用于细胞培养应用光介导的形成和构图的水凝胶

Bioengineering
 

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Sawicki, L. A., Kloxin, A. M. Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications. J. Vis. Exp. (115), e54462, doi:10.3791/54462 (2016).

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Abstract

点击化学已被研究用于大量生物材料的应用,包括药物递送,组织工程和细胞培养。特别是,光介导的点击反应,如光引发硫醇 - 烯和硫醇炔反应,得到过的材料特性的时空控制,并允许系统的设计具有高度用户控制的特性的控制。制造和使用由光以及由这些硫醇-X photoclick化学提供的多功能性,得到精度基于水凝胶的生物材料的变形是越来越大的兴趣,特别是对于细胞的明确定义的,仿生的微环境中的培养。在这里,我们描述了细胞,并使用由硫醇 - 烯photoclick聚合反应灵活,模块化的构造块水凝胶基质内生化线索的后续光图案的photoencapsulation方法。具体地讲,一种方法提出了共从烯丙氧基羰nstructing水凝胶(的Alloc)-functionalized肽交联和挂件肽部分和硫醇官能化的聚(乙二醇)(PEG),在锂acylphosphinate光引发剂和细胞相容性剂量长波紫外(UV)光的存在下迅速聚合。轻便的技术来可视化光图案和量化描述加入的肽的浓度。此外,方法,是为包封细胞,特异性人类间质干细胞,并确定其活性和活性。而形成与硫醇的alloc水凝胶的初始图案显示在这里,这些技术广泛地可应用于其他一些光以及自由基引发材料系统( ,巯基降冰片烯,硫醇-丙烯酸酯)的生成图案化衬底。

Introduction

点击化学在对众多的生物医学应用,包括药物递送,组织工程,和受控的细胞培养材料的设计越来越多地使用的,由于其选择性的,有效的,并且经常细胞相容性的反应性。这利用光触发1-3 Photoclick化学或引发反应( 例如 ,叠氮化物-炔,4-硫醇-烯,5和四唑-烯烃6)是用于生物材料的形成或修改特定的兴趣。温和的条件和何时以及控制那里发生的光使这些反应非常适合于细胞的存在的生物材料性能的用户控制的控制。-7,8-具体地说下快速率,硫醇-烯photoclick化学已被用于以生成具有强大的机械性能5,9和用于多种细胞类型,包括,但封装基于水凝胶的生物材料不电讯有限公司于,人类间质干细胞(hMSCs),成纤维细胞,软骨细胞和胰腺癌细胞,用细胞培养和交付承诺。-10,11-此外,这些化学品已被用于生化线索的空间图案来模仿的关键方面天然细胞微环境和促进适当的细胞-基质相互作用,包括粘附,分化和侵入。3,12

用于与光硫醇-烯水凝胶,含有半胱氨酸(硫醇)肽通常是具有与细胞相容性的条件下快速,光引发聚合的丙烯酸酯或降冰片烯('烯')官能化的聚合物进行反应。建设13展开该工具箱,我们试图建立对于水凝胶的形成与所需的最少的合成处理或者是对他们的合成细胞外基质广泛使用市售新品多功能和可访问的构建块的方法。14具体来说,肽用氧羰修改(的Alloc)保护赖氨酸:一个吊坠,整联蛋白结合组来促进细胞粘附[K(ALLOC)GWGRGDS = Pep1Alloc]或两个非降解或细胞降解的交联[K( ALLOC)RGKGRKGK(ALLOC)G或KK(ALLOC)GGPQGIWGQGK(ALLOC)K = Pep2Alloc,分别]。与这些序列中,分别建立了快速反应(1-5分钟)四臂硫醇改性聚使用细胞相容性剂量长波长UV光(10毫瓦/ cm 2的在365nm处)和(乙二醇)(PEG4SH)的条件下光引发剂的锂苯基-2,4,6- trimethylbenzoylphosphinate(LAP)。所得水凝胶是数周的细胞培养条件下是稳定的。以使细胞驱动的降解和重塑,酶可切割的肽凝胶交联( ,GPQGIWGQ),15和模型的初级细胞,人类间质干细胞(hMSCs)内引入,仍然封装和都灵后高度可行这些矩阵内摹文化。此外,肽已被空间地这些材料中图案化,和的hMSCs保持存活和光图案化的条件下代谢活性。备用挂件肽序列,这里未示出( 例如 ,IKVAV,YIGSR,GFOGER ),也可以矩阵内掺入探测与周围的微环境额外细胞相互作用。这些结果是有希望的为这些基于水凝胶的材料的应用为三维(3D)细胞培养和输送来研究和直接的细胞 - 基质相互作用为多种细胞类型。

此处,方法photoencapsulate细胞和所提出的水凝胶系统内随后photopattern生化线索呈现( 图1)。技术来观察,也量化这些photopatterns被证明:值得注意的是,ⅰ)的定量和定性用埃尔曼的测定法来确定modifica的图案的基板和ii)互补的定性使用荧光肽(AF488Pep1Alloc)的范围内的免费硫醇重刑在三个层面观察这些模式。此外,分析以确定存活力(活/死活力/细胞毒性染色)和代谢活性(MTS; 3-(4,5-二甲基-2-基)-5-(3-羧基甲氧基)-2-(4-磺苯基) -2H四唑)呈现,使用户可确定为水凝胶基质中的不同细胞系photoencapsulation和光图案化条件下细胞相容性。虽然展示了一个浅显基于光的photoclick水凝胶系统中的协议,该技术可以在细胞的存在可以应用于对photoencapsulation和光图案许多其它自由基引发的水凝胶系统。

