RGD功能化水凝胶作为治疗应用的工具合成

Bioengineering

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Mauri, E., Sacchetti, A., Rossi, F. The Synthesis of RGD-functionalized Hydrogels as a Tool for Therapeutic Applications. J. Vis. Exp. (116), e54445, doi:10.3791/54445 (2016).

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Abstract

Introduction

水凝胶是由亲水性的交联的聚合物,它们是天然或合成的,并且其特征在于,一个独特的三维结构形成的三维网络。这些设备是在药物递送,组织工程,基因的载体和智能传感器1,2的生物医学领域越来越有吸引力。事实上,它们的高水含量,以及它们的流变学和机械性能使之适合候选模拟软组织的微环境,使它们有效工具水溶性细胞因子或生长因子的递送。其中最有希望采用的是作为可注射生物材料携带细胞和生物活性化合物。水凝胶可以通过保持并在生理相关的方式精确地递送干细胞调节信号提高细胞存活和控制干细胞的命运,如在体外体内实验3,4-观察。这样做的主要优点是有可能保持接种(原位 )的区域内注射的细胞,减少细胞的叶面积和extravasates进入循环系统洪流,迁移遍布全身,失去靶目标5的量。三维水凝胶网络的稳定性是由于其交联位点,由聚合物链6之间的共价键或内聚力形成。

在此框架下,正交选择的化学品适用于聚合物链能够提高水凝胶演出7的多功能工具。事实上,用适当的化学基团的聚合物的改性可以帮助提供适当的化学,物理和机械性能,以提高细胞生存力以及它们在组织形成使用。以相同的方式,这些技术中以加载细胞或生长因子的凝胶基质中,使用了含RGD肽允许在细胞粘附和存活的改善。 RGD是由三肽精氨酸,甘氨酸和天冬氨酸,这是迄今为止的最有效和最经常使用的三肽,由于其处理多于一个细胞粘附受体的能力和对细胞锚定,行为和生存8,9-其生物学影响。在这项工作中,RGD官能水凝胶的合成进行了研究与设计网络的一个热情细胞微环境特征在于足够的生化特性的目的。

在水凝胶的合成使用微波辐射提供了一个简单的过程,以减少副反应,并在比常规热过程10更短的时间周期得到较高的反应速率和产率。此方法不需要纯化步骤和产量的无菌水凝胶由于聚合物之间的相互作用,并在反应系统11不存在有机溶剂。因此,它可以确保链接到聚合物网络,因为没有模RGD的高百分比ifications需要参与凝胶形成的聚合物的化学基团。羧基,由PAA与卡波姆和羟基,由PEG和琼脂糖,通过缩聚反应产生的水凝胶三维结构。所提到的聚合物可用于水凝胶在脊髓损伤的修复治疗12的合成。这些设备,如报告以前的作品13,14,显示出高生物相容性,以及类似于那些生活的许多组织和触变性质的机械和物理化学性质。此外,它们在原位保持局限性,在注射区域。

在这项工作中,PAA的羧基与炔部分修改( 图1),和一个RGD叠氮化物化合物合成用的结构(CH 2)N利用该三肽末端基团-NH 2的反应与制备化学化合物- N 3(<STRONG>图2)。随后,将改性的PAA通过CuAAC点击反应15-17( 图3)的RGD-叠氮化物衍生物进行反应。使用铜(I)催化剂的导致在这两个反应速率和区域选择性的重大改进。该CuAAC反应被广泛用于有机合成和在聚合物科学。它结合了高效率和高耐受性的官能团,并且它是通过使用有机溶剂的影响。高选择性,快速的反应时间和简单的纯化过程允许星形聚合物,嵌段共聚物或链接枝所需部分18的获得。此点击策略使得能够修改聚合物聚合后根据最后的生化应用定制的物理化学性质。所述CuAAC实验条件容易再现(反应不敏感,水,而可以最低限度发生铜氧化),和的性质形成三唑确保了产品的稳定性。使用铜金属可以被认为是一个临界点时,由于对细胞的潜在毒性作用,并在生物微环境,但透析用作纯化方法,以允许完全除去催化剂残留物的。最后,PAA改性RGD在水凝胶的合成( 图4),将所得网络的物理化学性质使用进行了研究,以检查这些系统如细胞或药物载体的潜在功能。

图1
图1:PAA改性炔合成炔基官能PAA的方案 “N”表示与羧基与炔丙基反应的单体。 请点击这里查看一个更大的版本这个数字。

图2
2:。RGD- 叠氮合成 RGD-叠氮衍生物的合成请点击此处查看该图的放大版本。

图3
图3:点击反应 RGD-叠氮衍生物和炔PAA之间的点击反应方案 请点击此处查看该图的放大版本。

图4
图4:水凝胶SYNThesis。RGD功能化水凝胶合成过程。 请点击此处查看该图的放大版本。

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Protocol

注:按照来文中使用的化学品。线性RGD购买,但是它可以通过标准Fmoc固相肽合成16,19来制备。溶剂是分析纯。透析需要与男截止等于3500大使用膜。所合成的化合物的特征在于记录在400MHz分光计使用氯仿1 H NMR谱(CDCL 3)或氧化氘(D 2 O)作为溶剂,和化学位移被报告为每百万份δ值。此外,水凝胶使用KBr压片技术进行FT-IR分析和他们的物理特征包括使用倒置试管在37℃下评估凝胶化的研究。

1. 4- Azidobutanoyl合成氯化物1

  1. 在10ml二氯甲烷和0.5ml二甲基甲酰胺溶解500毫克的4- azidobutanoic酸(3.90毫摩尔)。
  2. 冷却该溶液在0℃下,使用冰浴。
  3. 添加505微升草酰氯(5.85毫摩尔)至5毫升二氯甲烷中,并缓慢加入滴加至反应体系中,同时搅拌。
  4. 用冰浴于0℃1小时后,返回到室温。
  5. 除去用旋转蒸发器在减压下除去溶剂。
  6. 通过1 H-NMR谱表征所得产物,在CDCl 316的样品溶解。

2. RGD的叠氮化物衍生物2的合成

  1. 在1ml的1M NaOH中溶解50毫克RGD的(0.145毫摩尔)。
  2. 在2ml四氢呋喃中溶解的1(0.16毫摩尔)24毫克。
  3. 用冰浴的所有RGD溶液添加到溶液1中滴加在0℃。
  4. 返回到室温并搅拌过夜。
  5. 加入1ml的1M HCl。
  6. 除去用旋转蒸发器在减压下除去溶剂。
  7. 表征OBTained通过1 H-NMR光谱法的产品,将样品溶解在D 2 O中16。

3. PAA炔修改3

  1. 溶解200毫克的35%w / w的在15毫升的蒸馏水中的PAA溶液(2.8毫摩尔)。
  2. 加入15.4毫克盐酸炔丙基胺(0.20毫摩尔)的。
  3. 1体积/体积乙腈:14毫升1溶解42.8毫克1-羟基苯并三唑水合物的三唑(HOBt,0.28毫摩尔)通过加热蒸馏水溶液至50℃。
  4. 添加所有的HOBt解决方案,以解决PAA在室温下。
  5. 53.6毫克ethyldimethylaminopropylcarbodiimide的(EDC,0.28毫摩尔)添加到反应混合物中。
  6. 使用的1M HCl以调节pH至5.5,并过夜搅拌该反应体系在室温下。
  7. 透析溶液。溶解11.2克氯化钠于2L蒸馏水,然后添加37%0.2毫升w / w的盐酸。利用透析膜与男 3.5 kDa的的截止解决方案。
  8. PERFORM透析三天。每日用2L含有0.2毫升37%w / w的盐酸新制备的蒸馏水的改变透析溶液。
  9. 储存在-80℃的最终解决方案。根据制造商的协议在冻干机冻干它。
  10. 通过1 H-NMR谱表征官能化聚合物,在D 2 O中16中的样品溶解。

4. PAA-RGD的合成聚合物4

  1. 溶解78毫克PAA的10毫升蒸馏水改性炔3(1.083毫摩尔)。
  2. 在5毫升四氢呋喃溶解25毫克RGD叠氮化物2衍生物(0.0722毫摩尔)的。
  3. 所有RGD溶液添加到聚合物溶液中。
  4. 添加2.2毫克的碘化铜(0.0116毫摩尔)和2.2毫克抗坏血酸钠(0.0111毫摩尔)的。
  5. 回流所得混合物过夜,在60℃,同时搅拌。
  6. 冷却该混合物至25℃。
  7. DialyzË解决方案。溶解11.2克氯化钠于2L蒸馏水,然后添加37%0.2毫升w / w的盐酸。利用透析膜与男 3.5 kDa的的截止解决方案。
  8. 三天进行透析治疗。每日用2L含有0.2毫升37%w / w的盐酸新制备的蒸馏水的改变透析溶液。
  9. 储存在-80℃的最终解决方案。根据制造商的协议在冻干机冻干它。
  10. 通过1 H-NMR谱表征所得产物,在D 2 O中16中的样品溶解。

5. RGD功能化合成水凝胶

  1. 准备PBS。溶解645毫克的PBS盐在50毫升的蒸馏水。
  2. 混合40毫克卡波姆和9毫升PBS(步骤5.1)的10毫克官能PAA 4,在室温下,直至完全溶解(30分钟)。
  3. 400毫克的PEG添加到该溶液中,并保持搅拌45分钟。
  4. 停止搅拌并允许系统沉降30分钟。
  5. 使用的1N NaOH以调节pH至7.4。
  6. 到5ml所获得的混合物中,添加25毫克琼脂糖粉末。
  7. 照射微波辐射系统在500瓦至沸腾,一时间通常为30秒和1分钟之间,并且电磁加热至80℃。
  8. 离开暴露于室温下将该混合物直到其温度降低至50℃,加入5毫升的PBS(步骤5.1)的,以便获得在一个1的溶液:1体积比。
  9. 准备12多孔板含钢瓶用直径1.1厘米
  10. 就拿从溶液500微升等分,并将它们放置到每个钢瓶。
  11. 离开休息45分钟,直至系统完全凝胶化。
  12. 除去使用不锈钢镊子以获得水凝胶的圆柱体。

6.装载的治疗手段(药物或细胞)

  1. 重复ST每股收益5.1-5.7。
  2. 当混合物(已经在溶胶状态)达到37℃,加入5毫升含有所需药物溶液或细胞培养物的溶液中,以便在一个1以获得最终系统:1的体积比。
  3. 重复步骤5.9-5.12以获得与凝胶内的物理包埋biocompounds聚合物网络。

7.水凝胶表征

  1. FT-IR分析
    1. 后形成凝胶,泡的原料合成的水凝胶中的一个在2.5ml蒸馏水中24小时。
    2. 除去,其中水凝胶浸入水性介质和冷冻干燥液体N 2。
    3. 根据KBr压片技术层压水凝胶样品。
      1. 添加铲满溴化钾到玛瑙研钵。取的水凝胶样品的少量并用溴化钾粉末混合(KBr压量,或者仅仅足以覆盖刮刀的尖端约0.1-2%)。
      2. 研磨混合物直到粉末细而均匀。</ LI>
      3. 使用KBr压片盒,以形成红外沉淀。按使用手动实验室按粉末:在压力容量等于5吨,然后进行3分钟,在10吨压力容量3分钟。
      4. 释放压力,得到最终的沉淀为均质和透明的外观。将粒料进红外样本保持器,并运行的频谱16。
  2. 凝胶研究
    1. 填充2ml微量管900微升的PBS并平衡至37℃。
    2. 添加100微升制备的聚合物溶液,以形成水凝胶,并在37℃下孵育。
    3. 倒置该管,并且如果凝胶在1,2,5,10和20分钟流向观察。记录在其中凝胶不流动的凝胶化的时间。

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Representative Results

的PAA炔衍生物有效地从聚丙烯酸和炔丙胺合成,如在1,其中n标签的羧基与胺反应的单体显示。该产物的身份通过1 H-NMR光谱法证实。 图5示出了具有三键改性的PAA的1 H-NMR谱。

图5
5:1 的PAA的H-NMR谱修改炔相关炔部分的信号被突出显示 请点击此处查看该图的放大版本。

聚合物链的信号可以在范围2.75-1.50 ppm的观察;而在2.8的峰值 0ppm的,有代表性的炔之H,并在4.20 ppm的峰,关系到-CH 2的2H,表征炔丙基部分。这证实了PAA已经被适当修改。炔官能化程度的评价已被下PAA峰积分的面积进行了(设置为3.00,根据每单体的氢的数目)和炔丙基结构部分,如在图5中示出。官能f的程度是计算公式如下:

方程

方程代表炔丙基残基的积分面积,炔的H区的总和(标记为方程 )及-CH 2区域(表示为方程 ),而离子“SRC =”/文件/ ftp_upload / 54445 / 54445eq5.jpg“/>指的是聚合物的信号的积分面积。官能度被计算为10%,它按水凝胶的合成,其中是考虑令人满意PAA具有穿过其剩余的羧基反应以形成三维网络。对于改性聚合物16得到定量产率。

以类似的方式, 图6示出了炔改性的PAA和RGD叠氮化物之间的CuAAC点击反应后的产物的1 H-NMR谱。在8.15 ppm的形成三唑的峰证实,发生在定量产率的反应和RGD强烈链接到PAA链。 图6示出所有的PAA链和RGD的特征信号。

图6
图6:含RGD的 1 H-NMR谱 挂PAA。三唑的信号表示(标记为“A”)。执行通过CuAAC点击反应RGD聚合物功能化。 请点击此处查看该图的放大版本。

RGD官能水凝胶是通过四个聚合物(PAA,卡波姆,琼脂糖和PEG)通过微波辅助自由基聚合的化学交联来制备。加热到80℃导致较高的大分子的移动性,并因此提高了聚合物的羧基和羟基之间的短距离的互连。酯化反应将这些官能团之间发生并产生本地网络被称为“微凝胶”。

作为缩聚的进行,连续系统的粘度增加,WHILE相互作用的大分子活性位点之间的概率减小。然而,更近的官能团仍有效地进行交互,由于较慢的流动性。所得的物理化学条件的特征在于产生水凝胶的最终三维宏观微粒凝胶表面之间的“焊接”。酯化,氢键和羧化带来聚合物链具有统计学接近,因此形成一个稳定的非均相结构。由此产生的系统表现出的溶胶/凝胶行为,并过渡到凝胶状态5分钟之内。该时间间隔记录为凝胶时间。

含RGD官能水凝胶的化学性质进行了研究使用FT-IR分析。 图7示出了RGD叠氮化物化合物的红外光谱(绿线),无RGD官能(黑线)中合成的水凝胶之间的比较,以及用肽修饰(蓝线)的水凝胶。水凝胶规范TRA都特点是在3,600-3,200厘米宽信号-1范围,代表性的残余OH键的伸缩振动,并通过围绕2940厘米-1 CH拉伸的峰。该酯化羧基和羟基的聚合物组之间发生的验证是由峰约1600 -1 1400 -1给出,分别对应,对对称和非对称伸缩 CO 2部分的。这些峰中的非官能化的水凝胶的频谱更为明显,而在RGD-凝胶光谱它们部分地被表示为酰胺频带I和II的信号覆盖。

图7
图7:FT-IR光谱比较 RGD(绿线)的FT-IR光谱,水凝胶不RGD功能化(黑线)和RGD功能化水凝胶(蓝线)。该有关酰胺RGD指示信号。 请点击此处查看该图的放大版本。

C的拉伸= O,标记为酰胺频带I(“酰胺I”,在图7中 ),提供于1650 -1的峰的三肽谱和它移位到约1670厘米-1的RGD-水凝胶样品在。的NH的弯曲,( 图7中“酰胺Ⅱ”)与酰胺频带II,可以与信号记录周围1550厘米-1在RGD光谱,它也是将水凝胶样品中可识别的,在约1600厘米3 - 1。因为有在标准的水凝胶制剂没有酰胺组件,一个酰胺基性质的峰的存在表明PAA真的官能与含RGD和它能够形成与聚合物网络内肽位点的水凝胶。

水凝胶的FT-IR光谱也显示了琼脂糖的单糖单元和酯基之间的相关糖苷键的COC的伸缩振动的峰(900-1,000 -1范围内)。

以获得洞察三维结构和这些水凝胶的物理和机械性能,SEM分析,凝胶化,溶胀动力学和流变研究被执行,如在先前的工作13,20讨论。 SEM分析( 图8)表明,水凝胶的特征是复杂的微观结构与包含小孔隙孔壁上一些较大的孔和一些纤维状的网络。此外,大多数的孔隙互连。缠结结构类似于以相同的方式,但没有RGD官能制备水凝胶的三维网络。这表明,RGD不改变聚合物网络。使用倒置试管试验中,水凝胶小号在5分钟内充分凝固,如在水凝胶样品中观察到的无RGD官能21。这个简短的凝胶时间强调其生物医学应用的适用性。

图8
图8:。SEM分析 SEM图像显示了RGD功能化的凝胶样品(A)和无功能化(B)水凝胶的形态,请点击此处查看该图的放大版本。

溶胀平衡比表示吸收和保留大量的水的能力,这是水凝胶系统20,22的前端的功能之一。分析样品表现出快速膨胀动力学和他们到达的第一个小时内膨胀平衡。他们的膨胀ING均衡值Q被报道在我们以前的工作16,它是类似于无RGD通过水凝胶的分析而得到的值,在确认三肽集成与聚合物网络,并且不产生高妨碍凝胶化过程。

与流变研究,凝胶储能模量(G')被发现是大约一比损耗模量(G'')更高量级,表示弹性,而不是粘性材料23和两个基本上独立于频率。 G'和G''类似的值记录没有修改肽16凝胶样本。这表明,RGD的聚合物网络内的存在不影响所述材料的流变性能,并保持特有特征争相注射系统用于生物医学应用。

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Acknowledgements

作者要感谢毛里齐奥教授马西的富有成果的讨论和小姐基娅拉阿莱格雷蒂语言编辑。作者的研究是由阪乔瓦尼Ricercatori 2010部(Ministero della Salute的GR-2010- 2312573)的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly(acrylic acid) solution average Mw ~100,000, 35 wt% in H2O Sigma Aldrich 523925 CAS 9003-01-4
Poly(ethylene glycol) 2,000 Sigma Aldrich 84797 CAS 25322-68-3
Carbomeer 974P Fagron 1387083
Agarose  Invitrogen Corp. 16500-500 UltraPure Agarose
RGD peptide abcam ab142698
4-azidobutanoic acid Aurum Pharmatech Z-2421  CAS 54447-68-6
Oxalyl chloride Sigma Aldrich O8801 CAS 79-37-8
Propargylamine hydrochloride 95% Sigma Aldrich P50919 CAS 15430-52-1
Copper(I) iodide Sigma Aldrich 3140 CAS 7681-65-4
Sodium ascorbate Sigma Aldrich Y0000039 CAS 134-03-2
Phosphate buffered saline Sigma Aldrich P4417
Dialysis Membrane Spectrum Laboratories, Inc. 132725 Spectra/Por 3 Dialysis Membrane  Standard RC Tubing
MWCO: 3.5 kD

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