स्ट्रक्चरल अध्ययन एक मिलकर आत्मीयता टैग पद्धति का उपयोग करके मूल निवासी परिसरों की शुद्धि

Biology

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van der Feltz, C., Pomeranz Krummel, D. Purification of Native Complexes for Structural Study Using a Tandem Affinity Tag Method. J. Vis. Exp. (113), e54389, doi:10.3791/54389 (2016).

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Abstract

आत्मीयता शुद्धि दृष्टिकोण प्रोटिओमिक लक्षण वर्णन के लिए देशी परिसरों को अलग-थलग करने में सफल रहे हैं। स्ट्रक्चरल विविधता और एक जटिल की compositional विविधता की एक डिग्री आम तौर पर इस तरह के अध्ययन के संचालन में प्रगति में बाधा नहीं है। इसके विपरीत, एक जटिल संरचनात्मक लक्षण वर्णन के लिए इरादा एक राज्य है कि दोनों compositionally और संरचनात्मक रूप से सजातीय के साथ ही एक उच्च एकाग्रता प्रोटिओमिक्स के लिए आवश्यकता से कम में शुद्ध किया जाना चाहिए। हाल ही में, वहाँ बड़े macromolecular परिसर की संरचना निर्धारण के लिए इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के आवेदन में महत्वपूर्ण प्रगति की गई है। यह इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा पर्याप्त गुणवत्ता और संरचनात्मक निर्धारण के लिए मात्रा के देशी परिसरों को शुद्ध करने के दृष्टिकोण में दिलचस्पी बढ़ गई है। अग्रानुक्रम आत्मीयता शुद्धि (नल) विधि निकालने के लिए और एक 18 सबयूनिट शुद्ध करने के लिए अनुकूलित किया गया है, ~ नवोदित खमीर से 0.8 एमडीए ribonucleoprotein विधानसभा (Saccharomyces cerevisiae)

Introduction

कई प्रमुख सेलुलर प्रक्रियाओं बड़े प्रोटीन और प्रोटीन आरएनए परिसरों 1 से बाहर किया जाता है। ऐसे परिसरों की biophysical और संरचनात्मक अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण टोंटी उन्हें एक उपयुक्त गुणवत्ता (यानी, एकरूपता) के और एक उचित एकाग्रता में प्राप्त है। एक देशी स्रोत से एक जटिल अलग यूनिटों की संगत के बाद ट्रांसक्रिप्शनल और / या translational संशोधनों को बनाए रखना है और उचित जटिल विधानसभा बीमा सहित कई फायदे हैं। हालांकि, बड़े सेलुलर परिसरों अक्सर एक कम प्रतिलिपि संख्या में एक सेल में मौजूद हैं और शुद्धि अत्यधिक कुशल हो सकता है और निकट शारीरिक शर्तों के तहत होने जटिल अखंडता को बनाए रखा है सुनिश्चित करने के लिए करना चाहिए। एक यूकेरियोटिक स्रोत से एक जटिल शुद्ध विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण है और आर्थिक रूप से निषेधात्मक हो सकता है। इस प्रकार, रणनीति या तरीकों कि कुशल हैं और एक सजातीय जटिल उपज अत्यधिक वांछित हैं।

एक रणनीति है कि कर दिया गया हैउनकी प्रारंभिक लक्षण वर्णन के लिए कोशिकाओं से देशी परिसरों सफ़ाई करने में सफल संगठनों ने मिलकर आत्मीयता शुद्धि (नल) विधि 2,3 है। नल विधि शुरू कारक 2 (एस) बातचीत के साथ परिसर में एक देशी प्रोटीन नवोदित खमीर (एस cerevisiae) से शुद्ध करने के लिए तैयार किया गया था। नल विधि दो टैग, प्रत्येक टैग एक ही प्रोटीन कोडिंग जीन अनुक्रम को मिलकर में जुड़े हुए उपयोग किया। के रूप में इतनी तंग और चयनात्मक शारीरिक समाधान की स्थिति के पास बनाए रखने के लिए एक इच्छा के साथ एक समानता राल के लिए बाध्य करने के लिए एक की जरूरत संतुलन के लिए टैग चयन किया गया था। यह संतुलन के बाद शुद्धि लक्षण वर्णन के लिए कारक (ओं) बातचीत के साथ टैग प्रोटीन की स्थिर बातचीत (ओं) को संरक्षित करने के लिए कार्य करता है। टैग बस पर 20 केडीए के लिए एक अतिरिक्त - genomically शामिल नल टैग अंत में रखा गया था (सी टर्मिनल) एक प्रोटीन कोडिंग जीन की और एक दृश्य एक Calmodulin बाध्यकारी पेप्टाइड (सीबीपी) एक प्रोटीन के द्वारा पीछा के लिए कोडिंग के शामिल प्रोटीन। सीबीपी, कम है 26 अमीनो एसिड होता है, और द्वारा मान्यता प्राप्त ~ 17 केडीए प्रोटीन Calmodulin 10 -9 के आदेश एम 4 पर एक कश्मीर डी के साथ कैल्शियम की उपस्थिति में (सीएएम)। एक प्रोटीन टैग बड़ा दोहराता के बीच एक छोटी लिंकर साथ 58 अवशेषों की दो दोहराता से मिलकर है। प्रत्येक 58 एमिनो एसिड दोहराने एक कश्मीर डी ~ 10 -8 एम 5 के साथ इम्युनोग्लोबुलिन जी (आईजीजी) द्वारा मान्यता प्राप्त है। इन दोनों के बीच टैग TEV प्रोटीज, तम्बाकू खोदना वायरस 6.7 से एक endopeptidase के लिए एक मान्यता साइट शामिल किया गया था। जैसा कि चित्र 1 में सचित्र, विधि नल टैग प्रोटीन की पहली समानता कदम में प्रोटीन ए टैग प्रोटीन TEV प्रोटीज, साइट विशेष के बीच cleaving के अलावा पर ​​स्तंभ दरार पर से eluted है के माध्यम से एक आईजीजी राल के लिए बाध्य है दो टैग। इस आईजीजी की बातचीत के रूप में एक आवश्यक कदम है और एक प्रोटीन बहुत मजबूत है और केवल पर्याप्त रूप से denaturing समाधान की शर्तों के तहत परेशान किया जा सकता है। एक पीआर अभावएक टैग otein, प्रोटीन कैल्शियम की उपस्थिति में सांचा राल के लिए बाध्य और धातु आयन chelator EGTA (एथिलीन ग्लाइकोल tetraacetic एसिड) (चित्रा 1) के अलावा के साथ इस राल से eluted है।

इसके तुरंत बाद नल विधि का परिचय, यह एक बड़े पैमाने पर अध्ययन में इस्तेमाल किया गया था उत्पन्न करने के लिए एक एस में जटिल संबंधों की 'नक्शा' cerevisiae 8। महत्वपूर्ण बात है, इस प्रयास को एक पूरे खमीर-नल गईं खुला पढ़ने फ्रेम (ओआरएफ) पुस्तकालय का एक परिणाम के रूप में अच्छी तरह से व्यक्तिगत नल के रूप में चिह्नित ORFs 9 एक वाणिज्यिक स्रोत से उपलब्ध हैं। इस प्रकार, एक किसी भी खमीर परिसर के लिए एक टैग प्रोटीन के साथ किसी भी खमीर तनाव प्राप्त कर सकते हैं। नल विधि भी संशोधन या नल टैग के रूपांतरों सहित प्रेरित: अन्य यूकेरियोटिक के साथ ही बैक्टीरियल कोशिकाओं 10,11 से परिसरों की शुद्धि के लिए इसके उपयोग; एक 'विभाजित टैग ", जिसमें एक प्रोटीन और सीबीपी अलग प्रोटीन 12 पर रखा जाता है की डिजाइन; और टाजी एस, बदल इतनी के रूप में इस तरह के सीए 2 या EGTA 13 करने के लिए जटिल की संवेदनशीलता के रूप में, अन्वेषक की जरूरत को समायोजित करने के लिए।

दोनों इंस्ट्रूमेंटेशन और कार्यप्रणाली में हाल के अग्रिमों संरचना निर्धारण के लिए इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) के आवेदन में उल्लेखनीय प्रगति की है, उस macromolecular परिसर में 14 के परमाणु संकल्प छवियों के पास उच्च करने के लिए नेतृत्व किया है, के लिए मार्ग प्रशस्त किया है। संकल्प ईएम द्वारा एक परिसर के प्राप्य, हालांकि, अध्ययन के तहत जटिल की गुणवत्ता पर आकस्मिक बनी हुई है। इस अध्ययन में नल टैग दृष्टिकोण एस से शुद्ध करने के लिए उपयोग किया गया है cerevisiae U1 snRNP, एक 18 सबयूनिट (~ 0.8 एमडीए) कम प्रतिलिपि संख्या ribonucleoprotein जटिल है कि spliceosome 15,16 का हिस्सा है। कदम की एक संख्या इस जटिल ऐसी है कि यह सजातीय और एक पर्याप्त एकाग्रता की है शुद्ध करने के लिए उठाए गए हैं। संभावित समस्याओं शुद्धि के विभिन्न चरणों में सामना करना पड़ा वर्णित हैं और रणनीतियों chall पर काबू पाने के लिए लियाenges पर प्रकाश डाला। सावधानी से आकलन करने और शुद्धि के चरणों का अनुकूलन से, U1 snRNP शुद्ध एक गुणवत्ता की और और नकारात्मक दाग के लिए उपयुक्त इलेक्ट्रॉन क्रायो माइक्रोस्कोपी (क्रायो ईएम) के अध्ययन के एक मात्रा में है। संरचनात्मक अध्ययन के लिए देशी परिसरों की शुद्धि के लिए एक अनुकूलित नल विधि प्रोटोकॉल यहाँ बताया है।

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Protocol

नोट: निम्न प्रोटोकॉल सेल संस्कृति के 4 एल, कोशिकाओं का लगभग 40 ग्राम गीला वजन से एक जटिल की शुद्धि के लिए तैयार किया गया था। एक बार तैयार है, सभी बफ़र्स 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत और उनकी तैयारी के एक महीने के भीतर किया जाना चाहिए। एजेंट को कम करने और प्रोटीज अवरोधकों केवल बफ़र्स बस का उपयोग करने से पहले करने के लिए जोड़ रहे हैं।

अग्रानुक्रम आत्मीयता शुद्धि के लिए पूरे सेल निकालने के 1. तैयारी

  1. एस का विकास cerevisiae प्रकोष्ठों
    1. स्ट्रीक वांछित नल टैग किए गए एस cerevisiae तनाव भंडारण से (-80 डिग्री सेल्सियस) एक खमीर peptone डेक्सट्रोज पर (YPD) थाली। 3 के लिए सेते हैं - 5 दिन (30 डिग्री सेल्सियस), जब तक खमीर कोशिकाओं सफेद और शराबी दिखाई देते हैं।
    2. एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार polypropylene अपकेंद्रित्र ट्यूब में 10 मिलीलीटर YPD मीडिया में लगभग 2 मिमी प्लेट से ताजा कोशिकाओं के 2 की एक लकीर टीका लगाना। प्रति मिनट 180 क्रांतियों (आरपीएम) रातोंरात (30 डिग्री सेल्सियस) पर ट्यूब हिला।
    3. से अधिक की 2 मिलीलीटर टीका लगानाएक 2 एल Erlenmeyer या शंक्वाकार फ्लास्क में प्रति YPD मीडिया की लीटर रात संस्कृति। 180 आरपीएम (30 डिग्री सेल्सियस) पर हिला। देर लॉग चरण तक 600 एनएम (600 आयुध डिपो) की एक ऑप्टिकल घनत्व में सेल के विकास पर नजर रखने, 2 से 1.8 के आयुध डिपो के 600, आम तौर पर 20 - 24 घंटा।
  2. कटाई एस cerevisiae प्रकोष्ठों
    1. centrifugation द्वारा हार्वेस्ट कोशिकाओं 15 मिनट (4 डिग्री सेल्सियस) के लिए 5400 XG पर।
    2. जल्दी से सतह पर तैरनेवाला छानना और 4 डिग्री सेल्सियस पर या बर्फ पर कोशिकाओं रहते हैं।
    3. ठंडा बफर 2 मिलीलीटर के साथ सेल गोली के प्रत्येक लीटर निलंबित (10 मिमी Tris एचसीएल, पीएच 8.0, 300 मिमी NaCl, 10 मिमी KCl, 0.2 मिमी EDTA, पीएच 8.0, 5 मिमी imidazole, पीएच 8.0, 10% ग्लिसरॉल, 0.1% वी / वी एनपी 40)। घूमता और / या दोहराने pipetting एक 10 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक pipet का उपयोग करके कोशिकाओं को निलंबित।
      नोट: एनपी 40 के महत्व के रूप में यह करने के लिए जटिल गुणवत्ता और पोस्ट-शुद्धि विश्लेषण नीचे चर्चा की है संबंधित है।
    4. एक खाली 50 मिलीलीटर शंक्वाकार polypropylene अपकेंद्रित्र ट्यूब कश्मीर में सेल निलंबन स्थानांतरणबर्फ पर Ept। ठंडा lysis बफर के एक अतिरिक्त 2 मिलीलीटर के साथ प्रत्येक सेंट्रीफ्यूज बोतल धो और 50 मिलीलीटर ट्यूब में सेल निलंबन के लिए जोड़ें।
    5. ट्यूब वजन और खाली ट्यूब के वजन घटाकर रूप में अच्छी तरह के रूप में जोड़ा बफर द्वारा सेल गोली का गीला वजन का निर्धारण करते हैं।
      नोट: एक आयुध डिपो के 600 1.8 होने सेल संस्कृति का एक लीटर में लगभग 10 ग्राम है।
    6. एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार polypropylene अपकेंद्रित्र ट्यूब में एक तरल नाइट्रोजन स्नान बनाएँ। एक 5 मिलीलीटर सिरिंज में निलंबित कोशिकाओं ड्रा। सिरिंज के लिए एक 16 जी सुई कनेक्ट करें। सिरिंज / सुई सेल उत्पन्न करने के माध्यम से गुजर द्वारा सेल निलंबन रुक "बूंदों।" ठंड की दर लगभग 1 मिनट / एमएल होना चाहिए।
    7. स्टोर जमे हुए सेल बूंदों (-80 डिग्री सेल्सियस) या सेल करने के लिए आगे बढ़ें।
  3. Lysing कोशिकाओं और Lysate स्पष्टीकरण
    1. Lyse एक कॉफी बनाने की मशीन का उपयोग कर खमीर कोशिकाओं। 25 सेकंड फटने पीस, जबकि सी झटकों के साथ कोशिकाओं lyse आठ से नौ गुनाoffee चक्की। उपयोग करने से पहले, पूर्व ठंडा तरल नाइट्रोजन के साथ कॉफी बनाने की मशीन। पीस के हर दो राउंड, चक्की के लिए तरल नाइट्रोजन का एक उथले परत जोड़ने और इसे लुप्त हो जाना करने के लिए अनुमति देते हैं।
    2. के रूप में clumping से कोशिकाओं को रखने के लिए आवश्यक एक तरल नाइट्रोजन ठंडा रंग के साथ हिलाओ। कोशिकाओं है, जो सेल clumping में परिणाम कर सकते हैं का विगलन को रोकने के लिए सावधानी रखना। कोशिकाओं सेल के बाद एक ठीक सफेद पाउडर के रूप में प्रकट करना चाहिए। खमीर संस्कृति (~ 40 ग्राम) के 4 एल से एक अधिकतम सेल गोली एक समय में जमीन हो सकता है।
      नोट: सेल की विधि के बारे में टिप्पणियों नीचे चर्चा कर रहे हैं।
    3. एक hemocytometer या वैकल्पिक सेल गिनती विधि का उपयोग सेल की डिग्री का आकलन। एक पर्याप्त विश्लेषण प्रदान करने के लिए निम्न नमूने लेने: (1) सेल से पहले; (2) सेल के चार दौर के बाद; और (3) सेल के बाद। इन नमूनों की जांच करने के लिए, एक तरल नाइट्रोजन ठंडा रंग और एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में जगह के साथ कोशिकाओं की एक छोटी राशि ले।
    4. एक बार कोशिकाओं thawed रहे हैं, पिपेट 5 कोशिकाओं के μlऔर 495 μl पानी के साथ मिश्रण। 40 - यदि कोशिकाओं का 60% सेल मनाया जाता है, प्रोटोकॉल में अगले कदम के लिए आगे बढ़ें।
      नोट: सेल की लंबी अवधि के प्रभाव के बारे में टिप्पणियों नीचे चर्चा कर रहे हैं।
    5. एक बार जब पर्याप्त सेल मनाया जाता है, दुकान lysed कोशिकाओं (-80 डिग्री सेल्सियस) या अगले कदम के लिए आगे बढ़ें।
    6. दो 50 मिलीलीटर शंक्वाकार polypropylene अपकेंद्रित्र 15 मिलीलीटर lysis बफर के साथ प्रत्येक 1 मिमी phenylmethanesulfonyl फ्लोराइड (PMSF), 1 मिमी dithiothreitol (डीटीटी), और प्रोटीज अवरोधकों के एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कॉकटेल सहित ट्यूब, तैयार करें।
      नोट: महत्वपूर्ण प्रोटियोलिसिस मनाया जाता है, एक प्रोटीज की कमी तनाव के उपयोग पर विचार करें।
    7. तैयार 50 मिलीलीटर ट्यूबों में जमे हुए lysed सेल पाउडर स्कूप करने के लिए एक तरल नाइट्रोजन ठंडा रंग का प्रयोग करें। बफर करने के लिए संवर्द्धित सेल पाउडर / ठोस जोड़ें, दोनों एक कम करने और protease अवरोध (एस) से युक्त।
    8. धीरे आरटी पर 50 मिलीलीटर ट्यूबों घुमाएँ के रूप में तो पिघलना करने के लिए / कोशिकाओं के गठन से बुलबुले को रोकने के लिए भंग, लेकिन यह भी। एसेल पाउडर / ठोस घुल, अतिरिक्त सेल ठोस / पाउडर डालें।
    9. दो 50 मिलीलीटर ट्यूबों के प्रत्येक भरें जब तक प्रत्येक कोशिकाओं के लगभग 20 ग्राम या सभी कोशिकाओं को जोड़ा गया है। जारी विगलन / भंग जब तक वहाँ कोई जमे हुए सेल 50 मिलीलीटर ट्यूब में मनाया झुरमुटों हैं। यह लगभग 50 मिनट के लिए ले जाना चाहिए।
    10. 25,000 XG (4 डिग्री सेल्सियस) पर 20 मिनट के लिए निलंबित सेल lysate अपकेंद्रित्र। खैर-lysed कोशिकाओं काले वेग की एक छोटी राशि प्रदर्शन कर सकते हैं।
    11. अल्ट्रा अपकेंद्रित्र ट्यूब (26.3 मिलीलीटर ट्यूबों का इस्तेमाल किया) polycarbonate और प्रत्येक पूर्ण ट्यूब के लिए 10 μl 200 मिमी PMSF जोड़ने की सतह पर तैरनेवाला के 50 मिलीलीटर स्थानांतरण।
    12. 100,000 XG (4 डिग्री सेल्सियस) पर 1 घंटे के लिए अपकेंद्रित्र। चार परतों, दिखाई जानी चाहिए ऊपर से नीचे: (1) एक कठिन स्पष्ट गोली, ribosomal परिसरों युक्त; (2) एक नरम लिपिड युक्त गोली; (3) एक बड़े स्पष्ट पीले रंग की परत सेल के घुलनशील प्रोटीन और परिसरों का सबसे युक्त; और (4) एक 'दरिद्र' शीर्ष स्तर लिपिड से मिलकर।
    13. सभी रों को पूरा करेंएक ठंडे कमरे (4 डिग्री सेल्सियस) में ubsequent कदम। शीर्ष 'दरिद्र' लिपिड संभव के रूप में परत के रूप में ज्यादा एक 1 मिलीलीटर pipet का उपयोग निकालें और त्यागने। पीले, स्पष्ट परत के सबसे ठीक करने के लिए एक 10 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक pipet का प्रयोग करें।
    14. 1 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग कर नीचे दो परतों को परेशान करने से बचने के लिए इस परत की पिछले कुछ मिलीलीटर की वसूली। 40 ग्राम गीला सेल गोली से, मध्यम स्तर के लगभग 48 मिलीलीटर आम तौर पर बरामद किया है और लिपिड परत के 8 मिलीलीटर हटा / खारिज कर दिया।
      नोट: स्तंभ शुद्धि प्रवाह बहुत, लिपिड, जो भी जटिल की गुणवत्ता को कम कर सकते हैं की उपस्थिति द्वारा रुकावट है नीचे चर्चा की।

2. स्तंभ शुद्धि चरण 1: आईजीजी क्रोमैटोग्राफी

  1. राल संतुलन और बंधन
    1. सेल गोली की 40 ग्राम के लिए एक 300 μl आईजीजी Sepharose घोल तैयार करें। घोल pipetting की सुविधा के लिए एक 1 मिलीलीटर pipet टिप के अंत कट। धोने / आईजीजी राल तीन बार, हर बार संतुलित 5 मिलीलीटर IgGD150 Buffe साथआर (10 मिमी Tris एचसीएल, पीएच 8.0, 150 मिमी NaCl, 150 मिमी KCl, 1 मिमी 2 MgCl, 5 मिमी imidazole, पीएच 8; 0.1% वी / वी एनपी 40, 1 मिमी डीटीटी, 50 प्रति एक protease अवरोध गोली मिलीलीटर मात्रा)।
      1. स्पिन washes के बीच 160 XG (4 डिग्री सेल्सियस) पर गोली और सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
    2. बीच का चरण सतह पर तैरनेवाला और कोशिकाओं की 40 ग्राम प्रति दो मिनी protease अवरोध गोलियों के साथ आईजीजी राल घुमाने के लिए, एक उचित रोटेटर का उपयोग कर, 2 घंटा (4 डिग्री सेल्सियस) के लिए। इस आईजीजी बैच समाधान है।
    3. स्तंभ के अंत काटने के एक फ्लैट में कटौती का उत्पादन द्वारा इस्तेमाल के लिए दो 10 मिलीलीटर पाली प्रस्तुत करने का कॉलम तैयार करें। पैकिंग और गुरुत्वाकर्षण प्रवाह से स्तंभ की धुलाई में तेजी लाने के लिए, या पैक आईजीजी राल के 200 μl की एक अधिकतम 10 मिलीलीटर प्रति स्तंभ आईजीजी बैच समाधान के 25 मिलीलीटर लोड ~।
    4. स्तंभ में आईजीजी बैच समाधान डालो और गंभीरता से तलछट के लिए अनुमति देते हैं। अवसादन 30 मिनट से अधिक समय लेता है, वहाँ सबसे अधिक संभावना लिपिड संदूषण था जब सेंट्रीफ्यूज टी से बीच का चरण उबरनेubes।
    5. IgGD150 बफर के लगातार चार 10 मिलीलीटर की मात्रा के साथ पैक स्तंभ धो लें।
  2. कॉलम TEV दरार पर
    1. स्तंभ के नीचे सील और IgGD150 बफर के 1 मिलीलीटर और TEV प्रोटीज के 100 μl जोड़ने (0.6 मिलीग्राम / एमएल शेयर, TEV के उत्परिवर्ती संस्करण S219V घर में उत्पादित)। स्तंभ के शीर्ष सील और 20 मिनट (18 डिग्री सेल्सियस) एक थर्मल मिक्सर का उपयोग कर, 750 rpm पर झटकों के लिए मिश्रण। Resuspend राल और फिर 20 मिनट के लिए 1 घंटा ऊष्मायन की कुल के लिए एक बार फिर मिश्रण, दोहराएँ।
      नोट: यह एक न्यूनतम करने के लिए गर्मी के समय रखने के लिए महत्वपूर्ण है।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस के लिए स्तंभ लौटें और गंभीरता से प्रोटीन / जटिल elute। IgGD150 बफर के एक अतिरिक्त 200 μl के साथ मृत मात्रा Elute।

3. स्तंभ शुद्धि चरण 2: Calmodulin आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी

  1. राल संतुलन और बंधन
    1. सेल की 40 ग्राम प्रति अपनत्व Calmodulin राल के 200 μl तैयारगोली। राल धो तीन बार, हर बार 5 मिलीलीटर Calmodulin बाध्यकारी बफर (10 मिमी Tris एचसीएल, पीएच 8.0 के साथ; 150 मिमी NaCl, 10 मिमी KCl, 1 मिमी 2 MgCl, 5 मिमी imidazole, 8 पीएच, 2 मिमी 2 CaCl; 0.1 % वी / वी एनपी 40; 10 मिमी β-mercaptoethanol), 160 XG (4 डिग्री सेल्सियस) पर centrifuging प्रत्येक धोने के लिए गोली।
    2. प्रत्येक 1 मिलीलीटर आईजीजी eluate करने के लिए, बंधन बफर Calmodulin के 3 खंडों को जोड़ने। कैल्शियम के स्तर स्थिर रखने के लिए, 2 CaCl और β-mercaptoethanol आईजीजी क्षालन में इन घटकों की कमी के लिए खाते में जोड़ सकते हैं। अंतिम सांद्रता 2 मिमी 2 CaCl और 10 मिमी β-mercaptoethanol होना चाहिए।
    3. Calmodulin राल के लिए नमूना जोड़ें और 1 घंटा (4 डिग्री सेल्सियस) एक ट्यूब रोटेटर प्रयोग करने के लिए बाध्य है।
  2. पैकिंग और Calmodulin राल से एल्यूटिंग
    1. स्तंभ के अंत काटने के लिए एक फ्लैट खोलने बनाने के लिए प्रति 100 μl Calmodulin घोल एक 2 मिलीलीटर पाली प्रस्तुत करने का स्तंभ तैयार करें। सह प्रति कोई 100 से अधिक μl Calmodulin घोल लोडनमूना राल की मात्रा को कम करने के लिए lumn क्षालन के दौरान के साथ संपर्क में आता है।
    2. गंभीरता से स्तंभ पैक और 5 मिलीलीटर Calmodulin बाध्यकारी बफर के साथ तीन बार स्तंभ में राल धो लें।
    3. 150 मिमी NaCl; 10 मिमी KCl, 1 मिमी 2 MgCl, 5 मिमी imidazole, पीएच 8.0, 4 मिमी EGTA, पीएच 8.0, 0.08% v 200 μl Calmodulin क्षालन बफर (10 मिमी Tris एचसीएल, पीएच 8.0 के अलावा के साथ प्रोटीन Elute / वी एनपी 40; 10 मिमी β-mercaptoethanol)। छह बार Calmodulin क्षालन बफर के 200 μl के अलावा दोहराएँ।
    4. 1 से 3 elutions के लिए, स्तंभ के लिए लागू करते हैं और मात्रा eluate तुरंत इकट्ठा। क्षालन 4 के लिए, स्तंभ के नीचे सील और 2.5 मिनट के लिए क्षालन बफर के साथ सेते हैं और फिर खोलना और गंभीरता से elute करने के लिए अनुमति देते हैं। क्षालन 5 के लिए, 5 मिनट के लिए सेते हैं और फिर खोलना और elute। क्षालन 6 के लिए, 10 मिनट के लिए सेते हैं और फिर खोलना और elute।
      नोट: जटिल की अखंडता elutions के बीच भिन्न हो सकते हैं / भिन्न (प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग देखें) <।/ Li>
    5. elutions Dialyze 2 व्यक्तिगत रूप से रात भर के लिए एक उपयुक्त सूक्ष्म डायलिसिस विधि का उपयोग करने के लिए 6। डायलिसिस बफर के खिलाफ अंशों Dialyze (10 मिमी Tris एचसीएल, पीएच 8.0, 150 मिमी NaCl, 10 मिमी KCl, 1 मिमी 2 MgCl, 5 मिमी imidazole, पीएच 8, 10 मिमी β-mercaptoethanol)।
      नोट: एनपी 40 appreciably पास नहीं है, अगर सब पर, डायलिसिस झिल्ली के माध्यम से।

4. पोस्ट शुद्धि विश्लेषण परिसर गुणवत्ता का आकलन

  1. देशी जेल और चांदी धुंधला
    1. निर्माता से निर्देशों के अनुसार परिसर के विश्लेषण के लिए 16% मिल में बना हुआ देशी जेल - एक 4 तैयार करें। जेल पर एक उपयुक्त आणविक वजन प्रोटीन मानक और dialyzed Calmodulin क्षालन / अंशों से प्रत्येक का भार 15 μl का प्रयोग करें।
    2. लगभग 3 घंटे के लिए (4 डिग्री सेल्सियस) के लिए 150 वी पर जेल Electrophorese।
    3. रजत छह elutions में से प्रत्येक की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए जेल दाग। वैकल्पिक रूप से, समान रूप से संवेदनशील वाणिज्यिक उपयोगफ्लोरोसेंट दाग (s)। इस स्तर पर, परिसर की एकाग्रता Coomassie नीले रंग धुंधला के लिए पता लगाने के स्तर से नीचे की संभावना सबसे अधिक है।
  2. अतिरिक्त जेल विश्लेषण के तरीके
    1. पश्चिमी सोख्ता द्वारा प्रोटीन का पता लगाने के लिए, एसडीएस या देशी पृष्ठ से जटिल हल और फिर Calmodulin बाध्यकारी पेप्टाइड (सीबीपी) मिलान निर्माता से निर्देशों के अनुसार एक नल टैग एंटीबॉडी का उपयोग के लिए जेल की जांच।
    2. एक विशिष्ट फ्लोरोसेंट दाग (एस) का उपयोग, उपस्थिति और एक नल शुद्ध परिसर में प्रोटीन और / या न्यूक्लिक एसिड की अखंडता की पुष्टि करें। ख्याल है कि कोई वर्णक्रमीय ओवरलैप इन दाग के बीच पाया जाता है ले लो।
  3. नकारात्मक दाग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी दृश्य
    1. चमक छुट्टी दे दी 30 सेकंड के लिए -15 मा निरंतर कार्बन ग्रिड का उपयोग, जटिल आवेदन के 30 मिनट के भीतर।
    2. ग्रिड से (आम तौर पर 1 एनएम के एक एकाग्रता में) ठोकर शुद्ध परिसर के 3 μl लागू करें। एक मिनट के लिए सेते हैं। ब्लाट चग्रिड के पक्ष ROM अतिरिक्त बफर हटा दें।
    3. विआयनीकृत पानी की 20 μl बूंदों के साथ दो बार धोएं। washes के बीच साइड दाग।
    4. एक 50 μl नकारात्मक दाग ड्रॉप करने के लिए ग्रिड को लागू करें और एक मिनट के लिए सेते हैं। uranyl एसीटेट (2%) या uranyl स्वरूप (0.75%) के साथ धुंधला सिफारिश की है।
      सावधानी: Uranyl लवण और समाधान दुर्बलता से रेडियोधर्मी हैं और भारी धातु होते हैं। ये ख्याल और सभी सामग्री है कि इन समाधान संस्थागत सिफारिश की बर्बादी के दिशा निर्देशों का पालन निपटारा किया जाना चाहिए के साथ संपर्क में आता है के साथ संभाला जाना चाहिए।
    5. एक ताजा 50 μl नकारात्मक दाग ड्रॉप करने के लिए ग्रिड लागू करें, सोख्ता के बिना। एक मिनट, तो साइड दाग के लिए सेते हैं, और अंत में शुष्क हवा और कल्पना।
  4. क्रायो इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो ईएम) दृश्य
    1. क्रायो ईएम निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार, नल शुद्ध जटिल के साथ प्रदर्शन हालांकि अनुकूलन के लिए आवश्यक हो सकता है।
      नोट: डिटर्जेंट की उपस्थिति उच्च सांद्रता माY प्रगति में बाधा और नीचे चर्चा की है।

5. जटिल भंडारण

  1. भंडारण के लिए जटिल तैयारी
    1. जटिल ध्यान लगाओ, अगर जरूरत है, जटिल के लिए एक उपयुक्त आणविक वजन कट ऑफ वाले एक केन्द्रापसारक फिल्टर का उपयोग कर। 1 मिनट की वेतन वृद्धि के लिए 14,000 XG पर स्पिन जब तक वांछित एकाग्रता पर पहुंच गया है।
      नोट: एनपी 40 एकाग्रता, ध्यान के दौरान एकाग्रता में वृद्धि के रूप में यह फिल्टर और न ही डायलिसिस झिल्ली के माध्यम से पारित नहीं होता होगा।
    2. फ़्लैश तरल नाइट्रोजन या सूखी बर्फ में 30 μl aliquots में जटिल इथेनॉल स्नान ठंडा फ्रीज और फिर -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
  2. डिटर्जेंट की वैकल्पिक पोस्ट शुद्धि हटाने

नोट: इस तरह के एनपी 40 के रूप में और अपनी महत्वपूर्ण मिसेल एकाग्रता में बाधा या कुछ अनुप्रयोगों के लिए प्रगति को बाधित कर सकते हैं कि ऊपर की एकाग्रता में एक साबुन की उपस्थिति। आद्य से हटाने के परिणामोंकर्नल के साथ-साथ अन्य additives या सह सॉल्वैंट्स के साथ प्रतिस्थापन नीचे चर्चा कर रहे हैं। कोई एनपी 40 वांछित है, एक विकल्प उदाहरण बायो-मोती के लिए, हटाने के लिए एक वाणिज्यिक अनुप्रयोग का उपयोग करने के लिए है।

  1. पूर्व संतुलित डायलिसिस बफर में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध डिटर्जेंट अवशोषित मोती। (आमतौर पर 10 एनएम एकाग्रता में) परिसर के 30 μl प्रति पांच मोती मिलाएं।
  2. बर्फ पर 15 मिनट के लिए नल शुद्ध परिसर के साथ कदम 5.2.1 से equilibrated मोती सेते हैं। डिटर्जेंट के हटाने के बाद कुछ ही घंटों के भीतर जटिल प्रयोग करें।

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Representative Results

एक संशोधित नल विधि एस से शुद्ध करने के लिए इस्तेमाल किया गया था U1 snRNP, एक 18 सबयूनिट ribonucleoprotein जटिल cerevisiae। प्रकाशित प्रोटोकॉल 2,3 निम्नलिखित परिसर के एक प्रारंभिक नल शुद्धि एक जटिल है कि विषम दिखाई दिया, पलायन के रूप में एक चांदी पर तीन बैंड मूल निवासी polyacrylamide जेल (2A चित्रा) दाग झुकेंगे। नल विधि के अनुकूलन के कई दौर, एक जटिल है कि के रूप में मुख्य रूप से एक अधिक सजातीय विधानसभा (2A चित्रा) का संकेत एक देशी जेल पर एक भी बैंड चले झुकेंगे। फ्लोरोसेंट रंगों का उपयोग कर दोनों प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड के लिए दाग, यह स्थापित किया गया था कि शुद्ध जटिल दोनों biopolymers वर्तमान (चित्रा 2 बी) था।

शुद्ध परिसर में भी एसडीएस पृष्ठ और पश्चिमी सोख्ता एक नल टैग एंटीबॉडी (चित्रा 3 ए) का उपयोग करके विश्लेषण किया गया था। विकासशील देशों के साथ संगतजेल परिणाम ve, जटिल प्रकाशित प्रोटोकॉल के अनुसार शुद्ध प्रदर्शित नल के प्रोटियोलिसिस टैग प्रोटीन (Snu71)। प्रोटियोलिसिस की राशि, हालांकि, काफी नल विधि के संशोधनों के साथ कम हो गया था। लगभग सभी U1 snRNP परिसर में सत्रह प्रोटीन की एसडीएस पृष्ठ से सुलझाया गया और सकारात्मक MALDI मास स्पेक्ट्रोमेट्री (चित्रा 3 बी) द्वारा की पहचान की। के रूप में अच्छी तरह से देशी और एसडीएस पृष्ठ के रूप में, जटिल गुणवत्ता नकारात्मक दाग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (चित्रा 4) से शुद्धि के विभिन्न चरणों में मूल्यांकन किया गया था। Monodispersed कणों 4C से चित्रा -4 ए और बी में मनाया लेकिन अनुपस्थित संरचनात्मक अध्ययन के लिए अच्छा नमूना के उदाहरण हैं। इस विश्लेषण विधि नल ​​विधि में परिवर्तन के प्रभाव के रूप में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान की है।

नल विधि गैर ईओण डिटर्जेंट एनपी 40 के शामिल किए जाने के लिए और एक सान्द्र पर कॉलअपनी महत्वपूर्ण मिसेल एकाग्रता (सीएमसी) की है कि ऊपर entration। जटिल प्रोटोकॉल में वर्णित की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए तरीकों की मजबूती के साथ ही एक प्रयोग है जहाँ zwitterionic surfactant CHAPS, ग्लिसरॉल या कोई सह विलायक एनपी 40 सभी बफ़र्स में (चित्रा 5) के लिए प्रतिस्थापित किया गया था द्वारा प्रदर्शन कर रहे हैं। मूल पृष्ठ और नकारात्मक दाग EM द्वारा, U1 snRNP करने के लिए कोई सह विलायक जोड़ा ग्लिसरॉल करने के लिए सबसे सजातीय और लोग से स्थिरता में कमी के साथ एनपी 40 में स्थिर प्रतीत होता है। यह हो सकता है कि खमीर U1 snRNP एक हाइड्रोफोबिक चेहरे और इस सतह कोटिंग से एनपी 40 रोकता एकत्रीकरण की उपस्थिति है। दुर्भाग्य से, एनपी 40 डायलिसिस से हटाया नहीं जा सकता है और जटिल ध्यान दे तो एनपी 40 ध्यान देना होगा। उच्च एनपी 40 जटिल उपद्रव करने के लिए प्रकट नहीं किया था, वहीं यह नकारात्मक क्रायो ईएम और बड़े मिसेल की तरह समुच्चय के लिए कांच का बर्फ में कण की ठंड के प्रभाव मनाया गया था। डिटर्जेंट अवशोषित मोती आर करने के लिए सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गयानिकालें संरचनात्मक रूप से जटिल प्रभावित करने के लिए प्रदर्शित होने के बिना एनपी 40 U1 snRNP नमूना से की बहुमत।

संशोधनों प्रोटोकॉल, दोनों नकारात्मक दाग और क्रायो ईएम के लिए एक जटिल उपयुक्त में विस्तृत के साथ परिसर की शुद्धि के बाद प्राप्त किया गया था, के रूप में कणों और विशिष्ट प्रतिनिधि वर्ग का औसत (चित्रा 6) के लॉन की छवियों इसका सबूत है।

आकृति 1
चित्रा 1. अग्रानुक्रम आत्मीयता शुद्धि (नल) विधि का अवलोकन। (क) दो कदम नल विधि के योजनाबद्ध। ब्याज (ग्रे) के परिसर एक नल टैग की सबयूनिट (काला; U1 snRNP सबयूनिट Snu71) भी शामिल है genomically एक दृश्य एक Calmodulin बाध्यकारी पेप्टाइड के शामिल के साथ जुड़े हुए (सीबीपी, हरा), साइट विशेष प्रोटीज के लिए एक मान्यता साइट TEV (ब्लू), और दो आईजीजी बाध्यकारी एक प्रोटीन के क्षेत्रों (पीआर एक रेड)। 1 चरण में, सेल lysate एक आईजीजी राल के साथ incubated है और जटिल प्रोटीन एक दृश्य के साथ अपनी बातचीत के माध्यम से बनाए रखा है। जटिल TEV मध्यस्थता दरार द्वारा राल से जारी है। 2 चरण में, परिसर में एक Calmodulin राल, एक सीए 2 निर्भर प्रतिक्रिया के साथ incubated है। जटिल सीए 2 chelator EGTA के अलावा के माध्यम से जारी किया जाता है। (बी) के पश्चिमी धब्बा एक नल के बाद में (ए) सचित्र शुद्धि कदम के माध्यम से टैग प्रोटीन। नमूने, सेल lysate के लिए ले जाया गया 1 कदम के बाद, और नल विधि के 2 कदम के बाद। प्रतिक्रियाशील प्रोटीन सेल lysate में मनाया 1 कदम के बाद तेजी से माइग्रेट करती है। TEV प्रोटीज दरार है और इस तरह एक प्रोटीन अनुक्रम के नुकसान के बाद, यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Ure 2 "src =" / files / ftp_upload / 54389 / 54389fig2.jpg "/>
चित्रा 2 नल विधि का अनुकूलन। (ए) चांदी नल शुद्ध परिसरों की देशी जेल दाग। के मूल निवासी पृष्ठ: प्रोटीन मानक (लेन 1); जटिल मूल नल विधि 3 (2 लेन) के अनुसार शुद्ध, तीन बैंड मनाया (तीर); परिवर्तन बफर करने के बाद एक ही नल शुद्धि से लगातार तीन elutions, दो बैंड (तीर) (गलियों 3 - 5) मनाया; नल विधि करने के लिए आगे के परिवर्तन, मुख्य रूप से एक भी जटिल बैंड ~ 800 केडीए में पलायन (6 लेन) से बेदखल। (बी) के एक शुद्ध परिसर की संरचना का विश्लेषण दोनों प्रोटीन और आरएनए प्रतिक्रियाशील दाग के साथ एक ही जेल लेन धुंधला द्वारा। के मूल निवासी पृष्ठ: प्रोटीन मानक (लेन 1) एक प्रोटीन फ्लोरोसेंट दाग के साथ दाग; जटिल प्रोटीन फ्लोरोसेंट दाग (2 लेन), दो बैंड मनाया के साथ imaged; 2 लेन में एक ही लेन, अब एक न्यूक्लिक एसिड फ्लोरोसेंट दाग (3 लेन), दो बैंड मनाया के साथ imaged; और अधिक से अधिक फ्लोरोसेंट संकेतगलियों 2 और 3 (4 लेन) में दाग परिसर के लेट गई। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
3. नल विधि का अनुकूलन चित्रा। (ए) जटिल गुणवत्ता में सुधार के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण, निम्नलिखित नल टैग की सबयूनिट Snu71 α-नल एंटीबॉडी के साथ जांच की। कई proteolyzed बैंड शुरू में दिखाई दे (1 लेन) कर रहे हैं लेकिन सुधार काफी कम बैंड की राशि (गलियों 2 और 3)। (बी) के एक प्रतिनिधि एसडीएस जेल एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन जेल दाग के साथ दाग को कम। जेल परिसर के 17 प्रोटीन की 12 समाधान करता है। बैंड में प्रोटीन की पहचान मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा स्थापित किया गया था। एक larg देखने के लिए यहाँ क्लिक करेंयह आंकड़ा की एर संस्करण।

चित्रा 4
चित्रा नल विधि में चरणों में 4. नमूना गुणवत्ता नकारात्मक दाग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी जटिल के बाद के नकारात्मक दाग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा मूल्यांकन द्वारा मूल्यांकन:। (ए) नल के 1 सेंट कदम, (बी) नल के 2 एन डी कदम, (सी ) जटिल अस्थिर। स्केल पट्टी, 125 एनएम। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5. नल विधि बफ़र में मौजूद योजक का नमूना गुणवत्ता पर प्रभाव लेन 1 -। 4 सी के नल शुद्धि के अंतिम या 2 एन डी कदम के पहले चार elutions हैंकी उपस्थिति में शुद्ध omplex: (ए) गैर ईओण डिटर्जेंट Nonyl phenoxypolyethoxylethanol (एनपी 40), देशी पृष्ठ (ऊपर) और नकारात्मक दाग EM (नीचे) द्वारा विश्लेषण, (बी) zwitterionic डिटर्जेंट 3 - [(3 cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate (लोग), देशी पृष्ठ (ऊपर) और नकारात्मक दाग EM (नीचे) द्वारा विश्लेषण, (सी) ग्लिसरॉल, देशी पृष्ठ (ऊपर) और नकारात्मक दाग EM (नीचे) द्वारा विश्लेषण; और (डी) कोई additive, देशी पृष्ठ (ऊपर) और नकारात्मक दाग EM (नीचे) द्वारा विश्लेषण किया। स्केल बार, 50 एनएम। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6 नल विधि का दृश्य परिसर शुद्ध। (ए) ऊपर, एक नकारात्मक दाग इलेक्ट्रॉन microsco के एक प्रतिनिधि छविPY (ईएम) माइक्रोग्राफ। मनाया इसी तरह के आकार के कणों की एक लॉन है, दो बॉक्सिंग कर रहे हैं, अनुकूलित नल विधि द्वारा शुद्ध। नीचे, वर्ग कणों कि कण विशिष्ठ सुविधाओं पर प्रकाश डाला का लिया औसत की एक चयन। स्केल बार, 50 एनएम। (बी) के ऊपर, एक क्रायो ईएम माइक्रोग्राफ़ के एक प्रतिनिधि छवि। मनाया, कणों की उच्च विपरीत प्रतिनिधि के क्षेत्रों रहे बॉक्सिंग दो ऐसे क्षेत्रों में देखते हैं। नीचे, कांच का बर्फ में जमे हुए चयन किया कणों के वर्ग का औसत। स्केल बार, 50 एनएम। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

नल विधि दो टैग कि तंग और चयनात्मक शारीरिक समाधान की स्थिति के पास बनाए रखने के लिए एक इच्छा के साथ एक समानता राल के लिए बाध्य करने के लिए एक की जरूरत के संतुलन का इस्तेमाल करता है। यह संतुलन के बाद शुद्धि लक्षण वर्णन के लिए कारक (ओं) बातचीत के साथ टैग प्रोटीन की स्थिर बातचीत (ओं) को संरक्षित करने के लिए कार्य करता है। इसके अलावा, व्यक्तिगत नल टैग की ORFs, एक वाणिज्यिक स्रोत से उपलब्ध हैं, ताकि किसी भी एक खमीर परिसर के लिए एक टैग प्रोटीन के साथ किसी भी खमीर तनाव प्राप्त कर सकते हैं। एक जटिल की अखंडता और एक संसाधन शुद्धि के लिए एक परिसर में अलग टैग प्रोटीन सब यूनिटों के उपयोग का परीक्षण करने की उपलब्धता के संरक्षण के लिए एक देशी जटिल सफ़ाई के लिए नल विधि के उपयोग के लिए दो फायदे हैं। हालांकि, मूल नल विधि प्रोटोकॉल सुनिश्चित करने के लिए कि जटिल शुद्ध compositionally और संरचनात्मक रूप से सजातीय है तैयार नहीं था। नल विधि इसलिए, संशोधित किया गया है ऊपर विस्तृत रूप में, इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए।

विभिन्ननल विधि में चरणों का इष्टतम दृष्टिकोण और शर्तों एक compositional और संरचनात्मक सजातीय जटिल शुद्ध करने के लिए स्थापित करने के लिए मूल्यांकन किया गया। एक प्रारंभिक महत्वपूर्ण कदम सेल है। जबकि बीमा है कि जटिल प्राप्त उच्च गुणवत्ता की है, यानी, सजातीय यह कदम, एक उच्च उपज है और इस तरह अधिकतम सेल के लिए एक इच्छा के बीच एक संतुलन की आवश्यकता है। lysing खमीर कोशिकाओं लिए अलग अलग दृष्टिकोण एक मनका डिब्बा, उच्च सरासर द्रव प्रोसेसर, और गेंद मिल का उपयोग सहित का पता लगाया गया। कम महंगी कॉफी बनाने की मशीन के उपयोग के वैकल्पिक तरीकों की तुलना में कम कुशल था (40 - 60% सेल), लेकिन जटिल पृथक और शुद्ध monodisperse दिखाई दिया, जबकि इन तरीकों में से कई या तो उपद्रव कण अखंडता या एकत्रीकरण की एक डिग्री पैदा करने के लिए दिखाई दिया। अंत में, कोशिकाओं की एक महत्वपूर्ण संख्या lysed नहीं कर रहे थे ताकि यह सुनिश्चित करने के लिए उच्च गुणवत्ता वाले जटिल प्राप्त हुई थी। जबकि 40 - 60% सेल खमीर U1 snRNP के लिए आदर्श है, अनुकूलन का सुझाव दिया है जब एक करने के लिए इस प्रोटोकॉल को लागू करने नई जैविक जटिल।

यह विधि में कदम है कि शुद्धि की रफ्तार बढ़ सुनिश्चित करने के लिए कि जटिल अखंडता कमजोर पड़ने का एक परिणाम के रूप में सेलुलर proteases, सबयूनिट हदबंदी से समझौता नहीं किया गया था सकता है की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण था, और TEV प्रोटीज दरार के दौरान 18 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन बढ़ाया। समय कुशल शुद्धि प्राप्त करने के लिए एक सरल कदम सुनिश्चित करने के लिए कि लिपिड जल्दी lysate स्पष्टीकरण से खत्म नहीं पड़ी थी, क्योंकि लिपिड गुरुत्वाकर्षण शुद्धि के दौरान प्रवाह में बाधा थी। अन्य चरणों के कुशल शुद्धि और एक अधिकतम प्रवाह दर को प्राप्त करने के लिए राशि राल और स्तंभ आकार / आयामों की एक इष्टतम संतुलन की पहचान शामिल थे। एक विशेष रूप से महत्वपूर्ण कदम TEV प्रोटीज द्वारा स्तंभ दरार पर के समय को कम करने के लिए किया गया था। इस्तेमाल किया TEV प्रोटीज घर में शुद्ध किया गया था स्वतंत्र और एक उच्च एकाग्रता के 17 में यह था प्रोटीज / nuclease सुनिश्चित करने के लिए। TEV प्रोटीज की काफी मात्रा में एक घंटे के तहत पूरा दरार प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया गया।

ontent "> प्रारंभिक नल शुद्धिकरण प्रोटियोलिसिस में मनाया गया। शुद्धि के दौरान प्रोटियोलिसिस कुशलता से काम कर रहे, अवरोधकों की एक बैटरी जोड़ने, और शुद्धि उच्च नमक washes में शामिल करके सीमित किया जा सकता है। प्रोटीज शुद्धि के पहले आधे से अधिक आपूर्ति की अवरोधकों की एक व्यापक रेंज काफी सुधार नल की स्थिरता टैग प्रोटीन और जटिल है। इसके अलावा, प्रोटियोलिसिस सेल और शुद्धि की आईजीजी चरणों के दौरान 300 से 500 मिमी की मोनोवैलेन्ट एकाग्रता बढ़ाने के द्वारा कम से कम किया गया था। यहाँ तक कि नल विधि के लिए ऊपर संशोधनों के साथ, लगातार eluted सीबीपी आत्मीयता के compositional एकरूपता के अपने डिग्री में विविध राल के बंद अंशों। इस प्रकार, दूसरे, सीबीपी क्रोमैटोग्राफी कदम से अंशों के चुनिंदा पूलिंग, warranted है।

कि विशेष रूप से ध्यान केंद्रित प्राप्त नल पद्धति का एक पहलू गैर ईओण डिटर्जेंट एनपी 40 जटिल शुद्धि के लिए और अपने सीएमसी के ऊपर एक एकाग्रता में का महत्व था। एनपी -4 की उपस्थिति0.08% या अधिक की एकाग्रता में 0 जटिल अखंडता और अंतिम उपज पर एक समग्र रूप से लाभकारी प्रभाव नहीं पड़ा। एनपी 40 के स्पष्ट लाभकारी प्रभाव (s) राल और जटिल के बीच गैर विशिष्ट बातचीत को कम करने के कारण भाग में हो सकता है। एनपी 40 शुद्धि के दौरान एक लाभदायक प्रभाव है प्रकट होता है, यह जटिल एकत्रीकरण के कारण के बिना पोस्ट-शुद्धि हटाया जा सकता है।

अंत में, संरचनात्मक अध्ययन के लिए नल विधि अनुकूलन करने के लिए महत्वपूर्ण कई पूरक अखंडता और जटिल की एकरूपता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया assays थे। इनमें प्रकाश बिखरने, एसडीएस और देशी पृष्ठ पश्चिमी धब्बा और / या फ्लोरोसेंट रंगों के साथ दाग, साथ ही नकारात्मक दाग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा नल एंटीबॉडी का उपयोग कर जांच की। इस के साथ साथ विस्तृत नल विधि में किए गए परिवर्तनों, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए पर्याप्त मात्रा में एक सजातीय जटिल झुकेंगे। विशेष रूप से एक रोकते अतिरिक्त परिवर्तन, अन्य परिसरों के लिए नल विधि करने के लिए किए जाने की जरूरत हो सकती हैएनपी 40 के महत्व के mination।

सारांश में, नल शोधन विधि सफलतापूर्वक संरचनात्मक अध्ययन के लिए उपयुक्त गुणवत्ता का एक यूकेरियोटिक स्रोत से macromolecular परिसर को शुद्ध करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हम एस की शुद्धि के लिए एक उपयुक्त दृष्टिकोण की स्थापना की है cerevisiae U1 snRNP और विस्तार कदम इन परिवर्तनों से कई के लिए औचित्य के रूप में के रूप में अच्छी तरह से लिया। अन्य परिसरों के लिए, हम सुझाव है कि अन्वेषक इसी तरह प्रोटोकॉल है, जो पर्याप्त मात्रा में और जटिल की गुणवत्ता उपज हो सकती है में कदम का पता लगाएं। कदम है कि जांच की जानी चाहिए सेल, नमक और additive प्रकार और डिटर्जेंट सहित सांद्रता, और कैल्शियम और धातु chelator EGTA करने के लिए परिसर की संवेदनशीलता शामिल हैं। इसके अलावा, यह लंबे समय तक अध्ययन है कि जटिल जमे हुए किया जा सकता है और thawed संरचना perturbing बिना के लिए महत्वपूर्ण है। महत्वपूर्ण बात है, एक के दौरान और शुद्धि के बाद कई वैकल्पिक तरीकों परिसर की संरचना की परख के लिए होनी चाहिए। मूल निवासी एकएन डी एसडीएस पृष्ठ, नकारात्मक दाग उन्हें, और प्रकाश बिखरने हमें कैसे एक सजातीय जटिल शुद्ध करने के लिए सबसे अच्छा नल विधि का उपयोग कर के बारे में हमारी जांच में अच्छी तरह से सेवा की है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
S. cerevisiae TAP tagged strain Open Biosystems YSC1177 This is the primary yeast strain used to develop the TAP protocol. Its background is S288C: ATCC 201388: MATa, his3Δ1, leu2Δ0, met15Δ0, ura3Δ0, SNU71::TAP::HIS3MX6
Coffee grinder Mr. Coffee IDS77 Used for cell lysis
Hemocytometer, Bright Line Hausser Scientific 3120 Used to assess cell lysis
JA 9.100 centrifuge rotor  Beckman Coulter, Inc. Used to harvest the yeast cells
JA 20 fixed-angle centrifuge rotor Beckman Coulter, Inc. Used to clear the cell extract of non-soluble cellular material
Ti 60 fixed-angle centrifuge rotor Beckman Coulter, Inc. Used to further clear the soluble cell extract
Thermomixer Eppendorf R5355 Temperature controlled shaker
Novex gel system Thermo Fisher Scientific 
IgG resin GE Healthcare 17-0969-01 Sepharose 6 fast flow
Calmodulin resin Agilent Technologies, Inc. 214303 Affinity resin
Protease inhibitor cocktail, mini tablets Sigma Aldrich 589297 Mini cOmplete ultra EDTA-free tablets
Protease inhibitor cocktail, large tablets Sigma Aldrich 5892953 cOmplete ultra EDTA-free tablets
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) Dissolved in isopropanol
2 ml Bio-spin column Bio-Rad Laboratories, Inc. 7326008 Used to pack and wash the Calmodulin resin
10 ml poly-prep column Bio-Rad Laboratories, Inc. 7311550 Used to pack and wash the IgG resin
Precast native PAGE Bis-Tris gels Life Technologies BN1002 Novex NativePAGE Bis-Tris 4 - 16% precast polyacrylamide gels
NativeMark protein standard Thermo Fisher Scientific LC0725 Unstained protein standard used for native PAGE. Load 7.5 μl for a silver stained gel and 5 μl for a SYPRO Ruby stained gel
Precast SDS PAGE Bis-Tris gels Life Technologies NP0321 Novex Nu-PAGE Bis-Tris 4 - 12% precast polyacrylamide gels 
PageRuler protein standard Thermo Fisher Scientific 26614 Unstained protein standard used for Western blotting
SDS running buffer Life Technologies NP0001 1x NuPAGE MOPS SDS Buffer
TAP antibody Thermo Fisher Scientific CAB1001 Primary antibody against CBP tag
Secondary antibody Thermo Fisher Scientific 31341 Goat anti-rabbit alkaline phosphatase conjugated
BCIP/NBT Thermo Fisher Scientific 34042 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate/nitro blue tetrazolium 
Dialaysis units Thermo Fisher Scientific 88401 Slide-A-Lyzer mini dialysis units
Centrifugal filter units, 100kDa MWCO EMD Millipore UFC5100008 Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane
Detergent absorbing beads Bio-Rad Laboratories, Inc. 1523920 Bio-bead SM-2 absorbants
SYBR Green II Thermo Fisher Scientific S-7564 Flourescent dye for nucleic acid staining, when detecting with SYPRO Ruby present, use excitation wavelength of 488 nm and emission wavelength of 532 nm
SYPRO Ruby Molecular Probes S-12000 Flourescent dye for protein staining, when detecting with SYBR Green II present, use excitation wavelength of 457 nm and emission wavelength of 670 nm
Copper grids Electron Microscopy Sciences G400-CP

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References

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