Une méthode d'isolement cellulaire ciblée via verre fonctionnalisation de surface

Cancer Research

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Ansari, A., Patel, R., Schultheis, K., Naumovski, V., Imoukhuede, P. I. A Method of Targeted Cell Isolation via Glass Surface Functionalization. J. Vis. Exp. (115), e54315, doi:10.3791/54315 (2016).

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Abstract

Introduction

Paillasse Les approches actuelles de séparation cellulaire (par exemple, cellules activées par fluorescence de tri 1, capture laser micro-dissection 2, immuno-bille magnétique séparation 1) peut prendre plusieurs heures de préparation et de tri. Ces grandes échelles de temps peuvent influer sur les niveaux d'intervention et d' expression physiologiques, résultant dans les analyses qui ne sont pas représentatifs de la réponse physiologique 3. Les systèmes sont nécessaires qui peuvent rapidement et efficacement isoler des types cellulaires spécifiques sans perturber le récepteur des niveaux de surface cellulaire afin d'améliorer l'isolement cellulaire et d'enrichissement pour des applications biomédicales. Par conséquent, la justification de notre approche est de développer une approche douce pour l'isolement cellulaire.

Le "laboratoire sur puce" concept offre la promesse d'ordres de grandeur plus rapide (heures à minutes) l'isolement cellulaire, et implique le plus souvent la capture des cellules sur une surface et de libérer des cellules ou intracellulaire contents par le biais physique 4,5 ou des méthodes chimiques 6. Bien que ces approches offrent quelques avantages tels que l' identification expression de protéines de 7,8, en identifiant l' expression de l' ARN 9-11, ou même fournir des cellules de culture in vitro 12,13, bon nombre de ces techniques ne peuvent pas être traduits à des diagnostics tels que le profilage de récepteur des cellules due à leurs environnements non-physiologiques. Agents de levage Enzymatic tels que les collagénases peuvent également affecter ces quantités de récepteurs 14,15, ce qui signifie des techniques de quantification du récepteur des cellules qui utilisent ces agents de levage ne ​​génère pas des données physiologiques précises. La lyse cellulaire prévient la différenciation entre les récepteurs de la surface d' origine, et celles qui ont déjà été internalisée 16. Ce protocole décrit une approche rapide et douce pour l'isolement cellulaire.

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Protocol

1. Nettoyage de la surface en verre et préparation Réactifs

  1. Placer une surface de verre dans une machine à plasma d'oxygène pendant 5 min à 50% de la puissance pour le nettoyer.
  2. Préparer 2,5 ml de 2% reconstitué (3-aminopropyl) triéthoxysilane (APTES) en solution, en ajoutant 50 pi de l'APTES et 2,45 ml d'éthanol dans un tube conique.

2. APTES et DSB fonctionnalisation

  1. Ajouter une solution APTES aux surfaces. Pipeter 150 ul par puits pour 8 plaques à puits. Pipeter 100 ul par puits pour plaques à 24 puits. Pipeter 1,1 ml pour les plats en verre 60 x 15 mm. Couvrir les surfaces pour éviter l'évaporation et la répartition inégale de la solution APTES. Placer les surfaces sur un agitateur à plate-forme pendant 50 minutes à la température ambiante, ce qui crée une distribution uniforme de la couche APTES.
    REMARQUE: APTES est un aminosilane qui forme la première couche de la surface. Si vous utilisez une surface différente, déterminer heuristically le volume de solution nécessaire pour couvrir la surface.
  2. Sélectionner la température du four, tandis que les surfaces se trouvent sur le shaker: Chauffer à 55 ° C pendant 2 h pour les plaques 8 puits et plaques à 24 puits. verre de chaleur uniquement des plats à 90 ° C pendant 1 heure.
  3. Rincer les surfaces avec de l'éthanol.
    1. Administrer la quantité d'éthanol requise en faisant référence à la base de la surface utilisée. Ajouter 150 ul d'éthanol à chaque puits pour 8 plaques à puits. Ajouter 125 ul d'éthanol à chaque puits pour plaques à 24 puits. Ajouter 1,1 ml d'éthanol pour les plats en verre.
    2. Rincer la surface par décharge et extraire le liquide à partir d'un point fixe tel que l'angle du puits. Tenir la pipette à un angle d'environ 70 ° de sorte que la pointe ne soit pas directement fait dans la surface. Rincer deux fois avec de l'éthanol.
      NOTE: Si l'une des plaques de verre de puits de fond ont toute matière plastique en eux, ne les chauffe pas au-dessus de 65 ° C, comme le plastique va commencer à fondre et la chaîne.
  4. Sec avec du gaz 100% d'azote distribué à partir d'un réservoir. Placer les surfaces en oême.
  5. Préparer 2,5 ml de d-desthiobiotine (ORD) en combinant une solution de 1,5 mg / ml dans DSB 37,5 ul de diméthylsulfoxyde (DMSO) et 5 mg / ml de 1-éthyl-3- (3-diméthylaminopropyl) carbodiimide (EDC) à 2.462,5 ul de 0,1 M d'hydrate d'acide 4-morpholinoéthanesulfonique (MES) (pH 6) tampon. Puis combiner les deux solutions.
  6. Ajouter 1 pl de 2-β mercaptoéthanol, après 15 minutes, dans la solution pour arrêter la réaction entre ORD et EDC. Enlever APTES chaud fonctionnalisés surfaces de verre du four. Attendre 5-10 minutes pour les surfaces de verre pour refroidir.
  7. Ajouter MES tampon de la surface à rincer, en utilisant des quantités en fonction de la surface. Ajouter 150 ul tampon MES à chaque puits pour 8 plaques à puits. Ajouter 125 ul tampon MES à chaque puits pour plaques à 24 puits. Ajouter 1,1 ml de tampon MES pour les plats en verre.
  8. Rincer la surface en déchargeant et en tirant le liquide à partir d'un point fixe, comme le coin du puits. Tenir la pipette à un angle d'environ 70 ° de sorte que la pointe ne soit pas directement faitdans la surface. Rincer deux fois avec un tampon MES.
  9. Appliquer la solution ORD aux surfaces pour leur permettre d'incuber. Ajouter 150 ul solution DSB par puits pour 8 plaques à puits. Ajouter 100 ul solution DSB par puits pour les plaques à 24 puits. Ajouter 1,1 ml pour la solution de verre plats de DSB.
  10. Placez les surfaces de verre DSB couverts sur une serviette en papier humide dans une boîte de Pétri. Couvrir et incuber dans un C réfrigérateur 4 ° pendant 18-24 h.

3. Streptavidin fonctionnalisation

  1. Rincer chaque surface de verre à trois reprises avec 1 ml de 1,0x tampon phosphate salin (PBS). Rincer la surface en déchargeant et en tirant le liquide à partir d'un point fixe, comme le coin du puits. Tenir la pipette à un angle d'environ 70 ° de sorte que la pointe ne soit pas directement fait dans la surface. Diluer la solution streptavidine (SAv) stock à 0,4 mg / ml (recommandé).
    REMARQUE: Le PBS est isotonique et peut donc être utilisé comme moyen de dilution et de rinçage. PBS est utilisé comme solvant pour la SA,v et, par conséquent, ne sera pas affecter la capacité du SAv à se lier à la surface.
  2. Appliquer 0,4 mg / ml de solution de SAv uniformément sur les surfaces de telle sorte qu'une couche mince de forme au fond du verre, sélectionner la quantité de solution sur la surface. Pour 8 plaques à puits, ajouter la solution de SAv 150 ul de 0,4 mg / ml par puits. Pour plaques de 24 puits, ajouter la solution de SAv 100 ul de 0,4 mg / ml par puits. Pour les plats en verre, ajouter la solution de SAv / ml 1,1 ml 0,4 mg.
  3. Couvrir et déplacer les plaques à un plat de 14 cm de Pétri pour retenir l'humidité. Incuber la boîte de Pétri au réfrigérateur pendant 18-24 h.
    NOTE: Il est essentiel d'utiliser des volumes constants de APTES, DSB et SAv sur chaque surface.
  4. Rincer chaque surface de verre à trois reprises avec 150 pi de PBS pour éliminer SAv. Rincer la surface en déchargeant et en tirant le liquide à partir d'un point fixe, comme le coin du puits. Tenir la pipette à un angle d'environ 70 ° de sorte que la pointe ne soit pas directement fait dans la surface.
  5. Mouiller une serviette en papier wvec l'eau de-ionisée et placez la serviette en papier à plat dans 14 cm boîte de Pétri entourant les plaques pour retenir l'humidité dans les puits. Couvrir la boîte de Pétri contenant les puits. Incuber la boîte de Petri dans un niveau 1 (BSL-1) réfrigérateur 4 ° C jusqu'à ce que nécessaire prévention des risques biotechnologiques.

4. Cellule de capture et de sortie

  1. Commencez par flacon (s) de T175 de cellules destinées à l'expérience. Aspirer le support de flacon (s). Laver les médias restants avec 5 ml de la température ambiante PBS. Aspirer PBS à partir du flacon (s).
  2. Ajouter 10 ml d'agent de levage non enzymatique, tels que Cell Dissociation solution, dans le flacon T-175 de cellules. Mettez le ballon dans l'incubateur pendant 6 min pour permettre la levée des cellules du flacon.
  3. Après 6 minutes, ajouter 10 ml de solution saline équilibrée de Hank froide (HBSS; Voir la liste des matériaux) pour inactiver l'agent de levage. Sortez 20 pi de cellules pour compter le nombre de cellules en solution en utilisant un hématimètre.
    NOTE: Selon le foncles surfaces utilisées dans l'expérience de capture tionnalisé, le nombre de cellules nécessaires varie. Pour fonctionnalisés 8 plaques à puits, utiliser 300.000 cellules par puits. Pour les plats en verre fonctionnalisés, utiliser 1,1 million de cellules. Pour fonctionnalisés plaques à 24 puits, 125.000 cellules sont recommandées. Plus d'informations sur le comptage des cellules se trouve dans le supplément.
  4. Répétez les étapes 4.1- 4.3 pour un autre flacon de cellules, si moins de cellules sont présentes que nécessaire pour l'expérience. Combiner des suspensions de cellules et les cellules recompter pour obtenir le nombre total de cellules en solution.
  5. Centrifuger la suspension cellulaire dans une centrifugeuse à 500 g pendant 5 min à 4 ° C pour obtenir un culot de cellules ont été concentrées. Trouver la quantité appropriée de HBSS à ajouter à la suspension de cellules pour obtenir une concentration de 1 x 10 6 cellules par ml, puis aspirer le surnageant à partir des cellules filées vers le bas, et ajouter le volume calculé. Ce volume peut être calculé en utilisant les équations du Supplément.
  6. Pipette de haut en bas (triturer) pour resuspendre ecellules e en solution et réduire l'agglutination cellulaire dans une solution qui peut réduire la liaison d'anticorps. Diviser la solution cellulaire dans un contrôle séparé et des solutions expérimentales. Voir fichier supplémentaire pour les composants et les calculs.
  7. Ajouter les anticorps biotinylés aux solutions cellulaires respectives comme décrit dans le fichier supplémentaire. Incuber pendant 30 min à 4 ° C sur un mélangeur à tambour en bout.
    NOTE: Pour les cellules MCF7GFP, 0,5 mg / ml hIgG ou des anticorps / ml HLA-ABC 0,5 mg sont recommandées. Pour les macrophages RAW, 1 mg / ml, il est recommandé mCD11b à la moitié du volume pour tenir compte des différences de dilution. Pour les cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVEC), 0,5 mg / ml hCD31 est recommandé.
  8. Laver la surface du verre fonctionnalisé avec du HBSS. Pour cette expérience, une plaque de 8 puits est conseillée.
    1. Ajouter 150 ul de HBSS à chaque puits pour 8 plaques à puits. Rincer deux fois plus en utilisant HBSS. Rincer la surface en déchargeant et en tirant le liquide à partir d'un point fixe, comme le coin du puits.Tenir la pipette à un angle d'environ 70 ° de sorte que la pointe ne soit pas directement fait dans la surface. Gardez à froid à 4 ° C.
  9. Ajouter des solutions cellulaires aux puits et attendre 45 min pour les cellules à incuber sur de la glace sur l'agitateur. Rendre la solution de biotine dans du HBSS stérile en utilisant des volumes calculés de la manière décrite dans le supplément.
  10. Retirer la solution de cellules dans les puits de verre à l'aide de HBSS.
    1. pipette doucement 150 ul HBSS dans chaque puits. Puis la pipette le HBSS. Rincer la surface en déchargeant et en tirant le liquide à partir d'un point fixe, comme le coin du puits. Tenir la pipette à un angle d'environ 70 ° de sorte que la pointe ne soit pas directement fait dans la surface.
    2. Répéter deux fois de plus. Après le lavage, ajouter HBSS aux puits pour maintenir les cellules humides.
  11. Ajouter 150 pi de solution de biotine 20 mM à chaque version respective bien, et puis attendre 20 minutes pour permettre à la réaction.
  12. Recollect cellules non spécifiquement liés par lavage avec du HBSS comme indiqué ci-dessus, puis si l'on utilise des cellules marquées par fluorescence, passer à l'image de fluorescence des cellules. Aussi l'image des cellules vivantes dans un ballon (comme un contrôle, à comparer avec les cellules dans le puits). Si l'on utilise une protéine fluorescente (GFP), les cellules transfectées vert, l'excitation sera de 470 nm, et l'émission sera de 515 nm.

5. Anticorps Optimisation: Anticorps Titration

  1. Commencer en soulevant les cellules de la fiole T75 ou T175, comme expliqué dans l'étape 4.1- 4.3.
    NOTE: Ces volumes sont calibrés pour plaques à 24 puits, mais peuvent être modifiés en fonction des surfaces de verre fonctionnalisées grâce à des tests heuristique. Un titrage d'anticorps représentatif est montré sur la figure 1.
  2. Compter les cellules à l'aide de l'hématimètre, puis centrifuger la solution de cellules dans un tube conique à 500 xg pendant 5 min à 4 ° C. Reconstituer cellules à 1 million de cellules par ml, en utilisant les calculs décrits dans le supplément.
  3. Diviser le 1 mles cellules illions par ml de solution dans six solutions différentes de 500 pi dans des tubes de centrifugeuse différents pour l'anticorps (Ab) les solutions.
    1. Diluer la solution d'anticorps de titres à 10 pg / ml, 1 pg / ml, 100 ng / ml, 10 ng / ml, 1 ng / ml. Créer les commandes à l'aide de 100 pi de tampon de taches (PBS + 1% d'azoture de sodium + 1% de BSA) et 500 pi de cellules pour le contrôle sans Ab dedans. Pour le contrôle à blanc (No Ab et pas de cellules), utiliser une solution de 300 pi de PBS.
      NOTE: ATTENTION: L'azoture de sodium est extrêmement toxique, explosif, et un soin extrême doit être prise lors de son utilisation. S'il vous plaît consulter la fiche de données de sécurité (FDS) et utiliser l'équipement de sécurité approprié.
  4. Combiner et faire incuber des solutions Ab avec les solutions de cellules dans le mélangeur à tambour-end à 4 ° C pendant 30 min. Rincer les fonctionnalisés plaques à 24 puits avec HBSS trois fois. Rincer la surface par décharge et extraire le liquide à partir d'un point fixe tel que l'angle du puits. Maintenez la pipette un angle d'environ 70 ° de sorte que la pointe ne soit pas directement fait dans la surface.
  5. Aliquoter 125 pi de chaque solution d'échantillon dans les APTES appropriés, DSB et SAv bien fonctionnalisés. Incuber à 4 ° C ou sur de la glace pendant 45 minutes sur la surface du verre. Rincer la surface avec HBSS trois fois pour éliminer les cellules non spécifiquement attachées. Rincer la surface en déchargeant et en tirant le liquide à partir d'un point fixe, comme le coin du puits. Tenir la pipette à un angle d'environ 70 ° de sorte que la pointe ne soit pas directement fait dans la surface. Ne pas rincer la rangée du bas, comme ceux qui sont témoins.
  6. Ajouter 150 ul de HBSS à chaque puits lavé, mis sur la glace les plaques 24 puits, puis utiliser un lecteur de plaque pour mesurer la fluorescence des cellules GFP (Excitation 485 nm / émission 528 nm).

