디지털 홀로그램 현미경과 복합 양적 위상 이미징 정확하게 장내 염증과 상피 상처 치유를 평가

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Lenz, P., Brückner, M., Ketelhut, S., Heidemann, J., Kemper, B., Bettenworth, D. Multimodal Quantitative Phase Imaging with Digital Holographic Microscopy Accurately Assesses Intestinal Inflammation and Epithelial Wound Healing. J. Vis. Exp. (115), e54460, doi:10.3791/54460 (2016).

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Abstract

즉, 염증성 장 질환의 발생 빈도는, 크론 병과 궤양 성 대장염은 상당히 지난 10 년간 증가했다. IBD의 원인은 알 수없는 남아 있고 현재 치료 전략은 면역 시스템의 불특정 억제를 기준으로합니다. 특히 현저 IBD의 관리를 향상시킬 수있는 장내 염증과 상피 상처 치유를 표적 치료의 개발은, 그러나 이것은 염증성 변화의 정확한 검출을 필요로한다. 현재 잠재적 인 약물 후보는 일반적으로 생체 내 또는 시험 관내 세포 배양 기술을 기반으로, 동물 모델을 이용하여 평가된다. 조직 학적 검사는 일반적으로 샘플 특성을 변경할 수 있으며, 또한, 연구 결과의 해석은 연구자의 전문성에 따라 다를 수있는 세포 또는 관심의 조직 염색 할 필요합니다. 디지털 홀로그램 현미경 (DHM)는 광로 길이 지연의 검출에 기초하여 허용얼룩없는 양적 위상차 영상. 이 결과는 직접적으로 절대 생 물리적 파라미터와 상관 될 수있다. 우리는 굴절률 측정을 기반으로 DHM와 조직 밀도의 변화 측정, 대장염 쥐와 인간의 대장 조직 표본의 다른 레이어에, 염색하지 않고, 염증성 변화를 정량화하는 방법을 보여줍니다. 또한, 우리는 건조 중량 및 마이그레이션 세포의 층 두께로 부상 면적과 형태 학적 매개 변수의 동시 결정 간단한 자동 결정을 통해 DHM을 사용하여 체외 가능 상피 상처 치유의 연속 복합 라벨없는 모니터링을 보여줍니다. 결론적으로, DHM은 가치, 소설, 양적 도구 가능한 매개 변수에 대한 절대 값과 장 염증의 평가, 시험관 내에서 상피 상처 치유의 단순화 정량을 나타내고, 따라서 번역 진단 유 높은 잠재력을 가지고있다그 자체.

Introduction

염증성 장 질환 (IBD), 궤양 성 대장염 (UC) 및 크론 병 (CD)은 위장관 (1)의 특발성 염증성 질환이다. IBD의 기본 병태 생리 및 잠재적 신약 또는 새로운 진단 방법의 평가에 대한 연구는 특히 중요하다. 모두 기초 연구 및 IBD 환자의 임상 관리에서, 장 점막 관심 2,3의 초점이되었다. 점막은 공생 박테리아, 상피 세포 및 장 면역계의 다양한 세포 구성 요소 간의 상호 작용을 직감 4,5 항상성 조율하는 해부학 적 경계를 나타낸다. 그러나, IBD 환자, 조절되지 않는 영구 장 염증은 결국 자체가 지역의 염증 (6)을 악화 상피 장벽 기능의 고장 절정에 달하다 수 있습니다 궤양이나 협착 등의 검출 손상, 점막 연결됩니다.

7 일 후 위장관 궤양 또는 문 합부 누출의 치유의 핵심 요구 사항입니다 상처. 상피는 치유 검정 치료 시험 관내 상처 시뮬레이션 장내 염증 8,9의 뮤린 모델 수 권취.시험 관내생체 내 접근법 실험 평가의 정확성을 제한하는 문제점을 가지고있다. 시험관 분석법을 고전 스크래치 분석처럼 형광 발색단와 장기화 염색 절차 또는 형질 전환이 필요합니다. 이들은 종종 10을 자동화 할 수없는 세포 증식 및 이동의 그 불연속 모니터링에 의해 제한된다. 이러한 덱스 트란 황산나트륨 (DSS)에 의해 유도 성 대장염과 같은 생체 내 모델을 자주 인해 나타나는 심각한 변화에 부분적으로 강력한 리드 아웃 부족 실험실 마커에, 엄마부적절한 왕 같은 마커는 대장염 심각도 11, 12을 평가한다. 염증 점막의 조직 학적 분석은 여전히 현재 대장염의 심각도를 결정하는 가장 유효한 방법이지만이, 시험 관내 상피 창상 치유의 분석처럼, 염색을 필요로하고 연구자의 ​​전문성 (13)에 따라 달라집니다.

최근 디지털 홀로그램 현미경 (DHM) 정량적 인 위상 현미경 (14)의 변형이 시험 관내 및 생체 15 상피 상처 치료의 평가에 유용한 도구로 확인되었다. DHM은 (OPD)의 광로 길이의 지연을 측정함으로써 조직 농도의 평가를 허용 어느 전망 소설 암 진단 16 ~ 18과 염증 관련 조직 변화 (19)의 정량화. 또한, DHM은 셀 두께, 셀 커​​버 표면적 세포 (단백질) 함량의 양을 측정함으로써 세포 형태 역학의 모니터링을 허용 생체 외 분석에서, DHM은 생리 학적 과정, 예를 들면, 세포 부피 및 두께 (21, 22)의 변화를 평가함으로써 셀룰러 투수의 분석을 가능하게한다. 또한, DHM 측정 조사원 관련된 샘플 바이어스를 방지하는 자동화 될 수있다.

