الكشف عن تعتمد على درجة الحموضة آخر من
1Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology, University of Michigan, 2Howard Hughes Medical Institute, University of Michigan

Published 10/23/2016
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

توضح هذه الدراسة تقنيات الطبيعية الحيوية، والكيمياء الحيوية والجزيئية لوصف النشاط كوصي من الإشريكية القولونية HdeB في ظل الظروف الحامضية. وقد تم تطبيق هذه الأساليب بنجاح للمرافقين آخرين حامض واقية مثل HdeA ويمكن تعديل للعمل من أجل مرافقين آخرين وظروف الإجهاد.

Cite this Article

Copy Citation

Dahl, J. U., Koldewey, P., Bardwell, J. C., Jakob, U. Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo. J. Vis. Exp. (116), e54527, doi:10.3791/54527 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

وكثيرا ما تتعرض البكتيريا لتغيرات بيئية، مثل التغيرات في درجة الحموضة، ودرجة الحرارة، وحالة الأكسدة، التعرض للضوء أو القوة الميكانيكية. العديد من هذه الشروط يسبب البروتين تتكشف في الخلية ويكون لها تأثير ضار على بقاء الكائن الحي. وقد أظهرت مجموعة من لا علاقة لها، المحرمين الجزيئي الإجهاد محددة للعب أدوار أساسية في بقاء هذه ظروف الإجهاد. في حين مطوية بالكامل وكوصي غير نشط قبل الإجهاد، وهذه البروتينات تتكشف بسرعة ويصبح-كوصي نشط تحت ظروف الإجهاد محددة. تنشيط مرة واحدة، وهذه مرافقين المختلين مشروط ربط عدد كبير من البروتينات المعرضة للتجميع مختلفة، ومنع تجميع وإما بشكل مباشر أو غير مباشر تسهيل بروتين refolding لدى عودته إلى الظروف غير الإجهاد. النهج الأساسي لاكتساب فهم أكثر تفصيلا حول آلية تفعيل والعميل الاعتراف بها ينطوي على تنقية وsubsequenر توصيف هذه البروتينات باستخدام فحوصات في المختبر كوصي. المتابعة في المقايسات إجهاد الجسم الحي ضرورية للغاية لتأكيد مستقل حصلت في نتائج المختبر.

يصف هذا البروتوكول في التجارب المختبرية وأساليب الجسم الحي لوصف النشاط كوصي من E. القولونية HdeB، وهو كوصي حمض تفعيلها. واستخدمت القياسات نثر الخفيفة، مريحة للقراءة خارج عن قدرة HdeB لمنع تجميع الناجم عن حمض من البروتين العميل نموذج المعمول بها، مليون درهم، في المختبر. طبقت التجارب تنبيذ فائق التحليلية للكشف عن تشكيل المعقد بين HdeB ورابطة حقوق الإنسان البروتين عملائها، لتسليط الضوء على مصير البروتينات العميل لدى عودتهم إلى الظروف غير الإجهاد. وأجريت فحوصات النشاط الأنزيمية للبروتينات العميل لرصد آثار HdeB على تعطيل العميل الناجم عن درجة الحموضة وتنشيط. وأخيرا، استخدمت دراسات البقاء على قيد الحياة لرصد ومراقبةص تأثير وظيفة كوصي HdeB في الجسم الحي.

Introduction

والبيئة الطبيعية المشتركة التي مسببات الأمراض الميكروبية تجربة الظروف التي تتكشف البروتين الحمضية التي يسببها هي المعدة الثدييات (المدى درجة الحموضة 1-4)، التي تعد بمثابة حاجز فعال ضد مسببات الأمراض التي تنقلها الأغذية 1 الرقم الهيدروجيني الحمضية. البروتين تتكشف والتجميع، والذي كان سببه الجانب الأحماض الأمينية سلسلة بروتوناتيون، ويؤثر على العمليات الحيوية، والأضرار الهياكل الخلوية ويتسبب في نهاية المطاف موت الخلية 1،2. منذ الرقم الهيدروجيني للالجبلة المحيطية البكتيرية equilibrates على الفور تقريبا مع درجة الحموضة البيئية بسبب نشر خالية من البروتونات عبر الغشاء الخارجي يسهل اختراقها، بروتينات غشاء محيط بالجبلة والداخلية من البكتيريا سالبة الجرام هي المكونات الخلوية الأكثر ضعفا في ظل الظروف الحمضية من الإجهاد 3. لحماية بروتيوم محيط بالجبلة ضد الضرر بوساطة حمض السريع، والبكتيريا سالبة الجرام الاستفادة من المحرمين محيط بالجبلة تنشيط حمض HdeA وHdeB. HdeA هو كوصي المختلين مشروط 6،7. تفعيل HdeA يتطلب تغييرات عميقة الهيكلية، بما في ذلك الانفصال حيز أحادية، والجزئي تتكشف أحادية 6-8. بمجرد تفعيلها، HdeA ترتبط بالبروتين التي تتكشف في ظل الظروف الحمضية. ويمنع على نحو فعال التجميع على حد سواء خلال حضانة في انخفاض الرقم الهيدروجيني، وكذلك على تحييد الحموضة. لدى عودته إلى 7.0 درجة الحموضة، HdeA يسهل refolding من البروتينات عملائها بطريقة ATP مستقلة ويحول مرة أخرى إلى مثنوي، التشكل كوصي خاملا 9 منه. وبالمثل، كوصي HdeB مثلي والوصيفة-نشط أيضا في درجة الحموضة 7.0. على عكس HdeA، ومع ذلك، النشاط كوصي HdeB ويصل الحد الأقصى واضح في الرقم الهيدروجيني 4.0، الظروف التي لا تزال مطوية HdeB إلى حد كبير ومثنوي 10. وعلاوة على ذلك، مما خفض مركز دراسات الرقم الهيدروجينيوفاق لتثبيط HdeB. وتشير هذه النتائج أنه على الرغم من التماثل على نطاق واسع، HdeA وHdeB تختلف في طريقتهم في تفعيل وظيفي والسماح لهم لتغطية مجموعة ودرجة الحموضة واسع مع وظيفة كوصي الحمائية. واحد كوصي الأخرى التي تورطت في مقاومة الأحماض من E. القولونية هو Hsp31 حشوية، والذي يظهر على استقرار البروتينات العميل تكشفت حتى تتم استعادة الظروف محايدة. وضع دقيق للعمل Hsp31، ومع ذلك، ظلت غامضة 12. وبالنظر إلى أن البكتيريا ممرض للأمعاء أخرى مثل السالمونيلا تفتقر إلى الاوبرون hdeAB، فمن المحتمل جدا أن مرافقين محيط بالجبلة بعد مجهولين آخرين قد توجد التي تشارك في مقاومة الأحماض من هذه البكتيريا 11.

البروتوكولات المعروضة هنا تسمح لمراقبة النشاط كوصي تعتمد على درجة الحموضة من HdeB في التجارب المختبرية والحية 10 ويمكن تطبيقها للتحقيق مرافقين آخرينمثل Hsp31. بدلا من ذلك، شبكة معقدة من عوامل النسخ التي تتحكم في التعبير عن hdeAB من المحتمل أن يتم التحقيق من قبل في الجسم الحي الإجهاد الفحص. لتوصيف وظيفة كوصي من البروتينات في الجسم الحي، ويمكن تطبيقها على الاجهزة التجريبية المختلفة. طريق واحد هو تطبيق البروتين تتكشف ظروف الإجهاد وظاهريا تميز سلالات متحولة إما بإفراط عن الجينات في المصالح أو تحمل حذف هذا الجين. ويمكن إجراء دراسات البروتين لتحديد أي البروتينات لم يعد مجموع المباراتين تحت ظروف الإجهاد عندما كوصي هو الحاضر، أو تأثير كوصي على انزيم معين يمكن تحديده خلال ظروف الإجهاد باستخدام المقايسات الأنزيمية 14-16. في هذه الدراسة، اخترنا بإفراط HdeB في سلالة rpoH الحذف، التي تفتقر إلى الصدمة الحرارية عامل سيغما 32. RpoH تسيطر على التعبير عن كل E. كبير مرافقين القولونية وحذفها من المعروف أن زيادة السيناتورitivity لظروف الإجهاد البيئية التي تسبب البروتين تتكشف 15. تقرر في الجسم الحي النشاط كوصي من HdeB من خلال رصد قدرتها على قمع حساسية الرقم الهيدروجيني للسلالة Δ rpoH. وإجمالا، فإن البروتوكولات المعروضة هنا توفر نهج سريع ومباشر لوصف النشاط من كوصي الحمضية التي تنشط في المختبر وكذلك في سياق في الجسم الحي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. التعبير وتنقية محيط بالجبلة HdeB

وأعرب عن HdeB في E. ملاحظة: خلايا القولونية إيواء البلازميد pTrc- hdeB 10، وتنقيته من الجبلة المحيطية على تحلل بوليميكسين.

  1. إعداد الثقافة بين عشية وضحاها من E. خلايا القولونية إيواء البلازميد pTrc- hdeB 10 في 30 مل LB تحتوي على 200 ميكروغرام / مل الأمبيسلين (LB الأمبير). تطعيم أربعة 1 الثقافات L من LB الأمبير وتنمو لهم عند 37 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة حتى يتم التوصل إلى OD ل 600Nm من 0.7. ثم، إضافة 300 ميكرومتر IPTG للحث على التعبير عن HdeB وانخفاض درجة حرارة النمو إلى 30 درجة مئوية.
  2. بعد 5 ساعة التعبير البروتين عند 30 درجة مئوية، حصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 8000 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
  3. غسل بيليه الخلية مع 100 مل العازلة ألف (50 ملي تريس / حمض الهيدروكلوريك، 50 مم كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.5) وأجهزة الطرد المركزي الخلايا مرة أخرى في 8000 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
  4. وفي وقت لاحق، و resuspendبيليه الخلية في 80 مل العازلة A، التي تحتوي على 1 ملغ / مل سلفات بوليميكسين. لتعطيل الفعال للغشاء الخارجي، وإثارة بلطف تعليق لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية.
  5. لإزالة جزء حشوية والحطام الخلوي، الطرد المركزي تعليق لمدة 20 دقيقة في 15000 x ج في 4 درجات مئوية. وهذا يؤدي إلى ~ 60 مل طاف تحتوي على HdeB قابل للذوبان.
  6. Dialyze طاف التي تحتوي على مستخلص محيط بالجبلة بين عشية وضحاها ضد حجم 150X العازلة ب (20 ملي تريس / حمض الهيدروكلوريك، و 0.5 ملي EDTA، ودرجة الحموضة 8.0) باستخدام غشاء غسيل الكلى مع 6 كيلو دالتون ميغاواط من قطع. تركيز البروتينات إلى 15 مل باستخدام وحدات تصفية الطرد المركزي مع الوزن الجزيئي قطع من 3 كيلو دالتون. تصفية حل البروتين باستخدام فلتر 0.2 ميكرون المسام.
  7. تطبيق البروتين على عمود الصرف أنيون اللوني (حجم العمود 5 مل) التي تم معايرتها مع 5 أحجام العمود B العازلة مع معدل تدفق 2.5 مل / دقيقة. مرة واحدة يتم تحميل البروتين على العمود، وغسل العمود مع العازلة B لمدة 10 دقيقة فيمعدل تدفق 2.5 مل / دقيقة. أزل HdeB مع الانحدار الخطي 0-0،5 M كلوريد الصوديوم في B العازلة على مدى فترة زمنية قدرها 50 دقيقة مع معدل تدفق 2.5 مل / دقيقة 6.
  8. تحديد الكسور التي تحتوي HdeB باستخدام 15٪ SDS-PAGE مزيج 20 عينة ميكرولتر مع 5 ميكرولتر 5X خفض العازلة تحميل SDS. تحميل 10 ميكرولتر على جل وتشغيل العازلة في تريس، جليكاين (14.4 غرام / لتر الجلايسين، 2.9 جم / لتر تريس، 1 غرام / لتر دوديسيل كبريتات الصوديوم، ودرجة الحموضة 8.3). تشغيل هلام في 150 V حتى ترحيل الفرقة برموفينول بالقرب من الجزء السفلي من هلام (~ 45 دقيقة).
  9. تجمع كل الأجزاء HdeB التي تحتوي على، dialyze في 4 درجات مئوية خلال الليل ضد 4 لتر عازلة تخزين HdeB (50 ملي تريس / حمض الهيدروكلوريك، و 200 ملي مول كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 8.0)، وتركيز البروتين إلى ما يقرب من 300 ميكرومتر باستخدام وحدات تصفية الطرد المركزي مع الوزن الجزيئي قطع من 3 كيلو دالتون. تحديد تركيز HdeB في 280 نانومتر باستخدام انقراض معامل ε 280nm = 15595 م -1 سم -1. إعداد 100 مكل وخالية من فلاشزي وقسامات في النيتروجين السائل.
    ملاحظة: يمكن تخزين HdeB في -70 درجة مئوية لمدة 6 أشهر على الأقل.

2. الوصيفة آخر الفحص عن طريق حراريا تتكشف مالات هيدروجيناز (مليون درهم)

ملاحظة: تأثير HdeB تنقيته على تجميع تتكشف حراريا الخنازير نازعة مالات الميتوكوندريا (مليون درهم) في قيم الرقم الهيدروجيني مختلفة تم رصدها على النحو المبين أدناه. جميع التركيزات البروتين المدرجة تشير إلى تركيز مونومر.

  1. لإعداد مليون درهم، dialyze مليون درهم في 4 درجات مئوية خلال الليل ضد 4 لتر عازلة C (50 ملي فوسفات البوتاسيوم، 50 مم كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.5) وتركيز البروتين إلى ما يقرب من 100 ميكرومتر باستخدام وحدات تصفية الطرد المركزي مع الوزن الجزيئي قطع من 30 كيلو دالتون.
    ملاحظة: مطلوب غسيل الكلى الدقيق مليون درهم كما يتم تسليم مليون درهم كما محلول كبريتات الأمونيوم.
  2. لإزالة الركام، الطرد المركزي البروتين لمدة 20 دقيقة في 20000 x ج في 4 درجات مئوية. تحديد تركيز مليون درهم من قبل الامتصاصية في 280 نانومتر (ε <فرعية> 280 نانومتر = 7950 م -1 سم -1). تجهيز 50 مكل من مليون درهم وفلاش تجميد قسامات للتخزين.
  3. ضع 1 مل الكوارتز كوفيت إلى معمل مضان مجهزة درجة الحرارة للرقابة أصحاب العينة والنمام. تعيين السابق λ / م إلى 350 نانومتر.
  4. إضافة وحدات مناسبة من قبل تحسنت (43 ° C) عازلة D (150 ملي فوسفات البوتاسيوم، 150 مم كلوريد الصوديوم) في القيم المطلوبة درجة الحموضة (هنا: الرقم الهيدروجيني 2.0، ودرجة الحموضة 3.0، ودرجة الحموضة 4.0، ودرجة الحموضة 5.0) إلى كفيت ومجموعة درجة الحرارة في حامل كوفيت إلى 43 درجة مئوية. الحجم الكلي هو 1000 ميكرولتر.
  5. إضافة 12.5 ميكرومتر HdeB (أو بدلا من نفس الحجم من العازلة التخزين HdeB لمراقبة عازلة) إلى المخزن المؤقت، تليها إضافة مليون درهم 0.5 ميكرومتر. تبدأ رصد تشتت الضوء. احتضان رد فعل ل 360 ثانية للسماح كافية تتكشف مليون درهم.
  6. رفع درجة الحموضة إلى 7 بإضافة 0،16-0،34 حجم 2 M K غير مصقول 2 هبو 4 ومواصلة إعادةحبال تشتت الضوء على 440 ثانية أخرى.
  7. تعيين حد لتجميع مليون درهم التي يتم تسجيلها في غياب كوصي عند نقطة زمنية محددة بعد تحييد (هنا بعد 500 ثانية، وعندما لوحظ القصوى تشتت الضوء من مليون درهم) إلى 100٪. تطبيع النشاط HdeB إلى إشارة ضوئية تناثر مليون درهم في غياب HdeB في كل قيمة الرقم الهيدروجيني المشار إليها.

3. الكشف عن HdeB-LDH تشكيل مجمع كتبها التحليلية تنبيذ فائق (AUC)

ملاحظة: تم تنفيذ الترسيب التجارب سرعة HdeB وحدها أو في المجمع مع تتكشف حراريا نازعة اكتات (LDH) باستخدام نابذة التحليلية.

  1. لإعداد LDH، dialyze LDH في 4 درجات مئوية خلال الليل ضد 4 لتر عازلة C (50 ملي فوسفات البوتاسيوم، 50 مم كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.5) وتركيز البروتين إلى ما يقرب من 200 ميكرومتر باستخدام وحدات تصفية الطرد المركزي مع الوزن الجزيئي قطع من 30 كيلو دالتون.
    ملاحظة: مطلوب غسيل الكلى الدقيق لرابطة حقوق الإنسان كما LDيتم تسليم H كما محلول كبريتات الأمونيوم.
  2. لإزالة الركام، الطرد المركزي LDH لمدة 20 دقيقة في 20000 x ج في 4 درجات مئوية. تحديد تركيز رابطة حقوق الإنسان من قبل الامتصاصية في 280 نانومتر (النانومتر = ε 280 43680 م -1 سم -1). تجهيز 50 مكل من LDH وفلاش تجميد قسامات للتخزين.
  3. احتضان 3 LDH ميكرومتر في حضور وغياب HdeB 30 ميكرومتر في المخزن D (درجة الحموضة 4 و 7، على التوالي) لمدة 15 دقيقة في 41 درجة مئوية.
    ملاحظة: الحضانة من رابطة حقوق الإنسان في أعلى نتائج درجات الحرارة في تجميع التام، وليس له تأثير كوصي من HdeB يمكن ملاحظتها.
  4. السماح للعينات يبرد إلى درجة حرارة الغرفة. ثم، وعينات من الحمل إلى الخلايا التي تحتوي على قطاع معيار شكل المركزية 2-قناة مع 1.2 سم طول المسار. تحميل الخلايا في نابذة وتتوازن إلى 22 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 1 ساعة قبل الترسيب.
  5. عينات تدور عند 22 درجة مئوية و 167000 x ج في الدوار منهما لمدة 12 ساعة، ورصد الحوار الاقتصادي الاستراتيجيimentation من البروتين بشكل مستمر عند 280 نانومتر. كما هو موضح سابقا، يتم تحسين إشارة إلى نسبة الضوضاء عندما يتم قياس شدة الضوء ينتقل من كل قناة بدلا من الامتصاصية. هذا أيضا يحسن نوعية تركيب البيانات لاحقا.
  6. إجراء تحليل البيانات مع SEDFIT (الإصدار 15.01b، ديسمبر 2015)، وذلك باستخدام نموذج توزيع ج مستمرة (ق) 17. وهناك أمثلة توضيحية تصف كيفية استخدام SEDFIT يمكن العثور في اشارة 18.
    1. تعيين مستوى الثقة لتسوية ME (الحد الأقصى الانتروبيا) إلى 0.7.
  7. حساب كثافة عازلة وكذلك اللزوجة باستخدام SEDNTERP 19. لتقدير كمية البروتين العميل مجمعة، مقارنة تكاملات LDH الرسوبية في درجة الحموضة 4 إلى الرقم الهيدروجيني 7 كمرجع.
    ملاحظة: دمج المؤامرات توزيع الترسيب يمكن القيام به مباشرة في SEDFIT. برنامج بديل لتحليل البيانات سرعة الترسيب يمكن العثور عليها في استعراض حديث 20. </ لى>

4. رصد مليون درهم التعطيل وإعادة تنشيط في وجود HdeB

ملاحظة: تأثير HdeB تنقيته على refolding من درجة الحموضة تكشفت مليون درهم تم تحديدها من قبل رصد نشاط مليون درهم على التعادل.

  1. احتضان 1 مليون درهم ميكرومتر في المخزن D في القيم المطلوبة درجة الحموضة (هنا: الرقم الهيدروجيني 2.0، ودرجة الحموضة 3.0، ودرجة الحموضة 4.0، ودرجة الحموضة 5.0) لمدة 1 ساعة على 37 درجة مئوية في ظل غياب أو وجود 25 ميكرومتر HdeB. ثم، تحول درجة الحرارة إلى 20 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
    ملاحظة: لم يلاحظ وجود refolding مليون درهم حتى في وجود HdeB عندما حضنت مليون درهم في درجات حرارة أعلى من 37 درجة مئوية.
  2. لبدء refolding من حمض مليون درهم التشويه والتحريف، تحييد عينات لدرجة الحموضة 7 بإضافة 0،13-0،42 حجم 0.5 M فوسفات الصوديوم، ودرجة الحموضة 8.0.
  3. بعد مرور فترة الحضانة لمدة 2 ساعة على 20 درجة مئوية، وتحديد النشاط مليون درهم من خلال رصد انخفاض NADH في 340 نانومتر 9.
    ملاحظة: مليون درهم يحفز تخفيض تعتمد على NADH من أوكسالوآسيتات إلى L-مالات. مزيج 50 ميكرولتر من رد فعل الحضانة مع 950 ميكرولتر من العازلة الفحص (50 ملي فوسفات الصوديوم، ودرجة الحموضة 8.0، أوكسالوآسيتات 1 ملم، و 150 ميكرومتر NADH).
    ملاحظة: يجب أن يكون تركيز النهائي من مليون درهم في المخزن المؤقت فحص 44 نانومتر.
  4. مراقبة التغير في الامتصاصية باستخدام مقياس الطيف الضوئي، ومجهزة كتلة بلتيير التحكم في درجة الحرارة المحددة إلى 20 درجة مئوية.
  5. عن النشاط مليون درهم مقارنة 44 نانومتر الأصلي مليون درهم التي تم الاحتفاظ بها في درجة الحموضة 7.0.

5. تأثير HdeB Overexpression على E. القولونية البقاء على قيد الحياة تحت الإجهاد حمض

ملاحظة: E. تم عزل كولاي MG1655 الجينومية الحمض النووي باستخدام بروتوكول نشر 21.

  1. تضخيم hdeB من E. القولونية MG1655 بواسطة PCR باستخدام بادئات hdeB - BamH I-مراجعة GGT GGT CTG GGA TCC TTA ATT CGG الجهاز المركزي للمحاسبات GTC ATT وhdeB - ECOR I-مهاجم GGT دول مجلس التعاون الخليجي غا عقاري AGG AGG CGC ATG AAT ATT TCA تكت لجنة مكافحة الإرهاب C.
  2. إعداد تفاعل PCR في 50 ميكرولتر على النحو التالي: 10 ميكرولتر 5X العازلة البلمرة، و 200 ميكرومتر dNTPs، و 0.5 ميكرومتر التمهيدي JUD2، و 0.5 ميكرومتر التمهيدي JUD5، 150 نانوغرام الجيني MG1655 الحمض النووي، و 0.5 ميكرولتر بوليميريز الحمض النووي، إضافة ده 2 O 50 ميكرولتر.
  3. أداء التضخيم من hdeB على النحو التالي: الخطوة 1: 5 دقائق في درجة حرارة 95 درجة مئوية، و1 دورة. خطوة 2: 30 ثانية في 95 درجة مئوية، و 30 ثانية في 55 درجة مئوية، و 30 ثانية في 72 درجة مئوية، 40 دورة. خطوة 3: 10 دقيقة عند 72 درجة مئوية.
  4. استنساخ الناتجة PCR جزء في مواقع ECOR الأول وBamH أنا البلازميد pBAD18 باستخدام الطرق القياسية لاستنساخ الموقع قيود. تنقية البلازميد باستخدام طقم تنقية البلازميد وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تحقق من البلازميد الناجم عن تسلسل 10.
  5. تحويل البلازميد معربا عن HdeB أو فارغة pBAD18 مكافحة ناقلات الأمراض في BB7224 سلالة (Δ rpoH) (النمط الجيني: F - λ E14 - [araD139] ب / ص [6؛ (صندوق الفرعي لاك) 169 flhD5301 Δ (fruK-yeiR) 725 (fruA25) relA1 rpsL150 (ن خ ص) rbsR22 Δ (fimB-FIME) 632 (:: IS1) ptsF25 zhf :: تينيسي 10S) suhX401 deoC1 اراد + rpoH :: اساسه + و 16) باستخدام الخلايا المختصة كيميائيا.
    ملاحظة: هذه السلالة هي حساسة للحرارة.
  6. بعد 45 ثانية الحرارة صدمة في 42 درجة مئوية، وقبل والطلاء، واحتضان الخلايا عند 30 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة. أداء واحدة مستعمرة خط الرافضة من الحيوانات المستنسخة الإيجابية واحتضان بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية. إعداد الثقافة بين عشية وضحاها في 50 مل LB الأمبير وزراعة الخلايا في 200 دورة في الدقيقة و 30 درجة مئوية.
  7. تمييع الثقافات بين عشية وضحاها من 40 أضعاف إلى 25 مل LB الأمبير وتنمو البكتيريا في وجود 0.5٪ الارابينوز (آرا) عند 30 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة لل 600Nm OD = 1.0 للحث على التعبير البروتين HdeB.
  8. لتجارب التحول درجة الحموضة، واستخدام LBأمبير + آرا لتمييع الخلايا لل 600Nm OD من 0.5 والتكيف مع القيم الخاصة الرقم الهيدروجيني (هنا: الرقم الهيدروجيني 2.0، ودرجة الحموضة 3.0، ودرجة الحموضة 4.0) وذلك بإضافة كميات مناسبة من 5 M حمض الهيدروكلوريك.
  9. بعد النقاط الزمنية المشار إليها (درجة الحموضة 2، 1 دقيقة، الرقم الهيدروجيني 3، 2.5 دقيقة، الرقم الهيدروجيني 4، 30 دقيقة)، تحييد الحضارات إضافة كميات مناسبة من 5 M هيدروكسيد الصوديوم.
  10. مراقبة نمو الثقافات تحييد في ثقافة السائل لمدة 12 ساعة على 30 درجة مئوية باستخدام القياسات OD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

HdeA وHdeB هي مثلي E. البروتينات القولونية، والمعروف لحماية البروتينات محيط بالجبلة ضد ظروف الإجهاد الحمضية 10. كشفت عملنا التي تشبه إلى HdeA، HdeB يعمل أيضا تنشيط حمض كوصي الجزيئية. ومع ذلك، وعلى النقيض من وظائف HdeA، HdeB في الرقم الهيدروجيني التي لا تزال محتملة للجراثيم، ولكن أعلى بكثير من الحد الأمثل الرقم الهيدروجيني للHdeA 6،9،10،22. للتحقيق في الأمثل الرقم الهيدروجيني من النشاط كوصي HdeB في المختبر، وقد تضعف الأصلي مليون درهم إلى ما قبل تحسنت (43 ° C) عازلة للدرجة الحموضة مبين في وجود أو عدم وجود HdeB. بعد 360 ثانية من الحضانة، وتحييد رد فعل الحضانة. هذا التحييد يؤدي تجميع مليون درهم في 43 ° C 9. وأظهرت النتائج تمثيلية إشارة خفيفة تناثر مليون درهم في غياب HdeB يزيد بشكل كبير على تحييد نظرا لتجميع مليون درهم (الشكل 1، BLخط ACK في كل درجة الحموضة). في ظل وجود HdeB، وانخفض إشارة تشتت الضوء بشكل كبير على تحييد الحموضة من 4 أو 5 درجة الحموضة مشيرا إلى أن HdeB يمنع تجميع مليون درهم (الشكل 1، ودرجة الحموضة 4 ودرجة الحموضة 5). في المقابل، ومع ذلك، على تحييد من درجة الحموضة (2) ودرجة الحموضة 3 مليون درهم المجاميع بسرعة بالقدر نفسه مستقلا عن وجود أو عدم وجود HdeB (الشكل 1، ودرجة الحموضة (2) ودرجة الحموضة 3)، مشيرا الى ان الأمثل الرقم الهيدروجيني للنشاط كوصي HdeB هو بين درجة الحموضة 4 و 5. المخزن المؤقت التخزين HdeB لم يكن لها تأثير على تجميع مليون درهم (الشكل 1، ومراقبة عازلة)، مشيرا إلى أن انخفاض إشارة خفيفة تناثر مليون درهم في وجود HdeB في درجة الحموضة 4 ويرجع ذلك إلى وظيفة كوصي لها. وكوصي HdeA نشط في شكله أحادى وتكشفت في درجة الحموضة 2-3 ولكن لا يظهر أي نشاط عند أو فوق درجة الحموضة 4 10. وهذه النتائج تشير إلى أن HdeB ديه نشاطها كوصي الأمثل حول الرقم الهيدروجيني 4 10.

ر = "الشكل 1" SRC = "/ ملفات / ftp_upload / 54527 / 54527fig1.jpg" />
وقد حضنت النشاط الوصيفة من HdeB في درجة الحموضة الحمضية 0.5 ميكرومتر مليون درهم في درجة حرارة ما قبل عازلة D في الرقم الهيدروجيني هو مبين في غياب أو وجود 12.5 ميكرومتر HdeB ل 360 ثانية في 43 ° C: الشكل 1. ثم أثيرت الرقم الهيدروجيني للعينات لدرجة الحموضة 7 (كما هو مبين من قبل النجمة) من خلال إضافة 0،16-0،34 حجم 2 M K غير مصقول 2 هبو وقد تم قياس مليون درهم تجميع ل440 ثانية إضافية من خلال رصد تشتت الضوء في 350 نانومتر في الرقم الهيدروجيني محايدة (خلفية زرقاء). تم تعديل الرقم من دال وآخرون. 10 البحوث .هذا وقد نشرت أصلا في مجلة الكيمياء البيولوجية. دال JU، Koldewey P، سمك السلمون L، هورويتز S، باردويل JC، وظائف جاكوب U. HdeB باعتبارها كوصي حامض واقية في البكتيريا. J بيول كيم. 2015، 290 (1): 65-75. دوى: 10.1074 / jbc.M114.612986. حقوق التأليف والنشر الجمعية الأمريكية للكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية.ق / ftp_upload / 54527 / 54527fig1large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

لمعالجة ما إذا كانت أشكال HdeB المجمعات مستقرة أيضا مع البروتينات الأخرى المتعاملة معها، LDH 3 ميكرومتر وقد تكشفت حراريا في 41 درجة مئوية في وجود أو عدم وجود HdeB 30 ميكرومتر في ظروف الأس الهيدروجيني مختلفة. أجري تحليل للسلوك الترسيب من هذه العينات من قبل تنبيذ فائق التحليلية عند 22 درجة مئوية. عندما حضنت LDH وHdeB معا في الرقم الهيدروجيني 7 و 41 درجة مئوية، وبقي LDH رباعي القسيمات حصرا (الوزن الجزيئي من 120 كيلو دالتون) وبقي HdeB مثنوي. وأشارت هذه النتائج إلى أن البروتينات لا تشكل مجمعات مستقرة في درجة الحموضة 7، ورابطة حقوق الإنسان لا يخضع أي تغيرات لا رجعة فيها في oligomerization بناء على حضانة 20 دقيقة في 41 ° C (الشكل 2، الخط الأخضر). وبالمثل، لا تزال HdeB مثنوي على الحضانة عند 41 درجة مئوية، ودرجة الحموضة 4.0، مما يشير إلى أن انخفاض درجة الحموضة حضانةمن HdeB لا يؤثر الدولة oligomerization لها حتى في ظل ظروف الصدمة الحرارية (الشكل 2، خط أحمر). رابطة حقوق الإنسان عندما حضنت في درجة الحموضة 4 و 41 درجة مئوية في ظل غياب HdeB تجميعها بسرعة كما يتضح من حقيقة أن 40٪ من LDH الرسوبية قبل سجلت الفحص الأول (الشكل 2، جاء في الزاوية العليا اليمنى). ظهر LDH المتبقية الرواسب في الغالب كما مونومر (الشكل 2، الخط الأزرق). في المقابل، تسببت حضانة LDH وHdeB في درجة الحموضة 4 و 41 درجة مئوية نسبة كبيرة من اثنين من البروتينات للمشاركة في الرواسب (HdeB-LDH C)، وتشكيل نوع جديد مع الوزن الجزيئي من 134 كيلو دالتون. هذا النوع من المرجح يمثل مجمع بين dimers HdeB وتتكشف حراريا LDH. وعلاوة على ذلك، في ظل وجود HdeB، لم يلاحظ أي LDH تجميع كبير قبل الترسيب، وهو ما يتسق مع في المختبر القياسات تجميع لدينا. وتشير هذه النتائج إلى أن HdeB يسلك النشاط كوصي في لشكل مثنوي في درجة الحموضة 4.0. هذا هو في تناقض صارخ مع HdeA التي كوصي نشطة في شكله أحادى. طبيعة ديناميكية للغاية من HdeB أن يسمح لها للخضوع لإعادة ترتيب الهيكلية بين درجة الحموضة 4 ودرجة الحموضة 7 هو على الأرجح كافية لتفعيل وظيفة كوصي HdeB في 10.

الشكل 2
الشكل 2: الكشف عن تشكيل المعقد بين HdeB ورابطة حقوق الإنسان تكشفت في درجة الحموضة 4 من تنبيذ فائق التحليلية وحضنت 3 ميكرومتر LDH في وجود HdeB تتجاوز 10 الرحى في المخزن D (150 ملي KHPO 150 مم كلوريد الصوديوم) لمدة 15 دقيقة في 41 درجة مئوية في أي درجة الحموضة 7 (الخط الأخضر) أو درجة الحموضة 4 (خط أسود). وعلى سبيل المقارنة، وحضنت LDH وحدها (الخط الأزرق) أو HdeB وحدها (خط أحمر) لمدة 15 دقيقة في 41 درجة مئوية في درجة الحموضة تم استخدام 4. تحليلية سرعة الترسيب تنبيذ فائق لتحديد العناصر المتفاعلة من HdeB، LDH، ومجمع تشكلت بين HdeB ورابطة حقوق الإنسان في التنمية المتكاملة للأسرةشروط ferent درجة الحموضة. لاحظ أن ~ 40٪ LDH تجميعها قبل الفحص الأول عندما حضنت في درجة الحموضة 4 و في غياب HdeB (كما هو موضح في الزاوية العليا اليمنى). أظهرت هو مؤامرة توزيع معامل الترسيب (ج (ق)) تحليلها باستخدام برنامج SEDFIT. رسائل تشير الدولة بلازميدة قليلة القسيمات كل من رابطة حقوق الإنسان أو HdeB، على التوالي: HdeB HdeB ديمر. LDH LDH مونومر، LDH LDH tetramer. HdeB-LDH مجمع HdeB-LDH. تم تعديل الرقم من دال وآخرون. 10. وقد نشر هذا البحث أصلا في مجلة الكيمياء البيولوجية. دال JU، Koldewey P، سمك السلمون L، هورويتز S، باردويل JC، وظائف جاكوب U. HdeB باعتبارها كوصي حامض واقية في البكتيريا. J بيول كيم. 2015، 290 (1): 65-75. دوى: 10.1074 / jbc.M114.612986. حقوق التأليف والنشر الجمعية الأمريكية للكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية. الرجاء انقر هنا لعرض أكبر الاصدارسيون من هذا الرقم.

لاختبار ما إذا HdeB يدعم refolding من البروتينات العميل على تحييد، تم تحليل تأثير HdeB حول refolding من مليون درهم، التشويه والتحريف درجة الحموضة. حراريا وحضنت التشويه والتحريف مليون درهم في قيم درجة الحموضة المختلفة في وجود أو عدم وجود HdeB. بعد انخفاض حضانة درجة الحموضة، وتحييد الحموضة (الذي يبدأ مليون درهم refolding)، وتحديد النشاط مليون درهم بعد 2 ساعة. كما هو مبين في الشكل (3)، وقد تحقق تنشيط كبيرا من مليون درهم على تحييد الحموضة من 4 في وجود HdeB. تم تحديد أي نشاط مليون درهم عندما كان HdeB غائبة عن حضانة انخفاض الرقم الهيدروجيني.

الشكل (3)
الشكل (3): HdeB يسهل refolding من حمض التشويه والتحريف مليون درهم إلى حالة نشطة إنزيمي وقد حضنت 1 ميكرومتر مليون درهم في المخزن D في درجة الحموضة وأشار لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية في ظل غياب أو ص.resence من 25 ميكرومتر HdeB. ثم، تم تحويل درجة الحرارة إلى 20 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة قبل أن تحييد عينات لدرجة الحموضة 7 بإضافة 0.5 M نا 2 هبو 4. اتخذت قسامات بعد 2 ساعة من الحضانة عند 20 درجة مئوية ويعاير للنشاط مليون درهم. ويظهر النشاط مليون درهم على تحييد في غياب (أشرطة بيضاء) أو وجود HdeB (أشرطة سوداء). يتم عرض الانحراف المعياري المستمدة من لا يقل عن 3 قياسات مستقلة. تم تعديل الرقم من دال وآخرون. 10. وقد نشر هذا البحث أصلا في مجلة الكيمياء البيولوجية. دال JU، Koldewey P، سمك السلمون L، هورويتز S، باردويل JC، وظائف جاكوب U. HdeB باعتبارها كوصي حامض واقية في البكتيريا. J بيول كيم. 2015، 290 (1): 65-75. دوى: 10.1074 / jbc.M114.612986. حقوق التأليف والنشر الجمعية الأمريكية للكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذاالشكل.

كشفت لدينا في المختبر البيانات التي HdeB يربط مختلف البروتينات العميل نموذج في درجة الحموضة 4، ويمنع تجميع ويسهل العميل refolding تتم استعادة ظروف الأس الهيدروجيني مرة واحدة محايدة. للتحقيق في آثار HdeB في الجسم الحي، وأجريت فحوصات البقاء على قيد الحياة تعتمد على درجة الحموضة باستخدام سلالة rpoH حذف حساسة للحرارة. هذه السلالة يفتقر معظم مرافقين، وبالتالي أكثر عرضة لدرجة حرارة مرتفعة، وانخفاض درجة الحموضة أو الاكسدة 15. أظهر overexpression من HdeB تحت ظروف الأس الهيدروجيني محايدة أي تأثير على معدل نمو السلالة، التي نمت بشكل جيد نسبيا لسلالة تحكم تؤوي في pBAD18 ناقلات فارغة (الشكل 4، غير المعالجة). وفي المقابل، وجدنا اختلافات واضحة في قدرتها على استئناف النمو على درجة الحموضة 3 أو 4 درجة الحموضة العلاج مع overexpressing سلالة HdeB تبين تحسين بتكاثر التعافي من انخفاض درجة الحموضة treatment من سلالة تحكم. وعلى النقيض من البيانات المتوفرة لدينا في المختبر، ومع ذلك، كان وجود HdeB أيضا تأثير وقائي ملحوظ في درجة الحموضة 3. قد يكون هذا بسبب تركيز عال من HdeB في الخلية، والتي قد تحول الدولة oligomerization من HdeB نحو dimers حتى في درجة الحموضة 3. لاحظ أن تحول الخلايا لدرجة الحموضة 2 أو 3 درجة الحموضة أدى إلى آثار سريعة جدا وشديدة السمية، بينما لم يلاحظ أي قتل كبير عندما الخلايا حيث المحتضنة في درجة الحموضة 4 9،10،22.

الشكل (4)
الشكل 4: HdeB يحمي E. وقد overexpressed القولونية ضد الحامضية. HdeB (الدوائر الحمراء) في BB7224 (Δ rpoH) في وجود 0.5٪ الارابينوز عند 30 درجة مئوية. واستخدمت خلايا BB7224 إيواء pBAD18 ناقلات فارغة عن السيطرة (الدوائر السوداء). وتظهر اللوحة اليسرى العليا نمو كل من شارعالأمطار في 30 درجة مئوية، تم نقل الرقم الهيدروجيني 7. الخلايا إلى درجة الحموضة أشار بإضافة 5 M حمض الهيدروكلوريك، والمحتضنة لمدة 1 دقيقة في درجة الحموضة 2 (اللوحة اليمنى العليا)، و 2.5 دقيقة في درجة الحموضة 3 (اللوحة السفلى اليسرى) أو 30 دقيقة في الرقم الهيدروجيني 4 (خفض اللوحة اليمنى). وفي وقت لاحق، تم تحييد الثقافات عن طريق إضافة كميات مناسبة من 5 M هيدروكسيد الصوديوم وتم رصد النمو في الوسط السائل عند 30 درجة مئوية. تم تعديل الرقم من دال وآخرون. 10. وقد نشر هذا البحث أصلا في مجلة الكيمياء البيولوجية. دال JU، Koldewey P، سمك السلمون L، هورويتز S، باردويل JC، وظائف جاكوب U. HdeB باعتبارها كوصي حامض واقية في البكتيريا. J بيول كيم. 2015، 290 (1): 65-75. دوى: 10.1074 / jbc.M114.612986. حقوق التأليف والنشر الجمعية الأمريكية للكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

من أجل دراسة آلية تفعيل وظيفة كوصي من HdeB، كميات كبيرة من HdeB يجب أن تكون أعرب وتنقيته. تتوفر لإنتاج مستويات عالية من بروتين الهدف، بما في ذلك pTrc أو pBAD ناقلات، وكلاهما المستخدمة في هذه الدراسة عدد من أنظمة ناقلات التعبير. المروجين يمكن الوصول إليها بسهولة لE. القولونية البلمرة RNA، وبالتالي تسمح upregulated بقوة تعبيرا عن HdeB في أي E. سلالة القولونية. هذا الجانب أهمية خاصة في الجسم الحي دراسة overexpression من HdeB تحت ظروف الإجهاد الحمضية، حيث تم استخدام سلالة -deficient rpoH. هذه السلالة يفتقر أكثر من مرافقين وبالتالي هو أكثر حساسية تجاه مختلف الضغوطات، بما في ذلك درجة حرارة مرتفعة، وانخفاض درجة الحموضة والاكسدة 15. كبديل، بقاء دراسات مماثلة لتلك المقدمة هنا لا يمكن أن يؤديها في سلالات متحولة التي تفتقر إلى الجين.

ر "> تصميم تجريبي لأي نشاط كوصي أو refolding فحص لابد من النظر بعناية، سواء في ما يخص نوع العميل، وتركيز البروتين العميل وعازلة الشروط. وفي المقايسات كوصي نموذجية والبروتينات العميل نموذج، مثل والتشويه والتحريف سينسيز سترات، وسيفيراز، أو نازعة مالات في تركيزات عالية من اليوريا أو غوانيدين، حمض الهيدروكلوريك، وتضعف إلى عازلة خالية من ممسخ للحث على تجميع 23،13. القياسات في وجود مرافقين تكشف عن المدى الذي منع تجميع البروتين. بدلا من ذلك، العملاء هم تكشفت حراريا ويتم رصد بروتين التجميع. وفي كلتا الحالتين، وتستخدم القياسات تشتت الضوء كما قراءات لتجميع البروتين. مرافقين النشط منع تجميع تتكشف البروتينات العميل، مما يسبب انخفاضا في إشارة تشتت الضوء 6. كل من هذه الاجهزة التجريبية يمكن الجمع مع انخفاض حضانة درجة الحموضة. وبالإضافة إلى تقييم مولالنشاط كوصي ecular من خلال رصد قدرتها على منع تجميع خاصة البروتينات العميل، وتأثير المحرمين على refolding العميل عند عودته إلى الظروف غير الإجهاد يمكن اختبار 24. هذا واضح ومباشر وخصوصا عندما تمتلك البروتينات العميل النشاط الأنزيمي، والتي يمكن أن تستخدم قراءات الكمية لتعطيل وتنشيط. في حين refolding بوساطة كوصي هو بطبيعة الحال عملية تعتمد على اعبي التنس المحترفين، وقد ثبت مرافقين محيط بالجبلة مثل HdeA، HdeB وجاسوس لتسهيل العميل refolding بطريقة ATP مستقلة، بما يتفق مع نقص الطاقة في الجبلة المحيطية 9،25.

دراسة الأمثل الرقم الهيدروجيني من كوصي حامض واقية مثل HdeB هو تحدي لأسباب مختلفة: (ط) السلوكيات تجميع البروتينات كوصي العميل حتى راسخة مثل سينسيز سترات تختلف في درجة الحموضة الحمضية. و (ثانيا) سوى عدد قليل من النظم عازلة تعمل في نطاق درجة الحموضة بين 2-5 وهي سويجدول لكل من كوصي من الفائدة والبروتين العميل. قررنا استخدام العازلة الفوسفات، على الرغم من أننا ندرك أن هذا هو نظام المخزن غير مثالية في ظل الظروف الحامضية. ومع ذلك، فقد وجد العازلة الفوسفات لتكون مناسبة تماما لتوصيف HdeA باسم حمض كوصي تنشيط 9،22. قياسات تجميع حساسة جدا تجاه التغيرات في درجة الحرارة أو عازلة المحتوى. للقضاء على نتائج إيجابية كاذبة، ولذلك فإننا ننصح دائما اختبار تأثير عازلة تخزين كوصي على تجميع العميل (الشكل 1، ومراقبة عازلة). أحيانا تجميع البروتين العميل يحدث بهذه السرعة أنه حتى أفضل كوصي قد لا تكون قادرة على المنافسة مع عملية التجميع. ولذا فمن الضروري إجراء اختبارات أولية لإيجاد الظروف المثلى فحص. ويرد مثال جيد لمثل هذه الحالة في التجارب تنبيذ فائق لدينا حيث حضانة LDH عند درجة حرارة> 42 درجة مئوية بسرعة لدرجة أنوجود فائض من HdeB لا يمنع LDH التجميع. وبالإضافة إلى ذلك، كوصي / المشارك كوصي نسبة أو نسبة كوصي / العميل يجب أن تحدد بدقة 23. بدأنا باستخدام HdeB مرتفعة إلى حد ما: نسبة مليون درهم من 50: 1 في التجارب الأولية والتي ساعدتنا في تحديد درجة الحموضة 4 كما في الرقم الهيدروجيني الأمثل للنشاط كوصي من HdeB. نحن ثم واصل تحليل HdeB: نسب مليون درهم في الفترة بين 1: 1 و 50: 1 في درجة الحموضة 4، وتحديد 25: 1 أن تكون نسبة الأكثر فعالية. في المقابل، قمعت HdeA مليون درهم التجميع إلى 10: 1 كوصي: نسب العميل 6،9،10،22. وبالتالي، فإننا نستنتج أن HdeA، بالمقارنة مع HdeB، هو أكثر فعالية في قمع مليون درهم تجميع عن انخفاض كوصي: كانت نسب العميل كافية لقمع تماما مليون درهم التجميع. مقاربة أخرى للتحقيق في قمع بوساطة كوصي من تجميع البروتين تشمل فحوصات تدور باستمرار، حيث يتم إزالة الركام العميل عن طريق الطرد المركزي وكميا بواسطة SDS PAGE يناسب هذا النهج أيضا لمonitoring تأثير المحرمين على تجميع البروتين في الجسم الحي. ويتعرض سلالات متحولة إما بإفراط أو تفتقر كوصي التي تهم البروتين تتكشف ظروف الإجهاد. وفي وقت لاحق، وهي lysed الخلايا ويتم فصل أجزاء القابلة للذوبان والمجمعة وكميا 15،16،26.

للكشف عن مجمع العميل كوصي، طبقنا تنبيذ فائق التحليلية. يجب الإشارة هنا إلى أنه استنادا إلى الإعداد التجريبية من غير الممكن لتحديد بشكل مباشر على كمية من HdeB وأحادية LDH ملزمة في هذا المجمع، كما تمتص كل من البروتينات عند 280 نانومتر. إذا رغبت في ذلك، رياضيات الكيمياء من مجمع كوصي العميل يمكن تحديده من خلال وصفها بشكل منفصل مرافق والبروتين العميل مع حامل اللون، التي تقع ضمن نطاق مرئية الأقصى الإثارة. بدلا من ذلك، رياضيات الكيمياء من العملاء للمرافقين داخل المجمعات يمكن تحديد باستخدام PAGE الأم إلى جانب لطخة غربية الكمية. عن طريق اتباع البروتوكولات المعروضة هنا، كنا قادرين على تميز اثنين مرافقين الجزيئية، HdeA، وHdeB 9،10،22. بشكل عام، هذه المقايسات يمكن أن تستخدم أيضا للتحقيق في دور مثبطات المحتملة للمرافقين الجزيئية في refolding البروتين في المختبر، وفي الجسم الحي أو يمكن تطبيقها على اختبار مرافقين الاصطناعية لقدرتها على منع تجميع العميل تحت الضغط الحمضية. وبالإضافة إلى ذلك، فإن البروتوكولات المعروضة هنا يمكن أن تستخدم لتحليل نقاط الطفرات و / أو المتغيرات اقتطاع من المحرمين الحمضية التي تنشط من أجل تسليط الضوء على آلية تفعيلها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

نشكر الدكتورة كلوديا كريمرز لها النصيحة مفيدة على المقايسات كوصي. واعترف كين وان للحصول على المساعدة الفنية له في تنقية HdeB. وأيد هذا العمل من قبل معهد هوارد هيوز الطبي (لJCAB) والمعاهد الوطنية للصحة منح RO1 GM102829 إلى JCAB وUJJ-UD يدعمها زمالة أبحاث ما بعد الدكتوراه المقدمة من مؤسسة البحوث الألمانية (DFG).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NEB10-beta E. coli cells New England Biolabs C3019I
Ampicillin Gold Biotechnology A-301-3
LB Broth mix, Lennox LAB Express 3003
IPTG Gold Biotechnology I2481C50
Sodium chloride Fisher Scientific S271-10
Tris Amresco 0826-5kg
EDTA Fisher Scientific BP120-500
Polymyxin B sulfate  ICN Biomedicals Inc. 100565
0.2 µm pore sterile Syringe Filter Corning 431218
HiTrap Q HP (CV 5 ml) GE Healthcare Life Sciences 17-1153-01
Mini-Protean TGX, 15% Bio-Rad 4561046
Malate dehydrogenase (MDH) Roche 10127914001
Potassium phosphate (Monobasic) Fisher Scientific BP362-500
Potassium phosphate (Dibasic) Fisher Scientific BP363-1
F-4500 fluorescence spectrophotometer Hitachi FL25
Oxaloacetate Sigma O4126-5G
NADH Sigma  N8129-100MG
Sodium phosphate monobasic Sigma  S9390-2.5KG
Sodium phosphate dibasic Sigma  S397-500
Lactate dehydrogenase (LDH) Roche 10127230001
Beckman Proteome Lab XL-I analytical Ultracentrifuge Beckman Coulter 392764
Centerpiece, 12 mm, Epon Charcoal-filled Beckman Coulter 306493
AN-50 Ti Rotor, Analytical, 8-Place Beckman Coulter 363782
Wizard Plus Miniprep Kit Promega A1470 used for plasmid purification (Protocol 5.1)
L-arabinose Gold Biotechnology A-300-500
Glycine DOT Scientific Inc DSG36050-1000
Fluorescence Cell cuvette Hellma Analytics 119004F-10-40
Oligonucleotides Invitrogen
Phusion High-Fidelity DNA polymerase New England Biolabs M0530S
dNTP set Invitrogen 10297018
Hydrochloric Acid Fisher Scientific A144-212
Sodium Hydroxide Fisher Scientific BP359-500
Amicon Ultra 15 ml 3K NMWL Millipore UFC900324
Centrifuge Avanti J-26XPI Beckman Coulter 393127
Varian Cary 50 spectrophotometer Agilent Tech
Spectra/Por 1 Dialysis Membrane MWCO: 6 kDa Spectrum Laboratories 132650
Amicon Ultra Centrifugal Filter Units 30K Millipore UFC803024
SDS Fisher Scientific bp166-500
Veriti 96-Well Thermal Cycler Thermo Fisher 4375786

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Smith, J. L. The Role of Gastric Acid in Preventing Foodborne Disease and How Bacteria Overcome Acid Conditions. J Food Protect. 66, 1292-1303 (2003).
  2. Hong, W., Wu, Y. E., Fu, X., Chang, Z. Chaperone-dependent mechanisms for acid resistance in enteric bacteria. Trends Microbiol. 20, (7), 328-335 (2012).
  3. Koebnik, R., Locher, K. P., Van Gelder, P. Structure and function of bacterial outer membrane proteins: barrels in a nutshell. Mol Microbiol. 37, 239-253 (2000).
  4. Reichmann, D., Xu, Y., et al. Order out of Disorder: Working Cycle of an Intrinsically Unfolded Chaperone. Cell. 148, (5), 947-957 (2012).
  5. Bardwell, J. C. A., Jakob, U. Conditional disorder in chaperone action. Trends Biochem Sci. 37, (12), 517-525 (2012).
  6. Tapley, T. L., Korner, J. L., et al. Structural plasticity of an acid-activated chaperone allows promiscuous substrate binding. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (14), 5557-5562 (2009).
  7. Hong, W., Jiao, W., et al. Periplasmic Protein HdeA Exhibits Chaperone-like Activity Exclusively within Stomach pH Range by Transforming into Disordered Conformation. J Biol Chem. 280, (29), 27029-27034 (2005).
  8. Zhang, B. W., Brunetti, L., Brooks, C. L. III Probing pH-Dependent Dissociation of HdeA Dimers. J Am Chem Soc. 133, 19393-19398 (2011).
  9. Tapley, T. L., Franzmann, T. M., Chakraborty, S., Jakob, U., Bardwell, J. C. A. Protein refolding by pH-triggered chaperone binding and release. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (3), 1071-1076 (2010).
  10. Dahl, J. -U., Koldewey, P., Salmon, L., Horowitz, S., Bardwell, J. C. A., Jakob, U. HdeB Functions as an Acid-protective Chaperone in Bacteria. J Biol Chem. 290, (1), 65-75 (2015).
  11. Waterman, S. R., Small, P. L. C. Identification of sigmas-dependent genes associated with the stationary-phase acid-resistance phenotype of Shigella flexneri. Mol Microbiol. 21, (5), 925-940 (1996).
  12. Mucacic, M., Baneyx, F. Chaperone Hsp31 Contributes to Acid Resistance in Stationary-Phase Escherichia coli. Appl Environ Microbiol. 73, (3), 1014-1018 (2007).
  13. Daugherty, D. L., Rozema, D., Hanson, P. E., Gellman, S. H. Artificial Chaperone-assisted Refolding of Citrate Synthase. J Biol Chem. 273, 33961-33971 (1998).
  14. Jakob, U., Muse, W., Eser, M., Bardwell, J. C. A. Chaperone Activity with a Redox Switch. Cell. 96, (3), 341-352 (1999).
  15. Guisbert, E., Yura, T., Rhodius, V. A., Gross, C. A. Convergence of Molecular, Modeling, and Systems Approaches for an Understanding of the Escherichia coli Heat Shock Response. Microbiol Mol Biol Rev. 72, (3), 545-554 (2008).
  16. Tomoyasu, T., Mogk, A., Langen, H., Goloubinoff, P., Bukau, B. Genetic dissection of the roles of chaperones and proteases in protein folding and degradation in the Escherichia coli cytosol. Mol Microbiol. 40, (2), 397-413 (2001).
  17. Schuck, P. Size-Distribution Analysis of Macromolecules by Sedimentation Velocity Ultracentrifugation and Lamm Equation Modeling. Biophys J. 78, (3), 1606-1619 (2000).
  18. Analytical ultracentrifugation direct boundary modeling with sedfit. analyticalultracentrifugation.com. Available from: http://www.analyticalultracentrifugation.com/default.htm (2016).
  19. Sednterp. bitcwiki.sr.unh.edu. Available from: http://bitcwiki.sr.unh.edu/index.php/Main_Page (2012).
  20. Patel, T. R., Winzor, D. J., Scott, D. J. Analytical ultracentrifugation: A versatile tool for the characterisation of macromolecular complexes in solution. Methods. 95, 55-61 (2016).
  21. Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of Nucleic Acids by Extraction with Phenol:Chloroform. Cold Spring Harb Protoc. 2006, (2006).
  22. Foit, L., George, J. S., Zhang, B. inW., Brooks, C. L., Bardwell, J. C. A. Chaperone activation by unfolding. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 1254-1262 (2013).
  23. Nicoll, W. S., Boshoff, A., Ludewig, M. H., Hennessy, F., Jung, M., Blatch, G. L. Approaches to the isolation and characterization of molecular chaperones. Protein Express Purif. 46, 1-15 (2006).
  24. Minami, Y., Hohfeld, J., Ohtsuka, K., Hartl, F. U. Regulation of the Heat-shock Protein 70 Reaction Cycle by the Mammalian DnaJ Homolog, Hsp40. J Biol Chem. 271, (32), 19617-19624 (1996).
  25. Quan, S., Koldewey, P. Genetic selection designed to stabilize proteins uncovers a chaperone called Spy. Nat Struct Mol Biol. 18, 262-269 (2011).
  26. Gray, M. J., Wholey, W. Y. Polyphosphate Is a Primordial Chaperone. Mol Cell. 53, (5), 689-699 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats