Multimodale Quantitative Phase Imaging con Digital olografico microscopia Valita accuratamente guarigione infiammazione intestinale e epiteliale della ferita

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Lenz, P., Brückner, M., Ketelhut, S., Heidemann, J., Kemper, B., Bettenworth, D. Multimodal Quantitative Phase Imaging with Digital Holographic Microscopy Accurately Assesses Intestinal Inflammation and Epithelial Wound Healing. J. Vis. Exp. (115), e54460, doi:10.3791/54460 (2016).

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Abstract

L'incidenza della malattia infiammatoria intestinale, cioè, la malattia di Crohn e la colite ulcerosa, è notevolmente aumentato negli ultimi dieci anni. L'eziologia della IBD rimane sconosciuta e strategie terapeutiche attuali si basano sulla soppressione aspecifica del sistema immunitario. Lo sviluppo di trattamenti che colpiscono specificamente l'infiammazione intestinale e epiteliale guarigione della ferita potrebbe migliorare in modo significativo la gestione di IBD, ma questo richiede un rilevamento accurato di alterazioni infiammatorie. Attualmente, i potenziali candidati di droga sono solitamente valutati utilizzando modelli animali in vivo o con tecniche basate su colture cellulari in vitro. L'esame istologico di solito richiede le cellule oi tessuti di interesse per essere macchiati, che possono alterare le caratteristiche del campione e, inoltre, l'interpretazione dei risultati può variare dalla competenza investigatore. microscopio olografico digitale (DHM), basato sul rilevamento di ottica percorso ritardo di lunghezza, permette-Macchia libera di imaging a contrasto di fase quantitativa. In questo modo i risultati di essere direttamente correlati con i parametri biofisici assoluti. Si dimostra come la misurazione delle variazioni di densità dei tessuti con DHM, basato sulla misurazione dell'indice di rifrazione, in grado di quantificare le alterazioni infiammatorie, senza colorazione, in diversi strati di campioni di tessuto del colon da topi e nell'uomo con colite. Inoltre, abbiamo dimostrato il monitoraggio senza etichetta multimodale continuo di epiteliale guarigione delle ferite in vitro, possibile utilizzando DHM attraverso la semplice determinazione automatica della zona ferita e la determinazione simultanea di parametri morfologici come la massa secca e spessore dello strato di cellule che migrano. In conclusione, DHM rappresenta un prezioso, romanzo e strumento quantitativo per la valutazione di infiammazione intestinale con valori assoluti per i parametri possibili, la quantificazione semplificata di epiteliale guarigione delle ferite in vitro e quindi ha un elevato potenziale di u diagnostica traslazionaleSE.

Introduction

Le malattie infiammatorie intestinali (IBD), vale a dire, la colite ulcerosa (UC) e la malattia di Crohn (CD) sono malattie infiammatorie idiopatiche del tratto gastrointestinale 1. La ricerca sulla fisiopatologia delle IBD e la valutazione dei potenziali nuovi farmaci o nuovi approcci diagnostici è particolarmente importante. Sia nella ricerca di base e la gestione clinica dei pazienti IBD, la mucosa intestinale è diventato un centro dell'attenzione 2,3. La mucosa rappresenta un contorno anatomico, in cui l'interazione tra batteri commensali, cellule epiteliali e vari componenti cellulari del sistema immunitario intestinale orchestrare budello omeostasi 4,5. Tuttavia, nei pazienti con malattia infiammatoria intestinale, infiammazione intestinale incontrollata e persistente conduce alla mucosa danni, rilevabile come ulcerazioni o stenosi, che possono finalmente culminare nella composizione della funzione di barriera epiteliale, che a sua volta aggrava infiammazione locale 6.

7. Epiteliale guarigione della ferita può essere simulato in vitro ferita healing in vitro e in modelli murini di infiammazione intestinale 8,9. Sia in vitro e in vivo approcci hanno inconvenienti, che limitano la precisione della valutazione sperimentale. Saggi in vitro, come saggi scratch classici, richiedono procedure di colorazione prolungata o trasfezione con cromofori fluorescenti. Essi sono spesso limitati dalla loro monitoraggio discontinuo di proliferazione e migrazione cellulare che non può essere automatizzato 10. In vivo modelli, come destrano solfato sodico (DSS) colite indotta, spesso mancano robusti read-out, in parte dovuta alla variazione significativa visto in marker di laboratorio, mare tali marcatori inadeguati per valutare la colite gravità 11,12. L'analisi istologica della mucosa infiammata è attualmente ancora l'approccio più valido per determinare la gravità colite ma questo, come saggi di guarigione della ferita epiteliali in vitro, richiede colorazione e dipende dalla perizia del ricercatore 13.

Recentemente digitale microscopio olografico (DHM), una variante della fase di microscopia quantitativa 14, è stato identificato come strumento utile per la valutazione dei epiteliale la guarigione delle ferite in vitro e in vivo 15. DHM permette valutazione della densità del tessuto misurando cammino ottico ritardo di lunghezza (OPD) , che la diagnosi di cancro prospettive romanzo 16-18 e la quantificazione dei relativi infiammazione alterazioni dei tessuti 19. Inoltre, DHM consente il monitoraggio delle dinamiche morfologia delle cellule per determinare lo spessore delle cellule, cellule superficie coperta e intracellulare (proteine) la quantità di contenuti in vitro, DHM consente anche l'analisi dei processi fisiologici, ad esempio, permeabilità cellulare valutando variazioni di volume delle cellule e spessore 21,22. Inoltre, le misure DHM possono essere automatizzate che impedisce pregiudizi campione investigatore associato.

Qui, dimostriamo l'uso di DHM in un modello murino di infiammazione intestinale, e applichiamo anche DHM per l'analisi dei campioni di tessuti umani per il monitoraggio quantitativo di guarigione della ferita come un test in vitro senza etichetta. In primo luogo, valutiamo le alterazioni infiammatorie delle diverse pareti del colon-strati nei topi colitici e sezioni di tessuto da esseri umani con IBD. Dopo aver descritto la procedura di imaging fase quantitativa DHM, forniamo istruzioni dettagliate per l'uso dei componenti del microscopio, la preparazione di sezioni di tessuto e anche descrivere la valutazione delle immagini acquisite fase quantitativa.

Successivamente, dimostriamo che DHM può essere utizato per il monitoraggio continuo multimodale di epiteliale guarigione delle ferite in vitro, e descrivere l'analisi delle caratteristiche cellulari come spessore dello strato di cellule, massa secca e volume cellulare dare visione indotta da farmaci e cellule fisiologica alterazioni.

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Protocol

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal comitato regionale di etica (il Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, LANUV, Germania) in base alla legge tedesca sulla protezione degli animali. Il comitato etico locale dell'Università di Münster ha approvato l'uso di tessuti umani per l'analisi istologica e microscopio.

1. Gli animali e materiali

  1. Utilizzare femminile o topi maschi del ceppo DSS-sensibili richiesto che pesano da 20 a 25 g, e la casa in base alla legislazione cura degli animali locale. Fornire chow speciale per i roditori e autoclavato bere acqua ad libitum.
  2. Indurre la colite DSS acuta con la somministrazione di 3% w / v destrano solfato di sodio (DSS, peso molecolare: 36,000-50,000 Da) in acqua di rubinetto in autoclave per 5 giorni.
    NOTA: La potenza del DSS è molto variabile a seconda del produttore e batch. Metti alla prova la tua DSS fornitore-ha fornito prima per l'induzione dell'attività della malattia, per la quale dail peso corporeo glia è un indicatore affidabile e oggettivo.
  3. Per la valutazione istologica di campioni di tessuto del colon, eutanasia topi di CO 2 insufflazione (o come specificato dalle direttive nazionali ed istituzionali) alla fine dell'esperimento.

2. Setup sperimentale per DSS-colite e in vitro la guarigione della ferita Assays

  1. Colture cellulari e la creazione di test di guarigione delle ferite.
    1. Grow cellule Caco-2 in una umidità del 95% e 5% CO 2 ambiente a 37 ° C. Utilizzare media RPMI con siero fetale bovino al 10% (FBS) e 1% di penicillina / streptomicina.
    2. Seme cellule Caco-2 con una densità di 4 x 10 5 cellule / cm 2 a 35 mm Petri con alta cultura Inserisci (Figura 4A).
      NOTA: L'inserto genera due aree di celle coperte che sono separati con uno spazio libero cellulare definito che rappresenta l'area ferito da analizzare.
    3. Cambiare media due giorni dopo seeding. Eseguire per prima aspirazione di media residua con detriti cellulari utilizzando una pipetta automatica, sciacquare con 100 ml di tampone fosfato (PBS) e aggiungere media RPMI fresco o medio di siero-privato.
    4. celle di coltura per 24 ore in media di siero-privati ​​(0,1% FBS) integrata con 20 ng EGF / siero ml o 2 mg mitomicina c / ml di siero di rilevare alterazioni nel comportamento delle ferite guarigione. Aggiungere normale media RPMI per controllare le cellule per 24 ore.
    5. Dopo 24 ore di cultura, rimuovere ed eliminare gli inserti cultura come descritto al punto 3.4 ed eseguire DHM.
  2. Induzione della colite acuta DSS
    1. Sciogliere 3 g di DSS in 100 ml di acqua in autoclave per ottenere un 3% (w / v) DSS. Fornire questa soluzione al posto di acqua potabile per i topi ad libitum per 7 giorni. Calcolare 5 ml di DSS-soluzione per topo / giorno. Fornire acqua autoclavato senza DSS per topi di controllo ad libitum.
  3. Preparazione delle sezioni criostatiche di murine e colon umano
    1. Euthanize topi di CO 2 insufflazione alla fine dell'esperimento.
    2. Sezionare addome agli animali, laparotomia 23. Rimuovere l'intero colon accuratamente con una pinzetta e tagliare l'estremità ileale e del retto con le forbici chirurgiche. Tagliare il colon con una forbice longitudinalmente dalla cecale al fine rettale e aprire il colon. Rimuovere tutte le feci dal campione con una pinzetta seguita da lavaggio con PBS 24.
    3. Preparare rotoli svizzeri arrotolando l'intero colon con un cotone gemma longitudinalmente dalla cecale alla fine del retto con la mucosa curvato verso l'interno. Incorpora campioni del colon in temperatura ottimale di taglio (OCT) composto e tenere congelato a -80 ° C fino a nuovo uso.
    4. Incorpora tessuti del colon umano dal pezzo operatorio in ottimali di taglio di temperatura ottobre composto e tenere congelato a -80 ° C fino a nuovo uso.
    5. sezioni tagliate di 7 micron di spessore dei campioni OCT-composti-embedded con l'aiuto di un cryotome solo prima dell'esame.
      NOTA: Lo spessore del campione ottimale dipende dalla proprietà di diffusione del tipo di tessuto in esame persistenza e. Per gli esperimenti descritti utilizzando tessuti del colon, spessore della fetta> 10 micron causa importante aumento del rumore a causa di dispersione della luce in immagini quantitativi contrasto di fase DHM, mentre i campioni di spessore <5 micron mostrano un più alto rischio di danno indotto manufatti dal processo di taglio crio.
    6. Trasferimento sezioni su di un vetrino oggetto vettore.

3. Attrezzatura tecnica, software e le procedure per l'acquisizione e la valutazione di ologrammi digitali

  1. Microscopio olografico digitale per cellulare quantitativa e imaging dei tessuti
    1. Utilizzare un sistema di microscopia fuori asse Mach-Zehnder digitale olografica per l'imaging cellulare dal vivo 25, come mostrato in Figura 1. Assicurarsi che il microscopio è dotato di un10X microscopio lente, un palco microscopio con un supporto per diapositive carrier oggetti in vetro e piastre di Petri con diametro di 35 mm, una camera di riscaldamento per preservare temperatura fisiologica a 37 ° C e software per l'imaging fase quantitativa 25.
      NOTA: per esempio, come descritto in Kemper et al 26 e Langehanenberg et al 27...
      NOTA: In alternativa, utilizzare un sistema simile che è in grado di eseguire luminoso microscopia campo dell'imaging fase quantitativa delle cellule viventi e diapositive tessuto sezionato.
    2. Pulire la lente del microscopio e condensatore con carta di pulizia lente e un detergente (ad esempio, etanolo) come raccomandato dal produttore del microscopio per rimuovere polvere o altre contaminazioni.
    3. Avviare il software di acquisizione delle immagini del microscopio DHM, selezionare "campo chiaro" modalità di imaging e l'interruttore "on" illuminazione luce bianca. Garantire Köhler-illuminzione del campione come raccomandato dal produttore del microscopio osservando il campione nella finestra di imaging in tempo reale del software di acquisizione immagini (in alternativa un software di acquisizione immagini standard può essere utilizzato in questa fase).
      NOTA: L'intensità dell'immagine deve essere distribuito omogeneamente nel campo di vista e la posizione del campione non deve muoversi durante rifocalizzazione ottica con l'unità di messa a fuoco del microscopio.
    4. Selezionare la modalità "DHM" delle immagini, ruotare "off" illuminazione a luce bianca e l'interruttore "on" la luce laser. Verificare che l'illuminazione con luce laser è omogenea (cioè che l'intensità della luce è omogeneamente distribuito nella finestra di imaging in tempo reale del software di acquisizione di immagini del microscopio DHM) e osservare che il vettore modello frangia di interferenza fuori asse appare con sufficiente contrasto nel immagini catturate (ologrammi digitali).
  2. Preparazione di sezioni al criostato per l'imagingcon DHM
    1. Prendere (sezione criostato su un vettore oggetto di vetro, spessore: 7 micron, come descritto al punto 2.3) del campione dal congelatore. Scongelare il campione per circa 5 minuti a temperatura ambiente e l'atmosfera normale.
    2. Aggiungere 50 - 100 microlitri tampone fosfato salino (PBS) come mezzo di inclusione sulla sezione di tessuto usando una pipetta finché non è completamente coperto con tampone. Coprire il campione con una copertura di slittamento di vetro pulito (spessore del vetro 170 micron).
      NOTA: Over-essiccazione può indurre cambiamenti significativi dell'indice di rifrazione e proprietà dispersive del campione.
    3. Assicurarsi che la parte inferiore del supporto di vetro e il vetrino vengono puliti da polvere e altri contaminanti che possono indurre la dispersione della luce. Il campione è pronto per le indagini con campo chiaro microscopia e DHM.
  3. l'imaging fase quantitativa delle sezioni di tessuto con DHM
    1. Accendere il microscopio olografico digitale, scegliere la lente del microscopio 10X per l'imaging. Avviare l'isoftware di acquisizione mago del microscopio DHM e selezionare la modalità di imaging di file luminosi.
    2. Posizionare il vetrino tessuto come descritto in 2) nel supporto microscopio, con lo slittamento coperchio rivolto l'obiettivo del microscopio.
    3. Switch "sul" campo dell'illuminazione luminosa del microscopio DHM. Posizionare il campione con la fase di microscopio e verificare che l'area tessuto di interesse è visibile nella finestra di monitoraggio in tempo reale. Migliorare la nitidezza dell'immagine utilizzando l'unità di messa a fuoco del microscopio.
      NOTA: Oltre alla zona di interesse, una superficie di scorrimento senza tessuto dovrebbero essere presenti nel campo visivo.
    4. Catturare un'immagine campo chiaro del campione fortemente focalizzato utilizzando il software di acquisizione delle immagini.
    5. Selezionare "DHM" modalità di imaging, girare "off" la luce di illuminazione bianca e girare "on" l'illuminazione luce laser. Selezionare il "tempo di esposizione" per la registrazione ologramma di sotto del 3 ms, osservare che holographic fuori asse frange di interferenza appaiono con un adeguato contrasto nella finestra di imaging dal vivo del software di acquisizione delle immagini e catturare un ologramma digitale.
    6. Ripetere i punti 3.3.3 - 3.3.5 fino a quando sono stati registrati un numero sufficiente di immagini in campo chiaro e ologrammi digitali di diverse aree campione. acquisizione Ologramma è ora completa.
  4. Preparazione del test guarigione della ferita per l'imaging DHM
    1. Accendere il Petri camera di riscaldamento piatto del microscopio DHM circa 1 - 3 ore prima dell'inizio dell'esperimento di assicurare condizioni di temperatura stabili durante le misure DHM.
    2. Preparare banco di lavoro con le attrezzature necessarie (piastra Petri per ferita saggio guarigione è descritto al punto 2.3): pipette, pinzette, coperchio in vetro per la capsula di Petri, 4- (2-idrossietil) Acido -1-piperazineethanesulfonic (HEPES) tamponata terreno di coltura cellulare con fisiologica temperatura (37 ° C) per la preparazione del campione in ambiente sterile.
      NOTA: 3.
    3. Rimuovere il coperchio di plastica dalla piastra di Petri e rimuovere il mezzo di coltura cellulare con una pipetta. Rimuovere l'inserto dal fondo piatto Petri usando pinzette.
    4. Lavare il campione 1 - 2 volte con 1 ml tamponata con HEPES terreno di coltura delle cellule per rimuovere le cellule morte e restanti componenti cellulari (per esempio, siero) nell'area della ferita. Aggiungere 2 ml di HEPES tamponato mezzo di coltura cellulare e tappare la piastra di Petri con il coperchio in vetro.
    5. Assicurarsi che il coperchio in vetro e il piatto fondo di Petri sono state pulite da polvere e altre contaminazioni. Campione è pronto per l'osservazione lasso di tempo con DHM.
  5. Monitoraggio multimodale continuo di guarigione della ferita in vitro con DHM
    1. Accendere il Petri camera di riscaldamento piatto del microscopio DHM circa 1 - 3 ore primaall'inizio dell'esperimento di assicurare condizioni di temperatura stabili durante le misure DHM.
    2. Switch "a" microscopio olografico digitale, selezionare la lente del microscopio 10X per l'imaging. Avviare il software di acquisizione delle immagini del microscopio DHM e selezionare "campo chiaro" modalità di imaging. Assicurarsi che la camera di riscaldamento per il piatto Petri opera una temperatura fisiologica (37 ° C).
    3. Porre la capsula di Petri con la guarigione della ferita test, preparato come descritto in 4), nella camera di riscaldamento del microscopio DHM.
    4. Selezionare la modalità di imaging campo luminoso e posizionare il campione con palco microscopio osservando nella finestra di monitoraggio dal vivo del software di acquisizione delle immagini del microscopio DHM. Si osservi che l'area desiderata del campione appare fortemente concentrata sotto illuminazione luce bianca.
    5. Cattura immagini luminose di campo di diverse aree del campione (zona della ferita e le zone circostanti con le cellule confluenti) sotto biancoilluminazione a luce con il software di acquisizione immagini e l'aspetto del documento, densità cellulare e omogeneità.
    6. Selezionare "campo chiaro" modalità di imaging del microscopio DHM. Scegliere la zona della ferita sotto la luce di illuminazione bianca nella finestra di sorveglianza in tempo reale con il software di acquisizione delle immagini del microscopio DHM. Assicurarsi che la zona della ferita è libera da cellule morte e non resti siero, e assicurarsi che entrambe le parti comprendono un singolo strato di cellule omogenee, preferibilmente con i bordi dritti.
    7. Catturare un'immagine luce bianca della ferita iniziale in modalità campo dell'imaging luminoso con il software di acquisizione delle immagini del microscopio DHM.
    8. Turn "off" illuminazione a luce bianca, selezionare la modalità "DHM" e l'interruttore "on" illuminazione laser. Selezionare un tempo di esposizione di sotto di 3 ms per la registrazione di ologramma (osservare che olografica fuori asse frange di interferenza appaiono con un adeguato contrasto nella finestra di imaging dal vivo del software di acquisizione immagini di tegli DHM microscopio) e catturare un ologramma digitale.
    9. Cattura un ologramma campione in modalità DHM con il software di acquisizione immagini e ricostruire un'immagine quantitativa fase con il software di ricostruzione del microscopio DHM per controllare la qualità dell'immagine.
    10. Selezionare un adeguato intervallo di tempo (ad esempio, 3-5 min) per l'acquisizione ologramma time-lapse con il software di acquisizione delle immagini del microscopio DHM.
    11. Selezionare la modalità di acquisizione time-lapse del software di acquisizione delle immagini in cui il campione è illuminato solo con la luce laser durante l'acquisizione ologramma.
    12. Avviare l'osservazione DHM time-lapse del test guarigione delle ferite.
    13. Fermare l'acquisizione time-lapse dopo il tempo previsto, selezionare la modalità di imaging campo luminoso e documentare l'aspetto finale del campione in immagini luce bianca.
  6. Ricostruire ologrammi digitali dei tessuti sezionati e determinare l'indice medio di rifrazione come parametro per quantificaredensità dei tessuti
    1. Ricostruire immagini fase quantitativa dai ologrammi digitali dei tessuti sezionati con il software del microscopio DHM, ad esempio, come descritto in Kemper et al. 26 e Langehanenberg et al. 27.
    2. Determinare il contrasto di fase Δφ media in diversi strati di tessuto (epitelio, sottomucosa, stroma) nelle regioni opportunamente scelti di interesse (ROI) 19.
    3. Determinare l'indice di rifrazione del mezzo di inclusione utilizzando un rifrattometro oppure utilizzando un valore appropriato dalla letteratura. (valori di indice di rifrazione per tipico dei media incorporamento: n acqua = 1.334 28, n tampone fosfato (PBS) = 1.337 29, n mezzo di coltura cellulare = 1,337-1,339 29,30).
    4. Calcolare gli indici di rifrazione diversi strati di tessuto da valori del contrasto di fase media 19
      Equazione 1 NOTA: In Eq. 1 λ è la lunghezza d'onda della luce laser (qui: λ = 532 nm), D lo spessore dei tessuti sezionati (qui: 7 micron) e n media è l'indice di rifrazione del mezzo di inclusione (qui: n medium = n PBS = 1.337, determinato da un Abbe-Rifrattometro).
  7. Ricostruire e valutare ologrammi digitali dal time-lapse la guarigione della ferita osservazione serie
    1. Ricostruire immagini fase quantitativa della serie lasso ologramma tempo ottenuto durante l'osservazione guarigione della ferita con il software microscopio DHM 26,27.
    2. Normalizzare ogni serie di immagini fase quantitativa per l'immagine con il massimo contrasto di fase.
    3. Determinare l'area S c che è coperto dalle cellule nelle immagini fase quantitativa DHM di segmentazione delle immagini, che può essere performato usando la cella di profiler del software libero (www.cellprofiler.org 31).
    4. Calcolare il contrasto di fase media della cellule cellule Δφ nella zona S c.
    5. Recuperare il DM massa secca cellulare dalla media contrasto di fase Δφ cella nella zona S c 15
      Equazione 2 (2)
      NOTA: In Equazione 2 DM indica la massa secca cellulare, S c presenta l'area che è occupato dalle cellule e α = 0,002 m 2 / kg.
    6. Determinare il cellulare rifrazione cellule indice n integrale e l'indice di rifrazione del mezzo n mezzo di coltura cellulare. Determinare cella n separatamente sperimentalmente da cellule in sospensione come descritto nel 30 e misurare media n con un rifrattometro. Alternavamente utilizzare i valori di letteratura per la cella n 30 e n media 29,30.
    7. Calcolare il d cellulare medio spessore cellulare da λ, cellule Δφ, n cellulare e n media 26,32
      Equazione 3 (3)
      NOTA: In Eq. 3 la cella parametro d è lo spessore medio delle cellule, λ denota la luce di lunghezza d'onda della luce laser, cellule Δφ indica il contrasto di fase media, e n cellulare e n medie sono l'indice di rifrazione cellulare integrato e l'indice di rifrazione del mezzo circostante.

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Representative Results

Configurazione tipica per DHM Imaging per Digital olografico microscopia (DHM)

Per eseguire l'imaging campo chiaro e imaging quantitativo contrasto di fase DHM, abbiamo applicato un microscopio rovesciato come illustrato in Figura 1 B. Il sistema è stato modificato collegando un modulo DHM, come descritto in precedenza 25. Ologrammi digitali sono stati generati dall'illuminazione il campione con la luce di una frequenza raddoppiata Nd: YAG laser λ = 532 nm) in configurazione Mach-Zehnder (Figura 1 A). Tessuti sezionati sono stati analizzati ex vivo su vetrini supporto di vetro. Superficie colture cellulari sono state osservate in piatti Petri speciali per osservare la guarigione della ferita, come mostrato in Fig. 1 C. I campioni sono stati ripresi nell'illuminazione trasmissione attraverso un 10X miLente croscope (NA = 0,3) e una lente del tubo. Una fotocamera del dispositivo ad accoppiamento di carica è stato utilizzato per registrare i modelli di interferenza (digitali ologrammi fuori asse) generati sovrapponendo l'immagine campione (onda oggetto) con l'onda di riferimento leggermente inclinato. Gli ologrammi catturati digitalmente sono stati ricostruiti per fase spaziale spostamento ricostruzione in combinazione con messa a fuoco automatica opzionale olografica 26,33.

La valutazione di Murine DSS-indotta colite da DHM

colite acuta è stata indotta in topi con la somministrazione di 3% w / v destrano solfato sodico (DSS) in acqua potabile per 5 giorni. La manifestazione e corso di colite è stata seguita da monitoraggio per progressiva perdita di peso nel gruppo DSS-trattati rispetto al gruppo di controllo. (Figura 2 A adattato da 19). Endoscopica, da moderata a grave colitis è stato osservato come risulta da un ispessimento della parete del colon, alterazioni del pattern vascolare (ad esempio, sanguinamento spontaneo, freccia rossa), essudati fibrina (freccia bianca) e granularità della superficie mucosa (Figura 2B). Valutazione istologica convenzionale di ematossilina e eosina (HE) macchiato sezioni del colon rivelato marcato edema nella parete del colon del DSS trattati versi animali di controllo, prevalentemente situati nella sottomucosa (Figura 2 C grigio freccia). Corrispondente immagini contrasto di fase quantitativa DHM e le relative mappe di indice di rifrazione recuperati dalla Equazione 1, anche raffigurato le alterazioni dei tessuti di cui sopra. Inoltre, l'indice di rifrazione, codificato a 256 livelli di grigio, indicato differenze di densità in strati di tessuto compreso l'epitelio (freccia bianca) e stroma (freccia nera) in campioni di tessuto, non colorati nativi (Figura 2 C). L'indice di rifrazione è stata significativamente ridotta nell'epitelio, nonché nella sottomucosa e stroma dei topi colitici rispetto ai controlli sani (Figura 2 E). Inoltre, potrebbe essere osservata una correlazione significativa tra il parametro clinico (relativa perdita di peso corporeo) e il parametro fisico assoluto (indice di rifrazione) (R 2 = 0.64 lineare; la figura 2 D, adattato da 19).

La valutazione della malattia di Crohn in esseri umani per DHM

malattia di Crohn è spesso identificato da alterazioni infiammatorie notevoli della parete intestinale, rilevate mediante endoscopia gastrointestinale. caratteristiche macroscopiche caratteristiche compongono di granularità della superficie della mucosa, ulcere longitudinali con fibrina exudationi (indicato anche come "sentieri lumaca") e sanguinamento spontaneo (Figura 3 A). la valutazione istologica da SE colorazione dei campioni di tessuto da pazienti con CD attiva spesso rivelano parete del colon, così come l'edema della sottomucosa. Corrispondente immagini contrasto di fase quantitativa DHM e le relative mappe di indice di rifrazione recuperati dalla Equazione 1 anche rilevato infiammatoria mediata valorizzazione / rigonfiamento della parete del colon, qui visto nell'epitelio (Figura 3 B). Inoltre, l'indice di rifrazione come parametro assoluto, è stato significativamente ridotto in tutti gli strati della parete (epitelio, stroma e sottomucosa) in campioni di tessuto del colon da pazienti con CD attiva versi quelli in remissione (Figura 3 C).

Il monitoraggio multimodale di guarigione della ferita in vitro

cellule Caco-2 ferita guarigione test sono stati eseguiti utilizzando uno speciale capsula di Petri per fornire condizioni standardizzate. Il piatto è dotato di un inserto cultura formando due camere diverse, che sono separate da una distanza di 500 micron (Figura 4). Per simulare diversi ambienti fisiologici, le cellule sono state esaminate o senza trattamento, stimolata dal fattore di crescita epidermico (EGF) o inibita con mitomicina C. La configurazione DHM consente il monitoraggio continuo della ferita processo nel corso del tempo di guarigione, rappresentata qui da immagini rappresentative quantitativi DHM contrasto di fase (codificati a 256 livelli di grigio) dopo 0, 22,5 e 45 ore dopo l'inizio dell'esperimento (Figura 4 B). Corrispondente falsi trame pseudo 3D colorati in figura 5 illustrano lo sviluppo spaziale dello spessore dello strato di cellule in tre dimensioni. Basato sul percorso ritardo lunghezza ottica, l'indice di rifrazione cellulare e equazioni 2 e 3, DHM permette valutazione dinamica simultanea di migrazione, la proliferazione e la morfologia dal monitoraggio temporale caratteristiche cellulari quali cellule superficie coperta, spessore medio delle cellule e massa secca cellulare ( Figura 4 C). In sintesi, i dati nella Figura 4 illustrano che i risultati della simulazione EGF in una migrazione più rapida di cellule nell'area della ferita, in un aumento dello spessore medio di cellule e in una massa secca superiore nel campo visivo rispetto alle cellule di controllo. Al contrario, mitomicina c cellule inibite coprono una lieve diminuzione della superficie di cellule di controllo nel corso dell'esperimento e mostrano anche un aumento di massa secca leggermente inferiore. Tuttavia, lo spessore medio cella appare chiaramente diminuita rispetto sia, stimolato e cellule di controllo.


Figura 1. Utilizzato Setup fuori asse per Digital olografico microscopia (DHM). Impostazione schematica della stazione di lavoro DHM (A). Corrispondente fotografia raffigurante la configurazione microscopio (monitor, l'immagine dal vivo e software di controllo (1), fuori asse configurazione microscopio digitale (2), (B), il percorso ottico del microscopio (verde linea tratteggiata) e un campione (indicato dal rosso freccia; (C)). clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2. La valutazione di Murine DSS-indotta colite da DHM. Il corso di colite è stata seguita da me tutti i giorniasurement di relativa peso corporeo e l'esame di follow-up endoscopico ripetuto. Una massiccia perdita di peso corporeo relativo dal giorno 4 dopo l'inizio della somministrazione DSS (adattato da 19) (A) è stato accompagnato da segni endoscopici di colite stabilito tra ulcerazioni focali e la vulnerabilità della mucosa (B). Analisi delle tradizionali sezioni criostatiche HE-macchiati rivelato l'edema della sottomucosa, ispessimento della muscolare e un marcato infiltrato infiammatorio della mucosa nella mucosa. Corrispondente immagini contrasto di fase quantitativa DHM e le relative mappe di indice di rifrazione recuperati dalla Equazione 1 (codificato a 256 livelli di grigio) ha confermato i cambiamenti edematosa della sottomucosa durante il processo infiammatorio (freccia bianca indica epitelio, sottomucosa grigio e stroma nero) (C). La relativa perdita di peso corporeo (un parametro clinico) significativamente correlata con l'indice di rifrazione (un parametro fisico assoluto, R 2 = 0.6 linear4; (D), adattato da 19), che è stata significativamente ridotta nell'epitelio nonché nella sottomucosa e stroma dei topi colitici rispetto ai controlli sani (media ± SEM, *** P <0,001;. E) Cliccando qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. Valutazione della malattia di Crohn in esseri umani da DHM. Campioni di tessuto del colon da pazienti con malattia endoscopicamente ed istologicamente confermato di Crohn sono stati esaminati (A). HE-colorazione visualizzata allungamento delle cripte della mucosa e un marcato infiltrato di cellule infiammatorie. Inoltre, è stato rilevato sottomucosa l'edema e l'allargamento della muscolare propria. Analisi del corrispondendo immagini contrasto di fase quantitativa DHM e le relative mappe di indice di rifrazione recuperati dalla equazione (1) (codificato a 256 livelli di grigio) anche rivelato cambiamenti edematosi (qui indicati da una stella bianca e nera) nell'epitelio (B). Differenze significative nella indice medio di rifrazione sono stati rilevati nei campioni di pazienti celiaci con il chiarore attiva (barre chiare) o lo sgravio (barre nere). Queste differenze sono visti in ogni tipo di tessuto (media ± SEM, *** p <0.001; C). Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4. Monitoraggio delle epiteliale la guarigione delle ferite White Light Microscopia e DHM. Le cellule coltivate erano transferred in piastre di Petri con inserti speciali (freccia rossa). Prima di inserti di coltura sono stati rimossi, le cellule sono stati trattati con EGF o mitomicina C per 24 ore, o trattate con il solo mezzo (controllo non stimolate) (A). Dopo la rimozione di inserti cultura, la guarigione delle ferite è stata costantemente monitorata da immagini a contrasto di fase da DHM nel corso del tempo. contorni cellulari potrebbero essere chiaramente riconosciuti. Immagini contrasto di fase rappresentativi quantitativi DHM sono mostrati all'inizio dell'esperimento, dopo 22.5 ore e alla fine della misurazione dopo 45 ore (B). Panel (C) mostra i corrispondenti cambiamenti temporali nella superficie cellulare coperto (S c), lo spessore medio di cellule (cellule d) e il cellulare massa secca (DM). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.


Figura 5. Illustrazione della cella strato Morfologia modifiche da falsi Pseudo 3 Parcelle D color-coded del contrasto Immagini quantitativa DHM fase. Rappresentativi falsi colori diversi appezzamenti pseudo 3D delle immagini contrasto di fase quantitativa DHM in figura 4B a t = 0, dopo 22,5 ore e al termine della misura dopo 45 ore, illustrare lo sviluppo territoriale dello spessore di strati di cellule per controllo-, mitomicina C-inibita e le cellule EGF-stimolata in 3D. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Abbiamo dimostrato che DHM fornisce una valutazione accurata del danno istologico in modelli murini colite e campioni ex vivo di tessuto del colon umano. Inoltre, abbiamo mostrato DHM può monitorare continuamente epiteliale guarigione della ferita mentre fornendo allo stesso tempo informazioni multimodale su alterazioni cellulari. In DHM, la ricostruzione di ologrammi catturate digitalmente viene eseguita numerico 32. Pertanto, in confronto al campo chiaro microscopia, contrasto di fase Zernike e microscopio a contrasto di interferenza differenziale, DHM fornisce contrasto di fase quantitativa con possibilità di correzione successiva messa a fuoco numerica (imaging multi-fuoco) 27. Imaging fase quantitativa si basa sulla determinazione delle variazioni di lunghezza di percorso ottico e quindi è altamente indipendente dal dispositivo di misurazione utilizzato. Questo semplifica il confronto dei dati di misura che vengono acquisiti con strumenti diversi. Inoltre, DHM richiede solo bassa intensità di luce per objeilluminazione ct. Ciò consente un'analisi minimamente invasiva dei tessuti sezionati non colorati e riduce al minimo la quantità di interazione campione richiesto durante le osservazioni time-lapse a lungo termine di cellule viventi.

L'armamentario terapeutico per IBD è notevolmente ampliato nel corso degli ultimi due decenni. Oltre l'introduzione di anti-TNF terapie-α, che sono efficaci sia in UC e CD e hanno effetto profili accettabili, romanzo e anticorpi specifici mirati integrine sono stati recentemente introdotti nella pratica clinica 34-37. Diversi altri agenti promettenti sono attualmente in corso di valutazione per la loro efficacia terapeutica nelle IBD 38-40. Tuttavia, prima di uso clinico negli esseri umani, l'efficacia e la sicurezza di questi potenziali terapie deve essere dimostrato in studi su animali. La colite DSS-indotta è uno dei modelli murini colite uso più frequente, a causa della sua elevata riproducibilità e bassi costi 23. Inoltre, questo modello può alcosì essere applicata a topi geneticamente modificati ceppi 41. Mentre gli indicatori sistemiche, ad esempio, CRP, sono molto variabili in modelli animali, la valutazione istologica del colon rappresenta l'approccio più valido per valutare la gravità della malattia 42,43. Tuttavia, la valutazione quantitativa di infiammazione istologica secondo i sistemi di punteggio è fortemente dipendente dalle competenze investigatore ed esperienza. Valutazione automatizzata e il punteggio da parametri oggettivi possibile con DHM supera queste limitazioni, ed inoltre è anche risparmio di tempo, evitando la necessità per la colorazione 19. Inoltre, DHM può essere utilizzato per esaminare campioni colon chirurgici nonché campioni di mucosa ottenuti durante l'endoscopia.

rigenerazione epiteliale e la guarigione delle ferite è un meccanismo fondamentale nel corso di diversi processi patologici tra cui ulcere gastrointestinali o perdite anastomotica. Mentre ci sono promettenti approcci per valutare epiteliale guarigione della ferita in vivo 44, queste tecniche richiedono sofisticati strumenti di esame e al momento non ampiamente disponibili. Pertanto, attualmente guarigione epiteliale è comunemente studiata mediante saggi in vitro e vinci 9. Questi test permettono l'esame valido di chiusura della ferita, ma di solito prima richiedono la colorazione delle cellule, che impedisce quindi ripetuta la valutazione 10,45. Inoltre, non ci sono dati di alterazione cellulare possono essere acquisiti in parallelo con questa configurazione sperimentale. Tuttavia, queste informazioni possono essere di notevole importanza in quanto può essere utilizzato per distinguere tra apoptosi e necrosi 46 e per valutare la proliferazione cellulare e la migrazione 46. Pertanto, la possibilità di determinare lo spessore delle cellule, massa secca o densità del tessuto contemporaneamente al monitoraggio della chiusura della ferita mediante esame DHM è di alto valore nella ricerca mucosa.

Gli obiettivi del trattamento per i pazienti con malattia infiammatoria intestinale umani sono stati in costante evoluzione negli ultimi decenni <sup> 47. Mentre inizialmente il controllo dell'infiammazione è stato considerato di primaria importanza, dopo la remissione di steroidi-libero e ora guarigione della mucosa sono obiettivi primari di trattamento 48. Recentemente, è stato ipotizzato che la remissione istologica può anche essere superiore alla guarigione della mucosa solo 49. Tuttavia, mentre ci sono alcuni sistemi di punteggio istologici disponibili per IBD umana, la variabilità inter-osservatore rimane alto 50. Pertanto, vi è la necessità di un approccio standardizzato per la valutazione dei campioni istologici colon. DHM può contribuire a questo obiettivo e dovrebbe essere ulteriormente valutata in uno studio clinico prospettico con IBD pazienti umani.