Optimisation 6. Cell: Cellule Titration

  1. Soulevez les cellules comme indiqué dans les étapes 4.1 -4.3.
  2. Compter les cellules en utilisant un hématimètre. Isoler cellule de sorterésolu- dans le tube conique à 500 g pendant 5 min à 4 ° C. Reconstituer les cellules à 1 million de cellules par ml.
    NOTE: Plus d'informations sur l'utilisation de l'hématimètre peut être trouvé dans le supplément.
  3. Pipette 1,6 ml de la solution de cellules pour le 1,6 million de cellules stock et place dans un tube conique. Pipeter 800 pi de cellules à partir de la solution de cellules pour 800.000 cellules stock et place dans un tube conique. Pipette 80 ul de la cellule boursier pour la 80.000 cellules stock et place dans un tube conique. Pipette 8 ul du stock cellulaire pour 8.000 cellules stock et placer dans un tube conique.
    NOTE: Les concentrations sont données par 8 mesures de la plaque ainsi, répliquer au besoin. Un exemple de sortie de la plaque est représentée sur la figure 2.
  4. Prenez les quatre solutions mères et de spin dans une centrifugeuse à 500 xg pendant 5 min à 4 ° C. Re-suspendre toutes les solutions mères dans 400 pi de HBSS.
  5. Ajouter 1,6 pi de 100 anticorps ng / ml à 1,6 million de stock de cellules, 0,8 μl à 800.000 stock de cellules et 0,5 pi à tous les autres stocks. Incuber l'anticorps pendant 30 minutes dans le mélangeur à tambour vertical pendant 30 minutes à 4 ° C. Laver la surface du verre fonctionnalisé avec du HBSS à trois reprises.
    NOTE: La plaque de puits fonctionnalisés 8 est recommandé pour la microscopie quantification, tandis que la plaque ainsi fonctionnalisé 24 est recommandé pour lecteur de plaque quantification. concentration d'anticorps pour 8.000 stock de cellules n'a pas été réduite pour permettre le facteur limitant de la surface de capture pour ne pas être le manque d'anticorps dans la solution, mais plutôt les propriétés de capture de la surface.
  6. Appliquer 150 ul de solution d'échantillon dans chaque puits. Appliquer le 1,6 million de stock de cellules à la première colonne de puits sur la gauche. Appliquer le 800.000 stock de cellules à la deuxième colonne de la gauche. Appliquer le 80.000 stock de cellules à la troisième colonne de la gauche. Enfin, appliquez le stock de cellules 8000 à la dernière colonne. Incuber pendant 45 min à 4 ° C sur l'agitateur.
    NOTE: Le 1,6 millionstock de cellules sert de la plus forte concentration à tester, et est le double de la quantité de cellules qui est utilisé généralement dans des expériences de séparation des cellules (600.000 cellules par puits) La 800.000 stock de cellules sert de témoin pour l'expérience car il est la concentration cellulaire typique qui est utilisé dans les expériences de séparation de cellules (3.000.000 cellules par puits). Le 80.000 stock de cellules sert de dix fois la dilution pour tester des concentrations plus faibles pour la capture cellulaire (30.000 cellules par puits). Le stock de cellules 8000 sert de dilution centuple à utiliser comme un test pour vérifier la limite inférieure de la séparation cellulaire (3.000 cellules par puits).
  7. Rincer à l'HBSS trois fois. Rincer la surface en déchargeant et en tirant le liquide à partir d'un point fixe, comme le coin du puits. Tenir la pipette à un angle d'environ 70 ° de sorte que la pointe ne soit pas directement fait dans la surface. Collecter tous les lavages.
  8. Image les cellules sur un microscope à fluorescence, en cas d'utilisation 8 plaques à puits, prendre des photos de chaque survisage, et appliquer 150 ul biotine à chaque surface pendant une heure à 4 ° C sur l'agitateur. Au bout d'une heure, rincer les puits de rejet de la biotine avec HBSS 3 fois comme précédemment. Recueillir tous les lavages des puits pour compter avec l'hémocytomètre et de l'image les rejets des puits.
  9. Appliquer 150 pi de 20 mM solution de biotine excès d'affecter la libération des puits biotine pendant 1 heure, si l'on utilise des plaques de 24 puits, puis rincer les puits 3 fois avec HBSS. Quantifient plaques à 24 puits en utilisant un lecteur de plaque. Utilisez un hématimètre pour compter les cellules de tous les lavages ainsi recueillies.

7. Analyse de l'image

Remarque: Le logiciel FIDJI (http://fiji.sc/Fiji) est recommandé pour l'analyse d'images. Initialement, les images ont été converties en images en niveaux de gris, puis la luminosité / contraste a été modifié pour mettre en évidence les cellules.

  1. Chargez l'image, et les convertir en niveaux de gris en cliquant sur l'onglet d'image puis en faisant défiler vers le bas pour "Type" puis en cliquant sur4; 8 bits ".
  2. Augmenter le contraste de l'image en cliquant sur l'onglet Image, puis faites défiler jusqu'à "Régler". Cliquez sur "Luminosité et Contraste", puis utiliser les barres de défilement pour rendre les cellules se détachent. Si vous utilisez des images de fluorescence, inverser les images pour rendre les cellules plus définies.
  3. Charger un plugin sur ImageJ appelé ITCN (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/itcn.html) pour analyser les images.
  4. Ouvrir ITCN. Quand une boîte de dialogue apparaît qui invite l'utilisateur avec plusieurs paramètres pour estimer la taille de la cellule, définir la largeur minimale de la cellule d'intérêt premier. Cliquez sur l'option "Détecter Sombres Peaks" si l'image est fluorescentes et les cellules sont obscurcie.
  5. Réglez la valeur de seuil à 2 au départ, puis cliquez sur le bouton "Count". Une nouvelle version compté de l'image apparaît avec des points rouges délimitant où les cellules ont été comptées.
  6. Réglez le paramètre de seuil et la largeur pour obtenir des données plus précises cellulaires par definitionng de la taille d'une «cellule». Note: Le nombre de cellules comptées sera dans une boîte de dialogue sur la droite. Modification des paramètres donneront un nombre différent de cellules comptées.
  7. Continuer à parcourir à travers les paramètres de seuil et la largeur jusqu'à ce qu'une bonne estimation est atteint pour le nombre de cellules.

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Representative Results

En utilisant ce protocole , nous montrons la capture cellulaire (Figure 3A) et la libération de cellules (figure 3C) de cellules MCF7GFP ainsi que des contrôles de cellules vivantes (figure 4). Nous avons quantifié la capture cellulaire de 60% ​​et 80% ont été libérés (figure 3C). Lorsque nous avons étendu cette approche à un mélange de RAW 264.7 macrophages et les cellules MCF7GFP, 50% des macrophages RAW ont été capturés (Fig. 3D) et 80% des macrophages RAW ont communiqué avec de la biotine 20 mM (figure 3B). Etant donné que l' excès d' anticorps peut diminuer la capture de cellules, nous avons optimisé par titrage 0-10,000 nM d'anticorps anti - HLA et observe que la concentration d'anticorps entre l' anticorps est idéal mM 100-1000 (Fig. 1). De même, on détermine que la concentration idéale de cellules qui peuvent être capturées est de 1 x 10 5 et 1 x 10 6, étant donné que sous ce nombre de cellules, les valeurs sont inférieures à celles du fond 17(Figure 2). Les données de fluorescence de chaque puits est traitée comme décrit ci-dessous.

L'équation 1

Ici, la moyenne de 3 répétitions est prélevé à partir d'un échantillon sans anticorps (en blanc) et est soustrait de la fluorescence obtenue à partir de chaque échantillon. Cette valeur est ensuite normalisée à la fluorescence maximale moyenne. Ce traitement permet au chercheur d'observer clairement la limite inférieure de détection cellulaire.

Figure 1
Figure 1. Normalized Effacé Anticorps Titration. Human HLA-ABC est titré à travers une quantité constante de cellules MCF7GFP (125.000 cellules par puits) et la fluorescence des cellules capturées ont été quantifiées en utilisant un lecteur de plaque. Avantà une exposition à la surface fonctionnalisée, les cellules et les anticorps ont été centrifugés pour éliminer la fixation de l'anticorps non spécifique. Sans cette centrifugation, on sature l'excès d'anticorps de surface et empêcher pulldown cellulaire, comme le montrent des concentrations de 10.000 ng / ml, où la centrifugation était insuffisante pour empêcher l'anticorps sursaturation de la surface, ce qui entraîne moins de cellules se liant à la surface. ligne grise représente le contrôle. Les barres d'erreur représentent l' erreur standard de la moyenne. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Normalized Effacé cellulaire Titration. En utilisant la concentration d'anticorps optimisé pour le titrage d'anticorps, les cellules MCF7GFP ont été titrés pour trouver optimisée concentration de capture alors keEping surface fonctionnalisée et la concentration en anticorps constante. Ceci peut être utilisé pour étalonner la capture des cellules pour différentes applications. Les colonnes de ce chiffre sont répétitions, tandis que les lignes changent la concentration de cellules pour trouver la gamme d'idées pour la capture cellulaire. Ligne grise représente le contrôle, et les barres d'erreur représentent l' erreur standard de la moyenne. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Captage et Relâchez expériences. Un mélange de cellule unique a été exposé à la surface fonctionnalisée (A), la capture des cellules MCF7GFP utilisant l' anticorps HLA-ABC. Quand on l'a lavé avec du HBSS (B), les cellules sont restées capturées, mais lorsqu'elle est exposée à une solution de biotine 20 mM (C), les cellules ont releelon. Un mélange cellulaire des cellules MCF7GFP et les macrophages RAW 264.7 ont été exposées à une surface fonctionnalisée et ont été capturées en utilisant un anticorps mCD11b (D). cellules MCF7GFP non spécifiques sont marqués en vert. L' intensité de fluorescence des cellules a diminué MCF7GFP lorsqu'il est exposé à un lavage neutre (E), ce qui implique que la surface ne leur cible et qu'ils attaché de manière non spécifique. Lorsqu'il est exposé à un lavage à la biotine (F), les macrophages RAW ciblés ont été libérés de la surface. Les barres d'échelle sont de 250 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4. Contrôle de cellules positives et négatives pour double isolement cellulaire. Le contrôle positif RAW Macrophages sont imagées ona microscope à fluorescence, ne montrant aucune activité fluorescente, ainsi que le dimensionnement relatif de cellules. Les macrophages RAW Brightfield montrent le dimensionnement des cellules (A), alors que sous excitation GFP, il n'y a pas de fluorescence (B), qui est représenté sur l'image fusionnée (C). Les cellules négatives contrôle de MCF7GFP sont imagés sur un microscope à fluorescence montrant grande activité fluorescente, ainsi que la taille relative des cellules MCF7GFP. Les cellules sont imagés sur fond clair (D), montrant le dimensionnement, et tandis que sous GFP excitation (E) montrent grande fluorescence, qui peut être clairement indiqué dans l'image fusionnée (F). Les barres d'échelle sont de 250 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5. Comparaison de l' utilisation de la centrifugeuse dans les techniques classiques de purification. L'étape de centrifugation de pré-analyse est conservée dans la préparation des échantillons. L' isolement de perles magnétiques ainsi que FACS implique plusieurs étapes de centrifugation supplémentaires, qui introduit le stress sur les cellules et peuvent modifier les niveaux d'expression. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Fichier de code supplémentaire. Les calculs. S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

L' amélioration des techniques d'isolement cellulaire favorise d' études scientifiques dans les relations structure-fonction en neurosciences 18, la tige de programmation de cellules en biologie régénérative, et la signalisation angiogénique en biologie vasculaire 19. En effet, la culture de cellules primaires 20 (par exemple, les HUVEC) dans la biologie vasculaire se fait principalement par l'utilisation de techniques d'isolement des cellules. L' isolement des cellules a été récemment utilisée pour l' écoulement quantitatif (QFlow) Analyse de cytométrie de récepteurs de la membrane plasmique 3,14,15,19,21. Cependant, les méthodes d'isolement des cellules existantes affectent les niveaux de récepteur de surface cellulaire et sont coûteux en personnel et des réactifs. Nous avons avancé un nouveau procédé de fonctionnalisation de surface 17, ce qui permet la création d'un système de capture douce reproductible d'un type de cellule unique à partir d' un mélange de types de cellules pour répondre à ces inconvénients. Cette technique peut être intégré dans un système itératif, ce qui permet la possibilité de capturing différents types de cellules par étapes en utilisant des anticorps spécifiques. Afin de clarifier davantage la procédure, un certain nombre de questions de dépannage et des réponses sont proposées ci-dessous:

Optimisation de fonctionnalisation: Les processus de fonctionnalisation a été optimisé pour une meilleure uniformité et tirer vers le bas des cellules MCF7gfp. Ce protocole peut également être optimisé et adapté à tout type de cellule et de la configuration de l'anticorps. Ceci peut être réalisé en modifiant les concentrations des composants de base dans la surface de capture, ou en changeant le type ou la concentration des anticorps. La plupart des types d'anticorps peuvent être biotinylés en utilisant le protocole ci-dessus. Une fois biotinylé, ils peuvent alors être titrés (Figure 1) pour trouver la concentration idéale pour tirer vers le bas. La concentration de la cellule peut être augmentée (figure 2) pour trouver la concentration idéale de cellules à capturer. Avec cela, la faisabilité de la capture d'un certain type de cellule avec le bouchonsurface ture peut être établie. Par exemple, si un type cellulaire d'intérêt est à l'échelle de 100 cellules par million de cellules, la capture des concentrations de cellules dans cette gamme en utilisant la surface fonctionnalisée serait idéal. Si au cours du titrage, la surface ne peut pas capturer les cellules de cette faible concentration, puis l'optimisation de la surface ou de l'anticorps est nécessaire pour être en mesure de filtrer des cellules à l'intérieur de cette plage de concentration.

Quels types cellulaires sont utilisés dans ce protocole? Comment quelqu'un pourrait modifier ce protocole à utiliser un type de cellule différent?

Actuellement, ce protocole utilise des cellules MCF7-GFP, et RAW 264.7 macrophages sont souvent inclus pour montrer une capacité à sortir un type de cellule dans un mélange à double cellule. Ces cellules ont été sélectionnés car ils étaient deux des types cellulaires les plus pertinents pour le modèle de xénogreffe de souris (tumeur humaine dans l'environnement murin). Afin de calibrer le procédé pour une variété d'autres cellules, un anticorps specificity est primordiale. Il existe plusieurs ressources disponibles en ligne pour la sélection des anticorps 22.

Quels sont les avantages de cette méthode?

Approche en douceur: Le manque de vigueur rend cette approche en douceur. En effet, notre force de cisaillement calculée est au maximum, 24 x 10 -6 pN 17, qui ne devrait pas causer d' importantes perturbations aux biomarqueurs, car les contraintes hydrodynamiques de 2,09 Pa (656 pN assumant la zone 314 pM 2 de surface cellulaire) induisent une nécrose alors que les valeurs de stress ci - dessous 0,59 Pa (185 pN supposant que 314 pM 2 cellules de surface) ne le font pas 23. Cette approche douce est donc avantageux sur certaines options disponibles dans le commerce telles que les approches à base centrifugation-24, qui exercent jusqu'à 0,78 Pa 25 de contrainte de cisaillement pic dû à l'accélération soudaine à des valeurs autour de 600 G, ce qui peut modifier les schémas et les morphologies 25 expression de protéines 26 23. Ainsi, un processus qui pourrait réduire la quantité d'usages de centrifugeuses réduirait la quantité de stress que les cellules seraient l'expérience par la purification et assurer davantage de données physiologiques en fin de compte. Notre protocole actuel utilise des centrifugeuses pour purifier et reconstituer la concentration cellulaire avant la capture, cependant, ce procédé de préparation est classique dans de nombreuses techniques de purification telles que l' isolement des billes magnétiques 27,28, cytométrie de flux 29 et FACS 30 (figure 5). Notre approche réduit tous les procédés de centrifugation en aval que les autres techniques utilisent en outre l'étape de préparation.

Approche biotine-avidine: L'application de biomatériaux couramment utilisés (DSB-Sav et de la biotine-Sav) rend également cette approche avantageuse 31,32. protéines de la famille avidine se lient très sélectivement aux protéines de la famille de la biotine et sont utilisés pour une gamme de scienttib et des applications médicales , y compris: anticorps fluorophore fixation 33, quantitative Qdot-perle de polystyrène de fixation 34, et la création d'hydrogels qui répondent à des stimuli de l'environnement pour libérer des médicaments encapsulés 32. En outre, la relative facilité d'acquisition des anticorps biotinylés rend cette approche largement accessible et personnalisable.

Approche desthiobiotine sans perles: La surface de capture est capable de mettre en œuvre l'utilisation de desthiobiotine sans l'utilisation de réactifs et de forces difficiles à libérer les cellules. ORD a été utilisé pour la fixation des cellules et la libération réversible par d' autres systèmes en liaison avec DSB-anticorps et des 35 billes magnétiques. Cependant, les effets sévères de la technique de séparation, ainsi que la grande perte cellulaire associés à la préparation des échantillons à 27,28 résultat récepteur différentiel et l' expression de la chimiokine 28,36. Cette approche vise à atténueret de surmonter ces limitations en éliminant l'utilisation des deux aimants et des perles pour créer une méthodologie de lavage et de libération beaucoup plus doux.

Quelles sont les étapes critiques dans ce protocole? Quelles sont les causes de la variabilité? Comment cette variabilité peut être contrôlé?

Ce procédé comporte quatre étapes essentielles qui peuvent conduire à la diminution de l'efficacité de la surface de capture. La première étape critique est la prévention de l'eau à la surface d'APTES pendant les étapes de fonctionnalisation APTES, qui conduiraient à la destruction de la surface auto-assemblée. Ceci est résolu en utilisant de l'éthanol comme solvant et la cuisson des APTES dans le four pour réduire l'hydrolyse de solutions aqueuses ultérieures. La deuxième étape critique est les étapes de réaction d'EDC dans laquelle EDC catalyse la réaction de l'ORD avec les APTES: permettant la réticulation des deux couches. Si l'EDC est exclue ou pas suffisamment ajouté, l'ORD ne sera pas en mesure de joindre le plancher, whic h compromettra le mécanisme de libération. La troisième étape critique est au cours de la fonctionnalisation de SAv, comme le maintien de la couche de SAv est critique. La non-uniformité des résultats de la couche de streptavidine dans la réduction de l'efficacité de capture. La quatrième étape critique est la biotinylation de l'anticorps, comme la liaison de l'anticorps à la surface de capture est facilitée par l'interaction biotine-streptavidine de la surface de capture et de l'anticorps. Si l'anticorps est non-biotinylé, puis la couche de streptavidine sera incapable de le capturer et de tirer vers le bas, ce qui rend la surface de capture inutile. Variabilité et incohérence dans la capture de surface peuvent être attribués à une concentration non-régularité ainsi que la stochasticité de l'attachement de la couche. Cette variation peut être contrôlée en utilisant des concentrations précises de composants de la couche calibrée à la surface et les objectifs prévus de la capture. Dans cette conception, les concentrations sont calibrées précisément à la capture des cellules MCF7-GFP.

e_content "> Quels sont les inconvénients de cette méthode?

Actuellement, la fonctionnalisation de l'APTES est effectué en utilisant une immersion dans la phase liquide de la surface pendant 55 minutes, suivie d'une étape de cuisson pendant 2 heures. Bien que cela permet une couche complète de l' APTES silane de se lier à la surface, un procédé plus uniforme serait la silanisation en phase vapeur 37. Cela diminue le temps de contact de APTES, économisant ainsi le temps des chercheurs, ainsi que d'accroître l'uniformité. En outre, l' amélioration de pull-down a été observé 17 quand une nuit d' incubation de SAv est utilisé, et actuellement, la fonctionnalisation de surface nécessite deux, incubations durant la nuit, ce qui rend l'ensemble du processus prend trois jours. Ainsi, l'optimisation de la chimie offrirait d'importantes économies de temps pour le chercheur.

Quels sont les avertissements ou les précautions qui peuvent être utiles?

Lorsque fonctionnalisation des surfaces, il est imperative que prise en charge adéquate au risque de lésions respiratoires. Les deux APTES et mercaptoéthanol peuvent être extrêmement dangereux pour les poumons et les organes associés, il est donc nécessaire de faire le processus de fonctionnalisation dans une hotte chimique pour réduire l'interaction avec les vapeurs chimiques. Mercaptoethanol est un thiol qui est particulièrement piquant de l'odeur. Lorsque vous utilisez mercaptoéthanol, permettre des déchets contaminés à siéger dans le capot pour un jour ou deux avant l'élimination.

Quels sont les objectifs futurs et les applications de cette surface?

Nos objectifs futurs impliquent la personnalisation de cette surface à travailler avec une variété de types cellulaires pertinents pour les maladies connexes angiogéniques. En particulier, nous avons l'intention de se concentrer sur les cellules humaines endothéliales de veine ombilicale afin d'enchaîner à l'aide d'échantillons de sang et séparer les cellules d'intérêt à partir de là. En outre, nous prévoyons d'intégrer les modalités de séparation telles que des aptamères dans la conception de la surfac fonctionnalisée d'augmenter encore nos capture et de libération des pourcentages.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
(3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) Acros Organics 919-30-2 Used to make 2% APTES solution
Plasma Cleaner Pico Diener Model 1 Cleans surfaces and allows for bonding of PDMS to glass
d-Desthiobiotin (DSB) Sigma D20655 Used as the releasing mechanism in the cellular capture surface. 
dimethyl sulfoxide (DMSO) British Drug Houses (BDH) BDH1115-1LP Dissolves the DSB into solution
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) Thermo-Scientific 5g: 22980
25g: 22981
Activates carboxylic acids and allows binding of proteins to glass surface.
uncoated 8-well culture slide BD Falcon Case of 24: 354118
Case of 96: 354108
Used in cellular experiments involving Zeiss fluorescence microscope such as initial capture and release quantification experiments
Glass bottom 24-well plates MatTek P24G-0-13-F Used in cellular experiments involving the plate reader such as antibody and cellular titration experiments
Mercaptoethanol Science Lab 60-24-2 Used to quench reaction between EDC and DSB
4-Morpholinoethanesulfonic acid hydrate
(MES Hydrate 99%)
Fisher Scientific AC172590250 Used to make 0.1 M MES Buffer for use in EDC reaction
Precision Oven Thermo Scientific 11-475-153 Used in curing of PDMS and APTES layer.
Titramax 1000 Shaker Heidolph 13-889-420 Used to ensure even distribution of APTES on surfaces.
1x Streptavidin 5 mg [e7105-5mg] Proteo Chem 9013-20-1 Biotin-binding protein. May cause irritation.
5 cm Glass Dish Fisher Scientific 08748A Used in HUVEC studies as well as future profiling studies.
14 cm Petri Dish with Cover Sigma-Aldrich Z717231 Used to hold samples being functionalized and transport them.
MCF7-GFP cells Cell Biolabs AKR211 Stored in liquid nitrogen
RAW264.7 mouse macrophages ATCC TIB-71 Gifted to us from Smith lab at the University of Illinois. Stored in liquid nitrogen.
TrypLE Life Technologies 12605036 Stored in 100 ml at room temperature
Dulbecco’s modified Eagle medium Cell Media Facility at School of Chemical Sciences at UIUC 50003PC Supplier: Corning
Nonessential amino acids Cell Media Facility at School of Chemical Sciences at UIUC 25-025-CI Already added into DMEM by facility. Supplier: Corning.
Cell scraper Fisher Scientific 12-565-58 Small 23 cm 50 pack
Cell Dissociation Solution Corning MT-25-056CI Used to lift cells non-enzymatically for the use in cell experiments
Hemacytometer Hausser 02-671-54 Used to count cells for quantification of cell solutions and capture and release effectivity.
Biotin Amresco 58-85-5 Used to release cells from surface.
HBSS Created from Recipe N/A Used to keep cells alive in suspension as well as wash surfaces of non-specific binding. Adapted from Cold Spring Harbor Protocols: In 500 ml, use 4 g NaCl, 0.2 g KCl, 0.0402 g Na2PO4•7H2O, 0.03 g KH2PO4 and 0.5 g glucose. Add DI water to get to 500 ml, filter, and then refrigerate.
HLA-ABC Antibody BioLegend 311402 Antibody used to capture MCF7gfp cells
hIgG Antibody BioLegend HP6017 Antibody used to capture MCF7gfp cells
MCF7 GFP cells Cell Biolabs AKR-211 Luminal Breast Cancer line that has been transfected with green fluorescent protein.
Assorted Conicals Thermo-Scientific 15mL: 12-565-268 50/15 ml plastic conicals for storing solutions and aliquots.
Mini-Tube Rotators (End over End Mixer) Fisher Scientific 05-450-127 Used to incubate antibody and mix other cellular solutions in order to mix
Axiovert 200M (Fluorescence Microscope) Zeiss N/A Zeiss Axiovert 200 M inverted florescence microscope.
Zeba Desalting columns Thermo-Scientific PI-87770 Used to purify newly biotinylated antibodies after the use of the Biotinylation Kit. Instructions provided at: http://www.funakoshi.co.jp/data/datasheet/PCC/89894.pdf
EZ Link Sulfo NHS Low Weight Biotinylation Kit Thermo- Scientific Used to biotinylate antibodies to allow them to integrate with the capture surface
Plate Reader BioTek Synergy HTX Multimode Reader Used to quantitatively measure fluorescent intensity in the titration experiments.

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