Protocol

1.水凝胶形成材料的制备

  1. 通过标准固相肽合成(SPPS)为端基修饰(PEG4SH)技术和硫醇官能化的聚合物通过三个步骤过程合成挂件(Pep1Alloc,AF488Pep1Alloc)和交联肽(Pep2Alloc)14,16可替代地,购买PEG4SH(M N〜20 kDa的),Pep1Alloc和Pep2Alloc商业。
  2. 通过下述两步反应合成的光引发剂(LAP)。14,17执行的合成步骤(1.2.1-1.2.11)在通风橱和处理化学品时要谨慎(戴防护手套,衣服和眼镜) 。 LAP也可以购得。
    1. 干所有的玻璃烤箱(> 2小时,80℃)。
    2. 搅拌棒添加到空单颈圆底烧瓶(100毫升),并盖有隔膜。
    3. 固定在磁搅拌热板具有环形支架和夹子的顶部烧瓶中。
    4. 一世nsert通过隔膜的针(18 G)和离开所述外端向大气开放。插入连接于惰性气体管线的第二针。打开惰性气体管线( 例如 ,氩气或氮气)并吹扫烧瓶10-15分钟。
      注:该系统将用惰性气体,氩气或氮气被连续地吹扫,整个反应。
    5. 转移将1.5g(〜1.4ml)中二甲基苯基亚(注意)至烧瓶中,用注射器针头穿过隔膜刺穿。开启搅拌板(中速)和要小心,内容物不飞溅到烧瓶的侧面。
    6. 1.6克(〜1.46毫升)2,4,6-三甲基氯化铵(警告)滴加到含有二瓶苯基亚,使用注射器带针来刺穿隔膜。
    7. 覆盖箔的反应容器避光,搅拌在氩气或氮气18小时。
    8. 第二天,提高该烧瓶的高度,放置在油浴上的搅拌器,一个ND小心地将烧瓶放入油浴中。热浴,将烧瓶至50℃,同时保持磁力搅拌。
    9. 溶解3.05克溴化锂在50ml 2-丁酮。养烧瓶从油浴和溴化锂溶液添加到圆底烧瓶中,将简要地除去隔膜倒入烧瓶中。
      1. 与隔膜再次密封该烧瓶(小心:隔仍会有通往氩线和针泄的针),降低烧瓶放回加热油浴中,并允许反应进行10分钟。固体沉淀就会形成。
    10. 10分钟后,关闭氩气,从热除去烧瓶中,使混合物静置4小时(用箔覆盖作为光敏引发剂已经产生,以避光。保持排气针的地方。
    11. 产品倒成玻璃砂芯漏斗或漏斗适当的滤纸衬里。用50ml 2-丁酮于r的冲洗滤液3次emove未反应的溴化锂。
    12. 干燥(第一上台式,然后在真空干燥器中),并在D 2 O.由1 HNMR分析产物在1.8-1.9(6H,S),2.1-2.2(3H,S),6.7-6.8(2H,S),7.3-7.4(2H,M),7.4-7.5(1H,M),和7.5的特征峰-7.7(2H,M)。14,17
  3. 使用电子表格来计算,必须准备作出水凝胶( 表1)各储备液(PEG4SH,Pep1Alloc,Pep2Alloc,LAP)的体积和浓度。为了使无图案的凝胶,确保[SH] = [页头],使所有活性基团在聚合过程中消耗。如果凝胶的光图案计划,包括巯基官能团的过程中凝胶形成基于化学计量与Pep1Alloc后反应过量( 0.2-5毫米,[SH]> [页头])。
    注:凝胶应含有大于5重量百分比(重量%)PEG4SH确保(在5分钟)快速聚合。然而,较低的重量%范围如果应用程序调用用于与低模量( 例如 ,<0.5千帕)水凝胶之间可以探讨;聚合应检查,并为这些低重量%的组合物相应的调整。同样,Pep1Alloc浓度可为如文献报道为硫醇官能的肽不同的应用程序( 例如 ,0.2-5毫米)进行调整。18-21 LAP浓度是围绕0.067%(重量)(2.2毫摩尔)或更小,如所描述,建议更高的浓度可降低细胞活力。
  4. 基于在表1中计算的细胞培养在无菌条件下制备Pep1Alloc,Pep2Alloc,PEG4SH和LAP的储备溶液。
    1. 为Pep1Alloc和Pep2Alloc,单独地从肽合成称量Pep1Alloc和Pep2Alloc的总质量和在含有1%青霉素/链霉素(PS)和0.5微克/毫升两性霉素B(FZ)无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶解。准备好的股票方案范围内的典型浓度从20-100毫克/毫升肽。混合这些股票在-20℃直至使用,实现与相关的软组织应用程序的最终模量(杨氏模量0.5-5〜千帕)的凝胶。22,23分装和储存。
    2. 为PEG4SH,称量PEG4SH到无菌微量离心管中并在PBS + PS + FZ溶解。此原液范围典型浓度从250-430毫克/毫升(按重量计20-30%PEG4SH)。
    3. 为LAP,称量LAP到无菌微量离心管中并在PBS + PS + FZ溶解到7.5毫克/毫升的最终浓度。
      注:准备PEG4SH和LAP的新的解决办法,建议对每个封装或凝胶实验,以确保一致的聚合时间。
  5. 准备无菌注射器提示压模成型水凝胶。
    1. 仔细切断的使用刀片1毫升注射器的尖端,并随后从注射器轴卸下柱塞。
    2. 浸没在70%的乙醇的注射器轴和柱塞15分钟的在无菌细胞培养罩ð处晾干(30分钟)。如果乙醇滴过剩仍注射器井内,用活塞推他们出去。
  6. 准备无菌玻璃滑动模成型为水凝胶。
    1. 浸泡载玻片(2的倍数)和橡胶垫片;在70%乙醇(0.254毫米厚2用作垫片小块,用圆盘的矩形冲裁或正方形框形状)15分钟,并在无菌的细胞培养罩处变干。
    2. 每个制造商的指示抗粘涂层的灭菌幻灯片涂层一半,以防止凝胶到滑动表面( 例如 ,如果有4个幻灯片,2幻灯片将涂有防粘剂)的顶部的粘合。这些将作为载玻片模具的顶部。
  7. 校准注射器或玻璃滑动模灯泡。
    注:对于这些实验中,使用与一个外部滤波器适配组件和365nm的外部过滤汞弧灯。其他灯如由其他人报道,可以使用S中的产生长波长UV光的适当的强度。24-27
    1. 附加准直透镜的充液光导的结束,以确保所有样品相对均匀的光强度。根据需要,调整从样品(多个)导光的距离,以达到一个点的大小,这将覆盖感兴趣的样品。
    2. 放入离心管架削减注射器模具(保持在垂直位置注射器模具)。持辐射计在注射器尖端所在的样品将被保持的高度,并调整快门(%开度)在365nm处达到10毫瓦/厘米2的光强度。记录以供将来使用调整设置。
    3. 载玻片模具放置到无菌表面的顶部( 例如 ,一个枪头盒的生物安全柜中的顶部)。持辐射计检测器在载玻片模具的高度,并调整快门(%开度)达到10μm的光强度 /平方厘米为365纳米。记录以供将来使用调整设置。

2.水凝胶形成和光图案

  1. 非图案化的水凝胶的制备。
    请注意:在该协议这一点上,如果水凝胶是在细胞培养应用中使用,所有的后续步骤应当在无菌条件下在无菌柜或罩进行。
    1. 根据电子表格计算( 见表1的例子)混合PEG4SH,Pep2Alloc,Pep1Alloc,LAP和PBS + PS + FZ库存解决方案。吸取所形成的凝胶前体溶液大力以确保均匀的溶液混合。
    2. 吹打10-20微升凝胶前体溶液(PEG / PEP / LAP / PBS)中的入无菌,切注射器的尖端准备在注射器提示成形厚的水凝胶。让每注射器单一凝胶,约0.5-1.5毫米厚的基于体积和注射器的直径。
      注:较大的体积可以探索的基础上所需的凝胶尺寸在哪里上限可能存在基于Pep1Alloc扩散限制光图案和/或营养/在细胞培养的废物,从封装细胞/。
    3. 通过将周围的非涂覆的玻璃载片的边缘上的橡胶密封垫(0.254毫米厚)准备在玻璃滑动模薄水凝胶。吸管5-10微升凝胶前体溶液到非涂覆的玻璃载片(单个或多个5-10微升凝胶可通过吹打的溶液的一个或多个点到单个幻灯片进行),并放置涂有防粘剂的载玻片在凝胶溶液的顶部(较大凝胶,到载玻片的大小,可以根据不同的最终应用。制造)。用小粘合剂片段以稳定固定在玻璃载玻片上。
    4. 灯下地方模具和设置在灯强度( 例如 ,%快门开启),以在基于测量在步骤1.7.2注射器尖端模具或载玻片模具凝胶表面达到10毫瓦/厘米2和1.7.3分别。
    5. 适用的光进行1〜5分钟以使凝胶完全聚合。使用较短的聚合时间为较高PEG4SH含量(8重量%以上,1分钟)和更长的用于与低PEG4SH含量(5-8%(重量),3-5分钟)凝胶凝胶与内模,以产生充分聚合的水凝胶软组织的范围(0.5-5千帕)。
    6. 地方的凝胶从注射器尖端模具到无菌未处理的48孔板,并代替载玻片到无菌培养皿中。
    7. 冲洗3×15分钟,细胞培养基或合适的缓冲液( 例如 ,PBS + PS + FZ,埃尔曼的反应缓冲液中)的基础上计划的实验中,如下面详述。
  2. 图案水凝胶的制备。
    1. 根据电子表格计算混合PEG4SH,Pep2Alloc,LAP和PBS + PS + FZ库存解决方案,使与Pep1Alloc后反应游离巯基(0.2-5毫米)。吸取前体溶液大力以确保均匀的溶液混合。
    2. 作为准备步骤2.1.2制定了到2.1.6厚,薄水凝胶。
      注意:不要光图案前置于生长培养基的凝胶。游离硫醇可通过在生长培养基物种被消耗( 例如 ,用含硫醇的蛋白质二硫键的形成),并且不允许没有额外的处理步骤,该凝胶的图案化( 例如 ,减少的二硫键)。
    3. 准备Pep1Alloc的解决方案(终浓度〜3-20毫克/毫升)和2.2毫米的腿上。
    4. 覆盖Pep1Alloc / LAP溶液预形成的凝胶,并在37℃下孵育1小时。
    5. 删除多余的Pep1Alloc / LAP的解决方案。如果凝胶在注射器尖端成形,用刮刀小心地从它们被培养于用于形成图案无菌载玻片48孔板转移凝胶。
    6. 放置具有所需直接syringe-和载玻片成型凝胶的顶部图案的光掩模。保证掩模的印刷部分接触为最佳PATT凝胶ERN保真度( ,口罩应阅读权,并药膜向下)。灯下放置样品,照射1分钟,用玻片(步骤1.7.3)灯设置。
    7. 图案化后,放置注射器成型凝胶成无菌的,48孔非组织培养处理板,及地点载玻片成型被附着于玻璃载片到无菌培养皿凝胶。
    8. 冲洗3×15分钟,细胞培养基或合适的缓冲液( 例如 ,PBS + PS + FZ,埃尔曼的反应缓冲液中)的基础上计划的实验。

3,可视化和光图案的量化

  1. 埃尔曼的检测,以在Photopatterned凝胶检测和定量游离巯基。
    1. 制备埃尔曼的反应缓冲液,半胱氨酸工作溶液,标准和Ellman试剂,如下所述。
      1. 对埃尔曼的反应缓冲液,溶解2.4克磷酸二钠( 磷酸氢二钠4)和74.4毫克在200毫升DIH 2 O(0.1M Na 2 HPO 4,1mM EDTA)中乙二胺四乙酸(EDTA)。将pH调节至7.5-8用氢氧化钠(NaOH)或磷酸(H 3 PO 4)的溶液。
      2. 对于半胱氨酸工作液,溶解在15毫升反应缓冲液(2mM的半胱氨酸)5.27毫克半胱氨酸。
      3. 对于半胱氨酸标准,稀释在反应缓冲液半胱氨酸工作溶液到2,1.5,1.25,1,0.75,0.5,0.25,和0毫半胱氨酸的终浓度。
      4. 为Ellman试剂,溶解在1ml反应缓冲液4毫克Ellman试剂。声处理以完全溶解Ellman试剂。
    2. 量化的游离硫醇与埃尔曼的测定( 图2)的凝胶的浓度。
      注:“薄”5微升水凝胶,玻璃幻灯片之间成型,在下面的过程中介绍,并建议允许Ellman试剂牛逼迅速扩散hrough凝胶( ,它需要的试剂较长时间透过厚厚的凝胶扩散)。
      1. 确定基于体积“薄”5微升凝胶(V S)溶胀比溶胀凝胶体积,Q。
        1. 请使用注射器模具3个20微升'厚'凝胶。在埃尔曼的反应缓冲广场凝胶24小时,随后称重(平衡肿质量M S)。冻干凝胶,随后称重(干重,男D)。
        2. 使用测量的质量为厚凝胶,计算体积由Q溶胀比28 = 1 +ρ 聚合物溶剂 (M S / Mð-1)其中,ρ 聚合物 R = 1.07克/厘米3PEG,29ρ 溶剂 = 1.0克/厘米3的PBS / H 2 O
        3. 计算出用于埃尔曼的测定(这里的凝胶的理论干质量,5微升“薄”的凝胶通常ùSED),由个别部件的群众PEG4SH,Pep1Alloc和Pep2Alloc(MD = M PEG4SH + M Pep1Alloc + M Pep2Alloc)总结。例如,含有10%(重量)PEG4SH 5微升凝胶含有约0.000535克PEG作为由M PEG4SH算出= 0.005厘米为1.07g /厘米3×0.10。 Pep1Alloc和Pep2Alloc群众可以在基于重量%溶液类似的方式(参见值电子表格)来计算,假设这些水溶液ρ≈为1.0g / cm 3以下。
          注:凝胶也可以被干燥和称重,而不是计算的理论干质量。然而,可能非常困难始终如一地测量薄,5微升凝胶的干燥质量。
        4. 基于预测的干质量和从'厚'凝胶,计算预测肿质量M S为“薄”凝胶(方程在步骤3.1.2.1.1)确定的Q值。假设ρ≈为1.0g /厘米每秒 ≈νs 。使用此计算νs 执行定量埃尔曼的检测。
          注:建议上述方法确定肿凝胶作为“薄”5微升凝胶νs 是难以转移进行称量。
      2. 如第2.2节(5微升体积)中描述的形成图案薄水凝胶。具体地,使用过量的游离硫醇凝胶和这些样品与Pep1Alloc使用明确盖玻片洪水与光暴露整个凝胶的'模式'的一半( 例如 ,6总凝胶用过量的硫醇:3未修改的非'patterned'和3'图案“)。
        注:对于这个实验,“图案”凝胶洪水暴露在光线下无光罩。这种方法被用来确定整个凝胶样品中消耗游离硫醇的总数,并展示如何有效地游离硫醇可以用肽进行修改。从这个信息,用的光掩模图案化过程中消耗游离硫醇的数量可以基于凝胶的厚度和图案区域(曝光区)被预测。
      3. 地点“图案化”,并在48孔板的孔中的非'patterned'凝胶和冲洗3×15分钟用埃尔曼的反应缓冲液,以允许未反应的物质的扩散出凝胶和平衡溶胀发生的。
      4. 添加额外的埃尔曼的反应缓冲液的漂洗凝胶使V s的反应缓冲液是在20微升的倍数。例如,如果预测的νs 是15微升,添加5微升反应缓冲液(20微升),并且如果预测νs 是30微升,添加10微升反应缓冲液(40微升)。
      5. 吸取一个96孔板的半胱氨酸标准纳入单独的孔(不含有凝胶)在根据在上一步骤( ,如果在前一步骤为V S +额外反应B中使用的体积20微升的倍数uffer = 40微升,加入40微升每个标准对个别井空的)。
      6. 稀释埃尔曼在反应缓冲液(180微升反应缓冲液+ 3.6微升Ellman试剂的倍数; 例如 ,183.6 20微升或367.2微升40微升步骤3.1.2.5)试剂。
      7. 稀Ellman试剂加入到含有标准和样品的孔中。 20微升的样品中,添加183.6微升溶液每个孔中。双该量稀释Ellman试剂为40微升样品(或缩放相应地根据样品的大小)。
      8. 孵育或放置在1小时和30分钟(在室温下)摇动器或直到溶液的颜色通过目测凝胶的颜色相匹配,以确保黄色2-硝基-5-硫代苯甲酸二价阴离子的充分扩散(TNB 2-),这是建立在Ellman试剂与游离硫醇的反应生成的,从凝胶。
      9. 取100微升的溶液从样品和s标准协商并放入96孔板的孔中。
      10. 在上酶标仪405nm处读取吸光度。
      11. 来处理数据,绘制标准曲线(样品从步骤3.1.1.3)(吸光度与浓度)和适合的线性函数。使用线性函数,游离硫醇在'稀释凝胶'溶液(凝胶+反应缓冲液中)的浓度可根据吸光率读数来计算。最后,考虑到“稀释”用反应缓冲液,测定在凝胶无反应缓冲液中游离硫醇的浓度。 ( 例如 ,如果15微升凝胶用5微升反应缓冲液稀释,由20/15乘)。
    3. 与Ellman试剂( 图3A)photopatterns的可视化。
      1. 浸泡在埃尔曼的反应缓冲区Pep1Alloc图案1小时薄水凝胶。
      2. 由周围的组织的水凝胶的边缘轻轻擦拭除去多余的反应缓冲液。
      3. 移液器Ellman试剂直接凝胶的表面上。立即在10X光学显微镜体视显微镜或用彩色摄像机图像。
        注:凝胶必须立即成像,因为可视化模式将在5分钟内消散作为黄色TNB 2-离子通过在非图案化区域与硫醇反应Ellman试剂的裂解产生扩散在整个凝胶。非图案区域出现微弱黄色肉眼;为更好的精度和更小的模式,放大率( 例如 ,使用显微镜)是必需的。
  2. Photopatterns用荧光肽( 图3B)的可视化。
    1. 对于具有更高分辨率或以三维可视化模式,photopattern一个AF488改性Pep1Alloc(或类似的荧光肽),以凝胶在步骤2.2。
    2. 图象上荧光显微镜。共聚焦显微镜可以用在这里采取Z-ST使图案可在x观察,y轴凝胶的应答影像,和z平面。
      注意:使用荧光剂,凝胶剂必须避光以确保AF488荧光团和最大荧光的稳定性。凝胶不需要立即成像因为如果(在4℃用铝箔包裹的容器中存储)避光荧光肽是相当稳定的。

4.水凝胶和光图案电池封装

  1. 收集和准备的细胞封装。
    1. 下列标准无菌哺乳动物细胞培养过程,trypsinize和收集从板块感兴趣的细胞。发生分离后淬火用生长培养基中胰蛋白酶( 例如 ,对于一个T-75烧瓶中,加入5ml胰蛋白酶,淬火用5ml介质中,以用于总共15个毫升5毫升培养基冲洗片)。
      注:胰蛋白酶消化时间可以细胞类型之间有所不同,但5和15分钟之间,通常会出现。备用电池detachmen吨剂( 例如 ,维尔烯)可被使用,如果期望以收集细胞。
    2. 计数细胞使用血球或其它细胞计数装置而离心散装细胞悬浮液(90-110 XG,5分钟)的胰蛋白酶细胞悬浮液的等分试样(至少100个或每个生产商的方案)。重悬细胞沉淀在PBS中的最小体积或生长培养基,并重新计数离心后如果初始胰蛋白酶细胞悬浮液太稀。
    3. 重悬在PBS中的最小体积为每个凝胶状态的细胞和等分部分到微量离心管中,以便将有5000个细胞/微升时与凝胶溶液(在聚合之前)混合。
      注意:典型细胞等份含有300,000-500,000细胞和足以使60-100微升可用于3-5×20具有5,000个细胞/微升微升凝胶凝胶/细胞悬液。更高或更低的细胞密度可用于封装,这取决于细胞 - 细胞的量与细胞 - 基质接触所需的,分别和应为每个应用程序来确定。
    4. 离心机细胞/ PBS等分(90-110 XG,5分钟)。
    5. 在离心管中封装前右小心吸PBS从细胞沉淀。
      注意:如果细胞是剪切力敏感,第二离心分离步骤可以通过计算( 例如血球),随后aliquotting的胰蛋白酶细胞悬浮液(胰蛋白酶+介质+细胞)到所需要的各凝胶状态的部分被消除。这些等分试样离心一次(90-110 XG,5分钟)和胰蛋白酶+培养基吸出,留下用于包囊的细胞沉淀。
  2. 在非水凝胶图案封装细胞。
    1. 抽吸PBS后,立即中止在电子表格计算至5000个细胞/μL的终浓度在PEG4SH,Pep2Alloc,Pep1Alloc,LAP,和PBS + PS + FZ丸状细胞。
    2. 霉菌和聚合水凝胶作为DESCRIBED步骤2.1.2 2.1.6。
      注意:当封装在玻片模具细胞,必须小心除去顶部滑动后聚合,以防止剪切凝胶,其可导致细胞死亡时作出。为了帮助除去从模具凝胶,滑动模可放置在无菌PBS或生长培养基中的聚合以润湿垫圈和水凝胶后,使其更容易除去的顶部滑动。为了防止该剪切干脆的方法是通过使用注射器模具。
    3. 在生长培养基中漂洗凝胶3×10分钟以除去未反应的物质和过量的LAP。
    4. 在37℃下孵育在生长培养基中的凝胶和5%的CO 2,直到用于进一步的分析所需的时间点。补充中每48小时或应用程序( 例如 ,对于特定的细胞类型和中典型喂食间隔)的决心。
  3. 封装电池和光图案在细胞的存在。
    1. 紧接着吸气PBS后,暂停作为在电子表格计算至5000个细胞/μL的终浓度在PEG4SH,Pep2Alloc,LAP,和PBS + PS + FZ丸状细胞。离开游离硫醇( 例如 2毫米)与Pep1Alloc后反应适当的浓度。
    2. 模具,聚合和模式水凝胶作为步骤2.2.2 2.2.8描述。
    3. 图案化以除去未反应物质和过量的LAP后在生长培养基中漂洗凝胶3×10分钟。
    4. 在37℃下孵育在生长培养基中的凝胶和5%的CO 2,直到用于进一步的分析所需的时间点。补充中每48小时或应用程序的决心。

5.确定封装细胞的活力和代谢活动

  1. 进行活/死细胞毒性检测,以确定封装的细胞活力( 图4A)。
    1. 从凝胶用PBS除去生长培养基并冲洗3×15分钟,以允许给G介质的扩散平。
    2. 解冻活/死细胞毒性试验方案(乙锭同型二聚体-1和钙黄绿素AM)。
    3. 添加2微升4mM的钙黄绿素AM溶液的2毫乙锭同型二聚体-1和0.5微升至1毫升无菌PBS中。涡旋,以确保完全混合。
    4. 添加300微升染色溶液到每个注射器模具凝胶在48孔板,或足以覆盖凝胶的表面上在无菌培养皿载玻片,并孵育45分钟。
    5. 删除多余的染色溶液和冲洗,从凝胶(3×15分钟,用PBS)去除多余的染料。
    6. 图像上共聚焦显微镜(Z堆栈图像)或与Z堆栈能力的落射荧光显微镜10X和五百二十五分之四百八十八纳米防爆/ EM。由突出的z堆栈和计数活(整个细胞体绿色)和死(红核)细胞成像软件数字量化存活细胞的数量。
  2. 执行代谢活性检测,以确定细胞活性后封装(Figu重新4B)。
    1. 24小时以测定,进料封装细胞用新鲜的生长培养基之前。
      注:加入培养基至几个额外的孔(不含有凝胶或凝胶具有无细胞)作为对照(背景读数)。
    2. 在感兴趣的时间点,解冻的MTS试剂溶液。
      注意:为了确定在一段时间的代谢活性,初始时间点(12-24小时后封装)被推荐为用于比较的稍后的时间点的参考。
    3. MTS试剂加至每孔(20每100微升生长培养基微升)。
    4. 孵育样品在37℃下1-4小时,5%的CO 2,按制造商的说明。
      注:培养时间应足以对细胞减少MTS和允许甲产物的扩散出凝胶。因此,较厚的凝胶如注射器尖端凝胶可能需要足够的MTS还原扩散更长的温育时间(〜4小时)。
    5. 吸取100微升减少MTS /中成在上读板器490纳米的96孔板并记录吸光度的清洁孔中。
    6. 减去水井背景吸收无细胞样品吸光度值产生基线的吸光度值。

Representative Results

设置和步骤photoencapsulate细胞和含有包封的细胞随后photopattern凝胶在图1中所描绘的和用于制备储液的例子,以形成10重量%的凝胶在表1中提供。使用表1中 ,单体的量(PEG4SH ,Pep2Alloc,±Pep1Alloc)和聚合的水凝胶需要光引发剂(LAP)的计算。基于这些计算,PEG4SH,Pep1Alloc,Pep2Alloc和LAP的储备溶液制备并有和没有Pep1Alloc用于形成和分别光图案凝胶,( 图1A)混合。接着,将细胞从平板收集,计数,并以适当的量离心封装( 图1B)。将细胞沉淀重新悬浮在凝胶形成溶液(在PBS中的肽/聚合物/ LAP),和细胞/单体混合物转移到玻璃或注射器摩尔DS。细胞被在光应用包封在水凝胶内(1-5分钟10毫瓦/厘米2在365纳米的)( 图1C)。对于光图案( 图1D),凝胶浸泡Pep1Alloc和LAP 30分钟到1小时和30分钟,使肽和引发剂扩散到聚合基质。这些肽载货凝胶覆盖有具有期望图案的光掩模,并暴露于光(1分钟)的第二剂量,以在基质内缀合的肽游离硫醇。挂件系绳仅共价连接到该凝胶在暴露于光的区域,有利于适当的细胞-基质相互作用和模仿朝向探测细胞功能和命运体外天然细胞微环境的关键机械和生物化学特性。

埃尔曼的检测提供了一种简便且廉价的方法来量化photopatte内凝胶修改和肽掺入rned基板。图案化和未图案化的凝胶( ,具有或不具有肽修饰凝胶)在埃尔曼的反应缓冲液中后聚合浸泡。接着,半胱氨酸标准和在缓冲液浸泡过的凝胶放置在48孔板并用Ellman试剂( 图2A,左)温育。 1小时30分钟后,将样品的等分试样放置在96孔板的各个孔中,并在吸光记录在405nm处。从半胱氨酸标准校正曲线( 图2A,右)绘制(吸光度VS浓度,线性拟合),并且可基于其稀释因子来确定的游离硫醇在凝胶中的量。这些游离硫醇浓度为10%(重量)的凝胶的各种聚合和光图案化条件示于图2B。无Pep1Alloc 1或5分钟聚合(蓝条,I = 1分钟和第II = 5分钟)凝胶具有统计学类似的游离巯基含量,表明Ť帽发生快速反应,凝胶化是1分钟(双尾t-检验,p> 0.05)内完成。因此,附加的暴露于光(2-5分钟)不会导致的官能团的进一步转化。无Pep1Alloc 1分钟聚合凝胶与Pep1Alloc浸泡(3毫克/毫升)和LAP(2.2毫摩尔)30和90分钟(绿色棒,II = 30分钟,IV = 90分钟),并暴露于光的第二剂量1分钟。在游离硫醇的减少(60-80%相对于1分钟条件)表示在这些条件下挂件线索凝胶的有效修饰。如果较高的修饰是期​​望的,增加的Pep1Alloc溶液浓度可以用作Pep1Alloc的无障碍游离硫醇在更稀肽溶液可限制转换;例如,我们已经发现,浓度高达20毫克/毫升Pep1Alloc产生> 90%的游离硫醇的转换。

独特的是,肽的图案添加到该水凝胶可用Ellman试剂( 图3A,下5分钟)被快速成像。然而,图案的可视化失去了由于通过凝胶黄色TNB 2-二价阴离子的扩散时间(大于5分钟)。为了提高成像分辨率并在三个维度(x轴,y和z平面)和在细胞存在下观察的图案,荧光肽加成(AF488Pep1Alloc)可被利用。在图3B中x,y和用共焦显微镜拍摄的图像栈的z突起示出,表明图案分辨率(微米尺度)。

约(94±2)%和可降解凝胶(Pep2Alloc = GPQG↓外高桥)内包封的hMSCs(94±1)%保持存活(绿色细胞体)的封装后1天和6天,分别用几个死细胞(红核)观察到( 图4A)。此外,hMSC的铺展6天后封装(观察荣>图4A,插图),这表明细胞可重塑和与整联蛋白结合RGDS改性这些MMP降解基质相互作用。封装在非可降解凝胶(Pep2Alloc = RGKGRK)细胞进行代谢活性测定法1和3天的封装后( 图4B)提供细胞活力的第二测量并证明细胞保持与测试的各种photoencapsulation和光图案化条件活性埃尔曼的测定( 图2B)。特别是,有代谢活性30分钟和90分钟的孵育之间与Pep1Alloc + LAP(条件III和IV)和初始封装(条件I和II)无显著差异,这表明该过程适合于在光图案的应用包封细胞的存在(双尾t-检验,p> 0.05)。

2fig1.jpg“/>
1: 设置为水凝胶中封装的细胞,随后与生化线索光图案 (A)准备大分子单体和光引发剂的储备溶液混合(PEG4SH =骨干,Pep2Alloc =交联,Pep1Alloc =挂件粘接部分(RGDS),LAP =光引发剂)。 (B)将细胞收集封装。 (C)的细胞用没有或整联蛋白结合肽大分子单体溶液(PEG4SH / Pep2Alloc / LAP或PEG4SH / Pep2Alloc / Pep1Alloc / LAP,分别)混合,并在暴露被封装到的光。 (D)的过程中凝胶形成含过量硫醇基凝胶(这里,PEG4SH / Pep2Alloc / LAP,有2mM过量硫醇形成的)可与生化线索通过随后加入与单一的alloc基(Pep1Alloc, 例如官能化肽的图案化, RGDS,IKVAV, 等),以促进细胞粘附内的凝胶的特定区域。在这里,用荧光标记的RGDS凝胶的图案所示。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2
2: 定量埃尔曼的实验设置和结果来评估图案化水凝胶的变形例 (A)的凝胶和半胱氨酸标准与Ellman试剂48孔板温育。线性标准曲线绘制以确定凝胶样品中的半胱氨酸的浓度。 (B)多余的硫醇期间凝胶形成水凝胶内注册成立,并消耗后,图案带有侧ALLOC肽(I = 1分钟聚合; II = 5分钟聚合; III = 30分钟孵育Pep1Alloc; IV = 90分钟孵化无线日Pep1Alloc;既III和IV聚合和配光图案的1分钟)。显示的数据说明了平均值(N = 3)误差条显示标准误差。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3
3: 埃尔曼的测定和荧光图像来可视化photopatterned水凝胶 (A)的 Ellman试剂可用于快速检测在x图案(线)和y平面(黄色=未图案化区域,比例尺= 1毫米)。 (B)的荧光肽可用于在X观察的图案,y和z平面(绿色=图案化区域;200μm的比例尺; 10X水浸渍目标;实施例/ EM五百二十五分之四百八十八纳米)。large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。

图4
4: 活力和不可降解的水凝胶photopatterned细胞内的代谢活性 (A)为例焦Z堆栈(Z-投影; 10X水浸渍目标)的活的(绿色;前/ EM五百二十五分之四百八十八NM)和死的hMSCs(红色;前/ EM580分之543nm)的封装内水凝胶后24小时封装(比例尺= 200微米)。细胞封装(插入图像,比例尺= 50微米)6天后这些水凝胶内扩散。 (B)细胞的代谢活性的1和3天(深色和浅色条,分别)封装后的各种聚合(I = 1分钟聚合; II = 5分钟聚合)和构图条件(III = 30分钟孵育Pep1Alloc ; IV = 90分钟incubatio类n Pep1Alloc;两个聚合和配光图案的1分钟)。显示的数据说明了平均值(N = 3)误差条显示标准误差。 请点击此处查看该图的放大版本。

表格1
表1: 示例设置来计算股票的解决方案体积制作水凝胶被蓝色高亮显示在电子表格中单元格表示用户定义的参数的其它量是基于这些设定来计算。每个原液,使凝胶的最终卷突出橙色。白细胞包含用于计算基于所述用户定义的参数的最终体积的公式。需要注意的是2.2毫LAP的浓度相当于0.067%(重量)。

Discussion

这里介绍的过程演示技术通过硫醇 - 烯点击化学凝胶形成内photoencapsulate细胞,随后photopattern与生化线索凝胶。利用光的最初形成水凝胶可以在聚合之前在聚合物溶液内均匀混合和细胞的悬浮液中。快速聚合“锁”在定义的模具的形状的凝胶,并封装悬浮在水凝胶网络中的细胞。凝胶还可以模塑成根据所需的最终应用许多不同的形状( 例如 ,玻璃载玻片或注射器提示)。例如,作为光衰减的薄样品内限定在附连到玻璃载玻片水凝胶包封的用于3D培养细胞可用于成像应用特别有用。注射器的模具可用于细胞的快速封装,允许在很短的时间内制备的样品更大数目(相对于载玻片s)表示可用于诸如流式细胞仪或定量PCR需要大量的细胞的实验。随后,这些凝胶然后可以与生化线索以引发所需的细胞反应,例如分化或侵入构图。30,31

为生存力和代谢活性测定表明呈现细胞供料系统和构图条件的存活。注意,代谢活性,直至3个天非可降解的凝胶监测(RGKGRK肽交联),以评估聚合和构图条件对细胞功能的初始作用。此外,在1和6天封装后在可降解肽交联(GPQGIWGQ)制定凝胶支持细胞保持活力,并在1周文化传播的hMSCs的膜完整性检测(现场/死可行性/细胞毒性染色)。的额外的细胞系的存活力已被报道用于32类似于光图案的条件此处使用,并且能够用于使用活/死染色和代谢活性试验中所描述的水凝胶系统进行评估。虽然我们没有观察到使用这种材料系统和相关的程序(4.2和4.3)的细胞活力的问题,一些类型的细胞可以是用自由基和/或光照射敏感。在这种情况下,用户可能33考虑使用非光引发材料系统,如叠氮化物-炔烃,12 FXIII,31或根据阿尔德-狄尔斯水凝胶形成化学。

轻便的技术来检测和凝胶还呈现(3.1和3.2)中的量化生化线索图案化。埃尔曼的测定法是特别感兴趣的,因为试剂是可商购的并且无需额外的合成处理步骤或更昂贵的试剂( 例如 ,荧光标记的肽)。埃尔曼的测定可用于精确地确定与下各色生化线索的游离硫醇的变形nt的光图案化的条件下,以及迅速可视化模式。用于定量肽掺入之前和图案化后的硫醇官能团的浓度,作为肽掺入的定量测量,直接评估用埃尔曼的测定。虽然这种类型的定量可以用荧光标记的肽来完成,34基于成像的量化,需要耗费更多的时间处理和分析的步骤( 例如 ,校准曲线的荧光标记的肽和产生的合成涉及荧光肽浓度利用图像分析)。用于成像的肽掺入Ellman试剂可直接应用于样本,并立即可视化。而限定于X和Y平面为图案的可视化,该技术可作为一个简单的常规方法来确定是否含有游离硫醇基的基质已经形成图案。要注意的是埃尔曼的测定不是C是很重要的onsidered细胞相容性,因此,虽然它也可以用于观察和量化photopatterns,它不能在细胞存在下进行。在三个维度和在细胞的存在成像图案,荧光肽的水凝胶基质中的共轭仍然是一个功能强大的和广泛使用的方法。图案的分辨率可以在x进行评价,y和使用共聚焦显微镜z轴架,并且该方法是细胞相容性,使得图案化的区域或非图案区域内的细胞可以被识别。总之,埃尔曼的检测和基于成像技术是研究人员评估在数量上和质量上的材料体系内生化线索的光图案的补充工具。

Photoclick,或者更广泛地光引发,在细胞的存在的水凝胶的形成和改性化学是很多的。这里介绍的成型,封装和图案化技术是不限量资讯科技教育所描述的材料系统,并且可以应用到替代基于光的化学品,如硫醇炔,35叠氮化物-炔烃,4和其它硫醇-烯化学( 例如 ,巯基降冰片烯),10,13以及与不同的光引发剂,如的Irgacure 2959,曙红Y,和樟脑醌。注意,用户可根据需要调整工艺参数( 例如 ,孵育时间,聚合时间,细胞密度),以确保条件保持细胞相容性,这些其他系统。由于图案化工艺要求的alloc修饰肽(多个)扩散到水凝胶(2.2.3-2.2.5),此过程可能证明对于增加整联蛋白结合部分( 例如 ,肽或细胞外基质蛋白的最有用片段)的水凝胶,其中需要用于由细胞和完全整合激活产生牵引力的配体与网络的附着。36注,对生物分子可是类似活性在溶液中或在固定( 例如 ,生长因子或细胞因子),对部分扩散(〜1小时)温育步骤进入水凝胶可能导致信令卷积构图结果事件。其他方法已建立了生长因子的固定或本地封存其图案化。37-39此外,图案的分辨率是通过在曝光控制支配。这里,光掩模允许通过凝胶深度,并在X和Y平面图案创作;然而,用凝胶内生化线索的图案化较大的空间控制可以与照射的替代方法,如使用双光子共焦显微镜来产生在x模式,y-和z-平面来实现。34,40最后,要注意的是,虽然此过程中使用的材料系统只最初与生化线索改性,正交photoclick化学可以用于允许阿尔特是很重要这里提出在基体性能口粮随着时间的推移12的过程和技术添加多样性到当前的方法为具有良好限定和spatiotemporally控制属性创建合成基质。特别是,该过程中使用的试剂和材料的商业可用性将是广泛的兴趣,在使用基于水凝胶的生物材料用于在受控细胞培养应用的研究是有用的。

Acknowledgments

这项工作是由药物发现和由机构发展奖从美国国立卫生研究院(分别为P20GM104316和P30 GM110758-01,)的将军医学科学研究所资助的高级生物材料,皮尤慈善信托基金特拉华COBRE方案的支持(00026178),国家科学基金事业奖(DMR-1253906),在宝来惠康基金(1006787),并在特拉华大学的美国国家科学基金会IGERT SBE2程序(奖学金到L. Sawicki)。作者感谢在特拉华大学特拉华生物技术研究所生物成像中心培训,并获得共聚焦显微镜,凯瑟琳·威利女士在视频拍摄过程中的帮助,马修Rehmann先生慷慨地提供从骨髓,克里Ĵ教授孤立的hMSCs 。Kloxin和Stephen马先生慷慨地提供光掩膜和威尔弗雷德陈教授对于使用自动酶标仪的。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Custom Peptides Various Vendors ---- Peptides may also be synthesized via standard SPPS techniques with materials from vendors including ChemImpex and ChemPep.
4-arm PEG Thiol, MW 20k JenKem USA 4ARM-SH Listed under Multi-arm Homofunctional PEGs. PEG4SH may also be synthesized as previously referenced.
Lithium Phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate Colorado Photopolymer Solutions Li-TPO
Dimethyl Phenylphosphonite Sigma Aldrich 149470 Caution, causes severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
2,4,6-Trimethylbenzoyl Chloride Sigma Aldrich 682519 Caution, causes severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
Lithium Bromide Sigma Aldrich 213225
2-Butanone Sigma Aldrich 360473
Flask, Round Bottom, 100 ml Chemglass CG-1506-05
80 ml Filter Funnel, Buchner, Medium Frit Chemglass CG-1402-L-02 Filter paper inside a regular glass funnel may be used if desired.
Magnetic Stir Bars Various Vendors ----
Magnetic Stirring and Hot Plate Various Vendors ----
Vacuum Dessicator Various Vendors ----
Deuterium Oxide Acros Organics 16630
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline ThermoFisher Scientific 14190-250
Penicillin Streptomycin ThermoFisher Scientific 15070-063
Fungizone ThermoFisher Scientific 15290-018
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red ThermoFisher Scientific 15400-054 Select appropriate medium and trypsin depending on cell type.
Microcentrifuge tubes Various Vendors ---- 1.5 or 2 ml sizes, sterile.
BD Syringe with Slip (Luer) Tips (Without Needle) Fisher Scientific 14-823-16H Product number listed here is for a 1 ml syringe (16H), Various sizes are available (14-823-XX).
Fisherfinest Premium Plain Glass Microscope Slides Fisher Scientific 12-544-1
High-Purity Silicone Rubber, 0.010" Thick, 6" x 8" Sheet, 55A Durometer (Gasket) McMaster Carr 87315K62
Ethanol, 200 Proof Decon Labs 2701
RainX, Original Amazon 800002243 May be purchased from other vendors.
Sigmacote Sigma Aldrich SL2
Photomasks Advance Reproductions Corporation ---- Photomask Division, different designs may be printed as desired.
DTNB; Ellman's Reagent; 5,5-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) ThermoFisher Scientific PI-22582
Sodium Phosphate Dibasic Sigma Aldrich S5136
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma Aldrich E6758
Sodium Hydroxide, Pellets/Certified ACS Fisher Scientific S318
Orthophosphoric Acid Alfa Aesar 33266
Cysteine Hydrochloride Monohydrate Sigma Aldrich C7880
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells ThermoFisher Scientific L-3224
CellTiter 96 Aqueous One Solution Assay Promega G3582
Centrifuge Various Vendors ---- Capable of speeds at 90-110 x g.
Multiwell Plate Reader Various Vendors ---- Capable of reading absorbance at 405 nm in a 96-well plate.
Epifluorescent or Confocal Microscope Various Vendors ---- To visualize peptide patterns and cells within hydrogels.
Omnicure Exfo Series 2000 Excelitas Technologies ---- Alternate light systems may be used to polymerize hydrogels.
Zeiss Zen Lite Software Zeiss ---- Available at zeiss.com; compatible with images taken on Zeiss microscopes
ImageJ NIH ---- Available at imagej.nih.gov; applicable for general image analysis

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