Nella procedura sperimentale presentato, i campioni sono illuminati e ripreso con luce laser altamente coerente. Pertanto, la risoluzione in DHM è principalmente limitata dalla dispersione e diffrazione effetti di luce causato dal disallineamento della illuminazione del campione, campioni di spessore, polvere oaltre impurità quali acqua condensato nel percorso ottico. Al fine di ottenere i dati di misurazione ad alta precisione da immagini quantitativi di fase DHM contrasto, un'attenta preparazione e l'allineamento del setup DHM e il campione sono i passi più importanti del protocollo. Accuratamente puliti elementi di imaging ottico, in particolare l'obiettivo del condensatore del microscopio e il microscopio, sono tenuti a ridurre al minimo il rumore. Inoltre diapositive campione carrier, Petri piatto fondo e coperchio, nonché il terreno di coltura cellulare utilizzato deve essere esente da impurità particolato. Ciò si ottiene pulendo accuratamente tutti i componenti e adeguata filtrazione dei liquidi applicati.

Più dettagliate difficoltà di ripresa suggerimenti sono i seguenti: se l'ologramma digitale e / o le immagini in fase DHM quantitativi di tessuti dissezionati sono rumorosi, il vettore di vetro e copertura di slittamento possono essere contaminati con la polvere. In tal caso, pulire il supporto di vetro e il coperchio antiscivolo con alcool (ad esempio, etanolo puro). Se la spessaness del tessuto sezionato è troppo grande (> 10 micron) e, quindi, si traduce in dispersione della luce, provare a utilizzare sezioni di tessuto più sottili. Nel caso in cui l'illuminazione con luce laser non è omogeneamente distribuito, allineare l'illuminazione dell'oggetto tramite l'microscopi condensatore. Se l'acqua condensata sul fondo del coperchio di vetro induce effetti dispersione, controllare la temperatura della camera di riscaldamento e umidità ambiente. Nel caso la densità cellulare è troppo alta o crescita cellulare in più di uno strato, ridurre la densità delle cellule durante la preparazione dei dosaggi guarigione di ferite. Infine, come DHM si basa sul principio della interferometria, il metodo è sensibile alle vibrazioni o altri disturbi meccanici, che variano a seconda dell'ambiente singolo laboratorio. Tuttavia, tali influenze solito possono essere minimizzati tempi di esposizione adeguatamente scelti (tipicamente nella gamma di millisecondi o inferiore) per la registrazione olografia durante la preparazione del setup sperimentale.

In sintesi, I nostri risultati dimostrano che DHM detiene importanti vantaggi rispetto campo chiaro e contrasto di fase le tecniche di imaging microscopia esistenti, come contrasto di fase Zernike e DIC grazie alla sua capacità di valutare quantitativamente l'infiammazione istologica ex vivo in modo quasi automatico. Inoltre DHM consente di valutazione multimodale continua senza etichetta epiteliale guarigione delle ferite in vitro con l'interazione minimizzato con i campioni. Questo spiana la strada per esame istologico automatizzata in termini di '' patologia digitale '' e ulteriori studi estesi per esplorare il potenziale di traslazione del DHM su pazienti con IBD. Inoltre, DHM offre romanzo in vitro opportunità di studiare quantitativamente la migrazione cellulare, la morfologia e la proliferazione.

La traduzione del DHM nella pratica clinica ha il potenziale per migliorare la diagnostica IBD. Come DHM consente la quantificazione di diversi gradi di infiammazione intestinale tramiteparametri fisici come variazioni di densità, una valutazione obiettiva e precisa della malattia nel senso di una "patologia digitale" sembra possibile. La valutazione oggettiva può avere un impatto importante sulla gestione clinica dei pazienti con malattia infiammatoria intestinale.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Azoxymethane (AOM) Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany A5486
Cell Culture Flask Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany 658170
Costar Stripette Corning Inc., New York, USA 4488
Dextran sulphate sodium (DSS) TdB Consulatancy, Uppsala, Sweden DB001
DMEM/Ham's F12 PAA Laboratories - Pasching - Austria E15-813
EGF Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany SPR3196
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany E 9884
Falcon Tube 50 ml BD Biosciences, Erembodegem, Belgium 352070
Isopentane (2-Methylbutane) Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany M32631-1L
Methylene blue Merck, Darmstadt, Germany 1159430025
Mitomycin C Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany M4287
Microscope Slides G. Menzel, Braunschweig, Germany J1800AMNZ
O.C.T. Tissue Tek compound                                  Sakura, Zoeterwonde, Netherlands 4583
Pen/Strep/Amphotericin B Lonza, Verviers, Belgium 1558
Phosphate buffered saline, PBS Lonza, Verviers, Belgium 4629
RPMI 1640 Lonza, Verviers, Belgium 3626
Sodium Chloride 0.9% Braun, Melsungen, Germany 5/12211095/0411
Standard diet Altromin, Lage, Germany 1320
Tissue-Tek Cryomold Sakura, Leiden, Netherlands 4566
Trypsin EDTA Lonza, Verviers, Belgium 7815
Vitro – Clud R. Langenbrinck, Teningen, Germany 04-0002 
 µ-Dish 35 mm with Culture-Insert, high ibidi GmbH, Munich, Germany 81176
DIC Lid for µ-Dishes, with a glass insert ibidi GmbH, Munich, Germany 80050
Equipment
MICROM HM550 Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, USA 46320
Digital holographic microscope
Component Model Company
Inverted Microscope iMIC Till Photonics, Graefelfing, Germany
Laser Compass 315M Coherent GmbH, Luebeck, Germany
Microscope lens Zeiss EC Plan Neofluar 10x/0.3 Zeiss, Goettingen, Germany
CCD camera DMK 41BF02 The Imaging Source, Bremen, Germany

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