L'isolamento di filtrazione di acidi nucleici: DNA metodo di estrazione semplice e veloce

Biology

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Summary

Descriviamo qui un metodo di estrazione del DNA semplice e rapida cartaceo di HIV provirale DNA da sangue intero rilevato mediante PCR quantitativa. Questo protocollo può essere esteso per l'utilizzo nel rilevare altri marcatori genetici o utilizzando metodi di amplificazione alternativi.

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McFall, S. M., Neto, M. F., Reed, J. L., Wagner, R. L. Filtration Isolation of Nucleic Acids: A Simple and Rapid DNA Extraction Method. J. Vis. Exp. (114), e54289, doi:10.3791/54289 (2016).

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Abstract

FINA, isolamento filtrazione di acidi nucleici, è un metodo di estrazione romanzo che utilizza filtrazione verticale tramite una membrana di separazione e tampone assorbente per estrarre DNA cellulare da sangue intero in meno di 2 min. Il campione di sangue viene trattata con un detergente, brevemente mescolato e applicato dalla pipetta alla membrana di separazione. Il lisato stoppini nel tampone assorbente per capillarità, catturando il DNA genomico sulla superficie della membrana di separazione. Il DNA estratto viene conservato sulla membrana nel corso di una semplice fase di lavaggio in cui gli inibitori della PCR sono malvagi nel tampone assorbente assorbente. La membrana contenente il DNA intrappolata viene quindi aggiunto alla reazione PCR senza ulteriore purificazione. Questo semplice metodo non richiede attrezzature di laboratorio e può essere facilmente implementato con materiale di laboratorio poco costoso. Qui si descrive un protocollo per il rilevamento ad alta sensibilità e la quantificazione del virus HIV-1 DNA provirale da 100 ml di sangue intero come modello per l'inizio inDiagnosi fant del virus HIV che potrebbe facilmente essere adattato per altri obiettivi genetici.

Introduction

Diversi rapporti hanno discusso lo sviluppo di metodi di estrazione carta- o membrana a base per l'uso in point-of-care (POC) dispositivi di 1-5, con l'obiettivo di rendere la sensibilità squisita e la specificità della diagnostica molecolare a disposizione di tutti. L'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) Malattie Sessualmente Trasmesse Diagnostica iniziativa ha coniato il termine ASSURED (a prezzi accessibili, sensibile, specifico, facile da usare, veloce e robusto, senza attrezzature e distribuito chi ne ha bisogno) per descrivere le caratteristiche ideali di un POC Test 6. Di queste linee guida, la caratteristica senza attrezzatura è particolarmente difficile da raggiungere per la diagnostica molecolare. Tuttavia, ogni innovazione nel campo avanzerà l'obiettivo di raggiungere le più bisognose, e non c'è speranza di miglioramento a breve termine in termini di prestazioni di prova adattando la tecnologia esistente 7.

Qui si descrive un protocollo semplice per l'estrazione del DNA da sangue interoche non richiede chimica complessa o strumentazione di laboratorio. La FINA (isolamento filtrazione di acidi nucleici) metodo di preparazione campione è stato originariamente sviluppato per estrarre il DNA dei leucociti dal sangue intero per rilevare l'HIV-1 provirus come parte di un point-of-care (POC) del campione alla risposta PCR quantitativa diagnostica piattaforma (EID) (qPCR) precoce infantile per l'utilizzo in contesti di risorse limitate 8-11. Estrazione FINA differisce dai metodi di purificazione convenzionali che utilizzano membrane di silice o silice particelle paramagnetiche rivestite di legarsi reversibilmente DNA in presenza di agenti caotropici 12. Invece, FINA utilizza filtrazione verticale attraverso una membrana di separazione per estrarre DNA cellulare da sangue intero direttamente. La membrana contenente il DNA intrappolata può essere collocato direttamente in un tubo di PCR e sia immediatamente utilizzato in una reazione PCR o aria secca per la successiva amplificazione 9. Senza caotropici agenti, fenolo, o alcoli sono utilizzati per l'estrazione del campione, eliminaTing le ampie fasi di lavaggio necessari per rimuovere potenti inibitori qPCR derivanti dal processo di estrazione 13,14.

La membrana FINA può catturare sia cellule 9 o DNA genomico liberati da lisi cellulare 11 prima che il campione viene aggiunto alla membrana. Per la cattura delle cellule, sangue intero viene aggiunto direttamente alla membrana. Le cellule sono poi lisate nella membrana per aggiunta di 10 mM NaOH. Il vantaggio di questo metodo è che si tratta solo 3 fasi: 1) l'aggiunta del campione; 2) la lisi cellulare / lavaggio e 3) il posizionamento del disco filtro in tubo qPCR. Lo svantaggio di questo metodo è che la membrana può contenere solo un numero definito di cellule direttamente proporzionale al diametro del disco membrana. Per raggiungere il limite di rilevazione necessario per EID, 100 ml di sangue intero è richiesto per l'ingresso di campionamento che comporta un filtro che è troppo grande per essere inserito in un tubo qPCR. Lisi delle cellule del sangue con detersivo prima di aggiungere il campione alla raccoltamembrana aggiunge una fase di elaborazione, ma consente l'uso di un filtro più piccolo per la stessa dimensione del campione. Siamo stati in grado di dimostrare alta riproducibilità, la rilevazione solo esemplare, e la quantificazione di un minimo di 10 copie di HIV-1 DNA provirale da 100 ml di sangue che utilizzano questa configurazione di prova 11.

In questo rapporto, descriviamo il protocollo FINA come originariamente sviluppato per l'uso in laboratorio. Il sandwich membrana / filtro noto come modulo di preparazione del campione FINA può essere preparato in grandi lotti e stoccato per un uso successivo. Quando i campioni vengono estratti questo processo richiede 2 min e può essere eseguita in diversi lotti di dimensioni. La qPCR può essere eseguito immediatamente o dei filtri contenenti il ​​DNA incorporato può essere conservato fino a quando non è conveniente per eseguire qPCR. Questo metodo è molto comodo per le analisi di routine, di esemplari in entrambe le impostazioni alte e basse risorse.

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Protocol

Etica dichiarazione: I campioni di sangue intero utilizzate in questo studio non sono considerati come ricerca che coinvolge soggetti umani. I campioni sono stati ottenuti per scopi diagnostici clinici, che sono state soddisfatte, e la porzione restante di questi campioni è stato fornito per il dosaggio di ricerca FINA. I campioni sono stati codificati in modo tale che i ricercatori non sono stati in grado di accertare facilmente l'identità degli individui.

1. Preparazione della FINA campione Modulo di preparazione

  1. Preparare tampone assorbente tagliando un 35 x 35 mm 2 di un 2,6 mm batuffolo di cotone al 100% di spessore. Tagliare una pastiglia per ogni campione.
  2. Preparare parafilm plastica con un nastro di protezione di carta da un pezzo di taglio della pellicola di paraffina (25 mm (h) di 50 mm (w)) e quindi un foro di diametro 7,14 millimetri al centro del nastro con un martello guidato perforazione. Preparare un nastro per ogni campione.
  3. Preparare un separatore membrana di sangue vetro rilegato (membrana cattura) disco perforando un cerchio di diametro 8,35 millimetricon un martello guidato perforazione. Punch un disco per ogni campione. Il disco ha una capacità di ritenzione delle particelle di 2,3 micron.
  4. Assemblare il modulo di preparazione del campione FINA disponendo il disc cattura nel centro del pad blotting utilizzando pinze. Posizionare il nastro parafilm sopra il disco acquisizione in modo che il foro del nastro paraffina lascia il centro del disco cattura esposto.
  5. Garantire il contatto tra il disco e il tampone assorbente allungando il nastro di paraffina leggermente a coprire il pad assorbente e premendo saldamente il nastro di paraffina a bastone per il pad assorbente lungo tutti i bordi del disco.
  6. Fare come molti moduli come necessario per l'esperimento o di riserva per un utilizzo futuro.

2. Preparazione della qPCR tubo

  1. Preparare un disco nastro 5,1 millimetri che ancorare la membrana cattura cella a lato del tubo qPCR per impedire la membrana blocchi la rilevazione della fluorescenza per punzonatura un cerchio di polie doppio rivestimentoster nastro diagnostico con un martello guidato pugno da un foglio di nastro. Preparare un disco a nastro per ogni campione.
  2. Rimuovere un lato del rivestimento adesivo del nastro. Posizionare il nastro in 200 microlitri tubo PCR, attaccare su un lato e verso il fondo della provetta. Rimuovere il secondo rivestimento adesivo. Il tubo è ora pronto a ricevere disco preparato.
  3. Produrre come molti tubi come necessario per l'esperimento o scorte per uso futuro.

3. Contrive sangue del campione

Nota: Se si sta preparando un vero e proprio provino, passare al punto 4.

  1. Scongelare le cellule 8e5-LAV 15 portatori di una singola copia dei provirus HIV-1 ottenuti dal Laboratorio Quality Assurance Virology (VQA; Rush Presbyterian / St Luke Medical Center, Chicago, IL.).
    Nota: Vengono memorizzati come pellet cellulari congelati ad una concentrazione di 4.000 cellule / microlitro. Conteggio delle cellule è stata verificata come descritto in precedenza 9.
  2. preparare serdiluizione ial a congelamento medio (siero 90% fetale bovino, 10% dimetilsolfossido) a concentrazioni che vanno da 1 a 400 cellule / microlitro.
  3. Pipettare 10 celle microlitri di ciascuna delle diluizioni seriali in una provetta. Aggiungere 100 ml di HIV-1 negativo EDTA campione di sangue intero fresco trattati ad ogni provetta per creare una curva standard di 8e5-LAV numero di copie 10-4,000. Mescolare delicatamente sfogliando il fondo del tubo 5 volte.

4. Eseguire FINA Estrazione

  1. globuli Lyse aggiungendo Triton-X100) ad una concentrazione finale di 1% (11 microlitri 10% Triton-X100 a 110 microlitri di sangue intero e cellule dal punto 3.3).
  2. Mescolare delicatamente sfogliando il fondo del tubo 5 volte. Il sangue dovrebbe diventare rosso traslucido.
  3. Pipettare tutti i campioni di sangue sul disco cattura.
    Nota: Una guarnizione a tenuta d'acqua tra il nastro paraffina e la membrana cattura assicura che il sangue scorre attraverso la membrana, e un buon contatto tra l'acquisizione membrane e assorbente complesso a tampone garantisce un rapido assorbimento del campione.
  4. Lasciare in ammollo campione attraverso il filtro.
    Nota: Gli stoppini lisato sangue nel tampone assorbente per capillarità, catturando il DNA genomico sulla superficie del disco cattura. Il lisato è imbevuto nel disco quando appare opaca.
  5. Aggiungere 600-1,000 ml 10 mM di NaOH goccia a goccia sul disco cattura.
    Nota: Il tampone di lavaggio può anche essere aggiunto come una massa aggiunta di 600 microlitri. Il buffer formerà una gocciolina sul nastro di paraffina idrofoba e stoppino attraverso il foro sul disco in circa 20 sec. Il filtro passa dal rosso al bianco indicando liquidazione di emoglobina.
  6. Separare il disco dal tampone assorbente con una pinza e applicare il disco al nastro nel tubo PCR preparato. Se c'è un colore rosso rimasto sul filtro aggiungere 50-100 ml di tampone di lavaggio per cancellare il filtro prima di mettere nel tubo.
    Nota: Raramente, l'eccesso di pressione applicata durante la preparazione dila FINA moduli comporta il partizionamento degli strati di membrana durante la separazione dal tampone assorbente. Eliminare questi dischi e preparare un campione fresco.
  7. Dopo il filtro è posizionato nel tubo PCR, analizzare i campioni subito. In alternativa, asciugare per una notte in una scatola contenente solfato di calcio essiccante, quindi cap e mettere in un sacchetto di alluminio con essiccante di silice e conservare fino al momento dell'analisi.

5. qPCR Reazione

  1. Preparare 100 microlitri qPCR master mix per reazione con l'HIV primer e sonde specifiche come descritto in precedenza 9,11. Includere un controllo interno di amplificazione per monitorare la presenza di inibitori di amplificazione e di verificare che un campione negativo è un vero negativo. Assicurarsi che il filtro è completamente ricoperta di master mix e che il filtro rimane fissato al lato del tubo durante la reazione.
  2. Eseguire l'amplificazione utilizzando un dispositivo di PCR in tempo reale, come descritto in precedenza 9.

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Representative Results

Il flusso di lavoro per l'estrazione del DNA provirale dal sangue intero addizionato di cellule 8e5-LAV è mostrato in Figura 1. La Figura 2 mostra il modulo di esempio FINA e preparati tubo qPCR. Questo metodo consente efficiente amplificazione del HIV-1 provirus da cellule 8e5-LAV a differenti numeri di copia, come mostrato nella curva standard di esemplari artificiosa (Figura 3). PCR ha avuto un rendimento del 103%, come calcolato dal Efficienza = -1 + 10 (-1 / pendenza). Equazione della linea era y = -3.25x + 27.95, con una correlazione di R² = 0,996. La curva provirale standard di DNA HIV replica hanno anche amplificazione altamente riproducibili, come evidenziato nella Tabella 1. Inoltre, un controllo interno di 500 copie Hydroxypyruvate reduttasi è presente per mostrare che non c'è alcuna inibizione PCR derivanti dall'estrazione di sangue con FINA, indipendente dal numero di copie di HIV-1 provirus presenti (Figura 4). IC amplificazione è stata ottenuta in modo efficiente in tutti i 18 campioni testati, con Cq media di 21,92 ± 0,25 e un CV di 1%.

Figura 1
Figura 1: Flusso di lavoro per la rilevazione del DNA provirale da sangue intero a spillo con le cellule 8e5-LAV per qPCR. (A) Da sinistra a destra, il modulo FINA preparato, dopo il sangue viene aggiunto alla membrana cattura e dopo il tampone di lavaggio è stato aggiunto. Tubi (B) qPCR con i dischi di cattura incollati al nastro doppio rivestimento con il maestro qPCR mix aggiunto. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2: FINA modulo in-house e la preparazione del tubo qPCR. (A) Un disco membrana cattura diametro 8,35 mm è stata inserita tra un quadrato 707 pad assorbente e un sottile foglio di nastro paraffina contenente un foro 7,14 mm di diametro nel centro in modo tale che il foro del nastro di paraffina è stato centrato su il disco di acquisizione per l'applicazione diretta di sangue lisato dalla pipetta. (B) Un nastro di poliestere diagnostica 5,1 millimetri doppio rivestimento è bloccato sul lato del tubo da 200 ml qPCR. Il secondo rivestimento del nastro è stato rimosso per esporre superficie adesiva per l'applicazione su disco cattura quando è pronto. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3:. Curva standard degli esemplari ideati da HIV-1 DNA provirale (A) grafici di amplificazione ottenuti da 100 ml di 4 repliche HIV-1 neesclusi a livello di sangue intero a spillo con 4.000, 400, 40 e 10 celle 8e5-LAV con 500 copie / reazione del controllo interno linee continue = grafici di amplificazione; La linea tratteggiata = soglia. Asse Y è unità di fluorescenza e asse X è qPCR numero di cicli. (B) Le curve standard dei valori Cq calcolati dal plot di amplificazione rispetto al numero di registro copia di cellule 8e5-LAV per 100 ml di sangue intero. Equazione della linea: y = -3.25x + 27.95; R² = 0,996; Efficienza della PCR = 103.23% calcolato tramite Efficienza = -1 + 10 (-1 / pendenza) Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4: controllo interno indica l'assenza di qPCR inibizione 500 copie Hydroxypyruvate reduttasi Amplification controllo plasmide aggiunto per reazione.. Solidolinee = grafici di amplificazione; La linea tratteggiata = soglia. Media Cq di IC = 21.92 ± 0.25. CQS variava 21,21-22,32. Coefficiente di variazione (CV%) = 1%; N = 18. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Cellule 8e5-LAV /
100 ml WB Ave. cq SD CV (%)
4.000 16.27 0.14 1
400 19.54 0.15 1
40 22.56 0.3 1
10 24.83 0.15 1

Tabella 1: Media Cq, la deviazione standard (SD) e il coefficiente di variazione (CV%) di 4.000, 400, 40 e 10 copie di curva standard 8e5-LAV con l'estrazione della FINA e HIV-1 primer specifici e sonde. N = 4. WB = sangue intero.

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Discussion

EID legata al trattamento di accesso rapido ha dimostrato di ridurre la mortalità infantile a causa di infezione da HIV 16. A causa della persistenza di anticorpi materni nel sangue di un neonato, rapidi test degli anticorpi HIV hanno limitato l'utilità per determinare il carattere dei bambini HIV-esposti. L'OMS raccomanda che tutti i bambini nati da madri HIV-1 positivi dovrebbero essere testati a 4-6 settimane di età, utilizzando un test virologico 17. Abbiamo riportato lo sviluppo di un saggio per la rilevazione e la quantificazione di HIV-1 DNA provirale in campioni di sangue intero che è capace di rilevazione copia singola con dimostrato sensibilità 100% e specificità in un piccolo campo di valutazione 61 sudafricano neonati 11. Cento microlitri o più di sangue intero possono essere raccolti tramite dita o il tallone bastone ed elaborati tramite i moduli FINA 18,19. Questi campioni di sangue possono essere conservate per almeno un mese prima dell'amplificazione rendendo questo metodo ideal test per neonati che sono lontani dai laboratori.

Nello studio presentato nella figura 3, una curva standard di esemplari inventati da HIV-1 sangue intero negativo addizionato di cellule scongelati harboring HIV-1 DNA provirale è raffigurato. Un avvertimento a questo studio è che alcune delle cellule aggiunti al campione poteva essere già lisati dovuto al gelo / disgelo, che avrebbe potuto potenzialmente migliorato il livello di rilevamento del bersaglio. Un disegno sperimentale più rigoroso sarebbe stata quella di aver ideato il campione utilizzando cellule in coltura fresco che sarebbe più accuratamente imitato sangue intero.

Il metodo di preparazione del campione FINA è stato progettato per essere incorporato in un dispositivo di EID POC qPCR (in fase di sviluppo) per l'utilizzo in contesti di risorse limitate 8; tuttavia, il formato manuale qui descritto può anche essere un utile aggiunta al portafoglio preparazione del campione di laboratorio. FINA non usa l'associazione, lavare ed eluire strategia utilizzata in driEd macchie di sangue e di altri sistemi di estrazione cartacei che diluisce gli acidi nucleici estratti, eventualmente abbinato a sub-ottimale sensibilità di rilevamento 5. Il sistema FINA è molto flessibile e può essere facilmente adattato per altri test genetici oltre rilevazione provirale HIV DNA. Minori volumi di sangue o altri campioni biologici possono essere trattati per obiettivi abbondanti e volumi più alti per quelli meno abbondanti. Nella nostra realizzazione originale del sistema FINA, abbiamo catturare le cellule da sangue intero utilizzando una membrana di separazione del sangue e poi lisare mediante aggiunta di 10 mM NaOH 9. Questa versione presenta il vantaggio di un minor numero di passaggi utente, ma il volume / sangue numero di cellule che possono essere elaborati è minore. Oltre alla membrana di vetro rilegato utilizzato in questa relazione, altri documenti di separazione del sangue o del filtro di raccolta del sangue sono stati utilizzati con successo con questo metodo, e diversi strumenti PCR quantitativa diversi hanno anche dimostrato di amplificare modello incorporato nel fdisco Ilter 9. L'unica condizione è che il filtro non blocca la lettura di fluorescenza dello strumento PCR in tempo reale.

Una significativa limitazione dell'estrazione FINA è che vi è un vincolo dimensioni del diametro della membrana cattura. Un disco con una membrana superiore a 9 mm non può essere collocato in un tubo 200 microlitri qPCR senza la sovrapposizione della membrana nel tubo che limita la superficie esposta alla miscela di reazione. Inoltre, maggiore è il diametro del disco, il maggior volume di reazione qPCR è necessario per coprire il filtro che aumenta il costo ed il tempo complessivo del test. Se il filtro è troppo piccolo per catturare efficacemente il DNA nel campione, esso può intasare prevenire lavaggio efficace.

Utilizzando la membrana cattura vetro rilegato, siamo stati in grado di catturare solo HIV-1 DNA provirale e RNA virale non da campioni di sangue intero (dati non riportati). Non sappiamo se le membrane alternative o buffer potrebbero essere utilizzati to promuovere isolamento di RNA in sostituzione o in aggiunta al DNA. Se il lettore desidera isolare solo DNA dal campione questo protocollo non richiede la rimozione enzimatica di RNA richiesto con alcuni protocolli. Rilevando sia HIV-1 RNA e DNA in campioni clinici migliorerebbe la sensibilità dell'EID e questa mancanza di rilevamento dell'RNA è una limitazione del nostro test diagnostico.

La fase più critica nell'adattare il processo FINA ad un nuovo test è convalidare la dimensione del filtro per accogliere la quantità di DNA, cioè, il numero di cellule, nel campione da testare. In generale, l'estrazione FINA funziona meglio con i campioni con un numero inferiore di cellule in modo che piccoli dischi di cattura possono essere utilizzati. Per determinare la capacità di legame del filtro, è sufficiente aggiungere un secondo disco filtro per il modulo FINA impilati sotto la membrana raccolta. Aggiungere il campione e lavare le membrane come nei passaggi 4.1-4.5. Mettere ciascuno dei dischi di cattura del DNA in tubi qPCR separate e ampLify. Utilizzando una curva standard, determinare la percentuale di DNA ingresso catturato ogni filtro. La dimensione del filtro può essere ottimizzato per le esigenze del dosaggio. Per il saggio FINA provirale DNA qui descritto, oltre il 99% del DNA genomico umano viene catturata quando lisato cellulare viene aggiunto al filtro (osservazioni non pubblicate) consentono capacità di rilevazione superiori.

Oltre a EID, le future applicazioni di FINA potrebbero includere il rilevamento e la quantificazione del DNA provirale come biomarker per l'HIV-1 il monitoraggio della malattia con i pazienti che hanno raggiunto la soppressione virale dovuta alla terapia antiretrovirale. monitoraggio del trattamento finalizzato alla eradicazione di HIV potrebbe essere eseguita con la proiezione di altri fattori oltre sangue periferico per serbatoi di HIV-1 le cellule infette. HIV test proviral potrebbe anche essere utilizzato per lo screening soggetti della sperimentazione del vaccino per la vera infezione. I campioni di sangue sono stabili durante la conservazione moduli FINA e possono essere raccolti in condizioni di campo per la spedizione in seguito a CElaboratori ntral per l'analisi PCR rendendo questo metodo ideale per gli studi epidemiologici. Oltre a HIV-1 rilevamento, questo metodo altamente flessibile potrebbe anche essere utilizzato per amplificare obiettivi medicina precisione trovati in campioni biologici quali lo screening farmacogenetica o altro rilevamento SNP o per una rapida genotipizzazione dei modelli animali. metodi di amplificazione isotermici, come elicasi amplificazione dipendente (HDA) o di amplificazione isotermica loop-mediata (LAMP) potrebbe essere utilizzato anche con FINA estratti modello o il DNA-embedded sul filtro potrebbe essere utilizzato come modello per l'amplificazione PCR convenzionale.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fusion 5 GE Healthcare Life Sciences 8151-9915
707 blotting pad VWR International 28298-014
PARAFILM M VWR International 52858-000
3M Double-Coated Polyester Diagnostic Tape  3M Medical Specialties 9965
200 µl qPCR strip tubes Agilent 401428
optical strip caps Agilent 401425
Mx3005p qPCR System Agilent 401456
sodium hydroxide Sigma-Aldrich 221465 A.C.S. Reagent
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284 BioXtra
dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D8418 for molecular biology
fetal bovine serum, certified, U.S. origin Thermo Fisher Scientific 16000-044
Hammer driven small hole punch 3/16" hole diameter (5.1 mm) McMaster Carr 3424A16
Hammer driven small hole punch 1/4" hole diameter (7.14 mm) McMaster Carr 3424A19
Hammer driven small hole punch 5/16" hole diameter (8.35 mm) McMaster Carr 3424A23

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References

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