साइटोसिन का संशोधित रूप संवेदनशील immunohistochemistry का उपयोग की जांच

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Abakir, A., Wheldon, L., Johnson, A. D., Laurent, P., Ruzov, A. Detection of Modified Forms of Cytosine Using Sensitive Immunohistochemistry. J. Vis. Exp. (114), e54416, doi:10.3791/54416 (2016).

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Abstract

Introduction

डीएनए (5mC) में साइटोसिन अड्डों में से मेथिलिकरण रीढ़ ट्रांसक्रिप्शनल मुंह बंद 1 के साथ जुड़े जीनोम में पाया एक प्रमुख epigenetic मार्क का प्रतिनिधित्व करता है। 5mC पेश किया जा रहा है और डीएनए Methyltransferases 2-5 से बनाए रखा है, और जीनोमिक चिन्ह, एक्स गुणसूत्र निष्क्रियता, सेलुलर भेदभाव, और विकास के 3, 6। नतीजतन, के विघटन सहित जैविक प्रक्रियाओं की संख्या में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए दिखाया गया है 5mC जीनोमिक पैटर्न रोगों 7, 8-11 की संख्या के साथ जुड़ा हुआ है। विकास और रोग में 5mC भूमिका को समझने में प्रगति के बावजूद, यह अभी भी काफी हद तक अनजान बने हुए है कि कैसे इस मार्क के विकास और वयस्क ऊतकों में हटाया जा रहा है। डीएनए demethylation के कई संभावित तंत्र हाल ही में 5mC अनुक्रमिक ऑक्सीकरण के उत्पादों को दस-ग्यारह translocation Enzym द्वारा मध्यस्थता की सक्रिय और निष्क्रिय demethylation तंत्र 12, 13, 14, 15 सहित प्रस्तावित किया गया है। डिस्कवरीes (tet1 / 2/3) ऐसे 5-hydroxylmethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC), और में यूकेरियोटिक डीएनए 16, 17, 18, ​​19 के लिए प्रेरित अटकलों 5-carboxylcytosine (5caC) क्या वे के मध्यवर्ती के रूप में सेवा कर सकते हैं के रूप में डीएनए demethylation प्रक्रियाओं या अपने आप 13 में स्थिर रूप में कार्य epigenetic निशान। प्रदर्शन है कि आधार छांटना मरम्मत के घटक, थाइमिन डीएनए glycosylase (TDG) बाँध और डीएनए 19 से दोनों 5fC और 5caC दूर कर सकते हैं, 20 एक सक्रिय डीएनए demethylation में संशोधित 5mC डेरिवेटिव के लिए एक भूमिका पता चलता है। हाल दिखा 5fC / 5caC ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन 29 में इन अंकों की संभावित संलिप्तता के लिए आरएनए द्वितीय Processivity अंक की दर मिलाना कर सकते हैं कि सबूत। 5mC का ऑक्सीकरण रूपों की इस संभावित जैविक महत्व के कारण, जैव रासायनिक और एंटीबॉडी आधारित तकनीकों की एक श्रृंखला उनके जीनोमिक वितरण और वैश्विक सामग्री 16, 19-24 के अध्ययन के लिए नियोजित किया गया है।

यह देखते हुए टी के सबसे किवह कशेरुकी अंगों विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं से मिलकर बनता है और संशोधित साइटोसिन अड्डों में से वितरण ऊतक और सेल प्रकार विशिष्ट है कि 16-18, 20, 23, 25-27, विभिन्न ऊतकों में ऑक्सीकरण 5mC डेरिवेटिव के स्थानिक वितरण का निर्धारण करने में एक महत्वपूर्ण प्रयोगात्मक हो जाता है उनके जैविक कार्यों अनावरण के लिए आवश्यक कार्य है। जैव रासायनिक और एंटीबॉडी आधारित दृष्टिकोण से अधिकांश विभिन्न ऊतकों और सेल-प्रकार में 5mC के संशोधित रूपों के वितरण के बारे में किसी भी स्थानिक जानकारी प्रदान नहीं करते। इसके विपरीत, immunochemistry आधारित तकनीक स्थानिक वितरण और 5mC 28 और उसके ऑक्सीकरण डेरिवेटिव 20 के परमाणु स्थानीयकरण का आकलन करने के लिए एक तेजी से उपकरण प्रदान कर सकते हैं। यही कारण है कि कहा जाता है, माउस जीनोम 18 में 5fC की सूचना बहुत कम बहुतायत (20 हर 10 6 साइटोसिन में) और 5caC (3 हर 10 6 साइटोसिन में) मानक immunochemistry के लिए एक महत्वपूर्ण चुनौती का प्रतिनिधित्व करता है।

यहाँ,हम एक बेहद संवेदनशील immunochemical तरीका है कि मजबूत प्रदान करता है और स्तनधारी मस्तिष्क के ऊतकों में साइटोसिन का ऑक्सीकरण फार्म का एक तेजी से पता लगाने का वर्णन है। peroxidase संयुग्मित माध्यमिक एक संकेत प्रवर्धन कदम के साथ मिलकर एंटीबॉडी को शामिल करके, इस विधि 5fC और 5caC की बहुत कम मात्रा का पता लगाने की चुनौतियों में गतिरोध उत्पन्न। इसके अलावा, इस तकनीक को प्रभावी ढंग से इन epigenetic निशान की जैविक कार्यों elucidating में दूसरे दृष्टिकोण के पूरक वंश विशिष्ट मार्कर के साथ साइटोसिन के सह पता लगाने के संशोधित रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।

Protocol

सभी पशु-शामिल प्रक्रियाओं नॉटिंघम विश्वविद्यालय के नैतिक समीक्षा बोर्ड के अनुसार में प्रदर्शन कर रहे थे।

1. immunostaining के लिए उपयुक्त ऊतक तैयार चयन

  1. जंगली प्रकार CD1 माउस भ्रूण और वयस्क मस्तिष्क के ऊतकों की आयल एम्बेडेड धारा उत्पन्न के रूप में पहले 25 में वर्णित है। मस्तिष्क ऊतक वर्गों या तो 4% formaldehyde (एफए) या ​​विधि 25 immunostaining के लिए 4% paraformaldehyde (पीएफए) के साथ तय प्रयोग करें।
    नोट: आयल एम्बेडेड ऊतक वर्गों के उपयोग एंटीबॉडी लेबलिंग से पहले de-वैक्सिंग की आवश्यकता है। 2 के साथ उपचार के बाद से - 4 एम हाइड्रोक्लोरिक एसिड (एचसीएल) डीएनए अप्राकृतिकरण के लिए प्रोटोकॉल में कार्यरत अधिकांश प्रतिजन पुनर्प्राप्ति रणनीतियों के साथ संगत नहीं है, हम प्रोटीन के साथ 5mC ऑक्सीकरण डेरिवेटिव के सह पता लगाने के लिए या तो cryo- या microtome वर्गों के इस्तेमाल की सिफारिश मार्करों।

2. Dewaxing आयल एम्बेडेड ऊतक वर्गों < / P>

  1. चल रहे एक द्वितीय श्रेणी सुरक्षा कैबिनेट में, xylene, 10 मिनट के लिए 2 बार प्रत्येक आरटी पर से भरा एक Coplin जार में आयल एम्बेडेड ऊतक वर्गों धो लें।
    नोट: यह ताजा xylene का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि अधूरा पैराफिन हटाने असंगत धुंधला पैटर्न को जन्म दे सकता है।
  2. de-वैक्सिंग के बाद, तेजी से 95, 75 में लगातार धोने से ऊतक वर्गों rehydrate, और आरटी पर प्रत्येक 10 मिनट के लिए 50% इथेनॉल।

3. फिक्सेशन और Cryo- और microtome धारा के Permeabilization

  1. आरटी पर 15 मिनट के लिए या तो बर्फ के ठंडे 4% पीएफए ​​या 4% एफए में उन्हें रखने के द्वारा rehydrated ऊतक वर्गों को ठीक करें।
  2. आरटी पर 5 मिनट के लिए पीबीएस में वर्गों (फॉस्फेट बफर खारा) धोने से अतिरिक्त लगानेवाला निकालें।
  3. एक Coplin आरटी पर 30 मिनट के लिए (पीबीएस में 0.5% ट्राइटन X-100) पीबीएक्स के साथ भरा जार में रखकर ऊतक वर्गों Permeabilize। पीबीटी (0.01% बीच 20 पीबीएस में) में शीघ्र ही वर्गों धोने से अतिरिक्त पीबीएक्स निकालें।
jove_title "> 4। Oxi-5mC संजात के लिए Immunostaining

  1. 2 एन एचसीएल में permeabilized वर्गों डीएनए के depurination के लिए आरटी पर 60 मिनट के लिए रखें।
    नोट: हालांकि एचसीएल के उच्च सांद्रता (जैसे, 4 एन) के नेतृत्व में एक अधिक कुशल डीएनए अप्राकृतिकरण करने के लिए, वे DAPI के साथ Oxi-एमसीएस के सह पता लगाने के लिए संगत नहीं हैं।
  2. एचसीएल बेअसर करने के लिए आरटी पर 30 मिनट के लिए 10 मिमी Tris एचसीएल (पीएच 8.5) में वर्गों रखें। वैकल्पिक रूप से, 5 मिनट पीबीएस में से प्रत्येक के लिए वर्गों तीन बार धोएं। आरटी पर 5 मिनट के लिए पीबीटी में वर्गों सेते हैं।
  3. ध्यान से धीरे स्लाइड झटकों से किसी भी कदम पर पूरी तरह से सूखे के लिए ऊतक अनुभाग की अनुमति के बिना ऊतक अनुभाग आसपास के क्षेत्र से तरल को हटा दें। खंड को छूने के बिना खंड घेरना एक हाइड्रोफोबिक बाधा कलम का प्रयोग करें।
    ध्यान दें: हाइड्रोफोबिक बाधा कलम ऊतक दाग और कई वर्गों differen के साथ दाग होने की अनुमति कर सकते हैं आवश्यक एंटीबॉडी की मात्रा कम कर देता हैएक ही स्लाइड पर टी एंटीबॉडी।
  4. एक नम कक्ष में अवरुद्ध समाधान आरटी पर 1 घंटे के लिए (10% गोजातीय सीरम पीबीएस में एल्बुमिन) के 100 μl में वर्गों सेते हैं।
    नोट: यह कदम लंघन संशोधित साइटोसिन ठिकानों धुंधला करने की क्षमता को प्रभावित नहीं करेगा।
  5. माउस मोनोक्लोनल विरोधी 5hmC के 5,000 कमजोर पड़ने और एक 1: एक नम कक्ष में आरटी पर 1 घंटे के लिए समाधान को रोकने में खरगोश पॉलीक्लोनल विरोधी 5caC प्राथमिक एंटीबॉडी के 1,000 कमजोर पड़ने एक 1 के 100 μl में ऊतक वर्गों सेते हैं। वैकल्पिक रूप से, 4 डिग्री सेल्सियस पर रात ऊष्मायन प्रदर्शन अगर जरूरत है।
    ध्यान दें: प्राथमिक एंटीबॉडी के बिना संसाधित वर्गों धुंधला प्रक्रिया के लिए के रूप में उपयुक्त नकारात्मक नियंत्रण सेवा कर सकते हैं। 12.5 दिनों coitum murine भ्रूण मस्तिष्क वर्गों 5caC, 5fC और 5hmC 20 में समृद्ध सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है पोस्ट।
  6. वर्गों पीबीटी से भरा एक Coplin जार में एक सिपाही में प्रत्येक 5 मिनट के लिए तीन बार धोने से अतिरिक्त एंटीबॉडी को दूरआरटी पर लिन जार।
    नोट: समाधान धोने की मात्रा बढ़ाने से पृष्ठभूमि धुंधला कम कर सकते हैं।
  7. अतिरिक्त पीबीटी निकालें और यदि आवश्यक हो, हाइड्रोफोबिक बाधा कलम के साथ फिर से वर्गों घेरना रूप पीबीटी डिटर्जेंट कि हाइड्रोफोबिक बाधा को कमजोर कर सकते हैं शामिल।
  8. बकरी विरोधी खरगोश एचआरपी संयुग्मित एंटीबॉडी के 400 कमजोर पड़ने और एक 1: समाधान को रोकने में गधा विरोधी माउस 555 संयुग्मित एंटीबॉडी के 400 कमजोर पड़ने एक 1 बनाओ।
  9. एक नम कक्ष में आरटी पर 1 घंटे के लिए कदम 4.9 से माध्यमिक एंटीबॉडी मिश्रण के 100 μl में ऊतक वर्गों सेते हैं।
  10. आरटी पर 5 मिनट प्रत्येक के लिए पीबीटी तीन बार से भरा एक Coplin जार में ऊतक वर्गों को धो लें।
  11. tyramide संकेत प्रवर्धन बफर में tyramide के 200 कमजोर पड़ने आरटी पर 2 मिनट के लिए एक 1: के 100 μl में ऊतक वर्गों रखें।
  12. इसके तत्काल बाद, स्लाइड पीबीटी में प्रत्येक 5 मिनट के लिए तीन बार धोने से अतिरिक्त tyramide समाधान निकालने।
  13. carefully एक बढ़ते मध्यम की एक बूंद के साथ अतिरिक्त पीबीटी हटाने और तुरंत कवर वर्गों (देखें सामग्री सूची)।
  14. धीरे ऊतक वर्गों पर एक coverslip जगह और तुरंत नेल पॉलिश के साथ coverslip सील।
  15. सूक्ष्म परीक्षण से पहले कई घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ऊतक वर्गों स्टोर। (- 40x बढ़ाई 10) 405, 488 और / या 555 एनएम पर एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के नीचे की जांच करना।

Representative Results

मस्तिष्क ऊतक वर्गों में 5hmC का वितरण निर्धारित करने के लिए, हम बाद mitotic न्यूरॉन्स, NeuN के लिए एक मार्कर के साथ इस epigenetic संशोधन के सह-खोज प्रदर्शन किया, वाणिज्यिक विरोधी 5hmC एंटीबॉडी कि विशेष रूप से इस निशान के साथ सूचना का आदान प्रदान, लेकिन रोजगार नहीं संशोधित के अन्य रूपों के साथ साइटोसिन 20, 25। वयस्क मस्तिष्क में 5hmC और 5caC वितरण के Immunohistochemical विश्लेषण से पता चला है कि जबकि प्रमुख 5hmC धुंधला NeuN सकारात्मक कोशिकाओं के साथ सह-localizes, NeuN नकारात्मक glial कोशिकाओं जीनोमिक 5hmC (चित्रा 1) 20 के निचले स्तर के अधिकारी।

हमने हाल ही में पता चला है कि Tet-निर्भर 5mC ऑक्सीकरण न्यूरल स्टेम सेल (एनएससी) 20 के वंश विनिर्देश दौरान ऑपरेटिव है। एनएससी में immunochemically undetectable होने के बावजूद, 5fC और 5caC न्यूरोनल एक ओर एनएससी भेदभाव के प्रारंभिक चरणों में प्रमुख immunostaining का प्रदर्शन एन डी glial प्रजातियों। इन दोनों के निशान क्षणिक जल्दी neuronal और glial भेदभाव 20 के मार्कर की उपस्थिति के साथ समवर्ती जमा। एनएससी हम glial भेदभाव की प्रेरण के 3 दिन में एनएससी की अचल संस्कृतियों पर एक glial मार्कर GFAP के साथ इस मार्क के सह-धुंधला प्रदर्शन फर्क में 5caC का वितरण निर्धारित करने के लिए। एनएससी या परिपक्व astrocytes में विपरीत (डेटा) नहीं दिखाया है, हम इन संस्कृतियों में GFAP व्यक्त कोशिकाओं (चित्रा 2) 20 के अपेक्षाकृत बड़े अनुपात में मजबूत 5caC संकेत मनाया।

आकृति 1
चित्रा 1. 5hmC वयस्क मस्तिष्क ऊतक DAPI (नीला) के साथ counterstained में साथ NeuN (लाल) (हरा)। अलग-अलग चैनलों और विलय देखने के सह-immunostaining दिखाए जाते हैं। स्केल सलाखों 25 माइक्रोन कर रहे हैं।blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा Glial भेदभाव के दिन 3 पर एनएससी की संस्कृति में GFAP साथ 5caC 2. सह-immunostaining। अलग-अलग चैनलों और विलय दृश्य दिखाए जाते हैं। स्केल सलाखों 20 माइक्रोन कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

हालांकि 5mC ऑक्सीकरण डेरिवेटिव, 5fC और 5caC कुछ ऊतकों में की सूचना कम बहुतायत एक मानक immunochemistry प्रोटोकॉल के लिए महत्वपूर्ण सीमाओं को प्रस्तुत करेंगे, peroxidase संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के समावेश तय ऊतकों और कोशिकाओं में इन साइटोसिन संशोधनों का पता लगाने के लिए अनुमति (चित्रा 2) । हालांकि, tyramide समाधान के साथ इष्टतम ऊष्मायन समय tyramide संकेत प्रवर्धन किट जहां संकेत तीव्रता और tyramide आधारित संकेत प्रवर्धन की अवधि के बीच एक रैखिक संबंध मनाया जाता है जानकारी के लिए, के प्रत्येक व्यक्ति बैच के लिए प्रयोगात्मक अनुकूलित किया जाना चाहिए अल्मीडा एट अल को देखें। 2012 26 । इसके अलावा, संकेत / पृष्ठभूमि अनुपात काफी अतिरिक्त एंटीबॉडी के कुशल हटाने की अनुमति के लिए एक Coplin जार में washes ले जाने से बढ़ाया जा सकता है। tyramide समाधान के साथ ऊष्मायन के बाद, यह महत्वपूर्ण है तुरंत घ पीबीटी समाधान में धोने से प्रतिक्रिया को रोकने केecrease पृष्ठभूमि धुंधला। यह वर्गों प्रक्रिया के दौरान किसी भी बिंदु पर सुखाने के लिए अनुमति देने के लिए महत्वपूर्ण नहीं है।

डीएनए depurination की दक्षता में 37 डिग्री सेल्सियस पर depurination प्रतिक्रिया से बाहर ले जाने से सुधार किया जा सकता है। 4 एन एचसीएल के बजाय 2 का उपयोग करते समय एन के रूप में यह डबल असहाय डीएनए के साथ विशेष रूप से सूचना का आदान प्रदान, डीएनए depurination के लिए 4 एन एचसीएल का उपयोग कर DAPI के साथ सह-धुंधला अनुमति नहीं होगी 5mC के संशोधित रूपों का धुंधला बढ़ाता है।

हालांकि इस तकनीक साइटोसिन ठिकानों जहां पहचाने जाने का संशोधित रूप से मजबूत अर्द्ध मात्रात्मक आकलन प्रदान कर सकते हैं, यह 5mC या उसके ऑक्सीकरण डेरिवेटिव के पूर्ण स्तर के मूल्यांकन के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है। इसलिए, हम अन्य पूरक के उपयोग की सलाह देते हैं लेकिन मात्रात्मक 16, 19 -24 दृष्टिकोण। स्तनधारी जीनोम में 5mC ऑक्सीकरण डेरिवेटिव की खोज के बाद से, कई दृष्टिकोण उनके जैविक भूमिकाओं 16, 19-24 अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है। इन approa यद्यपिटांके 5mC ऑक्सीकरण डेरिवेटिव के पूर्ण स्तर का निर्धारण करने में महत्वपूर्ण हो सकता है, वे अपने स्थानिक वितरण 20, 26 के विषय में जानकारी प्रदान नहीं करते। हम सफलतापूर्वक विधि यहाँ वर्णित का इस्तेमाल किया है विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं में स्थानिक वितरण और 5mC ऑक्सीकरण डेरिवेटिव के स्थानीयकरण नक्शा करने के लिए विकासशील और वयस्क मस्तिष्क 20 की

उनके स्थानिक वितरण 20 खुलासा करके, इस तकनीक का जैविक प्रभाव और विभिन्न जैविक संदर्भों में 5mC का ऑक्सीकरण डेरिवेटिव जहां 5mC के इन संशोधित डेरिवेटिव सेलुलर भेदभाव, विकास और रोग सहित पाया जा सकता है के भाग्य को समझने के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है। इसके अलावा, विधि हम यहाँ वर्णन tyrami के साथ अलग अलग ऊष्मायन समय पर peroxidase प्रतिक्रिया के कैनेटीक्स (जो धुंधला तीव्रता के लिए आनुपातिक है) का आकलन करने से विभिन्न ऊतकों में 5mC का ऑक्सीकरण डेरिवेटिव के अर्द्ध मात्रात्मक आकलन दे सकते हैंडी 26।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Coplin jar Cole-Parmer UY-48585-30 Glass made
Xylene Use only in Class II safety cabinet
Phosphate buffer saline (PBS) Fisher Scientific 12821680 pH 7.5, filtered before use
4% paraformaldehyde (PFA) Sigma Aldrich P6148 Once made can be stored at -20 °C in aliquotes for several months
4% formaldehyde  (FA) Sigma Aldrich F8775 Once made can be stored at -20 °C in aliquotes for several months
Ethanol, anhydrous denatured, histological grade Sigma Aldrich 64-17-5 95, 75, 50% in PBS
0.01% Tween 20 in PBS Sigma Aldrich P9416 PBT
0.5% Triton X-100 in PBS Sigma Aldrich X100 PBX
2 N HCl Sigma Aldrich 71826 caution extremely toxic
100 mM Tris-HCl  Promega H5121 pH adjusted to 8.5
hydrophobic barrier pen Abcam ab2601 for immunohistochemistry
Slide moisture chamber Scientific Device Laboratory 197-BL
anti-5mC mouse antibody Diagenode C15200081 monoclonal primary antibody
Anti-5hmC antibody Active Motif 39791 rabbit polyclonal primary antibody
Anti-5caC antibody Active Motif 61225 rabbit polyclonal primary antibody
Peroxidase-conjugated anti-rabbit seconday antibody Dako K1497
555-congjuated goat anti-mouse antibody Molecular probes A-11005  secondary antibody
10% BSA Sigma Aldrich A9418 Blocking solution
22 x 32 mm Glass cover slips BDH 406/0188/24
Tyramide Signal Amplification System Perkin Elmer NEL741001KT Other fluorochome conjugated seconday antibodies can be used for co-detection of oxi-5mC 
 Mounting Medium with DAPI Vector Labs H-1200
Colourless nail polish
chicken polyclonal anti-GFAP polyclonal antibody Thermo Scientific PA5-18598 1:400 dilution
anti-NeuN mouse monoclonal antibody Merck milipore MAB377B 1:400 dilution

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References

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