Анизотропию, как флуоресценция инструмента для изучения белок-белковых взаимодействий

1Departamento de Química de Biomacromoléculas, Instituto de Química, Universidad Nacional Autónoma de México, 2Departamento de Genética del Desarrollo y Fisiología Molecular, Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional Autónoma de México
Published 10/21/2016
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Белковых взаимодействий в основе функции клетки. Калориметрические и спектроскопические методы широко используются для их характеристики. Здесь мы опишем флуоресцентной анизотропии в качестве инструмента для изучения взаимодействия между белком мутировал в синдром Shwachman-DIAMOND (SBDS) и фактор элонгации типа 1 GTPase (EFL1).

Cite this Article

Copy Citation

Gijsbers, A., Nishigaki, T., Sánchez-Puig, N. Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions. J. Vis. Exp. (116), e54640, doi:10.3791/54640 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Белок-белковые взаимодействия играют существенную роль в функционировании живого организма. После того, как взаимодействие было определено и подтверждено, необходимо охарактеризовать его на структурном и механистической уровне. Существует несколько биохимических и биофизических методов для этой цели. Среди них, анизотропии флуоресценции мощный метод особенно используется, когда интенсивность флуоресценции флуорофора-меченого белка остается постоянным при белок-белкового взаимодействия. В этой технике, флуорофор-меченого белка возбуждается с вертикально-поляризованным светом с соответствующей длиной волны, который селективно возбуждают подмножество флуорофоров в соответствии с их относительной ориентации с помощью входящего пучка. В результате эмиссии также имеет направленность, отношения которых в вертикальной и горизонтальной плоскостях определяет анизотропии (г) следующим образом : г = (I VV -I В.Х.) / (I VV + 2I В.Х.), где я VV , и я

Introduction

Клетки содержат множество биомакромолекулах, которые постоянно взаимодействуют друг с другом. Эта ассоциация рождает комплексы, которые участвуют в клеточных путей, ответственных за их функционирование в сигнальной трансдукции, регуляции экспрессии генов и миграции клеток среди других. Все белок-белковых взаимодействий, которые происходят в клетке составляют сеть, известную как интерактома. В Saccharomyces CEREVISIAE было показано более чем 70% от его белков , чтобы иметь взаимодействующих партнеров 1. Понимание интерактома клетки и их функции предоставляют соответствующую информацию о сложности и разнообразии живых организмов. Несколько методик были описаны для идентификации и характеристики белок-белковых взаимодействий. Различные высоко через положить методы , такие как дрожжи дигибридная 2, белок-фрагмент комплементационных анализов 3, 4 аффинной очистки в сочетании с масс - спектрометрии и белка microarraYS используются для идентификации взаимодействия 5,6. После идентификации, необходимо проверить его, и это может варьироваться в зависимости от случая к случаю. Как правило, эти эксперименты связаны с срыве самого взаимодействия на уровне отдельных членов пары взаимодействия, например, путем делеции гена или избыточная экспрессия одного из белков, а затем ищет изменения в свойствах или функции другого члена в то на клеточном уровне. Впоследствии, биофизические методы 7 используются для характеристики белок-белковых взаимодействий на молекулярном уровне. С этой целью, структура белковых комплексов определяются с помощью рентгеновской кристаллографии, ядерного магнитного резонанса и крио-электронной микроскопии в то время как калориметрии и флуоресцентной спектроскопии используются для количественной и механистически описания.

В этой работе, анизотропии флуоресценции использовали в качестве методики для характеристики взаимодействия между ГТФ EFL1 и SBDS белок. Эти белки участвуют в синтезе рибосом путем содействия высвобождение эукариотических фактора инициации 6 от поверхности 60S рибосомальной субъединицей 8. Белок SBDS мутирует в заболевание , известное как Shwachman-Даймонд синдром 9 и действует как фактор обмена гуанина нуклеотиддля EFL1 уменьшая его сродство к гуанозиндифосфат 10,11. мутации болезни в SBDS отменить взаимодействие с EFL1 и тем самым предотвратить его активацию.

Флуоресцентная анизотропия обычно используется в биологических приложениях для изучения белок-пептид или взаимодействий белок-нуклеиновых кислот. Он основан на принципе, что флуорофор возбуждаемых с поляризованными светом приводит частично поляризованного излучения. Анизотропии флуоресценции определяется уравнением 1:

Equation1

где я VV , и я В.Х. являютсяинтенсивности флуоресценции вертикально (VV) и по горизонтали (VH) поляризован излучение , когда образец возбуждается с вертикально поляризованный свет 12. Флуоресцентная анизотропия чувствительна к факторам, которые влияют на скорость вращательной диффузии флуорофора и, таким образом, зависит от температуры, вязкости раствора и кажущегося размера молекул флуорофора. Видимый размер белка, содержащего флуорофор увеличивается, когда он взаимодействует с другим белком, и такое изменение может быть оценена как изменение анизотропии. Более конкретно, флуорофор , который вращается медленно в растворе по отношению к его жизни флуоресцентного будет иметь большое значение , я VV и малое значение I V H , и , следовательно , будет демонстрировать относительно большую анизотропию. Для флуорофоров , что ОБРУШЬТЕСЬ быстро по сравнению с их флуоресцентным жизни, я VV , и я В.Х. будут подобны и их анизотропии значение будет небольшим 12 (Рисунок 1). Кроме того, для хорошей анизотропии сигнал измерения уровня шума, необходимо иметь флуорофор с времени жизни флуоресценции, подобной времени вращательной корреляции интерес молекулы. В противном случае, не представляется возможным точно регистрировать разницу в анизотропии между свободным белком и что в комплексе. Например, анизотропия флуоресцентного зонда с временем жизни около 4 наносекунд, такие как флуоресцеин или родамин, прикрепленных к низкомолекулярного соединения молекулярного 100 дальтон составляет 0,05. Связывание с молекулой 160 кДа увеличит его анизотропии значение 0,29; различие, которое может быть точно измерена. В противоположность этому, тот же флуоресцентного зонда участвуют в реакции связывания, чей рост размера молекул варьируется от 65 до 1000 кДа, приведет лишь к изменению анизотропии 0,28 до 0,3, который слишком мал, чтобы быть точно измерена. В этом случае зонд со временем жизни 400 нсек был бы более подходящим 12.


Рисунок 1. Схематическое изображение оборудования , используемого для измерения анизотропии флуоресценции и процедуры. Схематическое изображение оборудования , используемого для выполнения измерительный белок-белок эксперимент взаимодействия анизотропии флуоресценции. Флуорофоры , что барабанные быстрый дисплей небольшой анизотропии , которая увеличивает на связывание с партнером взаимодействия. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Флуоресцентные системы требуют присутствия флуорофор в любой из молекул изученных. Для изучения белок-белковых взаимодействий, существуют три типа флуорофоров: 1) Триптофан остатки, присутствующие в белках, 2) химически присоединенные флуорофоры и 3) флюоресцентные партнеры слитые, такие как зеленый флуоресцентный белок (GFP) и его Derivaставители. Большинство белков имеют остатки триптофана на его структуру, таким образом, самый простой способ измерить взаимодействие является путем мониторинга изменений в соответствующих спектров флуоресценции или путем наблюдения за изменениями в интенсивности флуоресценции остатков триптофана. Тем не менее, триптофан остатки могут присутствовать в обоих белках, усложняющих анализ. С другой стороны, для флуорофора, чтобы изменить его флуоресцентные свойства из-за взаимодействия он должен быть расположен на или вблизи сайта связывания, и это может помешать само взаимодействие. Это требует особого внимания при использовании громоздких флуорофоры, такие как GFP Если ни один из этих флуорофоров не может быть использован для исследований связывания необходимо, а затем, чтобы ввести примесные флуорофоры к одному из белков, участвующих. Многие химически синтезированные флуорофоры существовать и могут быть ковалентно связаны с белками через их реакционноспособные группы, такие как аминные группы (боковой цепи лизина или N-конца) и тиоловых групп в цистеин. Fпроизводные luorophore с изотиоцианатных и сукцинимидиловых эфиры реагируют с амидной группы в то время как йодацетамида и малеимидная являются тиол-реактивные группы 13. Наиболее распространенные красители, используемые в приложениях флуоресцентных являются производными флуоресцеина и родамина зеленые красители, кумарины, BODIPY флуорофоры и Alexa Fluor красители. Подробный перечень коммерчески доступных флуорофоров и их использование можно найти в ссылках 14,15. Для успешной маркировки, реактивная группа должна быть открыта на поверхности белка, но из-за большого количества химически активных функциональных групп, обычно присутствующих в полипептидах очень трудно получить модификации конкретного участка. Белок интерес в данном исследовании, SBDS, содержит 5 свободных цистеина и 33 лизинов, которые могут привести к многократной маркировки сайта. Неравномерный маркировка может повлиять на связывании и усложнит анализ данных, как разные молекулы флуорофором могут вызывать различные сигналы интенсивности флуоресценции при связывании. Для Овеrcome эту проблему, мы использовали флуорофора âñïûøêè, 4 ', 5'-бис (1,3,2 dithioarsolan-2-ил) флуоресцеина сайт-прямой этикетке белок SBDS. Это arsenoxide краситель с высоким сродством к четырем разнесенных цистеина в мотиве знают , как ФЛЭШ-тег , состоящий из CCXXCC последовательности , где X обозначает любую аминокислоту, кроме цистеина 16,17. Этот tetracysteine ​​мотив добавлен к N- или С-конце белка методом генной инженерии вместе с соответствующим линкером для предотвращения нарушения общей складки белка. Пара , состоящая из красителя и ФЛЭШ ФЛЭШ-таг был первоначально разработан для сайт-специфических белков меток в живых клетках 17 , но он также может быть использован для обозначения очищенных белков в пробирке , как это иллюстрируется здесь. Кроме того, ферментативные стратегии были также разработаны для того, чтобы сайт-специфической функционализации белков 18.

В этой рукописи мы опишем полезность флуоресцентной анизотропии аса инструмент для изучения белок-белковых взаимодействий. Связывание может быть оценена с помощью простого осмотра связывающей формы кривой в то время как количественная информация может быть получена из подгонки экспериментальных данных.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. SBDS-ФЛЭШ Tag Экспрессия белка и очистка

Примечание: Для экспериментов анизотропии, фотовспышка-тег, соответствующий последовательности Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys был добавлен к С-концу человеческого SBDS кодирующей последовательности с помощью ПЦР. Эту конструкцию субклонируют в вектор экспрессии pRSET-A и трансформировали в кишечной палочки C41 клеток для экспрессии белка , кодирующий N-концевой гексагистидиновую метки (His-тэг), человеческие SBDS последовательность и С-концевой ВСПЫШКА тегов 10 кодирования.

  1. Экспрессия белка SBDS-ФЛЭШ
    1. Transform компетентную E. палочки C41 клетки с плазмиды pRSET-HisSBDS-ФЛЭШ с использованием стандартного протокола теплового шока 19. Пластина клеток в твердых Лурии-Бертани (LB) среде с 100 мкг / мл ампициллина. LB твердые среды композиция состоит из 10 г NaCl, 5 г дрожжевого экстракта, 10 г триптон и 20 г агар для объема 1 л.
    2. Культуры, трансформированной бактерии при 37 ° С доОптическую плотность при 600 нм (А 600) достигает в 1 л LB жидкой среде , дополненной 100 мкг / мл ампициллина 0,5-0,7.
    3. Индуцируют экспрессию белка путем добавления 0,5 мМ изопропил- β-D-1-тиогалактопиранозид к культуре и продолжают инкубацию в течение еще 5 ч.
    4. Сбор бактериальной суспензии центрифугированием при 3,800 мкг в течение 10 мин при температуре 4 ° С. Удалить супернатант. На данный момент, либо хранить осадок клеток при -20 ° С или использовать немедленно для очистки белков.
  2. Очистки белка SBDS-ФЛЭШ
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все хроматографические операции выполняются с помощью жидкостной хроматографии системы (FPLC) быстрый белок или перистальтический насос. Ni 2+ -affinity хроматографии использует 5 мл колонку быстрый поток. Анионообменной хроматографии использует 5 мл сильную сульфопропил катиона колонку обменника. Использовали скорость потока 3 мл / мин был использован для всех хроматографических стадий.
    1. Ресуспендируют клеток в 35 мл лизирующего SBDS бuffer (50 мМ фосфатный буфер, рН 7,5, 300 мМ NaCl, 20 мМ имидазола) с фенилметилсульфонила фтористого 1 мМ (ФМСФ) и лизировать дополнена обработкой ультразвуком в течение общего времени 4 мин с использованием циклов 10 сек ВКЛ и 30 сек ВЫКЛ, при 4 ° С.
    2. Центрифуга образца при 9000 х г в течение 50 мин при температуре 4 ° С.
    3. Держите супернатант и отбросить осадок для удаления остатков клеток.
    4. Равновесие 2+ сродства колонке Ni с 3 объемами колонки (CV) из SBDS буфера для лизиса и ввести всю осветленный супернатант на колонку.
    5. Удаления несвязанного белка промывкой 3 CV из SBDS буфера для лизиса и элюции с 3 CV буфера для элюции SBDS (50 мМ фосфатного буфера, рН 7,5, 300 мМ NaCl, 250 мМ имидазола).
    6. Развести элюированного белка в 6 раз 50 мМ фосфатным буфером с рН 6,5 и удалить возможные агрегаты путем фильтрации через мембрану 0,22 мкм целлюлозы.
    7. Равновесие колонку сульфопропил катионит с 3 CV с низким содержанием соли S колонкибуфер (50 мМ фосфатный буфер, рН 6,5, 50 мМ NaCl), и ввести образец белка из предыдущего шага.
    8. Мытье несвязанный материал с 3 CV из низким содержанием соли S колоночного буфера и элюции белка в одной стадии с 50 мМ фосфатного буфера, рН 6,5, 1 М NaCl.
    9. Развести элюированного белка в 3,3 раза с 50 мМ фосфатного буфера с рН 6,5. Концентрат белка с ультрафильтрации устройствами с помощью центрифугирования при 3800 х г в течение 15 мин. Флэш замораживания белка в жидком азоте и хранить при -80 ° С до дальнейшего использования.
    10. Проверьте чистоту белка с помощью анализа SDS-PAGE и Кумасси окрашивания 20.

2. EFL1 Экспрессия белка и очистка

Была выражена EFL1 под регулирование Gal 1/10 расходящегося промотора 21 и Saccharomyces CEREVISIAE MAT A 3'UTR в векторе pRS426: Примечание. Рекомбинантный белок кодирует человеческий EFL1 изоформы 1, слитый с вирусом протеазы (Tobacco EtchТРВ) сайт распознавания и гексагистидиновую метку на С-конце.

  1. Экспрессия белка EFL1
    1. Transform S. CEREVISIAE BCY123 клетки с плазмидой pRS426-EFL1TevHis с использованием протокола 22 ацетат стандарт лития. Пластинчатый все трансформированные клетки в синтетических выпавшей средах без урацила (SD-URA) с добавлением 2% (вес / объем) глюкозы. Состав СМИ SD-URA состоит из 8 г дрожжевого азотистого основания без аминокислот, 11 г казаминокислот, 55 мг аденин сульфата, 55 мг тирозина, 60 мг лейцина и 60 мг триптофана для объема 1 л.
    2. Культура трансформированных дрожжей при температуре 30 ° С до тех пор , пока не достигнет 600 1,8 в 1 л SD-URA, дополненной 0,5% (вес / объем) глюкозы.
    3. Индуцируют экспрессию белка путем добавления 2,8% (вес / объем) галактозы к культуре и продолжают инкубацию еще в течение 18 для ч при 30 ° С.
    4. Собирают суспензии дрожжей путем центрифугирования при 3,800 мкг в течение 10 мин при температуре 4 ° С. Удалить супернатант.На данный момент, либо хранить осадок клеток при -20 ° С или использовать немедленно для очистки белков.
  2. Очистку белка EFL1
    Примечание: Все хроматографические этапы выполняются с помощью FPLC системы или перистальтического насоса. Ni 2+ -affinity хроматографии использует 5 мл колонку быстрый поток со скоростью потока 3 мл / мин. Хроматографи с исключением размеров использует колонку емкостью 125 мл, предварительно упакованную с Superdex 200 смолой при скорости потока 1 мл / мин.
    1. Ресуспендируют клеток в 50 мл EFL1 буфера для лизиса (50 мМ Трис-HCl , рН 8, 300 мМ NaCl, 20 мМ имидазола, 5 мМ MgCl 2, 10% глицерина) , дополненной 1 мМ PMSF и 1 мМ бензамидина и разрушения клеток путем трение на бисерной колотушки с использованием стеклянных шариков (диаметр = 0,5 мм) в течение общего времени от 6 мин, с использованием циклов 2 мин и 15 мин ВЫКЛ, при 4 ° с.
    2. Центрифуга образца при 9000 х г в течение 50 мин при температуре 4 ° С.
    3. Держите супернатант и отбросить осадок для удаления остатков клеток. Равновесие сходству столбца Ni 2+ с 3 CV из EFL1 буфера для лизиса и ввести все осветленный супернатант на колонку.
    4. Удаления несвязанного белка промывкой 3 CV из EFL1 буфера для лизиса и элюции с 3 CV буфера EFL1 элюции (50 мМ Трис-HCl , рН 8, 300 мМ NaCl, 250 мМ имидазола, 5 мМ MgCl 2, 10% глицерина).
    5. Равновесие колонки эксклюзионной с 1,5 CV буфера анизотропию (50 мМ Трис-HCl , рН 7,5, 300 мМ NaCl, 5 мМ MgCl 2, 10% глицерина, 5 мМ β-меркаптоэтанол).
    6. Концентрат на 1 мл Белок EFL1 элюируют из колонки сродства Ni 2+ с ультрафильтрации устройствами путем центрифугирования при 3800 х г до нужного объема. Введем образец на эксклюзивной колонке.
    7. Собирают элюированного белка и концентрат ультрафильтрацией до конечной концентрации примерно 30 мкМ. Флэш замораживания белка в жидком азоте и хранят при -80 ° С до дальнейшего использования. Проверка тысе чистота белка с помощью анализа SDS-PAGE и окрашиванием Кумасси 20.

3. Маркировку SBDS-ФЛЕШ с фотовспышкой флуоресцентным красителем 4 ', 5'-бис (1,3,2 dithioarsolan-2-ил) флуоресцеина

  1. Смешайте 3 нмоль белка SBDS-ФЛЭШ с 3 нмоль из 4 ', 5'-бис (1,3,2-dithioarsolan 2-ил) флуоресцеина красителя в объем 5 мкл буфера анизотропией.
  2. Пусть реакция протекать в течение 8 часов при температуре 4 ° С. Диализировать образца против буфера анизотропией в течение ночи для удаления свободного красителя.
  3. Используйте закон Ламберта-Бера для количественного определения% меченого белка. Измеряют поглощение при 280 нм и 508 нм на спектрофотометре с использованием кварцевой кювете соответствующего объема. Примечание: Рассмотрим следующие молярные коэффициенты поглощения (M -1 см -1):
    Equation1B
  4. Вычислить концентрацию меченого белка SBDS-ФЛЭШ, используя уравнение 2.
    Equation2
  5. Вычислить концентрацию общего белка SBDS , используя уравнение 3 путем замены вычисленного C SBDS-ФЛЕШ из предыдущего шага.
    Equation3
  6. Вычислить процент меченого белка с использованием уравнения 4.
    Equation4

4. Эксперименты анизотропии флуоресценции

Примечание: эксперименты Анизотропия были сделаны в спектрофлуорометра, снабженного поляризационный набор инструментов и сбор данных осуществляли с помощью программы анизотропии в программном обеспечении оборудования. Длина волны возбуждения была установлена ​​на уровне 494 нм со спектральной шириной полосы 8 нм, и излучение регистрировали с использованием полосового фильтра 530 ± 25 нм. Измерения проводились при 25 ° С в 200 мкл кювету с длиной 10 тракта длиной 5 мм.

  1. В флуоресцентной кювете, поместите 200 мкл 30 нМ SBDS-Вспыхните в буфере анизотропии и титруют 2 мкл 30 мкМ EFL1. Тщательно перемешать и дать постоять реакцию в течение 3 мин перед измерением величины анизотропии.
  2. Повторите шаг 4,1 до общего объема 40 мкл EFL1 была добавлена.

5. Анализ данных

  1. Установить данные в соответствующей модели связывания с использованием нелинейного алгоритма регрессии наименьших квадратов. Уравнения для наиболее распространенных моделей связывания представлены в таблице 1.
  2. Вычислить наилучшую модель , которая описывает взаимодействие белков путем проверки остатков подгонки 23. Поддержка выбранной модели с помощью дополнительных экспериментов.

Таблица 1. Общие связывания белок-белковых взаимодействий модели и математические уравнения, описывающие их.0 / 54640table1large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой таблицы.
Таблица 1

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Для выполнения любой анизотропии эксперимент, важно, чтобы исключить большие изменения в интенсивности флуоресценции флуорофора, так как наблюдаемая анизотропия смеси вида представлен уравнением 5:

Equation5

где F I представляет собой дробную флуоресценцию каждого компонента и R I является соответствующая анизотропия. Фракционное флуоресценцию каждого компонента зависит от обоих, его концентрации и его относительной флуоресценции, которая определяется уравнением 6:

Equation6

где X я представляет собой мольную долю йе я й звонкой и O I является квантовый выход I - го вида.

Таким образом, если интенсивность флуоресценции резко изменяется вдоль титрования лучше, либо измерить образование комплекса в зависимости от изменения сигнала флуоресценции, а не сигнала анизотропии, или скорректировать наблюдаемое значение анизотропии путем подгонки как интенсивность флуоресценции, и анизотропии данные. Флуоресценция SBDS-Фотовспышка не заметных изменений после связывания с EFL1 (рисунок 2) предполагая , что анизотропия флуоресценции достаточна для измерения связывания между двумя белками.

фигура 2
Рисунок 2. Флуоресценция излучение SBDS-ФЛЕШ при титровании возрастающих концентраций EFL1. Изменения в эмиссии флуоресценции флуорофора являются negligiblе и случайным образом вдоль титрования. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Пример анизотропии флуоресценции связывания кривой , полученной из титрования EFL1 к SBDS -флешка показано на рисунке 3. Качественно форма графика ясно показывает , что эти два белка взаимодействуют, о чем свидетельствует увеличение сигнала анизотропии при добавлении EFL1. Кроме того, значения анизотропии достигало плато предполагая, что в конце титрования все белки SBDS-ФЛЭШ присутствовал в комплексе с EFL1. Вполне возможно, затем, чтобы количественно описать взаимодействие между этими белками и соответствовать данным с использованием нелинейной регрессии наименьших квадратов к предполагаемой модели связывания и получить соответствующий диссоциации константа равновесия. Монтаж к одной модели связывания сайта не сделал appropriленно описывают экспериментальные данные (рис 3А). Это видно не только из фитинга следа в связывании кривой, но и от отклонений остатков подгонки (разница между теоретическими и экспериментальными данными), которые заметны и неслучайной. Это хорошо согласуется с тем фактом , что одна модель привязки сайта математически описывается гиперболической кривой а не сигмоидальной кривой, наблюдаемым на экспериментальных данных , представленных на рисунке 3. С другой стороны, такие модели, как две идентичные или две разные связывания сайты описывают лучше экспериментальные данные и остатки подгонки не показывают систематическое отклонение поддержки модели ассоциации двух сайтов (Рисунок 3B-C). При отсутствии какой-либо другой экспериментальной информации трудно установить, какая из двух моделей соответствуют механизму связывания между EFL1 и SBDS. Тем не менее, SBDS и EFL1 оба являются мономерные белки, поэтому difficии предусмотреть две идентичные модели сайты связывания.

Рисунок 3
. Рисунок 3. Флуоресцентная анизотропия связывания изотермы взаимодействия между EFL1 и SBDS-прошить сплошная линия в каждом из верхних участков соответствует подгонки данных к различным моделям связывания: (A) одного сайта, (B) два одинаковых сайтов и (С) , два неидентичных сайты. Нижние участки представляют собой остатки подгонки к соответствующей модели. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Большинство биохимических экспериментов с белками требуют не только чистый белок, но и большое количество них, независимо от используемого метода. По этой причине белки, используемые для этого типа экспериментов получаются гетерогенной экспрессии, как это было в случае, представленные здесь. Цветении спектроскопии требует наличия флуорофором в исследуемой молекуле. Ароматические остатки представляют собой внутренние флуорофоры протеина, тем не менее, используя свой сигнал для изучения белок-белковых взаимодействий усложняет анализ, так как они являются общими для большинства белков и будет присутствовать в обоих, белок-рецептор и лиганд. Кроме того, время жизни триптофана является слишком коротким для анизотропии флуоресценции экспериментов. По этой причине обычно добавляют примесные флуорофоры к одному из изученных белков. С этой целью, флуорофор, был добавлен к С-концу SBDS через координационной связи между красителем 4 ', 5'-бис (1,3,2-dithioarsolan 2-ил) Fluorescein с tetracysteine ​​мотив введен в белок методом генной инженерии. Выбор белка, который обнажает флуорофор не является случайным делом. Из-за размеров исследованных белков здесь (SBDS 29 кД и EFL1 127 кДа), мы ожидали большего изменение анизотропии между свободной меченой-SBDS и что в комплексе с EFL1, по сравнению с изменением ожидаемой между свободной меченой-EFL1 и что связан с SBDS. Имея это в виду, фотовспышка тег был введен в SBDS, а не EFL1. Другой параметр важно учитывать при настройке анизотропии флуоресценции эксперимент является поглощение используемых растворов. Оптическая плотность раствора в кювете не должно быть больше, чем 0,1 при возбуждения и излучения длиной волны, и должно оставаться постоянным вдоль всей титрования. В противном случае, внутренний эффект фильтра может создавать помехи в измерении и должен быть скорректирован. В эксперименте, представленном здесь, белки изучали не поглощают при длине волны excitatион или испускание 4 ', 5'-бис (1,3,2-dithioarsolan 2-ил) флуоресцеина красителя; Таким образом, эффект внутренний фильтр не создает проблем.

Что касается сбора данных, и впоследствии правильно подобрать данные, необходимо иметь четко определенные нижние и верхние исходные линии с точками несколько данных через переход вдоль кривой связывания. В противном случае, установка данных является неточным и информацию относительно режима связывания могут быть потеряны. Для описания достойной кривую связывания, необходимо, чтобы концентрация свободного лиганда отличается от двух логарифмических единиц ниже и выше константы диссоциации, тем не менее, экспериментально это может быть трудно достичь. В нижнем пределе, проблемы, связанные с чувствительностью оборудования может возникнуть в частности, когда сродство между белками, является очень высокой, в то время как большие концентрации не могут быть достижимы из-за проблем растворимости лиганда. Это было четко проиллюстрировано при тестировании взаимодействия между SBDSS143L мутант болезнь и EFL1. Этот мутант нарушается связывание с EFL1 до такой степени , что оно не было возможности получить правильную кривую связывания , так как EFL1 может быть сконцентрирован только до 70 мкМ , и белок разбавляется ≈ 5 раз в течение титрования 10. Таким образом, необходимо иметь грубую оценку сродства оптимизировать схему титрование и убедитесь, что скачки в концентрации лиганда не происходит в положениях, что приведет к менее точной подгонки. Например, отсутствуют начальные точки привязки кривой , представленной на рисунке 3 сделает его похожим на гиперболы в заблуждение исследователя по отношению к единой модели связывания сайта.

После сбора данных были установлены на предполагаемую модель привязки. По сравнению с флуоресценция данные, данные анизотропию можно использовать без дальнейшей обработки и не требуют коррекции для разбавления эффектов. Уравнения , представленные в таблице 1 , считают , что [L] ≈[L] 0 в каждой точке титрования. Это не может произойти, когда сродство между белками очень высока таким образом, что в первых точках истощения титрование лиганда происходит. В этом случае возможны более сложные квадратные уравнения описаны в другом месте 23 необходимо , чтобы соответствовать данным. В эксперименте, описанном здесь, лиганд EFL1 всегда был в большом избытке по сравнению с концентрацией SBDS-ФЛЭШ и изменения концентрации EFL1 в каждой точке титрования можно пренебречь. Как уже говорилось в разделе результатов, модель двух неидентичных сайты связывания лучше всего можно описать экспериментальные данные (рис 3C). Дополнительные биохимические информация, полученная в группе поддерживает идею, что это правильная модель для описания взаимодействия между EFL1 и SBDS (данные не показаны). Этот режим взаимодействия является общим в многодоменные белки, такие как EFL1 и SBDS являются, и существуют несколько примеров в литературе 24-26. Тем не менее, этоРБП важно, чтобы исключить неспецифическое взаимодействие, которое может появиться в качестве модели взаимодействия различных участков связывания с различным сродством для их лиганда. С этой целью в Скэтчарда сюжет очень полезно. По сравнению с другими методами, сигнал анизотропии флуоресценции сообщает количество комплекса, образованного и, таким образом, можно построить график Скэтчарда с данными. Кривая выпуклой Скэтчарда предложена модель две различные сайты связывания с отрицательной кооперативности или неспецифическое связывание, в то время как вогнутые Скэтчарда предполагает модель два различных сайты связывания с положительной кооперативности или нестабильности лиганда (рисунок 4). Анализ экспериментальных данных показал Скэтчарда с вогнутой формой , поддерживающей модель двух независимых сайтов связывания для EFL1 и SBDS (рис 4D). Кроме того, положительный кооперативности был подтвержден после проведения анализа Хилла, который привел к коэффициенту значения Хилла 1,8 ± 0,02 (данные не показаны).


Рисунок 4. Скэтчарда участки для связывания моделей отличается белокбелковых. (A) Одно сайт связывания или несколько одинаковых сайтов , которые не взаимодействуют между собой . (B) , множество различных сайтов связывания с отрицательной кооперативности или неспецифическое связывание. (C) Несколько различных сайтов связывания с положительной кооперативности или нестабильности лиганда. (D) Скэтчарда в результате анализа данных , полученных экспериментальных анизотропии от титрования EFL1 к SBDS-ФЛЭШ. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Флуоресцентная анизотропия является решением на основе истинного равновесия метод, который требует Изученные молекулы остаются в растворе в условиях испытания. Он может быть использован для изучения не наLY взаимодействие между полнометражных белками, но и взаимодействия белковых доменов, мутантных белков или даже пептидов с пост-трансляционных модификаций. Кроме того, анизотропии флуоресценции также может быть использован для измерения связывания белков с липидными мембранами с использованием флуоресцентных зондов чувствительных мембран. Этот подход был успешно использован для изучения эффекта , что альфа-синуклеина имеет на синаптические везикулы упаковка 27. Одним из главных преимуществ флуоресцентной анизотропии является то, что она обеспечивает количественную информацию о связывании исследуемых молекул, таких, что истинные константы диссоциации могут быть получены вместе с механистической информацией. Хотя другие биофизические методы также могут быть использованы для получения такой информации, анизотропии флуоресценции требует небольшого количества материала и могут быть выполнены не только в равновесии, как представлено здесь, но и с использованием быструю кинетику, такие как флуориметрии остановленного потока, чтобы получить ассоциацию и скорость диссоциацииконстанты (K, и K ВЫКЛ, соответственно) 28. Сравнительная таблица с преимуществами и недостатками анизотропии флуоресценции по отношению к другим биофизических методов представлены в таблице 2. Все методы , описанные методы , истинно-равновесием , так как ни один из них не включают в себя процесс механического разделения свободных и связанных фракций. Как уже упоминалось в разделе результатов, если интенсивность флуоресценции меченого белка в значительной степени изменяется при взаимодействии, это свойство может затем быть использован для количественного определения аффинности связывания. Однако изменения в интенсивности флуоресценции, возникающие в результате взаимодействия предполагают возможное вмешательство внешнего флуорофора на самом молекулярного взаимодействия; а именно возможное изменение значения константы диссоциации (K d) соответствующих немеченого белков. Таким образом, анизотропии флуоресценции можно рассматривать как менее инвазивной техники, чем CHANGES интенсивности флуоресценции, так как первый должен быть применен, когда интенсивность флуоресценции не изменяется при взаимодействии. В этом смысле, хотя большое количество белка требуется, изотермический Титрование калориметрия (ITC) может обеспечить истинное K d значение молекулярного взаимодействия , так как это свободный метод этикетки. С другой стороны, механистический информация не получена из - за различия в теплом сообщают только на энтальпию процесса , а не количество образовавшегося комплекса 29.

Для сравнения, в методах естественных условиях , таких как дрожжи двух гибридных или фрагмент комплементационных анализов не требуют очищенных белков , но они только обеспечивают полуколичественный информацию о режиме связывания. Несмотря на то, что в дрожжевом двухгибридном техники можно выразить силу связывания с использованием единиц Миллера, это не реальная константа равновесия, и многие факторы вне контроля исследователя может изменить его.

Таблица 2. Преимущества и недостатки обычно используемых биофизических методов , используемых для изучения белок-белковых взаимодействий. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой таблицы.
Таблица 2

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 mm Glass beads Biospec Products 11079105
Tris Base Formedium TRIS01 Ultra pure
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
dye 4’,5’-bis(1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein ThermoFischer Scientific LC6090 This kit contains the dye to label a FlAsH tag
Ampiciline IBI Shelton Scientific, Inc IB02040
D(+)-Glucose Anhydrous Formedium GLU03
D(+)-Galactose Formedium GAL03
L-Leucine Formedium DOC0157
L-Tryptofan  Formedium DOC0189
Bezamidine hydrochloride Sigma-Aldrich B6506-5G
PMSF Gold Biotechnology, Inc P-470-25 Phenylmethylsulfonyl fluoride
NaCl Formedium NAC02 Sodium Chloride 
Glycerol Tecsiquim, S.A. de C.V. GT1980-6
MgCl2 Merck Millipore Corporation 1725711000 Magnesium Chloride
Imidazole Sigma-Aldrich I2399-500G
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250-100ML
K2HPO4 Sigma-Aldrich P3786-500G Potassium phosphate dibasic
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S3139-500G Sodium phosphate monobasic
Yeast nitrogen base without amino acids Formedium CYN0410
Yeast extract Formedium YEM03 Micro Granulated
L-Tyroisne Formedium DOC0193
Adenine sulphate Formedium DOC0230
Casamino acids Formedium CAS03
Tryptone IBI Shelton Scientific, Inc IB49182
IPTG Formedium IPTG025
Filtration units Merck Millipore Corporation UFC901096 Amicon Ultra-15, membrana PLGC Ultracel-PL, 10 kDa
Membrane Filter Merck Millipore Corporation GSWP04700 Membrane Filter, mixed cellulose esters, Hydrophilic, 0.22 µm, 47 mm, white, plain
Ni2+ affinity column QIAGEN 30760 Cartridge pre-filled with 5 ml Ni-NTA Superflow
Strong Sulfopropyl cation exchanger column GE Healthcare Life Science 17-5157-01 HiTrap SP Sepharose FF 5 ml
Size Exclusion column GE Healthcare Life Science 28989335 HiLoad 16/600 Superdex 200 PG
Fluorescence cell Hellma Analytics 111-057-40
Spectrophotometer Agilent Technologies G6860AA Cary 60 UV-Vis
Shaker ThermoFischer Scientific SHKA4000-7 MaxQ 4000 Benchtop temperature range Ambient-15° to 60°C
Centrifuge ThermoFischer Scientific 75004271 Heraeus Megafuge 16R
FPLC Pharmacia Biotech Discontinued FPLC system conductivity UV-MM II monitor P500 pump fraction
Spectrofluorometer Olis No applicable Olis DM 45 with Polarization Toolbox

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440, (7084), 637-643 (2006).
  2. Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340, 245-246 (1989).
  3. Michnick, S. W., Hien Ear, P., Landry, C., Malleshaiah, M. K., Messier, V. A toolkit of protein-fragment complementation assays for studying and dissecting large-scale and dynamic protein-protein interactions in living cells. Methods in Enzymology. 470, 336-366 (2010).
  4. Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
  5. Dwane, S., Kiely, P. A. Tools used to study how protein complexes are assembled in signaling cascades. Bioeng Bugs. 2, (5), 247-259 (2011).
  6. Snider, J., et al. Fundamentals of protein interaction network mapping. Mol Syst Biol. 11, (12), 848 (2015).
  7. Fersht, A. Structure and mechanism in protein science: a guide to enzyme catalysis and protein folding. Baldwin, R. L. W. H. Freeman and Company. 191-214 (2002).
  8. Menne, T. F., et al. The Shwachman-Bodian-Diamond syndrome protein mediates translational activation of ribosomes in yeast. Nat Genet. 39, (4), 486-495 (2007).
  9. Boocock, G. R., et al. Mutations in SBDS are associated with Shwachman-Diamond syndrome. Nat Genet. 33, (1), 97-101 (2003).
  10. Garcia-Marquez, A., Gijsbers, A., de la Mora, E., Sanchez-Puig, N. Defective Guanine Nucleotide Exchange in the Elongation Factor-like 1 (EFL1) GTPase by Mutations in the Shwachman-Diamond Syndrome Protein. J Biol Chem. 290, (29), 17669-17678 (2015).
  11. Gijsbers, A., Garcia-Marquez, A., Luviano, A., Sanchez-Puig, N. Guanine nucleotide exchange in the ribosomal GTPase EFL1 is modulated by the protein mutated in the Shwachman-Diamond syndrome. Biochem Biophys Res Commun. 437, (3), 349-354 (2013).
  12. Lakowicz, J. R. Principles of fluorescence spectroscopy. Third, Springer US. (2010).
  13. Nishigaki, T., Treviño, C. L. Tools to understand protein-protein interactions. Gòmez, I. 37, Transworld Research Network. 1-14 (2012).
  14. Johnson, I. The Molecular Probes Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. 11th, Life Technologies Corporation. (2010).
  15. Sabnis, R. W. Handbook of Fluorescent Dyes and Probes. Wiley. (2015).
  16. Adams, S. R., et al. New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: synthesis and biological applications. J Am Chem Soc. 124, (21), 6063-6076 (2002).
  17. Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells. Science. 281, (5374), 269-272 (1998).
  18. Rashidian, M., Dozier, J. K., Distefano, M. D. Enzymatic labeling of proteins: techniques and approaches. Bioconjug Chem. 24, (8), 1277-1294 (2013).
  19. Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. Molecular cloning: A laboratory manual. 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
  20. Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250. Electrophoresis. 9, (6), 255-262 (1988).
  21. West, R. W. Jr, Chen, S. M., Putz, H., Butler, G., Banerjee, M. GAL1-GAL10 divergent promoter region of Saccharomyces cerevisiae contains negative control elements in addition to functionally separate and possibly overlapping upstream activating sequences. Genes Dev. 1, (10), 1118-1131 (1987).
  22. Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K., Kimura, A. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. J Bacteriol. 153, (1), 163-168 (1983).
  23. Eftink, M. R. Fluorescence methods for studying equilibrium macromolecule-ligand interactions. Methods Enzymol. 278, 221-257 (1997).
  24. Han, H., et al. Binding of Substrates to the Central Pore of the Vps4 ATPase Is Autoinhibited by the Microtubule Interacting and Trafficking (MIT) Domain and Activated by MIT Interacting Motifs (MIMs). J Biol Chem. 290, (21), 13490-13499 (2015).
  25. Sanchez-Puig, N., Veprintsev, D. B., Fersht, A. R. Binding of natively unfolded HIF-1alpha ODD domain to p53. Mol Cell. 17, (1), 11-21 (2005).
  26. Trusch, F., et al. The N-terminal Region of the Ubiquitin Regulatory X (UBX) Domain-containing Protein 1 (UBXD1) Modulates Interdomain Communication within the Valosin-containing Protein p97. J Biol Chem. 290, (49), 29414-29427 (2015).
  27. Kamp, F., Beyer, K. Binding of alpha-synuclein affects the lipid packing in bilayers of small vesicles. The Journal of Biological Chemsitry. 281, 9251-9259 (2006).
  28. Bujalowski, W. M., Jezewska, M. J. Fluorescence Intensity, Anisotropy, and Transient Dynamic Quenching Stopped-Flow Kinetics. Spectroscopic Methods of Analysis. 875, 105-133 (2012).
  29. Asano, N., et al. Direct interaction between EFL1 and SBDS is mediated by an intrinsically disordered insertion domain. Biochem Biophys Res Commun. 443, (4), 1251-1256 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats