Nükleik Asitlerin süzülmesi İzolasyonu: basit ve hızlı DNA izolasyonu,

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Burada nicel PCR ile tespit tam kan HIV proviral DNA için basit ve hızlı bir kağıt bazlı DNA ekstraksiyon yöntemini tarif etmektedir. Bu protokol için diğer genetik işaretleyiciler saptanması veya alternatif yükseltme yöntemleri kullanılarak kullanılmak için uzatılabilir.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

McFall, S. M., Neto, M. F., Reed, J. L., Wagner, R. L. Filtration Isolation of Nucleic Acids: A Simple and Rapid DNA Extraction Method. J. Vis. Exp. (114), e54289, doi:10.3791/54289 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

FINA, nükleik asitlerin filtrasyon izolasyonu, en az 2 dakika içinde tam kandan, hücresel DNA elde etmek için, bir ayırma membranı emici ped vasıtasıyla dikey filtrasyon kullanan yeni bir ekstraksiyon yöntemi. Kan numunesi deterjan, kısa bir süre karıştırıldı ile muamele edilmiş ve ayırma membranı şekilde kamış ile uygulanır. Lizat ayırma membranı yüzeyinde genomik DNA yakalama, kılcal eylemi lekeleme pedine fitilleri. Ekstre edilen DNA, PCR inhibitörleri, emici lekeleme pedine kötü burada basit bir yıkama aşaması sırasında zar üzerinde muhafaza edilir. yakalanmış DNA içeren zar daha sonra daha fazla arıtılmadan PCR reaksiyonuna ilave edildi. Bu basit yöntem laboratuvar ekipmanı gerektirmeyen ve kolayca ucuz laboratuar malzemeleri ile uygulanabilir. Burada erken için bir model olarak, 100 ul tam kandan, HIV-1 proviral DNA'nın son derece hassas algılama ve miktar tayini için bir protokol açıklarkolayca diğer genetik hedeflere adapte olabilir HIV fant tanı.

Introduction

Çeşitli raporlar, herkes için ulaşılabilir zarif duyarlılığı ve moleküler tanı özgüllüğünün yapma hedefiyle noktası-bakım (POC) aygıtları 1-5 kullanım için, kağıt veya membran bazlı ekstraksiyon yöntemleri geliştirilmesini ele aldık. Dünya Sağlık Örgütü (WHO) Cinsel Yolla Bulaşan Hastalıklar Tanı Girişimi POC (Ekonomik, Hassas, Özgül, kullanıcı dostu, hızlı ve sağlam, Ekipman-özgür ve ihtiyacı olanlara teslim) tanımlamak için idealdir özellikleri ASSURED terim icat Test 6. Bu yönergelerin, ekipman gerektirmeyen karakteristik moleküler teşhis için elde etmek özellikle zordur. Bununla birlikte, sahada her yenilik en çok ihtiyacı olanlara ulaşma hedefine ilerlemek olacak ve umut mevcut teknoloji 7 adapte test performansında yakın vadeli iyileştirmeler için vardır.

Burada kandan DNA ayıklamak için basit bir protokol açıklarkarmaşık kimya veya laboratuar aletleri gerekli değildir. FINA (nükleik asitlerin filtrasyon izolasyon) örnek hazırlama yöntemi ilk olarak, bir örnek-yanıt noktası bakım (POC) bir parçası nicel PCR HIV-1 provirüsü tespit etmek için tam kan lökosit DNA elde etmek için geliştirilmiştir sınırlı kaynak ayarlarını 8-11 kullanılmak üzere (qPCR) erken bebek teşhis (EID) platformu. FINA ekstraksiyon tersine çevrilebilir kaotropik ajanların 12 varlığında DNA bağlama silika membranlar veya silis kaplı paramanyetik parçacıkları kullanan geleneksel saflaştırma yöntemleri farklıdır. Bunun yerine, FINA doğrudan tam kandan, hücresel DNA elde etmek için, bir ayırma membranı üzerinden dikey filtrasyon kullanır. Yakalanmış DNA içeren zar bir PCR tüpü içinde doğrudan yerleştirilmiş ve ya hemen sonraki amplifikasyon 9 kurutuldu bir PCR reaksiyonunda veya hava da kullanılabilir. Resim kaotropik maddeler, fenol ya da alkoller, numûne alma kullanılır, Eliminating çıkarma işlemi 13,14 türetilen güçlü qPCR inhibitörleri kaldırmak için gerekli geniş yıkama adımları.

FINA Membran örneği, zara ilave edilmeden önce, hücre lizizi 11 tarafından serbest ya hücrelerinin 9 ya da genomik DNA yakalayabilir. hücre yakalama için, tam kan membranına doğrudan ilave edilir. Hücreler daha sonra 10 mM NaOH eklenerek zarda lizlenir. Bu yöntemin avantajı, sadece 3 etapları kapsar: 1) Örnek ilave; qPCR tüpünde 2) hücre parçalama / yıkama ve 3) filtre diski yerleştirme. Bu yöntemin dezavantajı, membran yalnızca membran diskin çapı ile doğrudan orantılı bir hücre belirli sayıda basılı olabilir. Eid gerekli saptama limitini ulaşmak için, tam kan, 100 ul qPCR tüp yerleştirilmesi için çok büyük bir filtre gerektirir Örnek girişi için gereklidir. koleksiyonuna örneğini uygulamadan önce bir deterjanla kan hücrelerinin lizeMembran, bir işlem adımını ekler, aynı numune boyutu için daha küçük bir filtre kullanımına izin verir. Biz yüksek tekrarlanabilirlik, tek kopya algılama ve bu test konfigürasyonu 11 kullanılarak kanın 100 ul HIV-1 proviral DNA kadar az 10 kopya ölçümünü göstermek başardık.

Bu yazıda, başlangıçta laboratuar kullanımı için geliştirilen FINA protokol açıklar. FINA örnek hazırlama modülü olarak bilinen membran / filtre sandviç büyük gruplar halinde hazırlanmış ve daha sonra kullanılmak üzere stoklanmış edilebilir. örnekler, bu işlem 2 dakika sürer ve boyut toplu değişen gerçekleştirilebilir ekstre edilmesi. qPCR hemen çalıştırılabilir veya qPCR gerçekleştirmek için uygun kadar gömülü DNA içeren filtreler saklanabilir. Bu yöntem, düşük ve yüksek kaynak ayarlarında hem numunelerin rutin analizler için çok uygundur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Etik bildirimi: Bu çalışmada kullanılan tam kan örnekleri insan denekleri araştırma olarak kabul edilmez. örnekler memnun edildi klinik tanı amaçlar için elde edilmiş ve bu örneklerin kalan kısmı FINA araştırma deneyi için sağlanmıştır. Numuneler araştırmacılar kolayca bireylerin kimliğini tespit etmek mümkün değildi böyle kodlanmıştır.

FINA Numune Hazırlama Modülü 1. Hazırlık

  1. A 2.6 mm 35 x 35 mm 2 kalınlığında% 100 pamuklu ped keserek pedi kurutma hazırlayın. örnek başına bir tane yastığı kesin.
  2. ve daha sonra bir çekiç tahrik delik yumruk kullanarak bant merkezinde 7.14 mm çapında bir delik delme (50 (w) mm 25 mm (h)) parafin film kesme parça kağıt bant ile plastik parafin filmi hazırlayın. örnek başına bir bant hazırlayın.
  3. Bir 8.35 mm çaplı daire delme bir bağlı cam kan ayırıcı membran (zar yakalama) diski hazırlayınBir çekiç tahrik delik kullanarak. örnek başına bir diski yumruk. Disk 2.3 um olan bir partikül tutma yeteneğine sahiptir.
  4. forseps kullanarak lekeleme pad merkezinde yakalama diski koyarak FINA örnek hazırlama modülü monte edin. parafin bant delik maruz yakalama diskin merkezine bırakır, böylece yakalama disk üzerinde parafin filmi bandı yerleştirin.
  5. lekeleme pedi kapsayacak şekilde hafifçe parafin bant germe ve diskin tüm kenarlarda blot pad sopa sıkıca parafin bant basarak disk ve lekeleme ped arasındaki maksimum temas sağlamak.
  6. ileride kullanmak üzere deney ya da stoku için gerektiği kadar modülleri yapın.

qPCR Tube 2. Hazırlık

  1. çift ​​kaplamalı Polye bir daire delme ile floresan algılama engelleme zarın önlemek için qPCR tüpün yanına hücre yakalama zarını demir atacak 5.1 mm'lik bant diski hazırlayınbant sacdan bir çekiç tahrik yumrukla teşhis bant kayit yaptirilabilir. örnek başına bir bant diski hazırlayın.
  2. Bandın etiket astarın bir tarafını kaldırın. bir yüzüne ve tüpün dibine doğru yapışmasını 200 ul PCR tüp içine bandı yerleştirin. İkinci etiket kaplamasını çıkartın. Tüp şimdi hazırlanmış diski almaya hazırdır.
  3. ileride kullanmak üzere deney ya da stoku için gerektiği kadar tüpleri üretin.

3. contrive Kan Numune

Not: gerçek bir test numunesi hazırlanmaktadır ediliyorsa, 4. adıma geçin.

  1. Viroloji Laboratuvarı Kalite Güvence elde edilen HIV-1 Provirüsün tek bir kopyasını barındıran Çözülme 8E5-LAV hücreleri 15 (MYK; Rush Presbyterian / St Luke Tıp Merkezi, Chicago, IL.).
    Not: / ml 4000 hücre konsantrasyonunda dondurulmuş hücre peletleri olarak depolanır. Daha önce tarif edildiği gibi, 9 hücre sayısı kontrol edildi.
  2. ser hazırlayın/ Ul 1 400 hücre arasında değişen konsantrasyonlara ortamı (% 90 fetal sığır serumu,% 10 dimetil sülfoksit) donma ial dilüsyon.
  3. mikrosantrifüj tüpü içine seri sulandırmaların her birinin arasında pipetleyin 10 ul hücre. 8E5-LAV kopya sayılarının 10-4,000 bir standart eğri oluşturmak için her bir tüpe, taze, HIV-1 negatif EDTA tedavi tam kan örneği 100 ul ekle. yavaşça tüpün 5 kez dibi hafifçe vurarak karıştırın.

4. FINA Ekstraksiyon gerçekleştirin

  1. 110 ul tam kan ve aşama 3,3 hücreler)% 1 (11 ul,% 10 Triton-X100 içinde bir son konsantrasyona kadar Triton-X100) eklenerek lize kan hücreleri.
  2. yavaşça tüpün 5 kez dibi hafifçe vurarak karıştırın. Kan saydam kırmızı renkte olmalıdır.
  3. Pipetleyin yakalama diske kan örneğinin tüm.
    Not: parafin bant ve yakalama membranı arasında bir su geçirmez mühür kan zarından akan sağlar ve yakalama m arasında iyi temaszarı böylesine ve kurutma ped montaj hızlı numune fitilleme sağlar.
  4. Örnek filtresinden bekletin.
    Not: kılcal eylemi lekeleme pedine kan lizatı fitilleri, yakalama diskin yüzeyi üzerinde genomik DNA yakalama. o mat göründüğünde lizat disk içine batırılmış gelmiştir.
  5. yakalama diske 600-1,000 ul 10 mM NaOH damla damla ekleyin.
    Not: Yıkama tamponu, 600 ul bir hacim ilave olarak eklenebilir. tampon hidrofobik parafin kasete bir damlacık oluşturur ve yaklaşık 20 saniye içinde diske delikten fitil olacak. Filtre hemoglobin beyaz belirten temizlenmesi için kırmızı değişecektir.
  6. forseps ile lekeleme pedi disketi ayırın ve hazırlanan PCR tüpünde bant diski uygulayın. Filtre üzerinde kalan herhangi bir kırmızı varsa tüp içinde yerleştirmeden önce filtreyi temizlemek için yıkama tamponu 50-100 ul ekleyin.
    Not: Nadiren, aşırı basınç hazırlanmasında kullanılanlekeleme pad ayrılma sırasında zar katmanlarının bölümleme FINA modülleri sonuçları. Bu diskleri atın ve taze bir örnek hazırlamak.
  7. Filtre PCR tüpünde yerleştirildikten sonra, hemen numuneleri analiz. Alternatif olarak, bir kutu içeren kalsiyum sülfat kurutucu kuru bir gecede, daha sonra analiz için hazır olana kadar silis kurutucu ve mağaza ile bir folyo kese içinde kap ve yer.

5. qPCR Reaksiyon

  1. Daha önce 9,11 açıklandığı gibi HIV spesifik primer ve problar kullanılarak reaksiyon başına 100 ul qPCR master karışımı hazırlayın. Bir iç amplifikasyon kontrolü amplifikasyon inhibitörlerinin varlığı izlemek için ve negatif örnek bir gerçek negatif olduğunu doğrulamak için ekleyin. Filtre tamamen ana karışımı ile ve filtre reaksiyon boyunca tüpün yanına sabitlenmiş kalmasını kaplı olduğundan emin olun.
  2. Daha önce 9 tarif edilen bir gerçek-zamanlı PCR cihazı kullanılarak amplifikasyon gerçekleştirin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

8E5-LAV hücreleri ile çivili tam kandan proviral DNA çıkarmak için iş akışı, Şekil 1 'de gösterilmiştir. 2 FINA örnek modülü göstermektedir qPCR tüp hazırlanır Şekil. Zoraki örnekleri (Şekil 3) standart eğride gösterildiği gibi bu yöntem, farklı kopya numaraları de 8E5-LAV hücrelerinden, HIV-1 provirüs verimli amplifikasyonu için izin verir. PCR Verimliliği = -1 + 10 (-1 / eğim) hesaplanan,% 103 bir etkinliği vardı. Doğrunun denklemi r² = 0,996 bir korelasyon ile = -3.25x + 27.95 y oldu. HIV proviral DNA standart eğri Tablo 1 'de görüldüğü gibi, aynı zamanda, yüksek ölçüde tekrarlanabilir amplifikasyon sahip çoğaltır. Buna ek olarak, hidroksipiruvat Redüktaz sayısından bağımsız FINA ile kan ekstrakte bir sonucu olarak ortaya PCR inhibisyonu olduğunu göstermek için mevcut olan 500 kopya bir iç kontrol mevcut HIV-1 provirüsün kopya (Şekil 4). IC amplifikasyonu verimli 21.92 ± 0.25 ortalama Cq ve% 1 bir CV ile, test edilen tüm 18 numune elde edildi.

Şekil 1
Şekil 1: tam kandan proviral DNA tespiti için iş akışı qPCR için 8E5-LAV hücreleri ile çivili. Kan yakalama zara ve yıkama tamponu ilave edildikten sonra ilave edildikten sonra (A), sağdaki hazırlanan FINA modülü yaptı. QPCR Master karışımı ile çift kaplamalı bant yapışmış yakalama disklerle (B) qPCR tüpleri eklendi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
Şekil 2: FINA içi modülü ve qPCR tüp hazırlanması. (A) Bir 8.35 mm çaplı yakalama membran disk kare 707 lekeleme pedi ve merkezi bir 7.14 mm çapında bir delik içeren parafin bant ince bir tabaka arasında sıkışmış olan bu tür parafin bant delik merkezli olduğunu pipet ile parçalanmış kan doğrudan uygulama için yakalama diski. (B) 5,1 mm çift kaplamalı polyester tanı bant 200 ul qPCR tüp tarafında kalmış. Bandın ikinci astar hazır olduğunda yakalama diski uygulamak için yapışkan yüzeyi açığa çıkarılır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3:., HIV-1 proviral DNA uydurulmasının örneklerin standart eğrisi 4 100 ul elde edilen (A), amplifikasyon çizimini, HIV-1 KD çoğaltır500 kopya / iç kontrol Katı hatlar = amplifikasyon araziler reaksiyonu ile 4,000, 400, 40 ve 10 8E5-LAV hücreleri ile çivili tam kan gatif; Noktalı çizgi eşiğini =. Y ekseni floresans birimleri ve X ekseni qPCR döngü sayısı. Cq değerleri (B), standart eğriler 100 ul tam kan başına 8E5-LAV hücre günlük kopya sayısı karşısında amplifikasyon grafiğinden hesaplanmıştır. Doğrunun denklemi: y = -3.25x + 27,95; R² = 0,996; PCR verimi = 103,23% Verimliliği hesaplanan = -1 + 10 (-1 / eğim) bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Şekil 4:. İç kontrol hidroksipiruvat Redüktaz Amplifikasyon kontrol plazmid reaksiyon başına eklenmiş qPCR inhibisyonu 500 kopya gösterir. Katıçizgiler = amplifikasyon araziler; Noktalı çizgi eşiğini =. IC Ortalama Cq 21.92 ± 0.25 =. CQS 21.21 den 22.32 arasında değişmektedir. varyasyon (% CV) katsayısı% 1 =; N = 18. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

8E5-LAV hücre /
100 ul DB Ave. cq SD ÖZGEÇMİŞ (%)
4.000 16.27 0.14 1
400 19.54 0.15 1
40 22.56 0.3 1
10 24.83 0.15 1

4000 Ortalama Cq, standart sapma (SD) ve değişim katsayısı (% CV), 400, 40 ve FINA çıkarma ve HIV-1 spesifik primerler ile 8E5-LAV standart eğrinin 10 kopya: ge = "1"> Tablo 1 sondalar. N = 4 WB = tam kan.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hızlı tedavi erişimine bağlı EID nedeniyle HIV enfeksiyonuna 16 bebek ölümlerini azaltmak için ortaya konmuştur. Çünkü bir bebeğin kanında anne antikorların kalıcılığı, hızlı HIV antikor testleri, HIV-maruz kalan bebeklerin durumunu belirlemede yarar sınırlıdır. DSÖ, HIV-1 pozitif annelerden doğan tüm bebeklerin bir virolojik testi 17 kullanılarak, yaş 4-6 hafta test edilmelidir önerir. Biz 61 Güney Afrikalı bebekler 11 küçük alan değerlendirmesinde göstermiştir% 100 duyarlılık ve özgüllük ile tek kopya algılama yeteneğine sahiptir tam kan örneklerinde HIV-1 proviral DNA tespiti ve miktar tayini için bir tahlilin gelişimini bildirmişlerdir. Yüz mikrolitre ya da bütün kan daha parmak veya topuk çubuk yoluyla toplanmış ve FINA modülleri 18,19 ile işlenebilir. Bu kan örnekleri daha sonra amplifikasyon bu yöntem ide yapmadan önce, en az bir ay depolanabiliral laboratuvarlar uzak bebekleri test etmek için.

Şekil 3 HIV-1 Negatif tam kandan zoraki örneklerin standart bir eğri sunulan çalışmada Eritilen hücreler, tasvir edilmiştir, HIV-1 proviral DNA barındıran ile arttı. Bu çalışmaya bir uyarı örnek eklenir bazı hücreler nedeniyle zaten potansiyel hedef algılama düzeyini gelişmiş olabilirdi donma / çözülme, için parçalanmış olabilir olduğunu. Daha sıkı deneysel tasarım daha doğru tam kan taklit olurdu taze kültür hücreleri kullanarak örnek yapmacık olması olurdu.

FINA örnek hazırlık yöntemi sınırlı kaynak ayarlarını 8 kullanılmak üzere (geliştirilme aşamasındadır) bir EID POC qPCR cihazın içine dahil edilmek üzere dizayn edilmiştir; Ancak, burada açıklanan manuel biçimi de bir laboratuvarın örnek hazırlık portföyüne yararlı bir ek olabilir. FINA yıkamak, bağlama kullanmak ve Kurutucuyla kullanılan stratejiyi Zehir değilAyıklanan nükleik asitleri sulandırır ed kan lekeleri ve diğer kağıt tabanlı emiş sistemleri muhtemelen sub-optimal algılama hassasiyeti 5 yol açar. FINA sistemi son derece esnek ve kolayca proviral HIV DNA tespiti yanında başka genetik testleri için uyarlanabilir. kan veya diğer biyolojik örneklerin alt hacimleri daha az bol olanlar için bol hedefler ve daha yüksek miktarlar için işlenebilir. FINA sistemi orijinal düzenlemede, bir kan ayırma membranı kullanılarak, tam kan hücreleri yakalama ve daha sonra 10 mM NaOH 9 eklenerek bunları lize. Bu sürüm, bir az sayıda kullanıcı adım avantajına sahiptir, fakat işlenebilir hücre sayısı / kan hacmi daha küçüktür. Bu raporda kullanılan ilişkili bir cam membran ek olarak, diğer kan ayrılması ya da kan toplama filtre kağıtları, bu yöntem ile başarılı bir şekilde kullanılmıştır ve çeşitli kantitatif PCR araçları da F gömülü şablonu amplifiye gösterilmiştirilter diski 9. tek şart filtresi real-time PCR aracının floresan okuma bloke olmamasıdır.

FINA ekstre önemli bir sınırlama, yakalama membran çapına bir boyut kısıtlaması olmasıdır. 9 mm 'den daha büyük bir zar olan bir disk, reaksiyon karışımına maruz kalan yüzey alanı sınırlandıran bir tüp içinde membran üst üste olmayan bir 200 ul qPCR tüpü içerisine yerleştirilmiş olamaz. Ayrıca, disk çapı daha büyük, daha qPCR reaksiyon hacmi maliyetini artırır filtreyi karşılamak ve dönüş etrafında zamanı testinin için gereklidir. Filtre verimli numune DNA yakalamak için çok küçükse, verimli yıkama engelliyor tıkayabilir.

Bağlı cam yakalama membranı kullanılarak, bütün kan örneklerinden, HIV-1 proviral DNA olup, viral RNA yakalamak mümkün olmuştur (veriler gösterilmemiştir). Alternatif membranlar veya tamponlar t kullanılabilir eğer biz bilmiyoruzO RNA'nın izolasyonu yerine veya DNA ilave olarak teşvik eder. okuyucu yalnızca örnekten DNA izole etmek istiyorsanız bu protokol bazı protokoller ile gerekli RNA enzimatik kaldırılmasını gerektirmez. EID hassasiyetini ve RNA tespiti bu eksikliği artıracak klinik örneklerde HIV-1 RNA ve DNA hem algılama tanı testi bir sınırlama yoktur.

Yeni bir tahlile FINA işlemi uyum en önemli nokta, örnekte, örneğin, DNA, hücre sayısı miktarını karşılamak için test edilecek olan filtre büyüklüğü kontrol etmektir. Daha küçük yakalama diskler kullanılabilir, böylece genel FINA çıkarma hücrelerin küçük sayılarla örnekleri ile en iyi şekilde çalışır. Filtrenin bağlama kapasitesini belirlemek için, sadece toplama membran altında yığılmış FINA modüle ikinci bir filtre diski ekleyin. örnek ekleyin ve adım 4,1-4,5 gibi membranları yıkamak. Ayrı qPCR tüpleri ve amp içine DNA yakalama disklerin her koyunlify. bir standart eğri kullanılarak, her bir filtre üzerinde tutulur giriş DNA oranında belirler. filtre büyüklüğü tahlilinde ihtiyaçlarına optimize edilebilir. Hücre lizatı filtre üstün tespit özellikleri sağlayan (yayınlanmamış gözlemler) ilave edilir Burada tarif edilen FINA proviral DNA testi için, insan genomik DNA'sından fazlasını% 99 yakalanır.

EID ek olarak, FINA gelecek uygulamalar bağlı anti-retroviral tedavi, viral bastırma elde hastaların HIV-1 hastalığı izlenmesi için bir belirteç olarak algılama ve proviral DNA kantitatif içerebilir. HIV eradikasyonu amacıyla tedavi izleme, HIV-1 ile enfekte hücrelerin rezervuarlar için periferik kan dışında diğer girdileri tarama tarafından da yapılabilmektedir. HIV Proviral testi de doğrudur enfeksiyon için aşı deneme konularını taramak için kullanılabilir. Kan örnekleri FINA modüllerde depolama sırasında stabil ve ce daha sonra sevkiyat için tarla koşullarında alınabilirepidemiyolojik çalışmalar için bu yöntem idealdir PCR analizi için ntral laboratuarlar. HIV-1 tespit ek olarak, bu son derece esnek bir yöntem, aynı zamanda farmakogenetik tarama ya da başka bir SNP tespiti veya hayvan modellerinde hızlı genotipleme için biyolojik örneklerinde bulunan hassas ilaç hedefleri amplifiye etmek için kullanılabilir. Ayrıca, FINA ile kullanılabilir örneğin helikaz göre amplifikasyonu (HDA) ya da döngü aracılı izotermal amplifikasyon (LAMP), izotermal amplifikasyon yöntemleri şablon ekstre ya da DNA-gömülü filtre üzerinde, geleneksel PCR amplifikasyonu için bir şablon olarak kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fusion 5 GE Healthcare Life Sciences 8151-9915
707 blotting pad VWR International 28298-014
PARAFILM M VWR International 52858-000
3M Double-Coated Polyester Diagnostic Tape  3M Medical Specialties 9965
200 µl qPCR strip tubes Agilent 401428
optical strip caps Agilent 401425
Mx3005p qPCR System Agilent 401456
sodium hydroxide Sigma-Aldrich 221465 A.C.S. Reagent
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284 BioXtra
dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D8418 for molecular biology
fetal bovine serum, certified, U.S. origin Thermo Fisher Scientific 16000-044
Hammer driven small hole punch 3/16" hole diameter (5.1 mm) McMaster Carr 3424A16
Hammer driven small hole punch 1/4" hole diameter (7.14 mm) McMaster Carr 3424A19
Hammer driven small hole punch 5/16" hole diameter (8.35 mm) McMaster Carr 3424A23

