的pH依赖性活性的检测
1Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology, University of Michigan, 2Howard Hughes Medical Institute, University of Michigan

Published 10/23/2016
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Biochemistry

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Summary

这项研究说明生物物理,生物化学和分子生物学技术的酸性pH条件下表征大肠杆菌 HdeB的伴侣活性。这些方法已被成功地用于其它酸保护伴侣分子如HdeA蛋白,并且可以进行修改,以用于其它分子伴侣和应力的条件下工作。

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Dahl, J. U., Koldewey, P., Bardwell, J. C., Jakob, U. Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo. J. Vis. Exp. (116), e54527, doi:10.3791/54527 (2016).

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Abstract

细菌经常暴露于环境的变化,如在pH值改变,温度,氧化还原状态,光照射或机械力。许多的这些条件导致蛋白质在细胞中解折叠和对生物体的存活有害影响。 A组无关,特定的应力 - 分子伴侣已被证明在这些胁迫条件存活中发挥重要作用。虽然完全折叠和分子伴侣不活动的压力之前,这些蛋白质迅速展开和具体的胁迫下成为伴侣活性。一旦被激活,这些条件无序伴侣结合到大量不同的聚集倾向的蛋白质,防止其聚集和直接或间接地促进蛋白在返回到非胁迫条件重折叠。对于获得关于它们的激活和客户识别的机理的更详细的了解主方法涉及纯化和subsequen使用体外实验伴侣这些蛋白质的牛逼表征。后续体内应激试验是绝对必要的独立证实体外结果所获得的。

这个协议描述的体外 和体内方法来表征E的伴侣活性大肠杆菌 HdeB,酸活化的蛋白伴侣。光散射测量被用来作为一种方便读出为HdeB的能力,以防止已建立的模型客户蛋白,MDH的酸诱导的聚集, 在体外 。分析超速离心实验应用于揭示HdeB及其客户蛋白LDH之间形成复合物,轻脱落到客户蛋白在返回非重压条件下的命运。的客户蛋白的酶促活性测定法进行监测HdeB的pH值引起的客户端的失活和活化的影响。最后,存活研究被用来monito的R 体内 HdeB的陪伴分子功能的影响

Introduction

其中微生物病原体经历酸诱导蛋白展开条件常见的自然环境是哺乳动物的胃(pH范围1-4),其酸性pH值作为对食源性致病菌1的有效屏障。蛋白质解折叠和聚集,这是由氨基酸侧链质子化引起的,会影响生物过程,损害的细胞结构,并最终导致细胞死亡1,2。因为细菌周质的pH值达到平衡几乎瞬间与环境pH值由于通过多孔外膜质子的自由扩散,革兰氏阴性细菌的周质和内膜蛋白是酸胁迫条件3下的最脆弱的细胞成分。以保护其免于快速酸介导的损伤的周质蛋白质,革兰氏阴性细菌利用酸活化周质蛋白伴侣HdeA蛋白和HdeB。 HdeA蛋白是一种有条件的无序伴侣6,7。 HdeA蛋白激活需要深刻的结构变化,包括其解离成单体,和部分解折叠的单体6-8。一旦被激活,HdeA蛋白结合到酸性条件下展开的蛋白质。它有效地防止了两者在pH中和过程中在低pH孵育以及它们的聚集。在返回至pH7.0,HdeA蛋白有利于在ATP无关的方式其客户蛋白质复性和转换回它的二聚体,分子伴侣活性构象9。同样地,同源伴侣HdeB也伴侣惰性在pH 7.0。不像HdeA蛋白,然而,HdeB的分子伴侣活性在pH值4.0达到其最大表观,其下HdeB在很大程度上仍然折叠和二聚体10的条件。而且,进一步降低pH CAUSES HdeB的失活。这些结果表明,尽管其广泛的同源性,HdeA蛋白和HdeB在它们的功能的激活允许它们以覆盖一个宽的pH范围内与它们的保护陪伴分子功能的方式有所不同。已经在大肠杆菌中的耐酸性牵连一种其它分子伴侣大肠杆菌是胞质Hsp31,这似乎直到恢复中性条件下稳定折叠客户蛋白。 Hsp31的行动的确切模式,但是,一直保持神秘的12。鉴于其他致肠病细菌如沙门氏菌缺乏hdeAB操纵子,它很可能是其他尚未鉴定的周质蛋白伴侣可能存在是参与这些细菌11的耐酸性。

这里介绍的协议允许监测体外体内 10 HdeB的pH依赖性伴侣活性和可应用于研究其他分子伴侣如Hsp31。或者,控制hdeAB的表达转录因子的复杂网络可以潜在地通过在体内应力测定法研究。为了表征体内蛋白的分子伴侣功能,不同的实验设置可以被应用。一路线是应用蛋白质折叠应激条件和表型表征突变菌株,无论是过表达感兴趣的基因或者携带缺失的基因。蛋白质组学研究可以进行到聚合识别哪些蛋白不再胁迫条件下时,分子伴侣存在时,或者可以在使用酶测定14-16应力条件来确定一个伴侣上的特定的酶的影响。在这项研究中,我们选择了过度HdeB在rpoH缺失株,它缺乏热休克σ因子32 RpoH控制所有主要E.表达大肠杆菌伴侣及其缺失是已知会增加SENSitivity到导致蛋白质折叠15环境胁迫条件。 HdeB 的体内伴侣活性通过监测其抑制ΔrpoH应变的pH敏感性的能力来确定。总之,这里介绍的协议提供了快速并简单的方法来表征体外以及在体内上下文酸活化的分子伴侣的活性。

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Protocol

1.表达和周质HdeB纯化

注:HdeB在大肠杆菌表达大肠杆菌细胞携带从在多粘菌素裂解周质质粒pTrc- hdeB 10,并纯化。

  1. 制备大肠杆菌的过夜培养大肠杆菌细胞携带质粒pTrc- hdeB 10在30毫升的LB含有200微克/ ml氨苄青霉素(LB 安培 )。接种LB 安培四个1L的培养物,并在37℃下生长他们和200rpm下,直至达到0.7的OD 600nm处 。然后,添加300微米的IPTG以诱导HdeB的表达和降低生长温度至30℃。
  2. 在30℃下5小时的表达后,在8000 xg离心收获细胞离心5分钟,在4℃。
  3. 洗细胞沉淀用100mL在8000 xg离心再次将细胞缓冲液A(50毫摩尔Tris /盐酸,50 mM氯化钠,pH值7.5)和离心机在4℃5分钟。
  4. 随后,悬浮在80中的细胞沉淀毫升缓冲液A,含有1mg / ml的多粘菌素硫酸盐。为外膜的有效破坏,轻轻搅动在4℃下的悬浮液1小时。
  5. 以除去细胞质部分和细胞碎片,离心悬浮液20分钟,在4℃下15000 xg离心。这导致〜含有可溶性HdeB60毫升上清液。
  6. 透析含周质提取物过夜针对使用具有6 kDa的MW透析膜缓冲液B(20毫摩尔Tris /盐酸,0.5毫摩尔EDTA,pH 8.0)中的150倍体积上清液切断。浓缩蛋白质使用离心过滤器单元3 kDa的分子量截断毗邻15毫升过滤用0.2μm细孔过滤蛋白质溶液。
  7. 应用该蛋白上已经用2.5毫升/分钟的流速平衡用5柱体积的缓冲液B中的阴离子交换层析柱(柱体积5毫升)中。一旦蛋白被加载到柱上,洗涤用缓冲液B的柱在10分钟2.5毫升/分钟的流速。洗脱HdeB从0至0.5M NaCl的超过50分钟为2.5毫升/分钟6的流速的时间段的线性梯度于缓冲液B。
  8. 确定用15%SDS-PAGE含HdeB分数。混合5微升5倍的还原SDS上样缓冲液20微升样品。负载10微升到凝胶,并在Tris-甘氨酸缓冲液(14.4克/升的甘氨酸,2.9克/升的Tris,1g / L的十二烷基硫酸钠,pH值8.3)中运行。在150V运行凝胶,直至溴酚频带已迁移接近凝胶(〜45分钟)的底部。
  9. 池中的所有含HdeB级分,在4℃下透析过夜针对4升HdeB存储缓冲液(50mM的Tris /盐酸,200mM的氯化钠,pH值8.0),并使用具有分子量离心过滤装置的蛋白浓缩至大约300微米截止3千道尔顿。使用消光系数ε280nm处 = 15,595中号确定HdeB的浓度在280nm -1 -1。准备100微升等分和免费闪存泽在液氮中等分试样。
    注:HdeB可以储存在-70℃至少6个月。

2.伴侣活性测定中使用热展开苹果酸脱氢酶(MDH)

注:纯化HdeB上的在不同pH值的热解折叠猪线粒体苹果酸脱氢酶(MDH)的聚集的影响如下所述进行监控。所有列出的蛋白质浓度是指单体浓度。

  1. 为了制备MDH,在4℃下透析MDH过夜针对4升缓冲液C(50mM磷酸钾,50mM NaCl中,pH为7.5),并使用为30的分子量截止离心过滤单元的蛋白浓缩至约100μM的kDa的。
    注:由于MDH是作为硫酸铵溶液MDH仔细透析是必需的。
  2. 要删除聚集,离心蛋白20分钟,在4℃,20000 XG。确定由吸光度MDH浓度在280nm(ε<子> 280毫微米= 7,950 M -1 -1)。准备MDH的50微升等分和闪光灯冻结等分进行存储。
  3. 放置1毫升石英试管到装有温度控样品支架和搅拌器的荧光分光光度计。设置λEX / EM到350纳米。
  4. 到试管并集:在所需的pH值(pH为2.0,pH值为3.0,pH值4.0和pH值5.0这里)添加预热(43℃)缓冲液D(150 mM磷酸钾,150mM的NaCl)中的适当体积在试管架的温度至43℃。总体积为1,000微升。
  5. 添加12.5μMHdeB(或者对于缓冲器控制相同体积HdeB存储缓冲器的)到缓冲器,接着加入0.5微米的MDH。开始监视光散射。孵育360秒的反应,以便有足够的MDH展开。
  6. 通过添加2M的无缓冲 K 2的0.16-0.34体积HPO 4将pH提高到7,并继续再盘带另一个440秒的光散射。
  7. 设置要在定义的时间点和后记录在不存在分子伴侣的MDH聚集程度(后这里500秒,当观察到的MDH最大光散射)至100%。正常化HdeB对在没有HdeB的MDH的光散射信号活动每一指明的pH值。

3.分析超速离心HdeB-LDH复合物的形成检测(AUC)

注意:使用分析超速离心机进行单独的或与热解折叠乳酸脱氢酶(LDH)络合物HdeB的沉降速度实验。

  1. 为了制备LDH,在4℃下透析,LDH过夜针对4升缓冲液C(50mM磷酸钾,50mM NaCl中,pH为7.5),并使用为30的分子量截止离心过滤单元的蛋白浓缩至约200μM的kDa的。
    注:LDH仔细透析需要为LDH被交付硫酸铵溶液。
  2. 要在20000 XG在4℃除去聚集,LDH离心20分钟。通过在280nm的吸光度确定LDH的浓度(ε280nm处 = 43680 M-1 -1)。准备LDH的50微升等分和闪光灯冻结等分进行存储。
  3. 孵育在缓冲液D的存在和不存在30μM的HdeB的(分别为pH值为4和7,)搅拌15分钟3微米的LDH在41℃。
    注:在其完整的聚合温度较高导致LDH的孵化和HdeB没有伴侣效果进行观察。
  4. 让样品冷却到室温。然后,负载样品到含有标准扇区小区形1.2 cm光程2通道中心焦点。加载细胞进入超速离心机和平衡至22℃,沉淀前至少1小时。
  5. 在22℃下旋样品和167000 XG在各自的转子12小时,并监视sed的连续在280处的蛋白的imentation。正如以前证明,当每个通道的透射光强度的测量,而不是吸光度信噪比得以改善。这也提高了随后的数据拟合的质量。
  6. 进行数据分析与SEDFIT(版本15.01b,2015年12月),采用连续C(S)分布模型17。介绍如何使用SEDFIT该教程可以参考18中找到。
    1. 设置为ME(最大熵)转正至0.7置信水平。
  7. 计算使用SEDNTERP 19缓冲密度以及粘度。估算聚集客户蛋白质的量,作为参考在pH为4比较沉降的LDH的积分至pH7。
    注:沉淀分布图的整合可以直接在SEDFIT进行。分析沉降速度数据的替代软件可以在最近的一篇综述20被发现。</ LI>

4.监测MDH失活和再激活的HdeB的存在

注:纯净HdeB对pH值展开MDH复性的影响是通过对中和监视MDH活性。

  1. 在不存在或25μMHdeB的存在下进行1小时,在37℃:孵育缓冲液D1μM的MDH在所需的pH值(pH为2.0,pH值为3.0,pH值4.0和pH值5.0这里)。然后,将温度转变为20℃下进行10分钟。
    注:观察到即使在HdeB存在无复性MDH MDH时,在温度高于37°C时保温。
  2. 以引发酸变性的MDH复性,通过加入0.13-0.42体积的0.5M磷酸钠,pH 8.0的中和该样品至pH 7。
  3. 在20℃温育2小时后,通过监控在340nm处9的NADH的减少确定MDH活性。
    注:MDH催化NADH依赖性降低草酰乙酸的为L-苹果酸。 混合50微升950微升测定缓冲液(50mM磷酸钠,pH值8.0,1mM的草酰乙酸,和150μMNADH)孵育反应。
    注:MDH的在测定缓冲液中的最终浓度应44纳米。
  4. 监测使用分光光度计吸光度变化,配备有设置为20℃的帕尔贴温度控制块。
  5. 报告相对于44纳米原生MDH的MDH的活动,一直保持在pH为7.0。

HdeB过表达对E. 5.影响酸胁迫下生存的大肠杆菌

:E。使用公开协议21 大肠杆菌 MG1655的基因组DNA分离出来。

  1. E.放大hdeB 大肠杆菌 MG1655采用PCR引物hdeB - 的BamHⅠ-REV GGT GGT CTG GGA TCC TTA ATT CAA CGG GTC ATT和hdeB - EcoRI位 I-FW GGT GCC GAA TTC AGG AGG CGC ATG AAT ATT TCA TCT CTC C.
  2. 成立于50微升如下PCR反应:10微升5倍聚合酶缓冲液,200μM的dNTP,0.5μM底漆JUD2,0.5μM底漆JUD5,150纳克基因组DNA MG1655,0.5微升DNA聚合酶,加DDH 2 O的50微升。
  3. 如下执行hdeB的扩增:步骤1:在95℃,1个循环5分钟;步骤2:30秒在95℃下,在55℃30秒,在72℃,40个循环30秒;步骤3:在72℃下10分钟。
  4. 克隆得到的PCR片段插入到使用限制性位点克隆的标准方法质粒pBAD18的EcoR I和BamH I 点。纯化使用根据制造商的说明的质粒纯化试剂盒的质粒。测序10验证得到的质粒。
  5. 变换表达HdeB或空载体对照pBAD18到菌株BB7224(ΔrpoH)(基因型质粒:F - ,λ - ,E14 - ,[araD139] B / R [6;(ARGF-LAC)169 flhD5301Δ(fruK-yeiR)725(fruA25)relA1 rpsL150(SM R)rbsR22Δ(fimB-FIME)632(:: IS1)ptsF25 ZHF :: Tn的10(TC S)suhX401 deoC1 araD的 + rpoH ::根 + 16)使用化学感受态细胞。
    注:此菌株是温度敏感。
  6. 后45秒在42℃的电镀前热休克和,孵育在30℃和200rpm下的细胞。执行阳性克隆的单菌落条纹奏孵育过夜,在30℃。制备在50毫升的LB 安培的过夜培养,并培养所述细胞在200rpm和30℃。
  7. 稀释过夜培养物40倍于25毫升LB培养基放大器 ,并在30℃和200 rpm到的OD 600nm的 = 1.0生长细菌在0.5%的阿拉伯糖(阿糖胞苷)的存在下,以诱导HdeB蛋白的表达。
  8. 对于pH变化的实验中,使用LBAMP +阿糖胞苷来稀释细胞以0.5的OD 600nm处并调整到各自的pH值(此处为:pH 2.0,pH值3.0和pH 4.0)通过加入5M的盐酸的适当体积。
  9. 指定的时间点(; pH为3,2.5分钟; pH为2,1分钟pH为4,30分钟)后,通过加入5 M氢氧化钠的适当体积的中和培养物。
  10. 监控中和培养物在液体培养基在30℃下使用的OD测量生长12小时。

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Representative Results

HdeA蛋白和HdeB同源E.大肠杆菌的蛋白质,称为保护周质蛋白对酸应激条件10。我们的工作表明,类似于HdeA蛋白,HdeB还充当一种酸活化的分子伴侣。然而,在pH是仍然可能的杀菌力,但比HdeA蛋白6,9,10,22的pH最适显著更高的对比度,以HdeA蛋白,HdeB功能。调查体外 HdeB的伴侣活性的最佳pH值,原生的MDH稀释到在HdeB的存在或不存在的指示pH值的预热(43℃)缓冲液中。孵育360秒后,将温育反应中和。该中和在43℃9触发MDH的聚集。代表性的结果表明,在不存在HdeB的MDH的光散射信号极大地在中和由于MDH的凝集增加( 图1,BL在各pH ACK线)。在HdeB的存在下,光散射信号显著在中和减少从pH为4或pH 5指示HdeB防止MDH( 图1,pH值为4和5)的聚集。与此相反,但是,在从pH值2和pH 3中和,MDH迅速聚集到独立HdeB( 图1,pH为2,pH为3)的存在或不存在的相同的程度,这表明最佳pH为HdeB的伴侣活性是pH为4和该HdeB存储缓冲器5之间对MDH聚集( 图1,缓冲器控制)没有任何影响,这表明在HdeB在pH 4的存在的MDH的减小的光散射信号是由于其伴侣功能。 HdeA蛋白是分子伴侣在其单体和非折叠形式的活性在pH为2-3,但示出了处于或高于pH 4 10无活性。这些结果表明,HdeB具有约pH 4 10其最佳伴侣活性。

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图1:在酸性pH HdeB的伴侣活性 0.5μMMDH在预热缓冲液D在不存在或12.5μMHdeB为360秒的存在所指示的pH值在43℃下温育。然后将样品的pH值升高至通过加入0.16-0.34体积的2M无缓冲的K 2 HPO 4 pH为7(由星号指示),苹果酸脱氢酶聚集额外440秒,在350处测量通过监测光散射在中性pH值(蓝色背景)。图是从达尔。10。本研究修改最初发表在生物化学杂志。达尔JU,科尔德威P,鲑鱼L,霍洛维茨S,巴德韦尔JC,雅各布U. HdeB功能细菌酸性保护伴侣。生物化学杂志。 2015年,290(1):65-75。 DOI:10.1074 / jbc.M114.612986。版权所有美国社会为生物化学与分子生物学。S / ftp_upload / 54527 / 54527fig1large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。

为了解决是否HdeB形成稳定的复合物还可以与其他客户蛋白,3μM的LDH进行热在41℃下在存在或不存在30μMHdeB的在不同pH条件下展开。这些样品通过分析超速离心的沉降行为的分析,在22℃下进行。当LDH和HdeB在pH 7和41℃下共同培养,LDH仍然只四聚体(120 kDa的分子量)和HdeB保持二聚。这些结果表明,蛋白质不在pH 7形成稳定的复合物,及LDH不会在41℃下( 图2,绿线)经历在20分钟温育在低聚任何不可逆的变化。同样,在HdeB 41°C和pH值4.0孵化保持在二聚体,这表明低pH孵化的HdeB并不影响,即使在热休克条件下( 图2,红色线)其低聚状态。 LDH当在没有HdeB的的事实,LDH的40%沉淀的第一次扫描,记录( 图2,在右上角说明)之前所指示的迅速聚集在pH 4和41℃下温育。剩余的LDH似乎主要滓作为单体( 图2,蓝线)。与此相反,在pH 4和41℃的LDH和HdeB孵育引起两种蛋白质共同沉积物(HdeB-LDH C)的大的比例,形成具有134 kDa的分子量的一个新种。这种可能代表HdeB二聚体和热去折叠的LDH之间的复合物。此外,在HdeB的存在下,在沉淀之前,没有显著LDH聚合中观察到,这与我们的体外聚集测量一致。这些结果表明,HdeB表现出伴侣活性的在pH 4.0二聚物形式。与此形成鲜明对比的HdeA蛋白,这是它的单体形式伴侣活跃。 HdeB的非常动态的性质,允许其经受pH值为4和7之间的结构重排为HdeB的伴侣功能10的激活可能足够。

图2
图2:通过分析超速离心HdeB和未折叠的LDH之间形成复合物的检测,在pH 4 3微米的LDH在10摩尔过量HdeB的在缓冲液D(150毫KHPO 4,150mM的NaCl)中15分钟的存在下培养在在任pH为7(绿线)41°C或pH值4(黑线)。为了比较,LDH单独(蓝线)或HdeB单独(红线)在41℃下孵育15分钟,在pH 4.分析超离心沉降速率来测定HdeB的化学计量,LDH,和HdeB之间形成的复合物和LDH在DIF同的pH条件。注意,〜40%的LDH之前第一扫描聚集时,在pH 4和在不存在HdeB温育(如在右上角说明)。使用程序SEDFIT示出的是一个沉降系数分布图(C(S))进行分析。字母分别表示LDH或HdeB各自的寡聚状态:HdeB D,HdeB二聚体; LDH ,LDH单体,LDH T,LDH四聚体; HdeB-LDH C,HdeB-LDH复杂。图是从达尔等人 10进行修改。这项研究最初发表在生物化学杂志。达尔JU,科尔德威P,鲑鱼L,霍洛维茨S,巴德韦尔JC,雅各布U. HdeB功能细菌酸性保护伴侣。生物化学杂志。 2015年,290(1):65-75。 DOI:10.1074 / jbc.M114.612986。版权所有美国社会为生物化学与分子生物学。 请点击此处查看大版本这个数字的锡永。

为了测试HdeB是否支持在中和客户蛋白的重折叠,HdeB的pH值改性的MDH复性影响进行了分析。热变性MDH在在HdeB的存在或不存在不同的pH值下培养。低pH温育后,将pH中和(它启动MDH复性)和2小时后测定的MDH活性。正如图3所示,MDH的显著激活物在中和从pH为4中HdeB的存在下实现的。当HdeB是从低pH孵育缺席测定没有MDH活性。

图3
图3:HdeB便于酸的重折叠变性MDH到酶促活性状态 1μM的MDH在缓冲液D以指定的pH值在37℃下在不存在或对温育1小时25μMHdeB的resence。然后,将温度转变为20℃下进行10分钟,然后将样品通过加入0.5M Na 2 HPO 4中和至pH 7。等分试样之后在20℃2小时温育所采取并测定MDH活性。当在不存在(白色柱)或HdeB的存在(黑色条)中和MDH活性示。自至少3个独立的测量得到的标准偏差被示出。图是从达尔等人 10进行修改。这项研究最初发表在生物化学杂志。达尔JU,科尔德威P,鲑鱼L,霍洛维茨S,巴德韦尔JC,雅各布U. HdeB功能细菌酸性保护伴侣。生物化学杂志。 2015年,290(1):65-75。 DOI:10.1074 / jbc.M114.612986。版权所有美国社会为生物化学与分子生物学。 请点击此处查看这个大版本数字。

我们在体外数据显示HdeB在pH值为4结合不同型号的客户蛋白,防止其聚集并有利于客户一旦复性中性pH条件下被还原。调查HdeB 在体内的作用,pH依赖性存活测定法采用温度敏感rpoH缺失菌株进行。这株最缺乏伴侣,因此是高温,低pH值或氧化应激15更敏感。中性pH条件下HdeB的过表达显示对菌株的生长速率,其前身同等良好到窝藏空载体pBAD18( 图4,未处理)对照菌株没有任何影响与此相反,我们发现在他们的能力明显的差异继续在与HdeB过表达株的pH 3或pH 4待遇增长呈现从低pH TREA重复性提高恢复tment比对照菌株。相反我们的体外数据,但是,HdeB的存在也有在pH 3.一个显著的保护作用,这可能是由于在细胞中高浓度HdeB的,这可能会HdeB低聚状态朝二聚体甚至在pH移位3.注意转移细胞至pH 2或pH为3导致非常快速和高毒性作用,同时当细胞,其中在pH为4 9,10,22孵育没有观察到显著杀伤。

图4
图4:HdeB保护E.大肠杆菌对酸性pH。HdeB(红色圆圈)在0.5%的阿拉伯糖在30℃下存在下过度表达在BB7224(ΔrpoH)。 BB7224细胞窝藏空载体pBAD18作为对照(黑圈)。左上图同时显示ST增长降雨在30℃,pH为7细胞中加入5 M盐酸移位到指定的pH,和在pH为2(右上面板)温育1分钟,在pH为3(左下图)或在30分钟2.5分钟pH值为4(右下图)。接着,将培养物通过添加5M的NaOH中适当体积中和生长在液体培养基中在30℃下监测。图是从达尔等人 10进行修改。这项研究最初发表在生物化学杂志。达尔JU,科尔德威P,鲑鱼L,霍洛维茨S,巴德韦尔JC,雅各布U. HdeB功能细菌酸性保护伴侣。生物化学杂志。 2015年,290(1):65-75。 DOI:10.1074 / jbc.M114.612986。版权所有美国社会为生物化学与分子生物学。 请点击此处查看该图的放大版本。

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Discussion

为了研究活化和HdeB的伴侣功能的机制,大量HdeB的必须被表达和纯化。许多表达载体系统可用于生产高水平的靶蛋白,包括的pTrc或的pBAD载体,这两者在此研究中使用的。发起人是E.容易获得大肠杆菌 RNA聚合酶和在任何大肠杆菌 HdeB的从而允许强烈上调表达大肠杆菌菌株。这方面是用于酸应力的条件下,在这里被使用的rpoH缺损株下HdeB的体内表达研究尤其相关。该菌株缺乏大部分伴侣的,因此是对各种紧张,包括升高的温度下,低pH值和氧化应激15更敏感。作为替代方案中,存活研究类似于这里提出可以在缺乏目的基因的突变菌株来执行的。

t“的>实验设计为任何伴侣活性或再折叠试剂盒要慎重考虑,都在问候的类型的客户端,客户端蛋白的浓度和缓冲液条件。在典型的分子伴侣测定中,模型客户蛋白,如柠檬酸合酶,萤光素酶,或苹果酸脱氢酶被变性以高浓度尿素或盐酸胍的,并稀释成无变性剂的缓冲液以诱导聚合23,13。在伴侣的存在下测量揭示它们阻止蛋白质聚集的程度。可替代地,客户端是热折叠和蛋白质聚集被监测。在这两种情况下,光散射测量被用作读出对蛋白质聚集。主动伴侣防止展开客户蛋白,从而导致光散射信号6的降低的聚集。这两个这些实验设置的可以与低pH温育结合。除了评估的摩尔通过监测其预防特定客户蛋白的聚集能力ecular伴侣活性,在客户端的重折叠蛋白伴侣的在返回到非胁迫条件的影响可以测试24。当客户蛋白具有的酶活性,可用于作为其失活和活化定量读数,这是特别简单的。而分子伴侣介导的重折叠自然是ATP依赖的过程中,周质伴侣分子如HdeA蛋白,HdeB和间谍已显示出促进客户在一个ATP无关的方式重折叠,以在周质9,25缺乏能量一致。

研究的酸保护伴侣如HdeB的最佳pH是具有挑战性的,由于各种原因:(ⅰ)聚合如柠檬酸合酶甚至既定分子伴侣客户蛋白的行为在酸性pH值不同;和(ii)仅少数缓冲系统的pH范围内工作,2-5之间,并且专门表用于感兴趣两个分子伴侣和客户蛋白。我们决定使用磷酸盐缓冲液,虽然我们都知道,这是酸性pH值条件下非理想的缓冲系统。然而,磷酸盐缓冲液被认为是非常适合表征HdeA蛋白作为酸活化伴侣9,22。聚集测量是对温度或缓冲区内容变化非常敏感。以消除假阳性结果,因此,我们建议始终测试客户端汇聚伴侣存储缓冲器的影响( 图1,缓冲器控制)。有时客户蛋白质的聚集发生如此之快,即使是最好的伴侣可能不能够与所述聚集过程竞争。因此,必须要进行初步测试,以找到最佳的实验条件。对于这样的情况的一个很好的例子,在我们的实验中超速离心给出,其中在> 42°C的高温LDH的潜伏期是如此之快,连过量HdeB的存在不会阻止LDH聚集。此外,该分子伴侣/共伴侣比或伴侣/客户比率必须仔细23确定。在初步实验1和确定pH值4作为HdeB的伴侣活性的最适pH帮助我们:我们开始使用一个相当高的HdeB:50 MDH比。然后,我们继续分析HdeB:1和50:1之间的MDH比在pH 4 1,识别25:1至是最有效的比率。与此相反,HdeA蛋白抑制MDH聚集为10:1的蛋白伴侣:客户比率6,9,10,22。因此,我们的结论是HdeA蛋白,相比于HdeB,在抑制MDH聚合低级伴侣更为有效:客户比率为足以完全抑制MDH聚集。调查蛋白质聚集的分子伴侣介导的抑制的另一种方法涉及降速测定法,其中客户聚集物通过离心除去,并通过SDS PAGE定量。这种方法还适用于在monitoring伴侣对蛋白聚集在体内的影响。突变株,要么过表达或缺乏所关注的分子伴侣暴露于蛋白质折叠应激条件。随后,将细胞裂解和可溶的和聚集的馏分被分离并定量15,16,26。

用于检测的客户机 - 分子伴侣复合物,我们应用分析超速离心。应当在这里指出,根据实验设置,不可能直接量化HdeB的和在这个复杂的结合量LDH单体,因为这两个蛋白质吸收在280nm处。如果需要,该分子伴侣客户复合物的化学计量可以通过分别标记伴侣和客户蛋白与发色团,其最大激发位于可见光范围内来确定。可替代地,客户端的对伴侣蛋白复合物中的化学计量可以通过使用结合定量免疫印迹变性PAGE来确定。 按照这里介绍的协议,我们能够表征两种分子伴侣,HdeA蛋白和HdeB 9,10,22。在一般情况下,这些试验也可用于研究体外体内分子伴侣的潜在抑制剂的蛋白质复性的作用,也可以应用于测试合成分子伴侣为他们以防止酸胁迫下的客户端的聚集的能力。此外,这里介绍的协议可以用于点突变和/或酸活化的蛋白伴侣的截短变体的分析,以光棚成它们的活化的机制。

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Acknowledgements

我们感谢克劳迪娅Cremers博士为她的伴侣测定有益的建议。啃完被确认为HdeB净化自己的技术援助。这项工作是由霍华德·休斯医学研究所(到JCAB)和健康补助RO1 GM102829到JCAB和UJJ-UD全国学院是由德国研究基金会(DFG)提供的博士后研究奖学金支承。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NEB10-beta E. coli cells New England Biolabs C3019I
Ampicillin Gold Biotechnology A-301-3
LB Broth mix, Lennox LAB Express 3003
IPTG Gold Biotechnology I2481C50
Sodium chloride Fisher Scientific S271-10
Tris Amresco 0826-5kg
EDTA Fisher Scientific BP120-500
Polymyxin B sulfate  ICN Biomedicals Inc. 100565
0.2 µm pore sterile Syringe Filter Corning 431218
HiTrap Q HP (CV 5 ml) GE Healthcare Life Sciences 17-1153-01
Mini-Protean TGX, 15% Bio-Rad 4561046
Malate dehydrogenase (MDH) Roche 10127914001
Potassium phosphate (Monobasic) Fisher Scientific BP362-500
Potassium phosphate (Dibasic) Fisher Scientific BP363-1
F-4500 fluorescence spectrophotometer Hitachi FL25
Oxaloacetate Sigma O4126-5G
NADH Sigma  N8129-100MG
Sodium phosphate monobasic Sigma  S9390-2.5KG
Sodium phosphate dibasic Sigma  S397-500
Lactate dehydrogenase (LDH) Roche 10127230001
Beckman Proteome Lab XL-I analytical Ultracentrifuge Beckman Coulter 392764
Centerpiece, 12 mm, Epon Charcoal-filled Beckman Coulter 306493
AN-50 Ti Rotor, Analytical, 8-Place Beckman Coulter 363782
Wizard Plus Miniprep Kit Promega A1470 used for plasmid purification (Protocol 5.1)
L-arabinose Gold Biotechnology A-300-500
Glycine DOT Scientific Inc DSG36050-1000
Fluorescence Cell cuvette Hellma Analytics 119004F-10-40
Oligonucleotides Invitrogen
Phusion High-Fidelity DNA polymerase New England Biolabs M0530S
dNTP set Invitrogen 10297018
Hydrochloric Acid Fisher Scientific A144-212
Sodium Hydroxide Fisher Scientific BP359-500
Amicon Ultra 15 ml 3K NMWL Millipore UFC900324
Centrifuge Avanti J-26XPI Beckman Coulter 393127
Varian Cary 50 spectrophotometer Agilent Tech
Spectra/Por 1 Dialysis Membrane MWCO: 6 kDa Spectrum Laboratories 132650
Amicon Ultra Centrifugal Filter Units 30K Millipore UFC803024
SDS Fisher Scientific bp166-500
Veriti 96-Well Thermal Cycler Thermo Fisher 4375786

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References

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