여기서는 장내 염증의 뮤린 모델 DHM의 사용을 설명하고, 또한, 라벨없는 시험 관내 분석과 같은 상처 치유 정량적 모니터링 인체 조직 시료의 분석을 적용 DHM. 첫째, 우리는 IBD와 인간의 대장염 마우스 및 조직 섹션에서 다른 대장 벽 층의 염증 변화를 평가한다. DHM 정량적 위상 촬상 절차를 기술 한 결과 취득한 정량적 위상 이미지에 대한 평가를 설명도 현미경 성분, 조직 절편의 제조 및 사용에 대한 자세한 설명을 제공한다.

다음으로, DHM은 요로 감염 될 수 있다는 것을 보여시험관 내에서 상피 상처 치유 복합 지속적인 모니터링하게 안정적 및 세포 막 두께, 건조 질량 및 부피 등 셀룰러 세포의 특성 분석을 서술 약물 유도 세포 생리적 변화에 대한 통찰력을 제공한다.

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Protocol

모든 동물 실험은 독일어 동물 보호법에 따라 지역 윤리위원회합니다 (Landesamt 대 투르, UMWELT 싶게 Verbraucherschutz, LANUV, 독일)에 의해 승인되었다. 뮌스터 대학의 지역 윤리위원회는 조직 학적 및 현미경 분석을위한 인체 조직의 사용을 승인했다.

1. 동물 및 재료

  1. 지역 동물 보호 법률에 따라 여성 또는 20g (25)에 무게 필요한 DSS 감수성 균주의 수컷 마우스, 집을 사용합니다. 설치류 특별한 차우을 제공하고, 임의 량의 물을 마시는 멸균.
  2. 멸균 된 수돗물 5 일 : 덱스 트란 황산 나트륨 (36,000-50,000 다 DSS, 분자량) V / 승 3 %를 투여하여 급성 DSS 대장염을 유도한다.
    참고 : DSS의 힘 제조 업체 및 배치에 따라 매우 다양하다. 질병 활성의 유도를 위해 먼저 공급 업체에서 제공하는 DSS를 테스트하는 다에 대한ILY 체중은 신뢰할 수있는 객관적 지표입니다.
  3. 결장 조직 샘플의 조직 학적 평가를 위해 실험 끝에 CO 2 통기 (또는 국가 기관 가이드 라인을 지정)에 의해 마우스를 안락사.

2. 실험 설정 DSS-대장염과에서 시험관 상처 치유 분석 실험

  1. 세포 배양 및 상처 치유 분석의 설립.
    1. 37 ° C에서 95 % 습도 및 5 % CO 2 환경의 카코 -2 세포를 성장한다. 10 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신을 RPMI 배지를 사용한다.
    2. 높은 문화 인서트 35mm 배양 접시에 4 × 10 5 세포 / cm 2의 밀도 씨 카코 2 세포 (그림 4A 참조).
      참고 : 삽입은 상처 영역을 나타내는 정의 된 셀 여유 공간을 분석하기로 분리 된 두 개의 셀 적용 영역을 생성합니다.
    3. 이일 seedin 후 매체 변경지. 먼저 자동 피펫을 사용하여 세포 파편과 잔류 매체를 흡입에 의해 수행, 인산염 완충 생리 식염수 100 ㎕ (PBS)로 세척하고 신선한 RPMI 매체 또는 혈청 박탈 매체를 추가합니다.
    4. 상처 치유 행동의 변화를 감지하는 20 ng를 EGF / ㎖의 혈청 또는 2 μg의 마이 토마 이신 C / ㎖의 혈청 혈청 박탈 매체 (0.1 % FBS)에서 24 시간 동안 배양 세포. 24 시간 동안 세포를 제어하는​​ 정상 RPMI 매체를 추가합니다.
    5. 문화의 24 시간 후, 제거하고 단계 3.4에 설명 된대로 문화 삽입을 취소하고 DHM을 수행합니다.
  2. 급성 DSS 대장염의 유도
    1. (w / v)의 DSS 솔루션을 3 %를 얻기 위해 물을 멸균 100 ㎖에 DSS의 3g을 녹인다. 7 일간 쥐 광고 무제한에 물을 마시는 대신에이 솔루션을 제공합니다. 마우스 / 하루 DSS-용액 5 ㎖를 계산합니다. 제어 마우스 광고 임의로위한 DSS없이 멸균 된 물을 제공합니다.
  3. 쥐와 인간의 결장의 저온 유지 섹션의 준비
    1. 실험의 끝에 CO 2 취입 마우스 안락사.
    2. 개복술 (23)에 의해 동물의 복부를 해부하다. 조심스럽게 핀셋을 사용하여 전체 대장을 제거하고 수술 가위를 사용하여 회장 및 직장 끝을 잘라. 직장 끝까지 맹장에서 길이 방향 가위로 결장을 잘라 콜론을 엽니 다. PBS (24)로 세척 한 다음 핀셋을 사용하여 표본에서 모든 배설물을 제거합니다.
    3. 안쪽으로 곡선 점막과 직장 끝으로 맹장에서 길이 방향으로 새싹 목화와 전체 대장을 감아 스위스 롤을 준비합니다. 최적의 절삭 온도 OCT () 화합물에 결장 샘플을 포함하고 더 사용할 때까지 -80 ℃에서 냉동 보관하십시오.
    4. 최적의 절삭 온도 10월 화합물 수술 표본에서 인간의 대장 조직을 포함하고 더 사용할 때까지 -80 ℃에서 냉동 보관하십시오.
    5. cryoto의 도움으로 OCT의 화합물 내장 표본의 7 μm의 두께의 컷 섹션시험에 날 직전.
      주 : 최적 샘플 두께는 조사중인 지속성 및 조직 유형의 분산 특성에 따라 달라진다. 인한 양적 DHM 위상 콘트라스트 영상에서 빛의 산란에 결장 조직 노이즈> 10 ㎛의 원인이 크게 증가 슬라이스 두께를 사​​용하여 설명 된 실험에 대한 두께의 샘플을 <5 ㎛의은 크라이 절단 공정 손상 유도 된 인공물에 대한 높은 위험을 표시하는 동안.
    6. 유리 개체 캐리어의 슬라이드에 섹션을 전송합니다.

3. 기술 장비, 디지털 홀로그램의 수집 및 평가 용 소프트웨어 및 절차

  1. 양적 세포 및 조직의 영상을위한 디지털 홀로그램 현미경
    1. 도 1에 나타낸 바와 같이, 생균 촬상 25 축외 마하 젠더 디지털 홀로그램 현미경 시스템을 사용한다. 현미경이 장착되어 있는지 확인10X 현미경 렌즈 35 mm의 직경을 갖는 유리 물체 운반기 슬라이드와 배양 접시의 홀더와 현미경 단계는 가열 챔버 정량적 위상 촬상 25 생리 37 ° C의 온도 및 소프트웨어를 보존한다.
      참고 : 예를 들어, 켐퍼 26 Langehanenberg 27에 설명 된대로...
      주 : 또는 시야 현미경 살아있는 세포의 양적 위상 이미징 해부 조직 슬라이드를 수행 할 수있는 유사한 시스템을 사용한다.
    2. 면도 현미경 렌즈와 렌즈 클리닝 용지 먼지 또는 기타 오염물을 제거하기 위해 현미경의 제조자가 권장하는 세정제 (예, 에탄올)와 콘덴서.
    3. 백색광 조명 "의" "시야"영상 모드 스위치를 선택 DHM 현미경의 이미지 수집 소프트웨어를 시작합니다. 쾰러 - illumin 확인(다르게는, 표준 화상 취득 소프트웨어가이 단계에서 사용될 수있다), 화상 취득 소프트웨어의 라이브 영상 창에서 샘플을 관찰하면서 현미경 제조사 권장 샘플 ATION.
      주 : 이미지 세기가 시야에 균일하게 분산되어야하며 샘플 위치는 현미경의 초점 거리를 가진 광학 재 집속 중 조작해야한다.
    4. 레이저 빛 "의"백색광 조명 및 스위치 "OFF"설정 "DHM"영상 모드를 선택합니다. 레이저 광 조명을 균질인지 확인 (즉, 광 강도가 균일 DHM 현미경 영상 수집 소프트웨어의 라이브 영상 창에 분포된다) 및 오프 액시스 캐리어 간섭 줄무늬 패턴이있는 충분한 콘트라스트 나타나는지 관찰 촬영 한 이미지 (디지털 홀로그램).
  2. 이미징을위한 저온 유지 부의 제조DHM와
    1. (두께, 유리 개체 캐리어에 그라 이오 스탯 섹션 : 7 μm의, 2.3에 설명 된대로) 샘플을 냉장고에서. RT 정상 대기에서 약 5 분 동안 샘플을 해동.
    2. 그 버퍼가 완전히 피복 될 때까지 피펫을 이용하여 조직 절편 상에 매체를 삽입 100 ㎕의 인산 완충 식염수 (PBS) - (50)를 추가한다. 깨끗한 유리 커버 슬립 (유리 두께 170 μm의)와 샘플을 커버.
      주 : 동안 건조 굴절률의 상당한 변화와 샘플의 산란 특성을 유도 할 수있다.
    3. 유리 캐리어와 커버 슬립의 바닥은 빛의 산란을 유도 할 수 먼지 및 기타 오염 청소되어 있는지 확인합니다. 샘플은 밝은 필드 현미경 및 DHM와 조사에 대한 준비가되어 있습니다.
  3. DHM와 조직 절편의 정량적 인 위상 이미지
    1. 디지털 홀로그램 현미경에 스위치 이미징의 10 배 현미경 렌즈를 선택합니다. 제 i 시작마법사 수집 상기 DHM 현미경의 소프트웨어와 밝은 파일 영상 모드를 선택합니다.
    2. 현미경 대물 렌즈에 대향하는 커버 슬립, 현미경 슬라이드 홀더) (2)에 기술 된 바와 같이, 조직 슬라이드를 놓는다.
    3. DHM 현미경의 시야 조명 "의"전환합니다. 현미경 스테이지에 샘플을 놓고 관심의 조직 영역은 실시간 감시 창에 표시되는지 확인합니다. 현미경의 초점 거리를 사용하여 이미지의 선명도 향상.
      주 :뿐만 아니라 관심 영역이없는 조직 슬라이드의 영역도 시야에 존재한다.
    4. 화상 획득 소프트웨어를 사용하여 크게 집중 샘플의 명 시야 이미지를 캡처.
    5. 선택 "DHM"영상 모드, 레이저 광 조명 "의"백색광 조명 "OFF"로 설정하고 전원을 켭니다. 3 밀리 초 이하 홀로그램 기록에 대해 "노출 시간"을 선택하여 그 hologr을 관찰aphic 축외 간섭 줄무늬는 촬상 수집 소프트웨어의 라이브 영상 창의 적절한 콘트라스트 나타나는 디지털 홀로그램을 포착.
    6. 명 시야 이미지와 다른 샘플 영역 디지털 홀로그램 충분한 수를 기록 할 때까지 3.3.5 - 반복 단계 3.3.3. 홀로그램 인수가 완료되었습니다.
  4. DHM 영상에 대한 상처 치유 분석의 준비
    1. DHM 측정시 안정적인 온도 조건을 보장하기 위해 3 시간 전에 실험의 시작 - 약 1 DHM 현미경의 페트리 접시 가열 챔버에 전환합니다.
    2. 필요한 장비 (2.3에서 설명하는 상처 치유 분석을위한 배양 접시)와 작업대 준비 : 피펫, 핀셋, 페트리 접시 용 유리 뚜껑, 4- (2- 히드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산 (HEPES)은 생리 학적으로 세포 배양 배지를 버퍼링 무균 환경에서 샘플 준비를위한 온도 (37 °의 C).
      참고 : ℓ의 NaHCO3로 구성된다.
    3. 페트리 접시에서 플라스틱 뚜껑을 제거하고 피펫으로 세포 배양 배지를 제거합니다. 핀셋을 사용하여 배양 접시 바닥에서 삽입물을 제거합니다.
    4. 사균 상처 영역에 남아있는 세포 성분 (예, 혈청)을 제거하기 위해 버퍼링 한 ML HEPES 세포 배양 배지로 2 회 - 샘플 1을 씻는다. 2 ml의 HEPES를 버퍼링 세포 배양 배지를 추가하고 유리 뚜껑 페트리 접시를 캡.
    5. 유리 뚜껑과 배양 접시 바닥 먼지 및 기타 오염 청소되어 있는지 확인합니다. 샘플 DHM와 시간 경과 관찰을위한 준비가되어 있습니다.
  5. DHM와 체외에서 상처 치유의 연속 멀티 모드 모니터링
    1. 이전에 3 시간 - DHM 현미경 약 1의 페트리 접시 가열 챔버에 전환실험의 시작에 DHM 측정 중에 안정된 온도 조건을 보장한다.
    2. 디지털 홀로그램 현미경 "의"스위치, 영상의 10 배 현미경 렌즈를 선택합니다. DHM 현미경의 이미지 수집 소프트웨어를 시작하고 "시야"영상 모드를 선택합니다. 페트리 접시의 가열 챔버는 생리적 온도 (37 ° C)를 작동하는지 확인합니다.
    3. DHM 현미경의 가열 실 (4)에 기재된 바와 같이 제조 된 상처 치유와 분석 페트리 접시), 놓는다.
    4. 명 시야 촬상 모드를 선택하고 DHM 현미경 화상 취득 소프트웨어를 실시간 감시 창을 보면서 현미경 스테이지 샘플 위치. 샘플의 원하는 영역이 크게 백색광 조명 아래에 초점을 맞춘 나타납니다 것을 관찰한다.
    5. 흰색에서 샘플의 서로 다른 영역의 명 시야 이미지 (상처 영역과 합류 세포와 주변 지역을) 캡처화상 획득 소프트웨어 및 문서 모양 세포 밀도와 균일 광 조명과.
    6. DHM 현미경의 "시야"영상 모드를 선택합니다. DHM 현미경 화상 획득 소프트웨어를 실시간 감시 창 백색광 조명 하에서 적절한 상처 영역을 선택한다. 상처 영역은 죽은 세포없이 혈청 유적에서 무료로 확인하고 양측이 바람직 직선 테두리가 하나의 균일 한 세포 층을 포함 있는지 확인합니다.
    7. DHM 현미경 화상 획득 소프트웨어 시야 촬상 모드의 초기 창상 면적 백색광 이미지를 캡처.
    8. 레이저 조명 "의" "DHM"모드 스위치를 선택, 백색광 조명 "OFF"로 설정합니다. 홀로그램 기록 다음 3 밀리의 노광 시간 (간섭 줄무늬가 t의 화상 취득 소프트웨어의 라이브 영상 창의 적절한 콘트라스트 나타나는 홀로그램 축외 관찰 선택그는 현미경을 DHM)와 디지털 홀로그램을 캡처합니다.
    9. 화상 획득 소프트웨어 DHM 모드 샘플 홀로그램을 포착하여 화상 품질을 확인하기 위해 DHM 현미경 재구성 소프트웨어 정량적 위상 이미지를 재구성.
    10. DHM 현미경 화상 획득 소프트웨어 경과 홀로그램 취득 - (5 분 3) 적절한 시간 지연을 선택한다.
    11. 샘플 만 홀로그램 취득 중에 레이저 광이 조사되는 화상 취득 소프트웨어의 시간 경과 획득 모드를 선택한다.
    12. 상처 치유 분석의 시간 경과 DHM 관찰을 시작합니다.
    13. , 의도 한 시간 후 시간 경과 수집을 중지 시야의 영상 모드를 선택하고 백색광 영상에서 샘플의 마지막 모습을 문서화합니다.
  6. 해부 조직 디지털 홀로그램을 재구성하고 정량화 파라미터로서 평균 굴절률을 결정조직 밀도
    1. 켐퍼 외. 26 Langehanenberg 외. (27)에 기술 된 바와 같이, DHM 현미경의 소프트웨어 해부 조직의 디지털 홀로그램 양적 위상 이미지를 재구성.
    2. 관심 (로아) (19)의 적절하게 선택 지역에서 다른 조직 층 (상피 세포, 점막하, 기질)의 평균 위상차 Δφ를 결정합니다.
    3. 굴절계를 사용하여 또는 대안 문헌 적절한 값을 이용하여 상기 매립 매체의 굴절률을 결정한다. (일반 매립 매체 굴절률 값 : = 1.334 N 28 N 인산염 식염수 (PBS) = 1.337 29 없음 세포 배양 배지 = 1.337-1.339 29,30 버퍼링).
    4. 평균 위상차 19 값과 다른 조직의 층의 굴절률을 계산
      식 (1) 참고 : 식으로. 상기 해부 조직의 두께 D (여기서는이 7㎛) 한 λ는 (λ = 532 nm의 여기) 레이저 광의 파장이고, n은 매질 여기 매립 매체 (굴절률이다 매체 = N PBS N 아베 - 굴절계에 의해 결정 = 1.337).
  7. 재구성과 일련의 관찰 상처 치유 시간 경과에서 디지털 홀로그램을 평가
    1. DHM 현미경 소프트웨어 (26, 27)와 상처 치유 관찰하는 동안 얻은 시간 경과 홀로그램 시리즈에서 양적 위상 이미지를 재구성.
    2. 최대 위상 콘트라스트 이미지에 양적 위상 이미지의 각 시리즈를 정상화.
    3. 당 될 수 영상 분할하여 정량적 DHM 위상 이미지의 셀에 의해 커버되는 영역 S의 C를 결정자유 소프트웨어 셀 프로파일을 사용하여 형성 (www.cellprofiler.org 31).
    4. 면적 S C가 세포 Δφ 셀의 평균 위상차를 계산한다.
    5. 면적 S의 15 ℃에서의 평균 위상차 Δφ 셀로부터 셀룰러 건조 질량 DM 검색
      식 (2) (2)
      주 :이 DM 셀룰러 건조 질량을 나타내고, 수학 식에서, S C는 세포 및 α = 0.002 / kg에 의해 점유되는 영역을 제공한다.
    6. 적분 셀룰러 굴절률 n 개의 및 세포 배양 배지 N 매질의 굴절률을 결정한다. (30)에 기술 된 바와 같이 부유 세포는 별도로 실험적으로 n 개의 셀을 결정하고 굴절계와 n 개의 매체를 측정한다. 알터상대적으로 n 개의 (30)과 중간 29, 30 N에 대한 문헌 값을 사용합니다.
    7. λ, Δφ 셀, NN 매체 26,32으로부터 평균 셀 두께 d 계산
      식 (3) (삼)
      참고 : 식으로. 세 파라미터 D λ는 레이저 광의 파장 평균 셀 두께를 나타내고있다, Δφ 전지는 평균 위상차를 나타내고, N 중, N은 정수 셀룰러 굴절률과 주위 매체의 굴절율이다.

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Representative Results

디지털 홀로그램 현미경에 대한 DHM 이미지에 대한 일반적인 설정 (DHM)

1b에 도시 된 바와 같이 명 시야 촬상 정량적 DHM 위상차 촬상을 수행하기 위해 거꾸로 현미경을 적용 하였다. (25) 상술 한 바와 같이 시스템이하는 DHM 모듈을 부착시킴으로써 변성시켰다. 마하 젠더 구성 (도 1 A)에 YAG 레이저 λ = 532 ㎚) : 디지털 홀로그램을 조명함으로써 주파수의 Nd 배의 빛으로 샘플을 생성 하였다. 해부 조직 유리 캐리어 슬라이드 생체 분석 하였다. .도 1 C에 도시 된 바와 같이, 살아있는 세포 배양 물은 상처 치유 관찰 특수 배양 접시에서 관찰되었다. 샘플을 10 배 MI 통해 투과 조명시에 이미징 된croscope 렌즈 (NA는 0.3 =) 및 튜브 렌즈. 전하 결합 소자 카메라가 약간 기울어 기준 파형과 견본 화상 (오브젝트 파)의 중첩에 의해 발생되는 간섭 패턴 (디지털 축외 홀로그램)을 기록 하였다. 디지털 촬영 된 홀로그램은 공간 위상 홀로그램 선택 사항 26,33를 오토 포커싱과 조합하여 재구성을 이동하여 재구성 하였다.

DHM에 의해 쥐 DSS 유발 성 대장염의 평가

급성 대장염 5 일 동안 물을 마시는 덱스 트란 황산 나트륨 (DSS)의 v / w는 3 %의 투여에 의해 쥐에서 유도 하였다. 발현 및 대장염의 과정은 대조군에 비해 처리 군 DSS 진보적 중량 손실을 모니터링 하였다. (그림 2 A는 19 일부터 적용). 심각한 대장균에 내시경, 중간대장 벽의 비후에 의해 반영 TIS 관찰, 혈관 패턴 (예를 들어, 자연 출혈, 빨간색 화살표), 섬유소 삼출물 (흰색 화살표)과 점막 표면 (그림 2B)의 단위의 변경. 헤 마톡 실린 및 에오신의 기존 조직 학적 평가 (HE)은 결장 섹션은 주로 점막하 (그림 2 C 회색 화살표)에있는 제어 동물, 절 DSS 처리의 대장 벽에 표시된 부종을 밝혀 스테인드. 수학 식 1에 의해 검색된 정량 DHM 위상차 이미지와 관련 굴절률 맵을 대응하여, 또한 상기의 조직 변화를 도시. 또한, 256 계조로 부호화 굴절률은 네이티브 염색 조직 샘플의 상피 (백색 화살표) 및 기질 (흑색 화살표) (도 2를 포함한 조직층의 밀도의 차이를 나타내 C). 굴절률이 크게 상피뿐만 아니라 건강한 대조군 (도 2 E)에 비해 대장염 마우스의 점막하 간질 감소 하였다. 또한, 임상 적 매개 변수 (체중의 상대적인 손실)과 절대적 물리적 매개 변수 (굴절률) 사이에는 유의 한 상관 관계가 관찰 될 수있다 (R 2 선형 = 0.64, (19)로부터 적응도 2 D).

DHM에 의해 인간의 크론 병의 평가

크론 병은 주로 위장관 내시경에 의해 검출 된 장 벽의 현저한 염증 변화에 의해 식별된다. 섬유소 exudat와 특징 매크로 기능은 점막 표면의 단위의 구성, 세로 궤양이온 (도 3 A)의 출혈과 자발적인 (또한 "달팽이 트레일"라 함). 활성 CD 환자에서 조직 샘플의 HE 염색에 의한 조직 학적 평가는 종종 결장 벽뿐만 아니라 점막하 부종을 알 수있다. 수학 식 1에 의해 검색 정량 DHM 위상 콘트라스트 이미지와 관련 굴절률지도를 해당 여기 상피 (그림 3 B)에서 볼 수있는 대장 벽의 염증 매개 성 향상 / 붓기가 발견되었습니다. 또한, 절대 파라미터로서 굴절률이 현저하게 경감의 구절 활성 CD (도 3 C)와 함께 환자의 결장 조직 샘플의 모든 벽 층 (상피 및 점막하 기질)로 감소 하였다.

- 시험 관내 상처 치유의 복합 모니터링

카코 -2 세포 분석은 표준 조건을 제공하기 위해 특수 배양 접시를 사용하여 수행 하였다 상처 치유. 요리는 500 μm의 (그림 4 A)의 간격에 의해 분리되어 두 개의 서로 다른 챔버를 형성하는 문화 인서트가 장착되어 있습니다. 다른 생리 학적 환경을 시뮬레이션하기 위해 세포는 표피 성장 인자 (EGF)에 의해 자극 또는 마이 토마 이신 C의 억제, 치료없이 어느 조사 하였다. DHM 설정 실험의 시작 (그림 4 B) 후 0, 22.5, 45 시간 후 (256 그레이 레벨로 코딩) 대표 양적 DHM 위상 콘트라스트 이미지가 여기에 묘사 된 시간에 프로세스를 치유 상처의 지속적인 모니터링을 할 수 있습니다. 5에 잘못된 색으로 의사 3D 플롯 대응하는 세 개의 다이의 셀 층 두께의 공간적 전개를 도시mensions. 광로 길이 지연 셀룰러 굴절률에 기초하여 2, 3 방정식, DHM은 전지 커버 표면적, 평균 셀 두께 및 세포 건조 중량 (셀룰러 특성 시간 모니터링하여 이동, 증식 및 형태 동시에 동적 평가를 허용 그림 4 C). 요약하면,도 4의 데이터는 시야에서 증가 된 평균 셀 두께 상처 영역에 세포의 빠른 이동, 및 더 높은 건조 질량 EGF 시뮬레이션 결과는 대조군 세포에 비해 것을 나타낸다. 억제 세포가 포함 된 c 반면, 미토 마이신은 약간의 실험 과정에서 대조군 세포에 비해 표면적이 감소하여도 약간 낮은 건조 질량의 증가를 나타낸다. 그러나, 평균 셀 두께 모두에 비해 감소 자극 대조군 세포 분명히 나타나는.


그림 1. 디지털 홀로그램 현미경 (DHM). DHM 워크 스테이션 (A)의 도식 설정에 오프 축 설정 활용. 현미경 설정 (모니터, 실시간 영상과 제어 소프트웨어 (1)을 묘사 한 사진 대응 축외 설치 디지털 현미경 (2), (B), 현미경 (녹색 점선)과 시료의 광로 적색으로 표시된 ( 화살표 (C)). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2. DHM에 의해 쥐 DSS 유발 성 대장염의 평가. 대장염의 과정은 매일 저를 선행되었다상대 체중과 반복 내시경 추적 검사의 asurement. (19에서 적응) DSS 관리 (A)의 시작 후 4 일에서 상대적 체중의 대규모 손실은 초점 궤양 및 점막 취약점 (B)를 포함하여 설립 대장염의 내시경 적 징후를 동반 하였다. 기존의 HE 염색 저온 유지 섹션의 분석은 점막하 부종, 근층 및 점막에 뚜렷한 점막 염증 침윤의 비후를 한 것으로 밝혀졌습니다. 수학 식 1에 의해 검색된 정량 DHM 위상차 이미지와 관련 굴절률지도 대응 (256 계조로 부호화) 염증 과정 점막하의 부종성 변화를 확인 (C) (흰색 화살표 상피 회색 점막하 블랙 기질을 나타낸다). 상당히 굴절율 (절대 물리적 파라미터, R = 0.6이 선형 상관 관계 체중의 상대적인 감소 (임상 파라미터)4; 크게 상피 세포에서뿐만 아니라 점막하과 정상 대조군에 비해 대장염 마우스의 기질에 감소 하였다 (19)에서 적응 (D가),), (SEM 평균 ±, *** P <0.001;. E) 를 클릭하세요 여기이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.

그림 3
DHM 의해 인간 크론 병에서의 평가도 3. 내시경 및 조직 학적으로 확인 크론 병 환자의 결장 조직 샘플을 조사 하였다 (A). HE-염색 점막 지하실의 연장 및 염증 세포의 침윤 표시를 표시. 또한, 점막하 부종과 근층의 고유 층의 확대가 검출되었다. CORR 분석식에 의해 검색 정량 DHM 위상 콘트라스트 이미지와 관련 굴절률지도를 esponding (1) (256 그레이 레벨로 코딩) 또한 상피 세포 (B)에서 (여기에 흰색과 검은 색 스타로 표시) 부종성 변화를 한 것으로 밝혀졌습니다. 평균 굴절률 유의 한 차이가 활성 플레어 (일반 바) 또는 면제 (검은 막대)와 CD 환자의 샘플에서 검출되었다. 이러한 차이는 각 조직 유형에서 볼 수 있습니다에게 (± SEM, *** P <0.001 의미; C)를. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
화이트 라이트 현미경 및 DHM에 의한 상피 창상 치유의 그림 4. 모니터링. 배양 된 세포가 트란했다특수 인서트 (빨간색 화살표)와 배양 접시에 sferred. 문화 인서트를 제거하기 전에 세포는 24 시간 동안 EGF 또는 마이 토마 이신 C 중 하나를 처리, 또는 혼자 매체 (자극되지 제어) (A)로 처리 하였다. 배양 인서트 제거한 후, 상처 치유 연속적 시간 경과 DHM 의해 위상차 촬상에 의해 모니터링 하였다. 세포 윤곽이 명확하게 인식 할 수있다. 주제 정량적 DHM 위상차 이미지는 22.5 시간 후, 45 시간 (B) 후에 측정이 끝날 때 실험의 시작 부분에 나타나있다. 패널 (C)는 세포 덮인 표면 (S의 c)에 해당하는 시간 변경, 평균 셀 두께 (D 셀) 및 휴대 건조 질량 (DM)를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.


그림 5. 정량적 DHM 단계 대비 이미지의 거짓 컬러 코딩 된 의사 3 D 플롯에 의해 세포 계층 형태학 변화의 그림입니다. t = 0도 4b의 양적 DHM 위상 콘트라스트 이미지의 대표 거짓 색으로 구분 의사 3D 플롯, 22.5 시간 후와 45 시간 후 측정의 끝에서, 제어 - 대한 세포 층의 두께의 공간 개발을 설명, 마이 토마 이신은 C-억제 및 3D에서 EGF 자극 세포. 이 ​​그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

우리는 DHM은 쥐 대장염 모델에서 조직 학적 손상과 인간의 대장 조직 샘플 생체의 정확한 평가를 제공한다는 것을 보여줍니다. 또한, 우리는 DHM 지속적 동시에 세포 변화에 대한 복합 정보를 제공하는 동안 상피 상처 치유를 모니터링 할 수 있습니다 표시. DHM에서 디지털로 촬영 된 홀로그램의 재건 수치 (32)이 수행된다. 따라서, 명 시야 현미경 제르 니케 위상차 미분 간섭 현미경 대조에 비하여, DHM은 선택적 후속 숫자 포커스 보정 (다 초점 화상)와 양적 위상차 (27)를 제공한다. 정량적 인 위상 이미지는 광로 길이의 변화의 판정에 기초하여 이에 이용되는 측정 장치의 매우 독립적이다. 이는 다른 수단에 취득 된 측정 데이터의 비교를 단순화시킨다. 또한, DHM은 OBJE 만 낮은 조명 강도를 필요코네티컷 조명. 이 흠 해부 조직의 침습적 분석을 가능하게하고 살아있는 세포의 장기간 경과 관찰 중 필요한 샘플의 상호 작용의 양을 최소화한다.

IBD의 치료 필수품 전반은 크게 두 개의 지난 수십 년에 걸쳐 확대했다. UC와 CD 모두에 효과적이고 허용되는 부작용 프로파일, 신규 최근 임상 34-37 넣고, 인테그린 특이 적 항체를 표적이 항 TNF-α 요법 도입 게다가. 다른 몇몇 유망 에이전트는 현재 IBD 38-40에서의 치료 효과에 대해 평가되고있다. 그러나, 인간에서의 임상 적 사용에 앞서, 이러한 잠재적 인 치료제의 효능 및 안전성은 동물 연구에서 입증되어야한다. DSS에 유도 된 대장염은 높은 재현성 및 저비용 23 때문에 가장 많이 사용되는 뮤린 대장염 모델 중 하나이다. 또한이 모델은 할 수있는 알이렇게 유전자 변형 마우스에 적용될 41 균주. 전신 마커는, 예를 들면, CRP는 동물 모델에서 매우 가변적이며, 대장의 조직 학적 평가 42,43 중증도를 평가하는 가장 유효한 방법을 나타낸다. 그럼에도 불구하고, 채점 시스템에 따라 조직 학적 염증의 정량적 평가는 조사의 전문성과 경험에 크게 의존한다. DHM와 가능한 대물 파라미터에 의해 평가 자동 채점은 이러한 한계를 극복하고, 또한 19 염색의 필요성을 피하고 또한 시간 절약이다. 또한, DHM은 내시경 수술시 얻은 결장 시료뿐만 아니라 점막 샘플을 조사하는데 사용될 수있다.

상피 재생 및 상처 치유 위장 궤양 또는 문 합부 누출 등 여러 가지 병적 인 과정에서 중추적 인 메커니즘입니다. 접근법이 유망한 동안 V 상피 상처 치유를 평가IVO (44)는,이 기술은 정교한 검사 도구를 필요로하고 현재 널리 사용할 수 없습니다. 따라서, 현재 상피 치유는 일반적으로 시험관 9 스크래치 분석에 의해 조사한다. 이러한 분석은 상처 봉합의 유효한 검사를 할 수 있지만, 일반적으로 먼저 평가 10,45 반복 방지 세포 염색을 필요로한다. 또한, 어떠한 셀룰러 데이터 변경이 실험 장치에 병렬로 획득 할 수 없다. 이 사멸 및 괴사 (46)를 구분하고 세포 증식 및 이동 (46)을 평가하기 위해 사용될 수 있기 때문에,이 정보는 크게 중요 할 수있다. 따라서, 가능성이 동시에 검사 DHM 의한 상처 봉합의 모니터링 셀 두께, 건조 질량 또는 조직 밀도를 결정 점막 연구에서 높은 가치가있다.

인간의 IBD 환자의 치료 목표는 지속적으로 지난 수십 년에 걸쳐 변화 한 <SUP> 47. 염증의 초기 컨트롤이 가장 중요 나중에 스테로이드없는 죄 사함이 될 지금 치유를 점막 간주 동안 치료 (48)의 주요 목표입니다. 최근에는 조직 학적 관해도 49 단독 치료 점막 우수 할 수 있다는 것을 가정 하였다. 인간 IBD 가능한 몇 학적 스코어링 시스템이 존재하는 동안 그러나 관찰자 간 변동성 50 높게 유지된다. 따라서, 조직 학적 결장 시료의 평가를위한 표준화 된 방법이 필요하다. DHM이 목표에 기여할 수 있으며, 또한 인간의 IBD 환자와 전향 적 임상 시험에서 평가되어야한다.

제시된 실험 절차에서, 샘플은 고도로 일관된 레이저 광을 이용하여 조명 및 촬상된다. 따라서, DHM의 해상도가 주로 샘플 조명의 어긋남에 의한 빛의 산란 및 회절 효과에 의해 제한된다, 두께 샘플, 먼지 나이러한 광로의 축합 물과 같은 다른 불순물. 정량적 DHM 위상 콘트라스트 영상의 DHM 설치주의 제조 및 정렬 시료에서 매우 정확한 측정 데이터를 얻기 위해 프로토콜의 가장 중요한 단계이다. 철저히 현미경 응축기 현미경 대물이 잡음을 최소화하는 데 필요한 특정의 광학 촬상 소자를 세척. 또한 샘플 캐리어 슬라이드 페트리 접시 뚜껑 아래뿐만 아니라, 이용 된 세포 배양 배지는 입자상 불순물이 없어야한다. 이 신중하게 적용 액체의 모든 구성 요소와 적절한 필터링을 청소함으로써 달성된다.

디지털 홀로그램 및 / 또는 해부 조직의 정량적 DHM 위상 이미지에 노이즈가있는 경우, 유리 캐리어와 커버 슬립이 먼지에 의해 오염 될 수 상세한 트러블 슈팅 팁은 다음과 같다. 이 경우, 알코올 (예를 들면, 순수 에탄올)와 유리 캐리어와 커버 슬립을 청소합니다. 두꺼운 경우해부 조직의 다움은 (> 10 μm의) 빛의 산란에 따라서 결과는, 얇은 조직 섹션을 사용하려고 너무 큽니다. 레이저 광 조명이 균일하게 분산되지 않는 경우, 현미경 용 응축기를 통하여 피사체 조명 정렬. 산란을 유도 효과를 유리 뚜껑의 하부에 물을 응축하면, 가열 실 및 실내 습도의 온도를 확인한다. 경우에 세포 밀도는 하나 이상의 층이 너무 높거나 세포의 성장은 상처 치유 검정의 제조 동안 세포 밀도를 감소시킨다. DHM은 간섭의 원리에 기초 마지막으로, 상기 방법은 각 실험실 환경에 따라 달라질 진동이나 기계적 외란에 민감하다. 그러나, 이러한 영향은 일반적으로 실험 장치의 제조 도중 홀로그래피 기록 용 적절히 선택된 노출 시간 (통상적으로 밀리 초 범위 또는 이하)에 의해 최소화 될 수있다.

요약하자면우리의 결과로 인해 양적으로 거의 자동화 된 방식으로 조직 학적 염증 생체을 평가하는 능력에 DHM 밝은 필드와 같은 제르 니케 상 대비 및 DIC 등 기존의 위상차 영상 현미경 기술을 통해 주요 장점을 보유하고 있음을 보여줍니다. 또한 DHM은 샘플을 최소화 상호 작용 시험관 내에서 상피 상처 치유의 라벨이없는 연속 멀티 모달 평가를 할 수 있습니다. 이 IBD 환자에 DHM의 번역 가능성을 탐구하는 '디지털 병리학' '더욱 확장 된 연구의 측면에서 자동화 된 조직 학적 검사에 대한 방법을 불법 체류자. 또한, DHM 기회가 정량적으로 세포 이동, 형태 및 확산을 연구하는 체외 소설을 제공합니다.

임상에 DHM의 번역은 IBD 진단을 향상시킬 수있는 잠재력을 가지고있다. DHM은 장 염증의 다른 정도의 정량화를 통해 할 수 있습니다으로밀도 변화는 "디지털 병리학」의 관점에서 질환의 대물보다 정확한 평가와 같은 물리적 파라미터 가능 보인다. 대물 평가 IBD 환자의 임상 적 관리에 큰 영향을 끼칠 수있다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Azoxymethane (AOM) Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany A5486
Cell Culture Flask Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany 658170
Costar Stripette Corning Inc., New York, USA 4488
Dextran sulphate sodium (DSS) TdB Consulatancy, Uppsala, Sweden DB001
DMEM/Ham's F12 PAA Laboratories - Pasching - Austria E15-813
EGF Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany SPR3196
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany E 9884
Falcon Tube 50 ml BD Biosciences, Erembodegem, Belgium 352070
Isopentane (2-Methylbutane) Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany M32631-1L
Methylene blue Merck, Darmstadt, Germany 1159430025
Mitomycin C Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany M4287
Microscope Slides G. Menzel, Braunschweig, Germany J1800AMNZ
O.C.T. Tissue Tek compound                                  Sakura, Zoeterwonde, Netherlands 4583
Pen/Strep/Amphotericin B Lonza, Verviers, Belgium 1558
Phosphate buffered saline, PBS Lonza, Verviers, Belgium 4629
RPMI 1640 Lonza, Verviers, Belgium 3626
Sodium Chloride 0.9% Braun, Melsungen, Germany 5/12211095/0411
Standard diet Altromin, Lage, Germany 1320
Tissue-Tek Cryomold Sakura, Leiden, Netherlands 4566
Trypsin EDTA Lonza, Verviers, Belgium 7815
Vitro – Clud R. Langenbrinck, Teningen, Germany 04-0002 
 µ-Dish 35 mm with Culture-Insert, high ibidi GmbH, Munich, Germany 81176
DIC Lid for µ-Dishes, with a glass insert ibidi GmbH, Munich, Germany 80050
Equipment
MICROM HM550 Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, USA 46320
Digital holographic microscope
Component Model Company
Inverted Microscope iMIC Till Photonics, Graefelfing, Germany
Laser Compass 315M Coherent GmbH, Luebeck, Germany
Microscope lens Zeiss EC Plan Neofluar 10x/0.3 Zeiss, Goettingen, Germany
CCD camera DMK 41BF02 The Imaging Source, Bremen, Germany

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