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Byrnes, S. A., et al. One-step purification and concentration of DNA in porous membranes for point-of-care applications. Lab Chip. 15, (12), 2647-2659 (2015).
  2. Connelly, J. T., Rolland, J. P., Whitesides, G. M. "Paper Machine" for Molecular Diagnostics. Anal Chem. 87, (15), 7595-7601 (2015).
  3. Govindarajan, A. V., Ramachandran, S., Vigil, G. D., Yager, P., Bohringer, K. F. A low cost point-of-care viscous sample preparation device for molecular diagnosis in the developing world; an example of microfluidic origami. Lab Chip. 12, (1), 174-181 (2012).
  4. Linnes, J. C., et al. Paper-based molecular diagnostic for. RSC Adv. 4, (80), 42245-42251 (2014).
  5. Rodriguez, N. M., et al. Paper-Based RNA Extraction, in Situ Isothermal Amplification, and Lateral Flow Detection for Low-Cost, Rapid Diagnosis of Influenza A (H1N1) from Clinical Specimens. Anal Chem. 87, (15), 7872-7879 (2015).
  6. Peeling, R. W., Holmes, K. K., Mabey, D., Ronald, A. Rapid tests for sexually transmitted infections (STIs): the way forward. Sex Transm Infect. 82, Suppl 5 1-6 (2006).
  7. Mabey, D., Peeling, R. W., Ustianowski, A., Perkins, M. D. Diagnostics for the developing world. Nat Rev Microbiol. 2, (3), 231-240 (2004).
  8. Jangam, S. R., Agarwal, A. K., Sur, K., Kelso, D. M. A point-of-care PCR test for HIV-1 detection in resource-limited settings. Biosens Bioelectron. 42, 69-75 (2013).
  9. Jangam, S. R., Yamada, D. H., McFall, S. M., Kelso, D. M. Rapid point-of-care extraction of human immunodeficiency virus type 1 proviral DNA from whole blood for detection by real-time PCR. J Clin Microbiol. 47, (8), 2363-2368 (2009).
  10. Kelso, D. M., Jangam, S., Yamada, D., McFall, S. Google Patents. (2012).
  11. McFall, S. M., et al. A Simple and Rapid DNA Extraction Method from Whole Blood for Highly Sensitive Detection and Quantitation of HIV-1 Proviral DNA by Real-Time PCR. Journal of Virological Methods. 214, 37-42 (2015).
  12. Boom, R., et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J Clin Microbiol. 28, (3), 495-503 (1990).
  13. Radstrom, P., Knutsson, R., Wolffs, P., Lovenklev, M., Lofstrom, C. Pre-PCR processing: strategies to generate PCR-compatible samples. Mol Biotechnol. 26, (2), 133-146 (2004).
  14. Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. PCR inhibitors - occurrence, properties and removal. J Appl Microbiol. 113, (5), 1014-1026 (2012).
  15. Folks, T. M., Powell, D. M., Martin, M. A. Google Patents. (1991).
  16. Violari, A., et al. Early Antiretroviral Therapy and Mortality among HIV-Infected Infants. N Engl J Med. 359, (21), 2233-2244 (2008).
  17. World Health Organization. World Health Organization. Geneva, Switzerland. (2010).
  18. Gruner, N., Stambouli, O., Ross, R. S. Dried blood spots--preparing and processing for use in immunoassays and in molecular techniques. J Vis Exp. (97), (2015).
  19. Maiers, T. J., et al. An investigation of fingerstick blood collection for point-of-care HIV-1 viral load monitoring in South Africa. S Afr Med J. 105, (3), 228-231 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics