि इस अध्ययन में दिखाया गया है, हालांकि या तो Rab5A या Rab7A मुंह बंद सेल व्यवहार्यता (चित्रा 5C) पर एक मामूली असर पड़ता है, इस कमी पर्याप्त स्पष्ट मनाया translocation डेटा की वैधता को नकारना नहीं है। सेल व्यवहार्यता foll के संबंध के साथ एक और विचारsiRNA मुंह बंद करने के कारण अवलोकन है कि महत्वपूर्ण कोशिका मृत्यु अक्सर translocation अनुपात में वृद्धि हो जाती है। यह जिसे उपयुक्त translocation डेटा PLK1 (चित्रा 5 ए) के लिए सूचना दी द्वारा प्रदर्शन किया है। कम हो सेल नंबर संक्रमण की बहुलता में एक आनुपातिक वृद्धि में परिणाम है। इस संक्रमण की दर और इसलिए translocation अनुपात में वृद्धि होगी।

हालांकि इस अध्ययन में प्रस्तुत नहीं, प्रेरक स्थानान्तरण के दृश्य भी एक मानार्थ मात्रात्मक परिणाम निकल सकते हैं। एक epifluorescent माइक्रोस्कोप अलग उत्तेजना और उत्सर्जन प्रकाश के लिए एक लंबी पास dichroic दर्पण के साथ फिट का उपयोग intracellular Blam सब्सट्रेट प्रतिदीप्ति का एक दृश्य अवलोकन प्रदान कर सकते हैं। β-lactamase संवाददाता प्रणाली के लिए एक संभावित विकल्प adenylate-साइक्लेज संवाददाता प्रणाली का उपयोग करने के लिए है। संवाददाता प्रणाली यहाँ वर्णित करने के लिए भी इसी तरह, ब्याज की जीन cyaA एक calmodulin निर्भर adenylate साइक्लेज जीन से जुड़े हुए है ( Bordetella काली खांसी से निकाली गई। प्रेरक translocation intracellular चक्रीय एएमपी (शिविर) की मात्रा का ठहराव से मापा जा सकता है एक प्रतिरक्षा एलिसा किट का उपयोग। चूंकि CyaA की गतिविधि पूरी तरह से मेजबान सेल calmodulin, जो मेजबान cytosol में ही मौजूद है पर निर्भर है, प्रेरक translocation शिविर के स्तर में वृद्धि से इसकी पुष्टि की है। हालांकि इस पद्धति का भी सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है बैक्टीरिया 45-47 की एक किस्म के लिए प्रेरक translocation को मापने के लिए, intracellular शिविर की मात्रा का ठहराव मेजबान कोशिकाओं के सेल शिविर, एक प्रक्रिया है कि विधि के भीतर वर्णित की तुलना में अधिक है timeconsuming निकालने के लिए पर निर्भर करता है। के बाद से Blam सब्सट्रेट कोशिकाओं को सीधे जोड़ा जा सकता है और प्रतिदीप्ति घंटे के भीतर मापा जा सकता है झल्लाहट आधारित β-lactamase संवाददाता प्रणाली का उपयोग करते हुए प्रेरक स्थानान्तरण के मापन अधिक कुशल है। इसके अतिरिक्त, विधि यहाँ वर्णित अधिक आसानी से, उच्च throughput परिणाम उत्पन्न करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, खासकर एक 96 अच्छी तरह से फार्म मेंपर।

कई बैक्टीरियल रोगज़नक़ों प्रोटीन सिस्टम पर निर्भर मेजबान कोशिकाओं रोगज़नक़ के लाभ के लिए मेजबान सेल कार्यों के मॉडुलन अनुमति में प्रेरक प्रोटीन लागू करने के लिए। प्रकार चतुर्थ स्राव सिस्टम ऐसे लीजोनेला, Coxiella और ब्रूसिला और के रूप में intracellular जीवाणुओं द्वारा उपयोग किया जाता है प्रकार III स्राव सिस्टम, क्लैमाइडिया सहित रोगाणुओं की एक श्रृंखला के द्वारा उपयोग किया जाता संलग्न और शर्मीला कोलाई और साल्मोनेला। रोगाणुओं की एक सीमा से प्रेरक translocation पर विशिष्ट मेजबान प्रोटीन का मुंह बंद अभिव्यक्ति के प्रभाव की तुलना करके, स्राव सिस्टम या विशिष्ट विशेष प्रकार से प्रेरक translocation के लिए आवश्यक मेजबान कारकों एक व्यक्ति रोगज़नक़ करने की समझ स्पष्ट किया जा सकता है। यह मेजबान रोगज़नक़ बातचीत की पेचीदगियों का अध्ययन करने के लिए एक अनूठा तरीका प्रदान करता है।

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Materials

लक्ष्य एकाग्रता
1μM 5 सुक्ष्ममापी 10μM 20μM
मोल्स शुरू
1 nmol 1 मिलीलीटर 200 μl 100 μl 50 μl
2 nmol 2 मिलीलीटर 400 μl 200 μl 100 μl
5 nmol 5 मिलीलीटर 1 मिलीलीटर 500 μl 250 μl
10 nmol 10 मिलीलीटर 2 मिलीलीटर 1 मिलीलीटर 500 μl
20 nmol 20 मिलीलीटर 4 मिलीलीटर 2 मिलीलीटर 1 मिलीलीटर
Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Citric acid Sigma C0759 ACCM-2 medium component
Sodium citrate Sigma S4641 ACCM-2 medium component
Potassium phosphate Sigma 60218 ACCM-2 medium component
Magnesium chloride Calbiochem 442611 ACCM-2 medium component
Calcium chloride Sigma C5080 ACCM-2 medium component
Iron sulfate Fisher S93248 ACCM-2 medium component
Sodium chloride Sigma S9625 ACCM-2 medium component
L-cysteine Sigma C6852 ACCM-2 medium component
Bacto-neopeptone BD 211681 ACCM-2 medium component
Casamino acids Fisher BP1424 ACCM-2 medium component
Methyl beta cyclodextrin Sigma C4555 ACCM-2 medium component
RPMI + Glutamax ThermoFisher Scientific 61870-036 ACCM-2 medium component
Chloramphenicol Sigma C0378 For bacterial culture
ON-TARGETplus Non-targeting Control Pool (OTP) Dharmacon D-001810-10-05 Non-targeting control
siGENOME Human PLK1 (5347) siRNA - SMARTpool Dharmacon M-003290-01-005 Causes cell death; measure of transfection efficiency
siGENOME Human RAB5A (5968) siRNA - SMARTpool Dharmacon M-004009-00-0005
siGENOME Human RAB7A (7879) siRNA - SMARTpool Dharmacon M-010388-00-0005
5x siRNA buffer Dharmacon B-002000-UB-100 Use sterile RNase-free water to dilute 5x siRNA buffer to 1x siRNA buffer
DharmaFECT-1 Transfection Reagent Dharmacon T-2001-01 For transfection
Opti-MEM + GlutaMAX ThermoFisher Scientific 51985-034 Reduced-serum medium used for transfection
DMEM + GlutaMAX ThermoFisher Scientific 10567-014 For cell culture and infection
Heat-inactivated fetal calf serum (FCS) Thermo Scientific SH30071.03 Can use alternate equivalent product
DMSO Sigma D8418 For storage of Coxiella strain
PBS For cell culture
0.05% Trypsin + EDTA ThermoFisher Scientific 25300-054 For cell culture
dH2O For dilution of samples and standards for qPCR
Quick-gDNA Mini Prep ZYMO Research D3007 Can use alternate equivalent product to extract gDNA
SensiFAST SYBR No-ROX Kit Bioline BIO-98020 Can use alternate equivalent qPCR master mix product for qPCR reaction
LiveBLAzer FRET-B/G Loading kit with CCF2-AM Invitrogen K1032 For measurement of translocation using fluorescence and generation of the 6X loading solution (contains Solution A, B, C and DMSO)
Sodium hydroxide Merck 106469 Probenicid solution component
Sodium phosphate monobasic Sigma 71505 Probenicid solution component
di-Sodium hydrogen orthophosphate Merck 106586 Probenicid solution component
Probenicid Sigma P8761 Probenicid solution component
DRAQ5 Fluorescent Probe Solution (5 mM) ThermoFisher Scientific 62251 Nuclei stain to determine cell viablity. Use 1:4000 diluted in PBS. 
4% PFA (paraformaldehyde) solution in PBS Sigma P6148 Fixing solution for HeLa 229 cells
25 cm2 tissue culture flask with vented cap Corning 430639 For growth of bacterial strain
96 Well Flat Clear bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually wrapped, with Lid, Sterile Corning 3603
75 cm2 tissue culture flask with vented cap Corning 430641 For growth of HeLa 229 cells
175 cm2 tissue culture flask with vented cap Corning 431080 For growth of HeLa 229 cells
Haemocytometer For quantification of HeLa 229 cells
Tear-A-Way 96 Well PCR plates 4titude 4ti-0750/TA For qPCR reaction
8-Lid chain, flat Sarstedt 65.989.002 For qPCR reaction
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Bench top microfuge
Bench top vortex
Orbital mixer
Centrifuge Eppendorf 5810 R For pelleting bacterial culture
Nanodrop For gDNA quantification
Mx3005P QPCR machine Aligent Technologies 401456 For quantification of Coxiella genomes in 7 day culture
ClarioSTAR microplate reader BMG LabTech For measurement of fluorescence

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References

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