荧光各向异性作为一种工具来研究蛋白质相互作用

1Departamento de Química de Biomacromoléculas, Instituto de Química, Universidad Nacional Autónoma de México, 2Departamento de Genética del Desarrollo y Fisiología Molecular, Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional Autónoma de México
Published 10/21/2016
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

蛋白质相互作用是在一个细胞的功能的心脏。量热和光谱技术通常用于表征它们。这里我们介绍荧光各向异性作为一种工具来研究在Shwachman-Diamond综合征(SBDS)突变蛋白质和延伸因子样1 GTP酶(EFL1)之间的相互作用。

Cite this Article

Copy Citation

Gijsbers, A., Nishigaki, T., Sánchez-Puig, N. Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions. J. Vis. Exp. (116), e54640, doi:10.3791/54640 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

蛋白质 - 蛋白质相互作用发挥活生物体的功能中起重要作用。一旦相互作用已被确定和验证是必要在结构和机械水平来表征它。几个生物化学和生物物理方法用于此目的存在。其中,荧光各向异性,特别使用一种强大的技术,当荧光团标记蛋白质的荧光强度保持在蛋白质 - 蛋白质相互作用常数。在该技术中,荧光团标记的蛋白是激发选择性地激发根据其与入射光束的相对取向的荧光团的子集的适当波长的垂直偏振光。所得发射还具有方向性,其在垂直和水平平面关系定义各向异性(r)的如下:R =(I VV -I V H)/(I VV + 2I V H),其中I VV和我

Introduction

细胞含有生物大分子是不断地与彼此交互的一许多。该协会产生了参与负责其在信号转导,基因表达和除其他细胞迁移的调节功能的细胞通路的复合物。发生在一个小区中的所有蛋白质 - 蛋白质相互作用包括称为相互作用组的网络。在酿酒酵母中的蛋白质的70%以上已被证明有相互作用伙伴1。理解的细胞的相互作用组和它们的功能提供关于复杂性和生物多样性的相关信息。数种方法已经描述于鉴定和表征蛋白质 - 蛋白质相互作用。不同的高通过放的方法,如酵母双杂交2,蛋白质片段互补测定法如图3所示 ,耦合到质谱和蛋白microarra亲和纯化4YS用于识别交互5,6。一旦确定,就必须对其进行验证,这可能在逐案的基础而改变。通常,这些实验涉及破坏相互作用本身在该相互作用对, 例如的个别成员的水平通过基因缺失或蛋白之一的表达,然后寻找在属性或改变的其它部件的功能细胞水平。随后,生物物理技术7用于在分子水平来表征蛋白质-蛋白质相互作用。为此,虽然量热法和荧光光谱被用于定量和机械地描述它们的蛋白质复合物的结构通过X射线晶体学,核磁共振和低温电子显微镜来确定。

在这项工作中,荧光各向异性用作技术来表征GTP酶EFL1和SBD之间的相互作用S蛋白。这些蛋白质通过来自60S核糖体亚基8的表面促进真核起始因子6的释放参与核糖体的合成。该SBDS蛋白在称为Shwachman-Diamond综合征9和充当EFL1减小为鸟苷二磷酸10,11其亲和性的鸟嘌呤核苷酸交换因子的疾病的突变。在SBDS疾病的突变废除与EFL1的相互作用,从而防止其激活。

荧光各向异性在生物应用通常用于研究蛋白质 - 肽或蛋白质 - 核酸相互作用。它是基于荧光团与偏振光产生一个部分偏振的发射激发的原理。荧光各向异性由等式1定义:

公式1

在那里我VVVH我是垂直(VV)和水平(V H)的荧光强度偏振的发射时,样品被激发与垂直偏振光12。荧光各向异性是影响荧光团的旋转扩散速度的因素敏感,因而取决于温度,溶液的粘度和荧光团的表观分子大小。含有荧光团的增加,当它与另一蛋白和这种变化相互作用的蛋白质的表观大小然后可以作为各向异性的变化进行评估。更具体地说,在相对于它的荧光寿命溶液缓慢旋转的荧光团将有一个大I VV值和小我的VH的值,因此,将表现出相对大的各向异性。对于迅速相对于它们的荧光寿命滚入荧光团,我VVVH我将类似和各向异性值将是12小图1)。此外,有一个良好的各向异性信号到噪声测量,有必要有一个与相似于感兴趣的分子的旋转相关时间荧光寿命的荧光团。否则,就不可能准确地记录游离蛋白在复之间以及在各向异性的差异。例如,荧光探针与接近4纳秒如荧光素或若丹明附着到100道尔顿的低分子量化合物一生各向异性为0.05。绑定到160 kDa的将其各向异性值提高到0.29的分子;可精确地测量的差。与此相反,参与结合反应,其增加的分子大小而变化,从65至1000 kDa的相同荧光探针只会造成0.28各向异性变化到0.3,这是太小而不能精确测量。在这种情况下,用400纳秒的使用寿命的探针会更适合12。


图1.用于测量荧光各向异性和过程的设备的示意图。用于执行蛋白质-蛋白质相互作用的实验测量荧光各向异性的设备的示意图。滚入快速显示小各向异性结合后相互作用的合作伙伴增加了荧光。 请点击此处查看该图的放大版本。

荧光应用需要荧光团在任何所研究的分子的存在。研究蛋白质 - 蛋白质相互作用有三种类型的荧光团:1)中存在的蛋白质中的色氨酸残基,2)化学连接的荧光团和3)荧光融合伙伴,例如绿色荧光蛋白(GFP)及其deriva表3-6。大多数蛋白质具有在其结构色氨酸残基,从而来测量相互作用的最简单的方法是通过监视在相应的荧光光谱的变化或通过在色氨酸残基的荧光强度监视更改。然而,色氨酸残基可存在于两种蛋白质的分析复杂化。另一方面,对于荧光团以改变其荧光性质由于交互它需要被位于或结合位点附近,它可以与交互本身干涉。使用笨重的荧光,如GFP时,这种需要特别注意。如果没有这些荧光团可用于结合研究是必要的,那么,引入外源性荧光团所涉及的蛋白之一。许多化学合成的荧光团存在,并且可被共价连接到通过其反应性基团的蛋白质,如胺基(赖氨酸或N末端的侧链)和在半胱氨酸的硫醇基团。 F与异硫氰酸酯和琥珀酰亚胺酯luorophore衍生物与酰胺基团反应而碘乙酰胺和马来酰亚胺是硫醇反应性基团13。在荧光应用中最常用的染料是荧光素的衍生物,和若丹明绿染料,香豆素,BODIPY荧光团和Alexa Fluor染料。市售的荧光团及其使用的详细列表可在参考文献14,15找到。对于成功的标记,反应性基团必须在蛋白质的表面上暴露出来,但由于大量通常存在于多肽的反应性官能团的是很难得到的位点特异性修饰。在这项研究的目的蛋白质,SBDS,含有5游离半胱氨酸和33的赖氨酸,可能导致在多个位点标记。非均匀标签可能影响结合和不同的荧光分子可能结合后引起不同的荧光强度信号将复杂的数据分析。奥雅纳rcome这一问题,我们使用了闪光灯荧光团,4',5'-双(1,3,2- dithioarsolan -2-基)荧光素到网站直接标记的SBDS蛋白。这是一arsenoxide染料与在一个基序知道作为由序列CCXXCC,其中X是除半胱氨酸16,17之外的任何氨基酸的闪光标记为四个间隔半胱氨酸的高亲和性。这四半胱氨酸基序被添加到通过遗传工程N-或蛋白质的C末端与适当的接头,以防止蛋白质的总体折叠的破坏在一起。由闪光染料和Flash标签的一对最初设计为位点特异性标签的蛋白在活细胞中17,但它也可以使用,因为它是这里例举标记纯化的蛋白在体外 。此外,酶的策略也已经被开发,以使蛋白18的位点特异性官能化。

在这个手稿中,我们描述的荧光各向异性的用处山工具来研究蛋白质 - 蛋白质相互作用。结合可以通过结合曲线形状的简单检查来评估而定量信息可以从实验数据的拟合而获得。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. SBDS闪光标签蛋白表达纯化

注:对于各向异性的实验中,对应于半胱氨酸 - 半胱氨酸-Pro的基-Gly-半胱氨酸 - 半胱氨酸加入到人类SBDS通过PCR编码序列的C-末端序列的闪光标签。此构建物亚克隆到表达载体pRSET-A,并转化到大肠杆菌 C41细胞以表达编码N-末端六组氨酸标签(His标签)的蛋白质,人类SBDS编码序列和C-末端闪光标签10。

  1. SBDS-FLASH蛋白的表达
    1. 转化感受态大肠杆菌 C41细胞,使用标准的热休克协议19质粒PRSET-HisSBDS闪光。板中补充有100微克/毫升氨苄青霉素固体的Luria-BERTANI(LB)培养基中的细胞。的LB固体培养基组合物包括10个克NaCl,5g酵母提取物,10g胰蛋白胨和1升20体积克琼脂的。
    2. 在37℃下培养转化的细菌,直到吸光度在600nm(A 600)达到在1升补充有100微克/毫升氨苄青霉素的LB液体培养基的0.5-0.7。
    3. 通过加入0.5mM的异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷至培养诱导蛋白质表达,并继续进行另外5小时孵育。
    4. 收集经离心细菌悬浮液3800×g离心在4℃下10分钟。去除上清。在这一点上,无论是存储的细胞沉淀在-20℃或立即用于蛋白质纯化。
  2. SBDS-FLASH蛋白纯化
    注意:使用快速蛋白质液相色谱(FPLC)系统或蠕动泵执行的所有层析步骤。镍离子色谱-affinity用5ml的快速流动柱。阴离子交换层析用5ml的磺强阳离子交换柱。 3毫升/分钟的流速,使用分的所有的色谱步骤。
    1. 悬浮细胞在35毫升SBDS裂解的Buffer通过超声处理用10秒ON和30秒的循环4分钟关的总时间补充有1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)和裂解(50mM磷酸盐缓冲液pH 7.5,300mM NaCl的20 mM咪唑)中,在4 C。
    2. 离心样品以9000rpm×g离心在4℃下50分钟。
    3. 保持上清液弃沉淀以除去细胞碎片。
    4. 平衡用SBDS裂解缓冲液3倍柱体积(CV)的镍离子亲和层析柱和引入澄清的上清液至色谱柱上的整体。
    5. 通过洗涤3的CV SBDS裂解缓冲液的除去未结合的蛋白质,并用3 CV SBDS洗脱缓冲液(50mM磷酸盐缓冲液pH 7.5,300mM NaCl的,​​250mM咪唑)洗脱。
    6. 稀释洗脱的蛋白6倍,用50mM磷酸盐缓冲液pH 6.5,并通过一个0.22微米的纤维素膜除去通过过滤可能聚集体。
    7. 用3 CV低盐S列中的平衡的磺基阳离子交换柱缓冲液(50mM磷酸盐缓冲液pH 6.5,50mM NaCl中),并引入来自前面步骤的蛋白质样品。
    8. 洗涤未结合的物质用3的CV低盐S柱缓冲液和洗脱蛋白在一个步骤中,用50mM磷酸盐缓冲液pH 6.5,1M NaCl洗涤。
    9. 稀释洗脱的蛋白3.3倍,用50mM磷酸盐缓冲液pH 6.5。离心3800 xg离心浓缩用超滤装置蛋白质15分钟。闪光灯冻结蛋白在液氮中,并储存在-80℃直至进一步使用。
    10. 验证的蛋白质通过SDS-PAGE分析和考马斯染色20的纯度。

2. EFL1蛋白表达纯化

注:EFL1是在加1/10发散子21酿酒酵母垫上 3'UTR在载体pRS426的调节下表达。重组蛋白编码融合到烟草蚀纹病毒蛋白酶人类EFL1同种型1(TEV)识别位点,并在C末端六组氨酸标签。

  1. EFL1蛋白的表达
    1. 变换S.酵母 BCY123细胞使用标准乙酸锂协议22质粒pRS426-EFL1TevHis。板的所有合成滴出媒体的转化的细胞,而不补充有2%(重量/体积)葡萄糖尿嘧啶(SD-URA)。对SD-URA培养基组合物包括8克酵母氮碱无氨基酸下,将11g酪蛋白氨基酸,55毫克硫酸腺嘌呤,55毫克酪氨酸,60毫克亮氨酸和60mg色氨酸为1升体积。
    2. 培养在30℃下转化的酵母,直至A 600达到1.8在1升的SD-URA培养基补充有0.5%(重量/体积)的葡萄糖。
    3. 通过加入2.8%(重量/体积)的半乳糖的培养诱导蛋白质表达,并继续进行另外18小时的温育在30℃。
    4. 收集通过离心分离酵母悬浮液3800×g离心在4℃下10分钟。去除上清。在这一点上,无论是存储的细胞沉淀在-20℃或立即用于蛋白质纯化。
  2. EFL1蛋白纯化
    注意:使用FPLC系统或蠕动泵被执行的所有层析步骤。镍离子 -affinity色谱以3毫升/分钟的流速使用5ml的快速流动柱。尺寸排阻色谱法使用的125ml列预填充的Superdex 200树脂以1毫升/分钟的流速。
    1. 悬浮细胞在50ml补充有1mM的PMSF和1mM苯甲脒EFL1裂解缓冲液(50mM的Tris-HCl pH值为8,300mM NaCl的20 mM咪唑,5mM的MgCl 2的,10%甘油)中,并通过破坏细胞摩擦使用玻璃珠(直径= 0.5mm)的为2分钟开,15分钟关6分钟使用周期的总时间,在4℃的珠打浆机。
    2. 离心样品以9000rpm×g离心在4℃下50分钟。
    3. 保持上清液弃沉淀以除去细胞碎片。 3 CV EFL1裂解液平衡的镍离子亲和柱,并介绍所有的澄清上清上柱。
    4. 通过洗涤3的CV EFL1裂解缓冲液的除去未结合的蛋白质,并用3 CV EFL1洗脱缓冲液(50mM的Tris-盐酸pH值为8,300mM NaCl的,250mM咪唑,5mM的MgCl 2的,10%甘油)洗脱。
    5. 用各向异性缓冲的1.5 CV(50毫摩尔Tris-盐酸pH值7.5,300mM NaCl的,5mM的MgCl 2的,10%的甘油,5mM的β巯基乙醇)平衡尺寸排阻柱。
    6. 浓缩到1ml 3800 xg离心从由离心超滤装置在Ni 2+亲和层析柱洗脱,所需体积的EFL1蛋白。引进的大小排阻柱样品。
    7. 收集被洗脱的蛋白质并通过超滤浓缩至约30微米的最终浓度。闪冻在液氮中,并存储该蛋白质在-80℃直至进一步使用。验证次通过SDS-PAGE分析和考马斯染色20蛋白质电子纯度。

3. SBDS-FLASH的标签与Flash荧光染料4',5'-双(1,3,2 dithioarsolan -2-基)荧光素

  1. 混合SBDS-FLASH蛋白3纳摩尔与4'的3纳摩尔,5'-双(1,3,2- dithioarsolan -2-基)在各向异性缓冲液5微升体积的荧光素染料。
  2. 让反应继续进行,在4℃下8小时。透析针对各向异性缓冲器样品过夜,以除去游离的染料。
  3. 使用朗伯 - 比尔定律量化标记蛋白的%。测量在280nm和在用适当体积的石英比色皿分光光度计508处的吸光度。注:考虑以下摩尔吸光系数(M -1厘米-1):
    Equation1B
  4. 计算使用公式2中标记SBDS-FLASH蛋白的浓度。
    方程2
  5. 通过从先前的步骤代替计算值:C SBDS闪光计算使用公式3总SBDS蛋白的浓度。
    Equation3
  6. 计算使用公式4标记的蛋白质的百分比。
    公式4

4.荧光各向异性实验

注:各向异性实验在装备有使用在设备中的软件提供的各向异性程序执行了极化工具箱和数据收集分光光度计进行。激发波长为494纳米的为8纳米的光谱带宽,并使用530±25nm的带通滤波器的发射被记录下来。测量在25℃下在200微升比色杯中进行用一个5毫米的路径长度10。

  1. 在荧光比色皿,将200微升30纳米SBDS闪各向异性缓冲液和滴定2微升30微米EFL1的。调匀,让站在反应3分钟测量各向异性值之前。
  2. 重复步骤4.1至40微升EFL1的总体积已被添加。

5.数据分析

  1. 利用非线性最小二乘回归算法拟合数据到合适的装订模式。对于最常见的结合模型方程表示在表1中。
  2. 评价,通过检查拟合23的残差描述了蛋白质之间的相互作用的最佳模式。支持额外的实验选择的模型。

表1普通的蛋白质-蛋白质相互作用结合模型和描述它们的数学方程。0 / 54640table1large.jpg“目标=”_空白“>请点击这里查看此表的放大版本。
表格1

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

执行任何各向异性实验它,因为物质的混合物所观察到的各向异性由等式5表示的,以排除在荧光团的荧光强度大的变化是很重要的:

Equation5

其中F i表示各成分及r的分数荧光i是对应的各向异性。各组分的分数荧光取决于两者,它的浓度和它的相对荧光,这是由公式6定义:

公式6

其中X i表示第的摩尔分数E I TH实物和Ø i 物种的量子产率。

因此,如果荧光强度沿滴定极大地改变,最好是,任一测量复合物形成中,而不是各向异性信号的荧光信号的变化的函数,或者通过拟合两者的荧光强度和各向异性纠正观察到的各向异性值数据。 SBDS-FLASH的荧光确实结合后EFL1不显着的变化( 图2),表明荧光各向异性是足够用于测定两种蛋白质之间的结合。

图2
SBDS-FLASH的时增加EFL1浓度的滴定图2.荧光发射。变化的荧光团的荧光发射是negligible和沿滴定随机的。 请点击此处查看该图的放大版本。

荧光各向异性结合从EFL1的滴定至SBDS闪光所得曲线的一个例子示于图3。定性地,曲线图的形状清楚地显示了两种蛋白质相互作用通过在加入的增加在各向异性信号所证明EFL1。此外,各向异性值达到稳定表明在滴定结束时,所有的争端解决附属机构闪存蛋白存在于与EFL1复杂。这是可能的话,定量地描述这些蛋白质之间的相互作用,并使用非线性最小二乘回归到一个推定的结合模型拟合数据,将获得相应的解离平衡常数。装修到一个结合位点模型没有appropriately描述实验数据( 图3A)。这不仅从结合曲线拟合跟踪而且来自我们明显和非随机的拟合(理论和实验数据之间的差)的残差的偏差是显而易见的。这与单结合位点模型由双曲线,而不是作为对在图3中呈现的实验数据中观察到一个S形曲线数学上描述的事实吻合。在另一方面,模型作为两个相同或两个不同的结合,例如网站更好地描述实验数据的配合展会的残差没有系统性偏差支持双站点关联模型( 图3B-C)。在不存在任何其他的实验信息的难以建立其中两个模型的对应EFL1和SBDS之间的结合机制。尽管如此,SBDS和EFL1都是单体蛋白质,因此它是difficULT设想一两个相同的结合位点的模式。

图3
图3.荧光各向异性结合EFL1和SBDS闪光之间的相互作用的等温线在每个上重复的连续行对应于拟合数据以不同的结合模型:(A)的单中心,(B)的两个相同的位点和(C)两个非一致的位点。下图表示适合相应的模型的残差。 请点击此处查看该图的放大版本。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

与蛋白质大多数生化实验不仅需要纯的蛋白质,而且大量的它们,而不管使用的技术。由于这个原因,用于这种类型的实验的蛋白质被异源表达得到,因为它是这里提出的情况。花期光谱需要荧光团的研究分子中的存在。芳香族残基构成的蛋白质的固有荧光团,但是,使用其信号来研究蛋白质 - 蛋白质相互作用变得复杂分析,因为它们是共同的大多数蛋白质和将存在于两个,受体蛋白和配体。此外,色氨酸的寿命太短荧光各向异性实验。出于这个原因,它是常见的外在荧光团加入到研究蛋白之一。为此,荧光团是通过染料4',5'-双(1,3,2- dithioarsolan -2-基)F之间配位键加到SBDS的C末端luorescein在基因工程蛋白质推出了四半胱氨酸基序。选择该露出的荧光团的蛋白质不是随机事项。由于这里的研究(SBDS 29 kDa和EFL1 127 kDa)的蛋白的大小,我们预期在游离的标记-SBDS之间各向异性的较大改变,而且在与EFL1复杂,相对于预期游离的标记-EFL1之间并且该变化势必SBDS。考虑到这一点,一个闪光标签引入SBDS而不是EFL1。重要的另一参数时要考虑设置一个荧光各向异性实验是所使用的溶液的吸收。在试管中溶液的光密度应不大于0.1的激发和发射波长的,并且应沿整个滴定保持不变。否则,内过滤器的效果可以在干扰测量和对必须进行修正。在这里介绍的实验中,研究了蛋白质不在excitat的波长吸收离子或4',5'-双(1,3,2- dithioarsolan -2-基)荧光染料的发射;因而内过滤效果并不构成问题。

关于数据收集,并且随后适当地拟合数据,有必要通过沿结合曲线过渡到有几个数据点定义良好下部和上部基准。否则,该数据的拟合是不准确的,并且可能丢失关于装订模式的信息。为了描述一个体面结合曲线是必要的游离配位体的浓度低于2对数单位与解离常数以上的不同,但是,实验上,这可能是难以实现的。在下限,随着设备的敏感性问题可能尤其出现在蛋白质之间的亲和力非常高,而高浓度的可能无法达到由于配位体中的溶解度问题。测试争端解决附属机构之间的相互作用时,这显然是例证S143L疾病的突变和EFL1。这种突变打乱EFL1结合到这样的程度,这是不可能的,为获得正确的结合曲线,因为EFL1只能浓缩至70μM和蛋白质被滴定10中稀释≈5折。因此,有必要有亲和力的粗略估计来优化滴定方案,并确保在配体浓度跳到的位置处不发生,将导致不准确配合。例如,缺少在图3中呈现的结合曲线的初始点将使它看起来像一个双曲线误导向的单个结合位点模型中的研究人员。

一旦收集,数据拟合到一个推定的结合模式。相比于荧光数据,可以在没有进一步的操作中使用各向异性的数据和不需要为稀释效应校正。在表1中呈现的方程考虑[L]≈在滴定的每一点[L] 0。当蛋白质之间的亲和力非常高,使得在滴定配体枯竭的第一点发生,这可能不会发生。在这种情况下,更复杂的二次方程描述拟合数据别处需要23。在这里描述的实验中,配体EFL1总是在大量过量相比SBDS闪光的浓度和在滴定的每个点在EFL1浓度的变化可忽略不计。如结果部分所讨论的,两个非相同的结合位点模型最好所述的实验数据( 图3C)。该组中获得的附加生物化学信息支持的想法,这是描述EFL1和SBDS之间的相互作用的正确的模型(未示出数据)。相互作用的这种模式是常见的多结构域蛋白,如EFL1和SBDS是,并且在文献24-26几个例子存在。然而,这是一个LSO重要,以排除可能出现作为不同的结合位点与它们的配体的不同的亲和力的相互作用模型的非特异性相互作用。为此,一个Scatchard图是非常有用的。与其它技术相比,荧光各向异性信号报告形成复合物的量,因此有可能建立一个Scatchard图的数据。有凸的Scatchard曲线表明与负协同或非特异性结合两个不同的结合位点模型,而凹Scatchard图意味着与正协同或配体不稳定性( 图4)两个不同的结合位点的模型。实验数据的分析显示与凹形支持两个独立的结合位点EFL1和SBDS( 图4D)的模型Scatchard图。此外,正协同被执行,导致1.8±0.02希尔系数值的山分析后证实(数据未显示)。


图4. Scatchard图对于不同的蛋白质-蛋白质结合的模型。(A)的单个结合位点,或不相互作用的多个相同位点。 (B)中的多个不同的结合位点与负协同或非特异性结合。 (C)多个不同的结合位点与正协同或配体不稳定。从EFL1的滴定SBDS闪光得到的实验各向异性数据的分析结果(D)Scatchard图。 请点击此处查看该图的放大版本。

荧光各向异性是基于溶液的,真实的平衡的技术,需要研究的分子留在在所测试的条件下的解决方案。它可以被用于研究不LY全长蛋白质也与翻译后修饰蛋白结构域,突变蛋白质或甚肽之间的相互作用之间的相互作用。此外,荧光各向异性,也可用于测量蛋白质的结合来使用荧光敏感膜探针脂膜。这种方法已被成功地用于研究该α突触核蛋白对突触小泡包装27上的效果。之一的荧光各向异性的主要优点是,它提供对结合使得真正的解离常数可以与机械信息来获得所研究的分子的定量信息。尽管其他生物物理技术,也可用于获得这样的信息,荧光各向异性需要少量样品,并且可以只在平衡不执行,如这里提出,而且还使用快速动力学,如停流荧光,得到的关联和离解速率常数(分别为K 开启K ,)28。同的好处和相对于其它生物物理技术荧光各向异性的缺点的比较表示于表2中描述的所有方法都为真平衡技术因为其中没有包括的游离和结合的级分的机械分离的方法。如结果部分中提到,如果一个标记蛋白的荧光强度相互作用时发生大的变化,这个属性可以被用于量化的结合的亲和力。然而,变化的荧光强度,从相互作用产生建议在分子相互作用本身外在荧光团的一个可能的干扰;即相应的非标记蛋白质的解离常数(K D)值的一个可能的改变。这样,荧光各向异性可以被认为是比沟道一个微创技术安格斯荧光强度,因为当荧光强度不相互作用时改变前应被应用。在这个意义上说,虽然需要大量的蛋白质,等温滴定量热法(ITC)可以提供的分子相互作用的真实ķ 的d值,因为它是一个标签免费方法。另一方面,不能获得机械信息,因为在热的差异仅在过程的焓报告和不复杂的量形成的29。

相比较而言, 在活体内的方法,如酵母双杂交或片段互补测定法不需要纯化蛋白但它们只提供有关的结合模式的半定量信息。尽管在酵母双杂交技术能够表达结合使用米勒单元的强度,这不是一个真正的平衡常数和许多因素出研究者的控制可以改变它。

表2.优点和用于研究蛋白质相互作用常用的生物物理技术的缺点。 请点击这里查看此表的放大版本。
表2

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 mm Glass beads Biospec Products 11079105
Tris Base Formedium TRIS01 Ultra pure
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
dye 4’,5’-bis(1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein ThermoFischer Scientific LC6090 This kit contains the dye to label a FlAsH tag
Ampiciline IBI Shelton Scientific, Inc IB02040
D(+)-Glucose Anhydrous Formedium GLU03
D(+)-Galactose Formedium GAL03
L-Leucine Formedium DOC0157
L-Tryptofan  Formedium DOC0189
Bezamidine hydrochloride Sigma-Aldrich B6506-5G
PMSF Gold Biotechnology, Inc P-470-25 Phenylmethylsulfonyl fluoride
NaCl Formedium NAC02 Sodium Chloride 
Glycerol Tecsiquim, S.A. de C.V. GT1980-6
MgCl2 Merck Millipore Corporation 1725711000 Magnesium Chloride
Imidazole Sigma-Aldrich I2399-500G
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250-100ML
K2HPO4 Sigma-Aldrich P3786-500G Potassium phosphate dibasic
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S3139-500G Sodium phosphate monobasic
Yeast nitrogen base without amino acids Formedium CYN0410
Yeast extract Formedium YEM03 Micro Granulated
L-Tyroisne Formedium DOC0193
Adenine sulphate Formedium DOC0230
Casamino acids Formedium CAS03
Tryptone IBI Shelton Scientific, Inc IB49182
IPTG Formedium IPTG025
Filtration units Merck Millipore Corporation UFC901096 Amicon Ultra-15, membrana PLGC Ultracel-PL, 10 kDa
Membrane Filter Merck Millipore Corporation GSWP04700 Membrane Filter, mixed cellulose esters, Hydrophilic, 0.22 µm, 47 mm, white, plain
Ni2+ affinity column QIAGEN 30760 Cartridge pre-filled with 5 ml Ni-NTA Superflow
Strong Sulfopropyl cation exchanger column GE Healthcare Life Science 17-5157-01 HiTrap SP Sepharose FF 5 ml
Size Exclusion column GE Healthcare Life Science 28989335 HiLoad 16/600 Superdex 200 PG
Fluorescence cell Hellma Analytics 111-057-40
Spectrophotometer Agilent Technologies G6860AA Cary 60 UV-Vis
Shaker ThermoFischer Scientific SHKA4000-7 MaxQ 4000 Benchtop temperature range Ambient-15° to 60°C
Centrifuge ThermoFischer Scientific 75004271 Heraeus Megafuge 16R
FPLC Pharmacia Biotech Discontinued FPLC system conductivity UV-MM II monitor P500 pump fraction
Spectrofluorometer Olis No applicable Olis DM 45 with Polarization Toolbox

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440, (7084), 637-643 (2006).
  2. Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340, 245-246 (1989).
  3. Michnick, S. W., Hien Ear, P., Landry, C., Malleshaiah, M. K., Messier, V. A toolkit of protein-fragment complementation assays for studying and dissecting large-scale and dynamic protein-protein interactions in living cells. Methods in Enzymology. 470, 336-366 (2010).
  4. Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
  5. Dwane, S., Kiely, P. A. Tools used to study how protein complexes are assembled in signaling cascades. Bioeng Bugs. 2, (5), 247-259 (2011).
  6. Snider, J., et al. Fundamentals of protein interaction network mapping. Mol Syst Biol. 11, (12), 848 (2015).
  7. Fersht, A. Structure and mechanism in protein science: a guide to enzyme catalysis and protein folding. Baldwin, R. L. W. H. Freeman and Company. 191-214 (2002).
  8. Menne, T. F., et al. The Shwachman-Bodian-Diamond syndrome protein mediates translational activation of ribosomes in yeast. Nat Genet. 39, (4), 486-495 (2007).
  9. Boocock, G. R., et al. Mutations in SBDS are associated with Shwachman-Diamond syndrome. Nat Genet. 33, (1), 97-101 (2003).
  10. Garcia-Marquez, A., Gijsbers, A., de la Mora, E., Sanchez-Puig, N. Defective Guanine Nucleotide Exchange in the Elongation Factor-like 1 (EFL1) GTPase by Mutations in the Shwachman-Diamond Syndrome Protein. J Biol Chem. 290, (29), 17669-17678 (2015).
  11. Gijsbers, A., Garcia-Marquez, A., Luviano, A., Sanchez-Puig, N. Guanine nucleotide exchange in the ribosomal GTPase EFL1 is modulated by the protein mutated in the Shwachman-Diamond syndrome. Biochem Biophys Res Commun. 437, (3), 349-354 (2013).
  12. Lakowicz, J. R. Principles of fluorescence spectroscopy. Third, Springer US. (2010).
  13. Nishigaki, T., Treviño, C. L. Tools to understand protein-protein interactions. Gòmez, I. 37, Transworld Research Network. 1-14 (2012).
  14. Johnson, I. The Molecular Probes Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. 11th, Life Technologies Corporation. (2010).
  15. Sabnis, R. W. Handbook of Fluorescent Dyes and Probes. Wiley. (2015).
  16. Adams, S. R., et al. New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: synthesis and biological applications. J Am Chem Soc. 124, (21), 6063-6076 (2002).
  17. Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells. Science. 281, (5374), 269-272 (1998).
  18. Rashidian, M., Dozier, J. K., Distefano, M. D. Enzymatic labeling of proteins: techniques and approaches. Bioconjug Chem. 24, (8), 1277-1294 (2013).
  19. Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. Molecular cloning: A laboratory manual. 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
  20. Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250. Electrophoresis. 9, (6), 255-262 (1988).
  21. West, R. W. Jr, Chen, S. M., Putz, H., Butler, G., Banerjee, M. GAL1-GAL10 divergent promoter region of Saccharomyces cerevisiae contains negative control elements in addition to functionally separate and possibly overlapping upstream activating sequences. Genes Dev. 1, (10), 1118-1131 (1987).
  22. Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K., Kimura, A. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. J Bacteriol. 153, (1), 163-168 (1983).
  23. Eftink, M. R. Fluorescence methods for studying equilibrium macromolecule-ligand interactions. Methods Enzymol. 278, 221-257 (1997).
  24. Han, H., et al. Binding of Substrates to the Central Pore of the Vps4 ATPase Is Autoinhibited by the Microtubule Interacting and Trafficking (MIT) Domain and Activated by MIT Interacting Motifs (MIMs). J Biol Chem. 290, (21), 13490-13499 (2015).
  25. Sanchez-Puig, N., Veprintsev, D. B., Fersht, A. R. Binding of natively unfolded HIF-1alpha ODD domain to p53. Mol Cell. 17, (1), 11-21 (2005).
  26. Trusch, F., et al. The N-terminal Region of the Ubiquitin Regulatory X (UBX) Domain-containing Protein 1 (UBXD1) Modulates Interdomain Communication within the Valosin-containing Protein p97. J Biol Chem. 290, (49), 29414-29427 (2015).
  27. Kamp, F., Beyer, K. Binding of alpha-synuclein affects the lipid packing in bilayers of small vesicles. The Journal of Biological Chemsitry. 281, 9251-9259 (2006).
  28. Bujalowski, W. M., Jezewska, M. J. Fluorescence Intensity, Anisotropy, and Transient Dynamic Quenching Stopped-Flow Kinetics. Spectroscopic Methods of Analysis. 875, 105-133 (2012).
  29. Asano, N., et al. Direct interaction between EFL1 and SBDS is mediated by an intrinsically disordered insertion domain. Biochem Biophys Res Commun. 443, (4), 1251-1256 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats