Uygulanması Floresan Rezonans Enerji Transferi (FRET) tarafından Efektör Translokasyon Verimliliği incelemek için

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

bakteriyel patojenler ve ev sahipleri arasındaki etkileşimleri araştıran biyolojik araştırmaların önemli bir alandır. Burada, Blam substrat kullanılarak siRNA gen susturma sırasında Coxiella burnetii'nin efektör translokasyonu ölçmek için gerekli teknikleri tarif eder.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Newton, P., Latomanski, E. A., Newton, H. J. Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing. J. Vis. Exp. (113), e54210, doi:10.3791/54210 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Coxiella burnetii, Q humması etkeni bir yineleme niş kurmak Tip IV Dot / ICM Salgı Sistemi dayanan bir hücre içi patojen olduğunu. efektör kohort ana işlemleri değiştirmek ve replikasyon için benzersiz bir lizozom türetilmiş vakuol kurulmasına izin vermek için konakçı hücreye Bu sistem sayesinde transloke edilmiştir. özgü gen siRNA kullanarak susturma ve β-laktamaz aktivitesinin dayanan bir FRET tabanlı substrat kullanılarak efektör translokasyon ölçümü: Burada sunulan yöntem, iki köklü teknikleri kombinasyonunu içermektedir. Bu iki yaklaşım uygulamak, bakteriyel salgı sistemi fonksiyonu ve efektör translokasyon ev sahibi faktörlerin rolünü anlamaya başlayabiliriz. Bu çalışmada, Rab5A ve Rab7A hem endositik trafik yolunun düzenlenmesi açısından çok önemlidir rolü incelenmiştir. Bu efektör translocatio bir azalma ya da proteinleri de ekspresyonunu susturma göstermektedirn verimlilik. Bu yöntemler de kolayca salgı sistemlerini kullanan diğer hücre içi ve hücre dışı patojenlerin incelemek için modifiye edilebilir. Bu şekilde, bakteriyel efektör translokasyon katılan ana faktörler hakkında genel bir tablo ortaya çıkarılabilir.

Introduction

Coxiella burnetii zoonotik insan enfeksiyon Q ateşe neden benzersiz bir hücre içi patojen olduğunu. Bu hastalık asemptomatik serokonversiyon sıklıkla maruz sonra 1 endokardit yıl olarak tezahür hayatı tehdit kronik enfeksiyona uzanan klinik sunumlar geniş bir yelpazede ile ilişkilidir. İnsan enfeksiyon öncelikle geviş getiren, özellikle, süt inek, koyun ve keçilerde enfeksiyonu için önemli rezervuar, kirlenmiş aerosollerin solunması yoluyla gerçekleşir. Bu hayvanlarda Coxiella enfeksiyonu genellikle subklinik olmasına rağmen, enfeksiyon kürtaj tetikleyebilir ve doğum sıvısı ve plasentanın içinde hatırı sayılır bakteriyel yük yerel çevreyi 1 kirletebilir. Halk sağlığı ve tarım sektöründe hem son zamanlarda Hollanda'da 2 meydana gelen Q humması salgını gözlendi üzerinde büyük bir yük gibi bir kontaminasyon örneğidir olabilir. 2007 ve arasında2010 Q humması 4.000 'den fazla insan vakası teşhis edildi ve bu salgın keçi çiftlikleri 3 önemli kirlenme bağlıydı. Ayrıca, Coxiella şiddetli morbidite ve mortaliteye 4 neden bakteri ve gerekli düşük bulaşıcı dozun çevresel istikrara Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri tarafından sınıflandırılmış olarak, bir potansiyel biyolojik silahtır.

Coxiella iki aşamada vardır: doğal kaynaklardan izole Faz I organizmalar, son derece öldürücü ve Faz II organizmalar yüksek in vivo zayıflatılmaktadır. Örneğin, Coxiella burnetti dokuz Mile Faz I organizmaların çeşitli in vitro geçiş sonrası, Faz II bakteri kesik lipopolisakarit ile sonuçlanan geri dönüşü olmayan bir kromozom silme içeren üretildi (LPS) 5. Bu suş, C. burnetii NMII, doku kültürü modelleri I Faz fenotipik benzer ve daha güvenli bir modu sağlarAraştırmacılar laboratuvarlarda 5 Coxiella hastalık oluşumunun incelenmesinde l. Son yıllarda birçok atılımlar hızla Coxiella genetik alanında gelişmiş var. En önemlisi, aksenik ortam geliştirilmesi (sitrat sistein orta asitleştirildi - ACCM-2) hem sıvı ve katı ortam 6,7 ile Coxiella hücresiz büyüme sağlamıştır. Bu uyarılabilir gen sentezleme sistemi için, mekik vektörleri ve rasgele transpozon sistemleri 8-11 de dahil olmak üzere Coxiella için genetik araçlar doğrudan gelişmeler ile sonuçlandı. En son, hedeflenen gen inaktivasyonu için iki yöntem de belirli virülans gen adayları 12 incelenmesi için önünü geliştirilmiştir.

Alveoler makrofajlar tarafından içselleştirilmesi ardından, Coxiella membrana bağlı bölme içinde yüksek sayılara çoğaltır vakuol (CCV) içeren Coxiella- adlandırılan. CCV konak endositik ticaretini inci gerektirirkaba erken ve geç endozomlar bir lizozom kökenli organel 13 içine olgunlaşır kadar. Bu süreç boyunca, CCV ya geçici görünür ya da dahil olmak üzere, vakuol ile ilişkili, ancak Rab5, Rab7, CD63 ve LAMP-13-15 Ocak, bunlarla sınırlı olmamak kalır konakçı faktörleri kazanır. Konak hücreleri içinde Coxiella çoğaltma tamamen işlevsel Dot / ICM Tipi IVB salgılanması Sistemi (T4SS) 8,16,17 tamamen bağlıdır. Bu salgı sistemi ancestrally konjugasyon sistemleri ile ilgili bir çok protein yapısı ve bakteriyel proteinler sunmak için hem bakteriyel ve vakuoler membranlar yayılan, ev sahibi sitoplazmada 18 içine, etkileyiciler olarak adlandırılan. Coxiella T4SS işlevsel Legionella pneumophila 19,20 iyi karakterize Tip IVB Nokta / ICM salgılama sistemine çok benzer. Coxiella asidik lizozom türetilmiş ulaşıncaya kadar İlginç bir şekilde, T4SS ve daha sonra efektör translokasyon aktivasyonu oluşmazorganel, yaklaşık 8 saat sonrası enfeksiyon 17,21. Bugüne kadar, 130 üzerinden Nokta / ICM efektörler 9,17,22-24 tespit edilmiştir. Bu etkileyiciler çoğu büyük olasılıkla konak hücreleri içinde Coxiella replikasyonu sırasında önemli rol oynamaktadır; Bununla birlikte, sadece bir kaç efektör işlevsel 25-29 karakterize edilmiştir.

Bu çalışmada, konakçı hücre sitoplazması içinde β-laktamaz aktivitesi ile (bundan sonra Bam alt-tabaka olarak da adlandırılır) CCF2-AM FRET alt-tabaka (Şekil 1) bölünmesi dayanan bir floresans bazlı translokasyon deneyi kullanmaktadır. ilgi konusu genin yapısal ekspresyonu sağlayan bir raportör plasmidi ile β-laktamaz (Bam)-1 TEM kaynaştırılır. Bam alt-tabaka, bir FRET çifti oluşturan iki florofor (kumarin ve floresein) oluşmaktadır. floresein ve efektör translokasyon yokluğunda yeşil floresan emisyon FRET içinde kumarin sonuçlarının Tahrik olma; Bununla birlikte, Bla halindeM-efektör füzyon proteini, konakçı sitoplazma içerisine doğru olan, elde edilen β-laktamaz aktivitesi böler uyarma aşağıdaki mavi floresan emisyon üretiminde FRET çifti ayırma Bam substratın β-laktam halkası. Bu translokasyon tahlil de C dahil olmak üzere farklı hücre içi ve hücre dışı bakterilerin bir dizi, efektör proteinleri tespit etmek bir yaklaşım olarak kanıtlanmıştır burnetti, L. pneumophila, L. longbeachae, Chlamydia trachomatis, enteropatojenik E. E. coli, Salmonella ve Brucella 17,30-35.

Coxiella efektör translokasyon belirli konak faktörlerinin rolünü belirlemek için biz özellikle küçük müdahale RNA (siRNA), RNA girişim olarak bilinen gen susturma için köklü bir yöntem kullanmaktadır. Başlangıçta Caenorhabditis elegans tespit RNA interferans doğal Defe için kullanılan korunmuş bir endojen hücresel süreçvirüslere karşı nse yanı sıra gen regülasyonu 36,37. Diziye özgü siRNA bağlanmasından sonra, mRNA degradasyonu özgü gen susturma ve demonte 38 elde (RNA-bağlı susturulması kompleksi) RISC yoluyla ortaya çıkar. Bu çalışmada, siRNA endositik yolunun düzenlenmesi açısından çok önemlidir, iki ana protein, Rab5A ve Rab7A, hedef için kullanılmıştır. Efektör TRANSLOKASYONA Rab5A ve Rab7A susturma etkisi C. kullanarak tespit edildi burnetti pBlaM-CBU0077. Bir önceki Coxiella 17 Nokta / ICM salgılama sistemi transloke gösterilmiştir gibi CBU0077 seçildi.

SiRNA gen susturulması ve burada açıklanan fluorescencebased translokasyon tahlil hem kullanarak, biz Coxiella tarafından efektör proteinlerin translokasyonu konak faktörlerinin rol kurmaya başlıyor. Bu yaklaşım, benzer secretio sahip hem hücre içi ve hücre dışı bakterilerin geniş bir aralığına uygulanabilmektedirefektör protein translokasyonu sorumlu n sistemleri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Not: Coxiella burnetii RSA439 NMII büyümesini veya manipülasyon içeren tüm prosedürleri Fiziksel Muhafaza Seviye 2 Laboratuvar ve yerel kurallara uygun bir biyolojik güvenlik kabini içinde yapılmalıdır. Aşağıda tarif ters transfeksiyon ve translokasyon tahlil iş akışı şematik diyagramı Şekil 2'de gösterilmiştir.

C 1. Hazırlık burnetti Kültür ß-laktamaz için (pBlaM-CBU0077) CBU0077 sigortalı ifade (1. GÜN)

  1. Hazırlayın 1X ACCM-2 6:
    1. Tablo 1 'de listelenen bileşenleri birleştirin. (Otoklav değil) 6 M NaOH ile 4.75 pH ve filtre sterilize ayarlayın. ACCM-2, 4 ° C'de saklanan, yaklaşık üç hafta boyunca stabildir.
  2. C oluşturmak burnetti pBlaM-CBU0077 stokları.
    1. C ile HeLa 229 hücreleri enfekte Büyük vacuol kadar pBlaM-CBU0077 ve geçit taşıyan burnetii suşuES hücrelerinin çoğunda görülmektedir.
      1. C büyümek % 5 CO2,% 2.5, O 2, 37 ° C 'de 7 gün süre ile havalandırılmış bir kap ile 75 cm2 doku kültürü şişesi içinde 20 mL ACCM-2 ihtiva eden 3 mg / ml kloramfenikol bölgesindeki pBlaM-CBU0077 taşıyan burnetii'nin soyu.
      2. C santrifüj oda sıcaklığında 15 dakika için 15,000 x g'da burnetti pBlaM-CBU0077 kültürü.
      3. Yeniden askıya +% 10 fetal dana serumu (FCS) + 3 | ig / ml kloramfenikol (bakım ortamı), 20 ml DMEM içinde pelet. HeLa 229 hücreleri% 50 konfluent 75 cm2 şişeye ortamı çıkarın. Ekle yeniden askıya C. HeLa 229 hücreleri burnetti. HeLa 229 hücreleri enfeksiyona izin% 5 CO2 içinde 37 ° C'de 2 gün süreyle inkübe edilir.
      4. 175 cm 2 doku kültürü şişesi içine hücreleri bölün.
        1. 75 cm 2 balona ortamı çıkarın ve 10 ml önceden ısıtılmış PBS ile iki kez tek tabaka yıkayın.
        2. 1 mi O eklentif 3 37 ° C ±% 5 CO2 seviyesinde% 0.05 tripsin-EDTA çözeltisi ve bir yer hücreleri - 5 dakika hücreleri ayırmak için.
        3. Bakım medya 10 ml hücrelerin yeniden askıya. Bakım ortamının 38 mi ihtiva eden bir 175 cm2 şişeye yeniden askıya hücreleri 2 ml ekle.
        4. % 100 konfluansa ulaşılana ve büyük vakuoller gözlenen kadar 5 gün - ilave 3% 5 CO2 içinde 37 ° C'de inkübe edin.
    2. Enfekte HeLa 229 hücreleri kapsar ve enfekte hücreleri lize etmek için 15 dakika boyunca inkübasyona 10 mi dH 2 O ekleyin 175 cm2 şişeye süpernatant toplayın.
    3. Oda sıcaklığında 15 dakika için 15,000 x g'da süpernatan ve lize hücreleri ve pelet birleştirin.
    4. Yeniden askıya 10 ml DH 2 O. pelet arka arkaya, 10 ml şırınganın en az 20 kez bağlanmış bir 23G iğne ile yeniden süspansiyon geçirilmesiyle daha Hücreleri,. 5 dakika boyunca 500 x g'de Pelet selüler artığın ayrılması için.
    5. <li> çıkarın ve pelet yüzer 15,000 x g'de toplamak için oda sıcaklığında 15 dakika boyunca burnetti.
    6. C yeniden askıya DMEM +% 10 FCS burnetti ve 4 uyarınca bakteri sayısını ölçmek. -80 ° C de DMEM +% 10 FCS +% 10 dimetil sülfoksit (DMSO), kısım 50 ul stok mikrofüj tüplerine ve mağaza kullanılarak 1 x 10 9 genomları / mL'ye seyreltilir.
  3. C 20 ul ile önceden ısıtılmış ACCM-2 ihtiva eden 3 mg / ml kloramfenikol 10 ml inoküle havalandırmalı kapak ile 25 cm 2 doku kültürü şişesi içinde (-80 ° C'de saklanan 1.2 oluşturulan stoktan) burnetti pBlaM-CBU0077 streyn 17. % 5, 37 ° C 'de 7 gün süre ile, CO2,% 2.5, O 2 bakteri kültürü büyütün.

2. Ters SiRNA NAKLİ VE HeLa Tohum 229 Hücreler (GÜN 4)

  1. ilk kez deney siRNA kullanıldığında hazırlanmasısiRNA aşağıdaki gibidir:
    1. Kısaca SiRNA pelet tüpün dibinde toplanan sağlamak için liyofilize siRNA santrifüj.
    2. 1x siRNA tamponu (Tablo 2) uygun hacimde pipetleme 20 mcM son stok konsantrasyonu topak haline siRNA yeniden askıya.
    3. çözümü Pipet ve 3 aşağı - 10 dk - 5 kez tüp her 5 tersini, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca bir yörünge mikser üzerinde karıştırmak ve yer için.
    4. Kısaca SiRNA tüpün alt kısmında toplanır emin olmak için tüp santrifüj.
    5. gerekene kadar -20 ° C'de mikrofüj tüpleri ve deposunda 50 ul alikotları siRNA kısım.
    6. gerektiğinde siRNA konsantrasyonunu çalışma 1 mcM oluşturmak için, pipet 1X siRNA 950 ul 50 ul kısım stokunun (20 uM) içine tampon. Not: Bu, 1 uM çalışma konsantrasyonu tekrar Transfeksiyonlar için birden çok kez dondurularak çözülmüş olabilir.
  2. DMEM +% 10 FCS yerleştirin30 dakika süre ile 37 ° C su banyosu (veya eşdeğeri) içinde% 0.05 tripsin-EDTA ile yıkandı ve PBS kullanımdan önce ısınmaya.
  3. Transfeksiyon bileşenlerinin hazırlanması:
    Not: Aşağıdaki protokol siyah duvarlar ve düz, şeffaf dipli, 96 oyuklu bir mikro-HeLa 229 hücreleri optimize edilmiştir. transfeksiyon reaktifi miktarı optimizasyonu, hücre siRNA'nın konsantrasyon ve tohum yoğunluğu farklı hücre hatları için gerekli olabilir.
    1. Her bir 0.1 ul transfeksiyon reaktifi kullanım için, 15.9 ul indirgenmiş serum orta ve 1 uM siRNA (40 nM nihai siRNA konsantrasyonu oluşturur) 4 ul (minimum temel ortam Malzemelerin Tablo bakınız Transfeksiyonlar için kullanılır). OTP, PLK1, Rab5A ve Rab7A için ayrı mikrofuge'de tüpleri kullanın. üç kez, her deney durumu ölçülür. 96 oyuklu bir plaka taslağına bir örneği, Şekil 3'te gösterilmiştir.
      Not: OTP ve PLK1: Bu protokol iki denetim kullanımını içermektedir. OTP isehedef dışı etkilerini azaltmak için optimize edilmiştir ve bu nedenle OTP negatif olmayan hedefleme kontrol olarak kullanılır dört toplanmış SiRNA oluşmaktadır. Şifreli siRNA bir negatif kontrol olarak da kullanılabilir. pro-apoptotik yollar uyarılması ve bu nedenle PLK1 siRNA hücre ölümü transfeksiyon verimi ilişkilidir transfeksiyon için pozitif kontrol olarak kullanılan hücre hatları, bir dizi geniş hücre ölümüne PLK1 ifade sonuçlarının kaybı.
      1. Her deneysel siRNA Transfeksiyon için, bağımsız bir mikrofüj tüpü içinde 0.4 ul transfeksiyon reaktifi 63.6 ul indirgenmiş serum ortamı birleştirir. Tüm mikrofüj tüpler ve oda sıcaklığında 5 dakika için karmaşık bileşenler izin vorteksleyin.
      2. transfeksiyon kompleksi ihtiva eden karşılık gelen mikrofüj tüplerine her deney siRNA 16μl ekleyin. Vorteks ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edilir. Not: 30 dakika aşmamak önemlidir, transfeksiyon verimi düşecektir olarak.
  4. 20 dk inc sırasındaubation (2.3.1.2), 20 transfeksiyon reaktifi ul + indirgenmiş serum ortamı ilave + siRNA steril, siyah düz, şeffaf dipli, 96 gözlü tepsi uygun kuyulara karıştırın.
  5. En kısa zamanda 20 dakika kuluçka süresi, tam tohum / oyuk 229 hücreleri, 3.92 x 10 3 hücre yoğunluğunda HeLa gibi.
    1. Hasat HeLa önceden ısıtılmış DMEM konfluent veya alt konfluent 75 cm 2 doku kültür şişesi 229 hücreleri% 10 FCS ve standart yöntemlerle göre 4,9 x 10 4 hücre / ml bir nihai yoğunluk için hücrelerin yeniden askıya. Verimlilik tehlikeye atmayacak transfeksiyon sağlamak için, 20 dakika kuluçka dönemi (2.3.1.2) sırasında hücreler hazırlamak.
      1. önceden ısıtılmış 10 ml PBS ile 229 hücreler iki kez HeLa tek tabaka yıkayın.
      2. 5 dakika hücreleri ayırmak için 3 - 37 ° C ile + 5% CO2% 0.05 tripsin-EDTA çözeltisi ve yeri, HeLa 229 hücreleri 1 ml ilave edilir.
      3. Önceden ısıtılmış, DMEM +% 10 FC 9 ml hücreleri toplamakS, bir hemositometre kullanılarak hücre sayımı ve DMEM +% 10 FCS ile 4.9 x 10 4 hücre / ml'lik bir son yoğunluğa hücreleri hazırlamak.
    2. Transfeksiyon reaktifi + indirgenmiş serum ortamı + siRNA karışımı içeren her kuyuya 229 hücreleri, 4.9 x 10 4 hücre / ml yoğunlukta HeLa Pipet 80 ul. Bu / oyuk 3.92 x 10 3 hücre, bir hücre yoğunluğuna karşılık gelir.
      Not: Arka çıkarma Bam alt-tabaka için gereklidir.
      1. Hücreleri veya siRNA katmayın için "boş" kuyular (Şekil 3). Bunun yerine, üç kopya halinde kuyulara DMEM +% 10 FCS, 80 ul ekle.
    3. 37 ° C ile + 5% CO2 seviyesinde 24 saat süre ile inkübe edilir.

3. Değişim Medya (GÜN 5)

  1. 24 saat sonra, çok kanallı bir pipet ile bir vakum kaynağına veya el bağlanmış bir çok kanallı adaptörü kullanarak ortamını çıkarın ve taze Prewarm 100 ul ile yerineEd DMEM +% 10 FCS.
  2. 37 ° C +% 5 CO2 seviyesinde ilave bir 48 saat daha inkübe edilir.
  3. Bu noktada, görsel olarak, standart bir ışık mikroskobu kullanılarak hücrelerin canlılığı kontrol. Arka transfeksiyon başarılı olursa, çok hücre ölümü OTP siRNA ile karşılaştırıldığında PLK1 siRNA içeren kuyucuklara gözlenecektir.

QPCR kullanarak Niceleme Coxiella burnetii pBlaM-CBU0077 Uzama 4. (GÜN 7)

  1. 10 mi C CO2,% 2.5 O 2 (1.3), santrifüj,% 5 37 ° C'de ACCM-2 büyüme 7 gün sonra oda sıcaklığında 15 dakika için 15,000 x g'da burnetti pBlaM-CBU0077 kültürü.
  2. Önceden ısıtılmış DMEM +% 10 FCS, 10 ml bakteriyel pelet yeniden askıya. 1:10 ve 1 hazırlayın: DH 2 O. kullanarak kültür (örnek) 100 dilüsyonları
  3. qPCR için gerekli bileşenleri ayarlayın.
    Not: gDNA ekstraksiyon önceden yapılmış ve -20 ° C UNT saklanabiliril gereklidir.
    1. standart hazırlanması:
      1. 7 gün, üreticinin talimatlarına göre, bir gDNA ekstre etme kiti kullanılarak% 5 CO2,% 2.5 O 2, 37 ° C 'de ACCM-2 yetiştirilen Coxiella burnetti RSA439 NMII yabani tip suştan gDNA'sından ekstrakte edin.
      2. 260 nm 'lik bir emişteki NanoDrop (ya da eşdeğeri) kullanılarak gDNA konsantrasyonu (g / ml) ölçülür.
      3. Aşağıdaki aşağıdaki formül kullanılarak ul başına genom kopya sayısını hesaplayın ve genomları / ml sayısına dönüştürmek.
        denklem
      4. DH 2 O kullanarak yeni bir mikrofüj tüpe (100 ul'lik bir son hacim içinde) 10 9 / ml genomları / ml sayısını ayarlama Bu 10 dakika süre ile kaynatıldı ve gerekene kadar -20 ° C'de muhafaza edilebilir.
      5. Enfeksiyonun gün, 10 9 genomundan 10 5 genomlar / ml 10 8 genomları / ml 10-kat seri dilüsyonları oluşturmaks / ml stok.
        1. Pipet dH 2 O 90 ul halinde 10 9 genomları / ml, 10 ul 10 8 genomları / ml üretir. Vortex karıştırın. Pipet dH 2 O 90 ul halinde 10 8 genomları / ml, 10 ul 10 7 genomları / ml üretir. 10 5 genomları / ml kadar Vortex ve tekrarlayın.
    2. qPCR reaksiyonu ayarlayın. 25 kuyu herhangi bir pipetleme hataları hesaba katmak için bir master karışımı oluşturun. Her biri için de, 10 ul qPCR Master Mix kullanın; OmpA primer karışımının 2 ul (4.3.2.2) ve dH 2 O 3 ul
      Not: OmpA C'lik bir dış zar proteinidir Daha önce tarif edildiği gibi 40 burnetti '39 ve yüksek oranda korunan bir bölge içinde, bir 82-baz-çifti bölümü bir prob olarak kullanılmak için seçilmiştir.
      1. Her standart (dH 2 O, 10 5, 10 6, 10 7, 10 8, 10 9 genomları / ml) ve örnek (1 ayarlayın:10 ve 1: 100 seyreltme) 96 gözlü PCR sırasıyla iki kopya ya da üç kopya halinde) (Non-etekli plaka yırtılacak. Uygun oyuklara numune veya standarda 5 ul ekle.
      2. (5'-CAGAGCCGGGAGTCAAGCT-3 ') ve ters primer OmpA (5'-CTGAGTAGGAGATTTGAATCGC-3') 4 uM'lik nihai bir konsantrasyona kadar, ompA ileri primer hem de seyreltik aynı mikrofüj tüpü içine birleştiren, DH 2 O kullanılması.
        Not: ompA primer karışımı önceden hazırlanmış ve gerekene kadar -20 ° C'de muhafaza edilebilir.
      3. 250 ul qPCR Master Mix, 50 ul ompA primer karışımı, 75 ul dH 2 O ve karıştırmak için girdap birleştirin. standartları veya numune ya içeren kuyulara bu ana karışımı 15 ul ekleyin.
      4. Her şeyi sağlamak için PCR tüpleri tüplerin alt toplanır uygun kuyulara ve nabız santrifüj üzerine 8-kapak PCR şerit kapakları yerleştirin.
      5. Bir kantitatif PCR ma aşağıdaki program kurmakÇin: 1 saniye 95 ° C'lik 45 döngü, 20 saniye (Şekil 4A), 60 ° C'de, ardından 2 dk, 10 dakika boyunca 95 ° C, 50 ° C.
    3. qPCR dan Ct (döngüsü eşik) değerleri analiz:
      1. Programın ihracat işlevini kullanarak bir elektronik tabloya Ct değerleri aktarın.
      2. 9 ila 10 genomları / ml (günlük değerleri olarak ifade edilen) yoluyla aykırı 10 5 genomlar / ml'lik bir scatterplot oluşturun. üçlü numuneler arasında herhangi bir bariz outliers atın. logaritmik bir eğilim çizgisi oluşturmak ve grafiğin denklemi belirler.
      3. 4.3.3.2 oluşturulan denklem kullanılarak numunede genomları / ml toplam sayısını hesaplayın. Numunelerin: (100 01:10 ve 1) ilk seyreltme için hesap unutmayın.

5. Ters enfeksiyon Transfekte hücreler (GÜN 7)

  1. C. toplam genomları / ml hesaplandıktan sonra burnetii pBlaM-CBU0077 kültürü 50 ul / oyuk önceden ısıtılmış kullanılarak DMEM +% 10 FCS bir son hacim içinde 300 MOI hücreleri enfekte etmek için yeniden süspansiyon haline bakteri kültürü ayarlamak bulaşmasına kullanılır.
    Not: 72 saat sonra, normal bir iki katına çıkma süresi ile tohumlanmış, HeLa 229 hücreleri beklenen yoğunluk de 3,136 x 10 4 hücre / olup. 300 bir MOI'da enfekte için gereken bakteri miktarı, 1.88 x 10 8 bakteri / ml eşittir 50 ul içinde 9.408 x 10 6.
    1. QPCR (genomları / ml) hesaplanan değeri (4.3.3.3) kullanarak, ters transfekte hücreleri enfekte 2 ml lik bir nihai hacim içinde önceden ısıtılmış DMEM +% 10 FCS ile yeniden süspansiyon haline getirilmiş bakteriler seyreltin.
  2. Boş mevcut ortamı çıkarın ve transfekte hücreler ters.
  3. Uygun oyuklara seyreltilmiş bakteri (1.88 x 10 8 bakteri / ml) 50 ul ekle. Boş ve u, her iki DMEM +% 10 FCS, 50 ul ekleninfected kuyular.
  4. 37 ° C ile + 5% CO2 seviyesinde 24 saat süre ile inkübe edilir.

Blam Yüzey 6. eklenmesi Translokasyon düzeyini belirleme (GÜN 8)

  1. Blam substrat 6x yükleme çözümü için çözümler hazırlayın.
    Not: Çözelti A, B ve C Blam substrat kiti (Malzeme Tablo bakınız) içinde sağlanır. Çözelti B, oda sıcaklığında bir çökelti oluşturabilir. kullanımdan önce ve çökelti çözülür gerekir 37 ° C, bu çözüm ısıtın.
    1. ilk seti kullanıldığında, sonra kurutulmuş Çözelti A'ya (Bam alt-tabaka kiti ile birlikte), DMSO 185 ul -20 ° C 'de yeniden süspansiyon haline çözelti bir saklayın.
    2. gerekene kadar -20 ° C'de 1 ml'lik alikolar içinde önceden ve mağaza 0.1 M probenisit çözeltisi hazırlayın.
      1. 0.4 M NaOH (100 mi dH 2 O 1.6 g) hazırlanır.
      2. 100 mM Na-fosfat tamponu pH 8 (1.56 g NaH 2 PO 4 .2H hazırlanması 2 O 1.41 gr 2 Na HPO 4).
      3. sert ajitasyon 0.4 M NaOH 22 ml probenisit 1.25 g çözündürülür.
      4. (Parçalı dönecek çözelti) ve oluşan çökelti çözülene kadar karıştırılır, 100 mM Na-fosfat tamponu pH 8 22 ml ilave edilir.
      5. 1 M NaOH / HCl ile pH 8 (gerekirse) ayarlayın.
      6. kuvvetlice karıştırın ve hafif ısı (<50 ° C) çözümü çoğunlukla netleşene kadar.
      7. 1 mi hacim filtresini (0.2 um gözenek boyutu) ve kısım. -20 ° C'de saklayın alikotları.
  2. her bir kuyunun, 0.06 ul çözelti A, 0.54 ul Çözüm B, 7.9 ul Çözüm C ve 1.5 ul 0.1 M probenisid kullanın. İlk bir mikrofuge'de tüp içinde bir araya Çözüm A 1.8 ul ve Çözüm B 16.2 ul birleştirerek 30 kuyuları için bir master karışımı oluşturun. bir girdap kullanarak iyice karıştırın. C çözeltisi, 237 ul 0.1 M probenisit 45 ul ekle. Vortex tüm componen birleştirmekts.
    Not: 6x yükleme çözümü 4 saat kadar (karanlıkta) stabildir ancak kullanımdan önce mümkün olduğunca yakın hazırlanmalıdır.
  3. Mevcut medya çıkarmadan doğrudan tüm boş ve transfekte ters kuyu içine 6x yükleme solüsyonu 10 ul ekleyin.
  4. karanlıkta 2 saat oda sıcaklığında inkübe plakası.
  5. translokasyon seviyesini belirlemek için, bir mikro levha okuyucusu kullanarak floresan miktarını belirlemek.
    Not: Aşağıdaki prosedür ClarioSTAR mikroplaka okuyucu özgüdür. Eşdeğer mikroplak okuyucular da kullanılabilir.
    1. okuma modu olarak uç noktasını kullanarak yeni bir floresan yoğunluğu protokolünü oluşturun.
    2. aşağıdaki gibi temel parametreleri ayarlayın:
      1. 96 çukurlu bir mikrolevhadaki seçin.
      2. optik ayarlar altında, aşağıdaki kullanıcı tanımlı ayarlarla 2 multichromatics belirleyin: (1) Giriş 410-10 nm uyarma ve 520-10 nm emisyon. (2) giriş 410-10 nm eksitasyon ve 450-10 nm emisyon. iyi mult sağlamakichromatics seçilir.
      3. 3 mm kadar bir çapa sahip yörünge ortalamasını belirleyin.
      4. optik altında, alt optik seçin.
      5. hız ve hassasiyet altında, hassas seçin. Bu oyuk başına sekiz bölgelerine karşılık gelir.
    3. numunelerin uygun kuyu seçerek plaka düzeni ayarlayın.
    4. Seç başlangıç ​​ölçümü.
    5. Kapağı çıkarın ve plaka okuyucu içine tepsiye yerleştirin. Maksimum floresan değerleri ulaşan önlemek için, kazanç değeri ayarlanır emin olun. Bunu yapmak için, ters OTP siRNA transfekte edilmiş enfekte kuyulardan birinde bir kazanç ayarı yapmak. Bu yüksek beklenen translokasyon karşılık gelir.
    6. Seç başlangıç ​​ölçümü sırasıyla 450 nm ve mavi ve yeşil floresan 520 nm hem de bir 410 nm uyarma ve emisyon dip floresan kullanan tüm uygun kuyular ölçmek için.

Sonuçların 7. analizi:

  1. oranını hesaplayınTüm numuneler için 520 nm (yeşil, mavi) 450 nm boş azalma takip ve enfekte olmamış OTP örneğine göre ifade eder.
    Not: Aşağıdaki analiz adımları basit bir elektronik tablo programı verilmektedir.
    1. Mikroplaka okuyucu ihracat işlevini kullanarak, 520 nm ve bir elektronik tabloya 450 nm emisyon dalga boylarında (6.5) hem de elde edilen ham floresan değerlerini aktarın.
    2. Ham 520 nm floresan değerler ekleyerek ve kuyu sayısına göre bölerek 520 nm dalga boyundaki için "boş" okumalar (medya sadece, hiçbir hücreleri) ortalamasını hesaplayın (3). Boş 450 nm dalga boyu değerleri kullanarak tekrarlayın. Bu değerler nedeniyle 96-çukurlu plaka ve ortama arka floresan temsil etmektedir.
    3. Arka plan floresan çıkarın. 7.1.2 elde edilen değerler kullanılarak tüm numune 520 nm floresan değerlerinden boş 520 nm dalga boyundaki ortalamasını çıkarın. 450 nm dalga boyu değerleri için tekrarlayın.
    4. 520 nm oranı boş düzeltilmiş değerleri kullanın (7.1.3): 450 edinin. onun 520 nm değeri karşılık gelen her bir numune 450 nm floresan değerini bölün.
    5. (7.1.4 itibaren) 520 nm oranı değerleri ve kuyular (3) sayısına göre bölünmesi: 450 ekleyerek bulaşmamış OTP oranı değerlerin ortalamasını hesaplayın.
    6. 7.1.5 hesaplanan bulaşmamış OTP oranı değerinin ortalama 7.1.4 hesaplanan 520 nm oranı: 450 bölerek enfekte olmamış OTP göre örneklerin oranını hesaplayın.

Çekirdekler Leke 8. eklenmesi Translokasyon Testi sonra Hücre sayısı belirleme (GÜN 8)

  1. floresans miktarının başlangıç ​​materyalleri olarak tüm oyuklara ya çok kanallı bir pipet ile bir vakum kaynağına veya el bağlanmış bir çok kanallı adaptöründen 6x yükleme çözeltisi içeren ortamı çıkarın.
  2. % 4 PFA (paraformaldehit) çözeltisi 50 ul eklePBS tüm uygun kuyulara hücreleri düzeltmek için. 20 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
  3. (8.1 göre)% 4 PFA PBS çözeltisi çıkarın ve PBS 75 ul hücreler iki kez yıkayın.
  4. Her bir oyuğa, örneğin DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol), bir hücre geçirgen Nükleer soya 50 ul ekle. Bir fluoresan mikroskobu ile görüntü alımı, ImageJ 41 gibi uygun görüntü analizi yazılımını kullanarak iyi siRNA tedaviden sonra her birinde mevcut çekirdeklerin sayısını ölçmek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu çalışma için, C. CBU0077 önce Coxiella Nokta / ICM salgılama sistemine 17 bir translokasyon efektör olduğu gösterilmiştir gibi burnetti pBlaM-CBU0077 soyu seçildi. Enfeksiyondan önce yedi günlük C. genomları / ml toplam sayısı burnetti pBlaM-CBU0077 kültür qPCR kullanılarak sayilmistir. 4 döngü eşiğinin bir örnek gösterir Şekil (Ct) değerleri qPCR izleyen hem standartlar ve numuneler bekleniyor. 4.3.3 tarif edildiği gibi (Amplifikasyon çizim (Şekil 4B) ve sayısal olarak (Şekil 4C) 'de grafik olarak ifade edilir), Ct değerleri, dışa ve analiz edildi. Gösterilen Örnek verilere göre, 10 ml yeniden süspansiyon haline bakteri kültürü (Şekil 4D), 2.31 ​​x 10 8 genomları / ml vardı. Uygun bakteriyel seyreltme oluşturmak için (1.88 × 10 8 genomları / ml in, 2 mi), yeniden süspansiyon haline getirilmiş bakteri 1.63 mi, taze, önceden ısıtılmış DMEM +% 10 FCS 370 ul ilave edildi. SiRNA ile transfekte ters Hücreler daha sonra C ile enfekte edildi 24 saat boyunca 300 MOl'de burnetti pBlaM-CBU0077.

ters inkübasyondan sonra efektör translokasyon Bam alt-tabaka miktarının ile transfekte enfekte edilmiş hücreler bir floresan plaka okuyucu kullanarak belirlenebilir. 7 de tarif edildiği gibi analiz sonra, enfekte olmamış OTP normalize olan tüm oran değerleri, aynı zamanda, enfekte ATP'ye normalleştirilebilir. konakçı genlerinde susturma sonra efektör translokasyon seviyesi enfekte OTP kontrol ile karşılaştırıldığında sonra üç sonuçlara gruba ayrılabilir: (1) herhangi bir değişiklik; (2) efektör translokasyon artması; (3) efektör translokasyon Azalmış. Daha sonra istatistiksel analiz, örneğin, bir Öğrenci t testi için, gözlenen herhangi bir fark, t önemini belirlemek için kullanılabiliro OTP kontrol bulaşmış. Üç ayrı deneyden elde edilen efektör TRANSLOKASYONA Rab5A ya Rab7A ya susturulması sonucu Şekil 5A'da gösterilmiştir. Blam-CBU0077 translokasyon düzeyinde anlamlı azalma OTP kontrol (p değeri = 0.0088 (Rab5A) ve p değeri = 0.0059 (Rab7A), eşleştirilmiş Student t testi) ile karşılaştırıldığında Rab5A ve Rab7A hem susturma sırasında meydana geldi. hücre canlılığı üzerinde siRNA tedavisinin etkisi de kurulmuştur. Translokasyon tahlilinde sonra hücreler, sabit olduğu bir çekirdek boyası ile boyandı ve daha sonra ölçülebilir. OTP kontrolü (% 12 ve% 31, sırasıyla) ile karşılaştırıldığında, hücre canlılığında bir düşüşe Rab5A ya Rab7A sonuçları ile tedavi, bu azalma PLK1 (% 97), bilinen bir gen gibi ağır olmasa da, Şekil 5C'de gösterildiği gibi, hücre ölümüne sebep (p-değeri = 0,0102 (Rab5A) p-değeri = 0.0081 (Rab7A) p-değeri <0.0001 (PLK1), eşleştirilmiş Student t-testi). ge konağın susturma nasıl Bu sonuçlarsiRNA kullanarak nes olumsuz bakteriyel efektör translokasyonu seviyelerini değiştirebilir.

Şekil 1
Şekil 1. Enfeksiyon sırasında Blam Yüzey Etki mekanizması. C. burnetii'nin konakçı hücreler tarafından ve lizozom türevi vakuol Coxiella içeren yeni vakuol olarak adlandırılan oluşturur. 24 saat Enfeksiyondan hücreler β-laktamaz, yani Bam-CBU0077 effektör Resim translokasyon, kumarin uyarma yokluğunda. FRET çifti (A) oluşturan iki florofor sahip membran geçirgen Blam alt-tabaka ile yüklenir yeşil floresan sinyali (520 nm) (B) gözlenen floresan FRET 410 nm ile sonuçlanır. fonksiyonel Nokta / ICM salgılama sistemi durumunda, Bam-CBU0077 füzyon proteini, konakçı hücre içerisine doğru olacak ve Cı olacakİki boya ayrılmasına neden olur ve FRET bozulması ve 410 nm (C) uyarma sonra mavi bir flöresan sinyalinin (450 nm) 'de elde edilen, β-laktamaz aktivitesi ile, Bam substratı eave. Hem yeşil ve mavi flüoresan sinyalleri, bir floresan plaka okuyucu kullanarak tespit edildi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
. Şekil 2. Ters NAKLİ VE Translokasyon Testi İş Akışı Şematik Bakış 1. Gün: C hazırlayın burnetti pBlaM-CBU0077 kültürü Gün 4: a. 96-kuyu tepsi içinde / oyuk 3.92 x 10 3 hücre nihai yoğunlukta 40 nM siRNA ve tohum HeLa 229 hücreleri kullanılarak Ters transfeksiyonu Gün 5:. Change medya 7. Gün:. C. toplam genomları / ml niceliğini burnetti pBlaM-CBU0077 kültür qPCR kullanarak ve daha sonra 300 Gün 8 bir İçişleri Bakanlığı ile ters transfekte hücreleri enfekte., 6x yükleme boyası ekleyin floresan ölçmek ve hücre sayısını ölçmek , bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3. Ters Transfeksiyon ve HeLa 229 Hücrelerinin Seeding kurma için kullanılır 96-kuyu Plaka Düzeni. (Kırmızı ile gösterilen) "boş" kuyu medya sadece içerir ve siRNA veya HeLa 229 hücreler ya eklenmesini gerekmez. o şekilde optimize edilmiştir beri OTP siRNA (bulaşmamış kuyu ve enfekte kuyuları için lacivert için açık mavi gösterilir), olmayan bir hedefleme kontrol olarak kullanılıraz hedef dışı etkileri vardır. kestane ve yeşil kuyular sırasıyla Rab5A ve Rab7A siRNA temsil etmektedir. PLK1 ifade kaybı hücre hatları büyük çoğunluğu pro-apopitotik yollar ve geniş hücre ölümünü teşvik gibi (sarı gösterilir) PLK1 siRNA transfeksiyon verimliliği bir ölçüsü olarak kullanılır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Şekil 4. Temsilcisi qPCR Ct Değerleri C. genomları / ml toplam sayısı ölçmek için kullanılabilecek burnetti pBlaM-CBU0077 Kültürü (A). Coxiella kültürlerinde genomları / ml sayısını saymak qPCR kullanılan çevrim koşulları. Standartlar ve numuneler için Ct değerleri, grafik (B) ve sayısal (C) yer almaktadırbiçimleri. (D) standart Ct değerleri, ortalama grafikle ve logaritmik eğilim çizgisi hesaplanmıştır bulundu. Denklemi ve örnek ortalamaları kullanılarak Ct C. genomları / ml toplam sayısını değerleri burnetti pBlaM-CBU0077 kültür × 10 8 2.31 ​​olarak belirlendi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5,
SiRNA Rab5A ve susturma ve Rab7A. HeLa 229 hücre sırasında Dot / ICM Efektör Blam-CBU0077 Şekil 5. Translokasyon ters Rab5A özgü siRNA (kestane çubuklar), Rab7A (yeşil çubuklar), OTP (mavi bar) ya da PLK1 ile transfekte edildi (sarı çubuklar) ve C ile enfeksiyondan önce 72 saat süreyle inkübe 24 saat boyunca 300 MOl'de burnetti pBlaM-CBU0077 soyu. t sonraO Bam alt-tabakanın eklenmesi, floresan mikroplaka okuyucu kullanılarak ölçülmüştür (A) Tablo 450 ile birlikte, tek bir deneyden elde edilen ham floresans değerlerini gösterir. boş değerler çıkarıldıktan sonra enfekte olmamış OTP kontrolüne 520 nm oranı görece (ortam sadece hücre yok). Translokasyon (B) ve hücre yaşayabilirliği (C) 'nin düzeyi yüzdesi olarak sunulmuştur, üç bağımsız deneyin OTP ters transfekte enfekte hücrelere ± standart sapma oranının ortalaması. * P değeri <0.05; ** P değeri <0.01; **** P-değeri <0.0001 (eşleştirilmiş Student t-testi). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Bileşen konsantrasyon
sitrik asit 13.4 mM
sodyum sitrat 16.1 mM
potasyum fosfat 3.67 mM
magnezyum klorür 1 mM
kalsiyum klorür 0.02 mM
demir sülfat 0.01 mM
sodyum klorit 125.4 mM
L-sistein 1.5 mM
neopeptone 0,1 g / l
kasamino asitleri 2.5 g / L
metil beta siklodekstrin 1 g / L'
RPMI 125 mL / L

Tablo 1. Bileşenleri Gerekli 1x ACCM-2 yapmak.

Uygun Konsantrasyon Nemlendirici Liyofilize siRNA için gerekli 1x siRNA Tampon Tablo 2. Cilt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Salgılama sistemleri ve bakteriyel efektör proteinler konakçı hücrelerin sitoplazmasına bu sistemler nakliye, bir çok patojen bakteriler özgü replikatif niş içinde bir enfeksiyona neden kullanan önemli hastalık oluşturma bileşenidir. Birçok araştırma grupları odağı bakteriyel etkileyiciler ve konak proteinler ve ana hücresel yollardaki bu etkileyiciler var etkisi arasındaki etkileşimi araştırmak olmuştur. Çok sınırlı bir araştırma, eğer varsa, ev sahibi proteinleri başarılı bakteriyel efektör translokasyon için gerekli olduğu potansiyeli incelenmiştir.

Bu çalışmada biz zorunlu hücre içi patojen Coxiella burnetii, zoonotik Q ateşi neden olan ajan kullanılır. Konakçı hücrelere girmesinden sonra, Coxiella ihtiva-eden vakuol pasif çok yüksek sayılar çoğaltır asidik lizozom türetilmiş çarpıtma, ulaşana kadar kanonik endositik yolu aracılığıyla trafik işlemlerini gerçekleştirir. Dışında advanta alaraknormal konakçı trafik yolunun GE, başarılı bir replikatif niş kurmak Coxiella yeteneği de fonksiyonel bir türü IVB salgılama sistemine (T4SS) ve daha sonra efektör translokasyon 8,17 dayanır. Bu salgı sistemi Legionella iyi karakterize edilmiş nokta / Icm T4SS işlevsel benzer. Bu aptly kendi Coxiella genlerinin 19,20 ile Legionella spesifik nokta / icm mutantlar tamamlayarak gösterilmiştir. Legionella ve Coxiella hem T4SSs replikasyonu için gerekli olmakla birlikte, bu sistemler devreye sokulduğunda zamanlaması oldukça farklı ve kendi replikatif nişler farklı doğasını yansıtır. Legionella T4SS hemen konakçı hücrelerin ve efektör hızlı translokasyonu ile temas ettiğinde tetiklenir bakteri varsayılan endozomal-lizozomal yolu önlemek ve bunun yerine benzersiz bir ER-türevli replikatif vacuo oluşturmanıza olanak sağlarle 42. Bakteriler asidik lizozom kaynaklı çarpıtma 21 ulaştıktan sonra tersine, Coxiella ve T4SS, yaklaşık 8 saat sonrası enfeksiyon kadar etkin değildir.

Coxiella pasif o lizozom ulaşana kadar aktif değil endositik yolağı ve translokasyon sistemi ile transit göz önüne alındığında, eşsiz bir fırsat endositik olgunlaşmasını incelemek için bir araç olarak Coxiella kullanmak için kendini göstermektedir. etkileyiciler transloke önce CCV gereksinimi konak proteinler, bir dizi endositik trafik yoluna katılan proteinler konakçı sitoplazmaya efektör proteinler translokasyon için önemlidir, özellikle, ancak bunlarla sınırlı değildir gösterir asitleştirildi hale gelmesine. Belirli bir hedef şekilde siRNA kullanan biz efektör translokasyon özellikle konak proteinlerin rolünü aydınlatmak başlayabilir. Bu çalışmada ökaryotik endositik kadınlara zorla fuhuş düzenleyen iki protein üzerinde duruldudolayısıyla ng yolu ve Coxiella efektör CBU0077 translokasyonunu etkilemek için tahmin edilmiştir. sırasıyla erken ve geç endozomlarda ile Rab5A ve Rab7A kontrol membran füzyon. Kontrol OTP siRNA (Şekil 5B) ile karşılaştırıldığında siRNA kullanılarak bu proteinlerin ya da susturma CBU0077 translokasyon verimliliğinde önemli bir azalma ile sonuçlanmıştır. Burada gösterilen temsilcisi sonuçları önceki yayınlanmış bulguları 21 yansıtmak ve Coxiella efektör translokasyon bu insan Rab proteinlerinin önemini daha da doğrulama sağlamak. Bu teknik aynı zamanda Coxiella Nokta / ICM efektör translokasyon diğer ana işlemler etkisini karakterize etmek için kullanılmıştır. Retromer kompleksi Coxiella hücre içi replikasyonu için önemli olduğu tespit edildi. biz bu retromer o indükler ortamı yaratmak için gerekli olan gösterebilirim bir translokasyon tahlil, retromer bileşenleri susturulması siRNA kullanılarak, ve sonra yaparakCoxiella efektör translokasyon 43.

Burada gösterilen Örnek sonucunu doğurmasına rağmen, enfekte OTP kontrol ve siRNA hedef Rab5A ve Rab7A arasında bir karşılaştırma, protokol deney ihtiyaçlarına göre değiştirilebilir. Örneğin, efektör translokasyon düzeyi de karıştırılmış siRNA veya non-transfekte edilmiş hücreler ile transfekte edilmiş hücreler ile karşılaştırıldığında edilebilir.

Bu özel çalışmanın odak noktası zorunlu hücre içi patojen C. oldu burnetti ve endositik ticareti katılan proteinler, ancak, tarif edilmiş olan yöntemler kolay ölümcüllük için salgılama sistemleri kullanan diğer hücre içi ve hücre dışı patojenlerin uyarlanabilir. Gerçekten de, burada kullanılan ana sitoplazması içinde β-laktamaz aktivitesi dayanır flüoresan bazlı translokasyon deneyi, daha önce yoğun patojenlerin 30-32,35,44 bir aralığında kullanılmaktadır. doğal, enfeksiyon koşullarıkullanılan özel hücre çizgileri özel bakterilerin enfeksiyon gereksinimleri yansıtmak için adapte edilmelidir. Ayrıca, bilinen bir endojen efektör ß-laktamaz için içinde açıklanan yöntemlerden başarısı için her şeyden önemlidir erimiş. protokolün başarılı bir şekilde uygulanması için önemli bir husus burada açıklanan bakteriyel girişi ve sonraki çoğaltma olabilir, belirli bir konak hedefi susturma etkisidir. Burada, Coxiella tarafından efektör translokasyon 24 saat sonrası enfeksiyon ölçülür. Bu durumda, diğer hücre içi bakteri, konak hücreler içine giriş yapmak için organizmanın yeteneği çok önemlidir. Buna ek olarak, belirli bir gen susturma dolayısıyla da görülen translokasyon seviyesinin değiştirilmesi bakteriyel replikasyonu etkileyebilir. siRNA susturma anlamlı bakteriyel giriş ve / veya replikasyonu, ve bunun sonucu olarak translokasyonu etkinliğini etkilemez dair onay, mikroskopi veya bakterinin sayılandırma kullanılarak elde edilebilir. translokasyonBu veriler daha sonra siRNA tedavi başına enfekte hücrelerin sayısı için normalleştirilebilir. Coxiella 24 saat inkübasyon periyodu sırasında çoğaltma az uğrar gibi bakteriyel çoğaltma Burada sunulan veriler eleştirilmiştir değil.

Bu yöntem, ilgi konusu genin, yeterli susturulması sağlamak için konakçı hücrelere siRNA verimli transfeksiyona gerektirir. Bu akılda, doğru transfeksiyon reaktifi seçerken son derece önemlidir. Yanı sıra, reaktif ve HeLa 229 hücreleri için optimize edilmiş bu özel çalışmada kullanılan koşullardan, seçim yapmak için çok sayıda başka reaktif vardır. Farklı transfeksiyon reaktifleri kullanılarak demonte verimlilik en uygun reaktif hem de seçili olduğundan emin olmak için RT-qPCR kullanılarak sayısal ve siRNA özel olarak seçilmiş ilgi transkript hedeflediği edilebilir. Bu çalışmada sunulan olmasa da, biz daha önce hem Rab5A demonte verimliliğini göstermiştir ve Rab7A RT kullanarak-qPCR 21. Ayrıca, western blot ile ilgi ve onay hedefe karşı antikorların kullanımı da belirli hedeflere siRNA susturulması teyit edebilir.

siRNA kullanırken dikkat çekmek için diğer iki önemli hususlar dışı hedef etkileri olasılığını ve transfekte hücrelerin hücre canlılığı bulunmaktadır. istenmeyen hedefleri de tahrip zaman hedef dışı etkileri ortaya çıkar. Bu fenotipik değişikliklere yol açabilir ve yanlış pozitif neden olabilir. Bu çalışmada tek bir ana hedefi susturmak için dört siRNA dubleksleri bir havuz kullanılmıştır. Belirli bir hedef susturma Bu sonuçlar dört siRNA dupleksleri ayrılması ve translokasyon deneyi tekrar elde edilebilir hedef dışı etkiler nedeniyle değildir translokasyon verimliliği, doğrulama bir azalmaya neden olursa. Dört siRNA dubleksleri dışında en az iki orijinal siRNA havuzuna benzer bir fenotip göstermesi gerekmektedir. Bu sonuçla, biri son derece emin olabilirsiniz gözlemlenmiştir translocation verimliliği hedef dışı etkilerine bağlı değildir. üretilen translokasyon sonuçlarının geçerliliği de hücre canlılığı bağlıdır. translokasyon tahlil sonra bir çekirdek leke uygulama siRNA susturma aşağıdaki hücre canlılığı numaralandırma sağlar. PLK1 durumunda, çok hücre ölümü kolay boyama olmaksızın gözlenebilir; Bununla birlikte, bir epifluorışıma mikroskopi daha kesin bir temsili kullanılarak elde edilebilir. kontrole kıyasla, örneğin,% 50 görülmektedir, belirli bir konakçı hedef, çok hücre ölümü susturduğu, bu mümkün değilse doğru bir resim efektörlerinin translokasyonu için bu özel konakçı protein önemine olarak anlaşılabilir ki. Rab5A ya Rab7A ya susturulması hücre canlılığı (Şekil 5C) üzerinde hafif bir etkiye sahip olmasına rağmen, bu çalışmada gösterildiği gibi, bu azalma gözlenmiştir translokasyon verilerinin geçerliliğini yok etmek için yeterince belirgin değildir. hücre canlılığı foll konusunda Diğer bir faktörsiRNA susmasının nedeniyle önemli bir hücre ölümü genellikle translokasyon oranında bir artışa yol açar gözlemdir. Bu uygun bir şekilde PLK1 (Şekil 5A) için rapor edilen translokasyon veriler ile gösterilmektedir. indirgenmiş hücre sayısı enfeksiyon çokluğu orantılı bir artışla sonuçlanır. Bu enfeksiyon oranını ve dolayısıyla translokasyon oranı artacaktır.

Bu çalışmada sunulan olmasa da, efektör translokasyon görselleştirme de ücretsiz bir niceliksel bir sonuç elde edebilirsiniz. Ayrı bir eksitasyon ve emisyon ışığa uzun geçiş dikroik ayna ile donatılmış bir epifluorescent mikroskop kullanarak hücre içi Blam alt-tabaka bir floresans görsel gözlem sağlayabilir. β-laktamaz haberci sistemine bir olası bir alternatif, adenilat-siklaz raportör sistemi kullanmaktır. Burada tarif edilen raportör sistemi benzer şekilde, ilgilenilen gen cyaA (a kalmodulin bağımlı adenilat siklaz genine kaynaştırılır Bordetella pertussis türetilmiş. Efektör translokasyon immunodeneydir ELISA kiti kullanılarak hücre içi siklik AMP (cAMP) nicelleştirilmesi ile ölçülebilir. CyaA aktivitesi ana sitosolunda mevcut olan yegane konakçı hücre kalmodulin, tamamen bağlı olduğundan, efektör translokasyon cAMP seviyelerinde bir artış ile teyit edilir. Bu yöntem aynı zamanda bakteri 45-47 çeşitli efektör translokasyonu ölçmek için başarılı bir şekilde kullanılmıştır, ancak, hücre içi cAMP ölçümü cAMP içinde tarif edilen yönteme göre daha zaman alıcıdır olan bir işlem elde etmek için konakçı hücrelerin lize dayanır. Bam alt-tabaka direkt olarak hücrelere ilave edilebilir ve floresan saat içinde ölçülebilir yana FRET tabanlı β-laktamaz raportör sistemi kullanılarak efektör translokasyon ölçümü daha etkilidir. Buna ek olarak, burada açıklanan yöntem, daha kolay bir şekilde, özellikle, bir 96 oyuklu formunda, yüksek hacimli sonuçları üretmek için adapte edilebilirat.

Birçok bakteriyel patojenler patojeni yararına konak hücre fonksiyonlarının modülasyonu sağlayan konakçı hücreler içine efektör proteinleri tanıtmak, protein translokasyon sistemleri bağlıdır. Tip IV salgılama sistemleri Legionella, Coxiella ve Brucella ve aynı zamanda hücre içi bakteri tarafından kullanılan Tip III salgılama sistemleri bağlama ve E silen, Chlamydia dahil patojen bir dizi tarafından kullanılan E. coli ve Salmonella. patojenlerin bir dizi ile efektör translokasyon belirli konak proteinlerin susturma ifade etkisini karşılaştırarak, bireysel patojene karşı salgı sistemleri veya özel belirli türlerine göre efektör translokasyon için gerekli konakçı faktörleri bir anlayış aydınlatılamamıştır olabilir. Bu konak-patojen etkileşimleri inceliklerini incelemek için benzersiz bir yaklaşım sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

konsantrasyon,
1 mikrona kadar 5 uM 10 uM 20 uM
Mole'ları Başlangıç
1 nmol 1 mi 200 ul 100 ul 50 ul
2 nmol 2 mi 400 ul 200 ul 100 ul
5 nmol 5 mi 1 mi 500 ul 250 ul
10 nmol 10 mi 2 mi 1 mi 500 ul
20 nmol 20 mi 4 mi 2 mi 1 mi
Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Citric acid Sigma C0759 ACCM-2 medium component
Sodium citrate Sigma S4641 ACCM-2 medium component
Potassium phosphate Sigma 60218 ACCM-2 medium component
Magnesium chloride Calbiochem 442611 ACCM-2 medium component
Calcium chloride Sigma C5080 ACCM-2 medium component
Iron sulfate Fisher S93248 ACCM-2 medium component
Sodium chloride Sigma S9625 ACCM-2 medium component
L-cysteine Sigma C6852 ACCM-2 medium component
Bacto-neopeptone BD 211681 ACCM-2 medium component
Casamino acids Fisher BP1424 ACCM-2 medium component
Methyl beta cyclodextrin Sigma C4555 ACCM-2 medium component
RPMI + Glutamax ThermoFisher Scientific 61870-036 ACCM-2 medium component
Chloramphenicol Sigma C0378 For bacterial culture
ON-TARGETplus Non-targeting Control Pool (OTP) Dharmacon D-001810-10-05 Non-targeting control
siGENOME Human PLK1 (5347) siRNA - SMARTpool Dharmacon M-003290-01-005 Causes cell death; measure of transfection efficiency
siGENOME Human RAB5A (5968) siRNA - SMARTpool Dharmacon M-004009-00-0005
siGENOME Human RAB7A (7879) siRNA - SMARTpool Dharmacon M-010388-00-0005
5x siRNA buffer Dharmacon B-002000-UB-100 Use sterile RNase-free water to dilute 5x siRNA buffer to 1x siRNA buffer
DharmaFECT-1 Transfection Reagent Dharmacon T-2001-01 For transfection
Opti-MEM + GlutaMAX ThermoFisher Scientific 51985-034 Reduced-serum medium used for transfection
DMEM + GlutaMAX ThermoFisher Scientific 10567-014 For cell culture and infection
Heat-inactivated fetal calf serum (FCS) Thermo Scientific SH30071.03 Can use alternate equivalent product
DMSO Sigma D8418 For storage of Coxiella strain
PBS For cell culture
0.05% Trypsin + EDTA ThermoFisher Scientific 25300-054 For cell culture
dH2O For dilution of samples and standards for qPCR
Quick-gDNA Mini Prep ZYMO Research D3007 Can use alternate equivalent product to extract gDNA
SensiFAST SYBR No-ROX Kit Bioline BIO-98020 Can use alternate equivalent qPCR master mix product for qPCR reaction
LiveBLAzer FRET-B/G Loading kit with CCF2-AM Invitrogen K1032 For measurement of translocation using fluorescence and generation of the 6X loading solution (contains Solution A, B, C and DMSO)
Sodium hydroxide Merck 106469 Probenicid solution component
Sodium phosphate monobasic Sigma 71505 Probenicid solution component
di-Sodium hydrogen orthophosphate Merck 106586 Probenicid solution component
Probenicid Sigma P8761 Probenicid solution component
DRAQ5 Fluorescent Probe Solution (5 mM) ThermoFisher Scientific 62251 Nuclei stain to determine cell viablity. Use 1:4000 diluted in PBS. 
4% PFA (paraformaldehyde) solution in PBS Sigma P6148 Fixing solution for HeLa 229 cells
25 cm2 tissue culture flask with vented cap Corning 430639 For growth of bacterial strain
96 Well Flat Clear bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually wrapped, with Lid, Sterile Corning 3603
75 cm2 tissue culture flask with vented cap Corning 430641 For growth of HeLa 229 cells
175 cm2 tissue culture flask with vented cap Corning 431080 For growth of HeLa 229 cells
Haemocytometer For quantification of HeLa 229 cells
Tear-A-Way 96 Well PCR plates 4titude 4ti-0750/TA For qPCR reaction
8-Lid chain, flat Sarstedt 65.989.002 For qPCR reaction
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Bench top microfuge
Bench top vortex
Orbital mixer
Centrifuge Eppendorf 5810 R For pelleting bacterial culture
Nanodrop For gDNA quantification
Mx3005P QPCR machine Aligent Technologies 401456 For quantification of Coxiella genomes in 7 day culture
ClarioSTAR microplate reader BMG LabTech For measurement of fluorescence

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Delsing, C. E., Warris, A., Bleeker-Rovers, C. P. Q fever: still more queries than answers. Adv Exp Med Biol. 719, 133-143 (2011).
  2. Delsing, C. E., Kullberg, B. J., Bleeker-Rovers, C. P. Q fever in the Netherlands from 2007 to. Neth J Med. 68, 382-387 (2010).
  3. van der Hoek, W., et al. Epidemic Q fever in humans in the Netherlands. Adv Exp Med Biol. 984, 329-364 (2012).
  4. Madariaga, M. G., Rezai, K., Trenholme, G. M., Weinstein, R. A. Q fever: a biological weapon in your backyard. Lancet Infect Dis. 3, 709-721 (2003).
  5. Hoover, T. A., Culp, D. W., Vodkin, M. H., Williams, J. C., Thompson, H. A. Chromosomal DNA deletions explain phenotypic characteristics of two antigenic variants, phase II and RSA 514 (crazy), of the Coxiella burnetii nine mile strain. Infect Immun. 70, 6726-6733 (2002).
  6. Omsland, A., et al. Isolation from animal tissue and genetic transformation of Coxiella burnetii are facilitated by an improved axenic growth medium. Appl Environ Microbiol. 77, 3720-3725 (2011).
  7. Omsland, A., et al. Host cell-free growth of the Q fever bacterium Coxiella burnetii. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4430-4434 (2009).
  8. Beare, P. A., et al. Dot/Icm type IVB secretion system requirements for Coxiella burnetii growth in human macrophages. MBio. 2, e00175-e00111 (2011).
  9. Chen, C., et al. Large-scale identification and translocation of type IV secretion substrates by Coxiella burnetii. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 21755-21760 (2010).
  10. Voth, D. E., et al. The Coxiella burnetii cryptic plasmid is enriched in genes encoding type IV secretion system substrates. J Bacteriol. 193, 1493-1503 (2011).
  11. Beare, P. A., Sandoz, K. M., Omsland, A., Rockey, D. D., Heinzen, R. A. Advances in genetic manipulation of obligate intracellular bacterial pathogens. Front Microbiol. 2, 97 (2011).
  12. Beare, P. A., Larson, C. L., Gilk, S. D., Heinzen, R. A. Two systems for targeted gene deletion in Coxiella burnetii. Appl Environ Microbiol. 78, 4580-4589 (2012).
  13. Howe, D., Shannon, J. G., Winfree, S., Dorward, D. W., Heinzen, R. A. Coxiella burnetii phase I and II variants replicate with similar kinetics in degradative phagolysosome-like compartments of human macrophages. Infect Immun. 78, 3465-3474 (2010).
  14. Heinzen, R. A., Scidmore, M. A., Rockey, D. D., Hackstadt, T. Differential interaction with endocytic and exocytic pathways distinguish parasitophorous vacuoles of Coxiella burnetii and Chlamydia trachomatis. Infect Immun. 64, 796-809 (1996).
  15. Romano, P. S., Gutierrez, M. G., Beron, W., Rabinovitch, M., Colombo, M. I. The autophagic pathway is actively modulated by phase II Coxiella burnetii to efficiently replicate in the host cell. Cell Microbiol. 9, 891-909 (2007).
  16. Beare, P. A. Genetic manipulation of Coxiella burnetii. Adv Exp Med Biol. 984, 249-271 (2012).
  17. Carey, K. L., Newton, H. J., Luhrmann, A., Roy, C. R. The Coxiella burnetii Dot/Icm system delivers a unique repertoire of type IV effectors into host cells and is required for intracellular replication. PLoS Pathog. 7, e1002056 (2011).
  18. Segal, G., Shuman, H. A. Possible origin of the Legionella pneumophila virulence genes and their relation to Coxiella burnetii. Mol Microbiol. 33, 669-670 (1999).
  19. Zamboni, D. S., McGrath, S., Rabinovitch, M., Roy, C. R. Coxiella burnetii express type IV secretion system proteins that function similarly to components of the Legionella pneumophila Dot/Icm system. Mol Microbiol. 49, 965-976 (2003).
  20. Zusman, T., Yerushalmi, G., Segal, G. Functional similarities between the icm/dot pathogenesis systems of Coxiella'burnetii and Legionella pneumophila. Infect Immun. 71, 3714-3723 (2003).
  21. Newton, H. J., McDonough, J. A., Roy, C. R. Effector Protein Translocation by the Coxiella burnetii Dot/Icm Type IV Secretion System Requires Endocytic Maturation of the Pathogen-Occupied Vacuole. PLoS One. 8, e54566 (2013).
  22. Lifshitz, Z., et al. Computational modeling and experimental validation of the Legionella and Coxiella virulence-related type-IVB secretion signal. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, E707-E715 (2013).
  23. Voth, D. E., et al. The Coxiella burnetii ankyrin repeat domain-containing protein family is heterogeneous, with C-terminal truncations that influence Dot/Icm-mediated secretion. J Bacteriol. 191, 4232-4242 (2009).
  24. Weber, M. M., et al. Identification of C. burnetii type IV secretion substrates required for intracellular replication and Coxiella-containing vacuole formation. J Bacteriol. (2013).
  25. Klingenbeck, L., Eckart, R. A., Berens, C., Luhrmann, A. The Coxiella burnetii type IV secretion system substrate CaeB inhibits intrinsic apoptosis at the mitochondrial level. Cell Microbiol. 15, (4), 675-678 (2013).
  26. Larson, C. L., Beare, P. A., Howe, D., Heinzen, R. A. Coxiella burnetii effector protein subverts clathrin-mediated vesicular trafficking for pathogen vacuole biogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, E4770-E4779 (2013).
  27. Luhrmann, A., Nogueira, C. V., Carey, K. L., Roy, C. R. Inhibition of pathogen-induced apoptosis by a Coxiella burnetii type IV effector protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 18997-19001 (2010).
  28. Newton, H. J., et al. A screen of Coxiella burnetii mutants reveals important roles for Dot/Icm effectors and host autophagy in vacuole biogenesis. PLoS Pathog. 10, (2014).
  29. Pan, X., Luhrmann, A., Satoh, A., Laskowski-Arce, M. A., Roy, C. R. Ankyrin repeat proteins comprise a diverse family of bacterial type IV effectors. Science. 320, 1651-1654 (2008).
  30. Charpentier, X., Oswald, E. Identification of the secretion and translocation domain of the enteropathogenic and enterohemorrhagic Escherichia coli effector Cif, using TEM-1 beta-lactamase as a new fluorescence-based reporter. J Bacteriol. 186, 5486-5495 (2004).
  31. de Felipe, K. S., et al. Legionella eukaryotic-like type IV substrates interfere with organelle trafficking. PLoS Pathog. 4, e1000117 (2008).
  32. de Jong, M. F., Sun, Y. H., den Hartigh, A. B., van Dijl, J. M., Tsolis, R. M. Identification of VceA and VceC, two members of the VjbR regulon that are translocated into macrophages by the Brucella type IV secretion system. Mol Microbiol. 70, 1378-1396 (2008).
  33. Raffatellu, M., et al. Host restriction of Salmonella enterica serotype Typhi is not caused by functional alteration of SipA, SopB, or SopD. Infect Immun. 73, 7817-7826 (2005).
  34. Wood, R. E., Newton, P., Latomanski, E. A., Newton, H. J. Dot/Icm Effector Translocation by Legionella longbeachae Creates a Replicative Vacuole Similar to That of Legionella pneumophila despite Translocation of Distinct Effector Repertoires. Infect Immun. 83, 4081-4092 (2015).
  35. Mueller, K. E., Fields, K. A. Application of beta-lactamase reporter fusions as an indicator of effector protein secretion during infections with the obligate intracellular pathogen Chlamydia trachomatis. PLoS One. 10, (2015).
  36. Agrawal, N., et al. RNA interference: biology, mechanism, and applications. Microbiol Mol Biol Rev. 67, 657-685 (2003).
  37. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  38. Lam, J. K., Chow, M. Y., Zhang, Y., Leung, S. W. siRNA Versus miRNA as Therapeutics for Gene Silencing. Mol Ther Nucleic Acids. 4, e252 (2015).
  39. Martinez, E., Cantet, F., Fava, L., Norville, I., Bonazzi, M. Identification of OmpA, a Coxiella burnetii protein involved in host cell invasion, by multi-phenotypic high-content screening. PLoS Pathog. 10, e1004013 (2014).
  40. Jaton, K., Peter, O., Raoult, D., Tissot, J. D., Greub, G. Development of a high throughput PCR to detect Coxiella burnetii and its application in a diagnostic laboratory over a 7-year period. New Microbes New Infect. 1, 6-12 (2013).
  41. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
  42. Prashar, A., Terebiznik, M. R. Legionella pneumophila: homeward bound away from the phagosome. Curr Opin Microbiol. 23C, 86-93 (2014).
  43. McDonough, J. A., et al. Host Pathways Important for Coxiella burnetii Infection Revealed by Genome-Wide RNA Interference Screening. MBio. 4, (1), e00606-e00612 (2013).
  44. Farfan, M. J., Toro, C. S., Barry, E. M., Nataro, J. P. Shigella enterotoxin-2 is a type III effector that participates in Shigella-induced interleukin 8 secretion by epithelial cells. FEMS Immunol Med Microbiol. 61, 332-339 (2011).
  45. Al-Khodor, S., Price, C. T., Habyarimana, F., Kalia, A., Abu Kwaik, Y. A Dot/Icm-translocated ankyrin protein of Legionella pneumophila is required for intracellular proliferation within human macrophages and protozoa. Mol Microbiol. 70, 908-923 (2008).
  46. Geddes, K., Worley, M., Niemann, G., Heffron, F. Identification of new secreted effectors in Salmonella enterica serovar Typhimurium. Infect Immun. 73, 6260-6271 (2005).
  47. Sory, M. P., Boland, A., Lambermont, I., Cornelis, G. R. Identification of the YopE and YopH domains required for secretion and internalization into the cytosol of macrophages, using the cyaA gene fusion approach. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 11998-12002 (1995).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics