Fluoreszenzanisotropiemessungen als Werkzeug Protein-Protein-Interaktionen zu untersuchen

1Departamento de Química de Biomacromoléculas, Instituto de Química, Universidad Nacional Autónoma de México, 2Departamento de Genética del Desarrollo y Fisiología Molecular, Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional Autónoma de México
Published 10/21/2016
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Biochemistry

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Summary

Protein-Wechselwirkungen sind im Herzen von einer Funktion der Zelle. Kalorimetrische und spektroskopischen Techniken werden allgemein zu charakterisieren sie verwendet. Hier beschreiben wir Fluoreszenzanisotropie als Werkzeug, um die Wechselwirkung zwischen dem Protein in dem Shwachman-Diamant-Syndrom (SBDS) und dem Elongationsfaktor-like 1 GTPase (EFL1) mutiert zu studieren.

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Gijsbers, A., Nishigaki, T., Sánchez-Puig, N. Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions. J. Vis. Exp. (116), e54640, doi:10.3791/54640 (2016).

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Abstract

Protein-Protein-Interaktionen spielen eine wesentliche Rolle in der Funktion eines lebenden Organismus. Sobald eine Interaktion identifiziert und validiert ist es notwendig, sie auf die strukturelle und mechanistische Ebene zu charakterisieren. Mehrere biochemische und biophysikalische Methoden existieren für solche Zwecke. Unter ihnen ist Fluoreszenzanisotropie eine leistungsfähige Technik insbesondere verwendet, wenn die Fluoreszenzintensität eines Fluorophor-markierten Proteins konstant bleibt auf Protein-Protein-Interaktion. In dieser Technik wird ein Fluorophor markiertes Protein ist mit vertikal polarisiertem Licht einer geeigneten Wellenlänge angeregt, die selektiv eine Untergruppe der Fluorophore entsprechend ihrer relativen Orientierung mit dem ankommenden Strahl erregt. Die resultierende Emission hat auch eine Direktionalität , deren Beziehung in der vertikalen und horizontalen Ebenen definiert Anisotropie (r) wie folgt: r = (I VV -I VH) / (I + 2I VV VH), wobei I VV und I

Introduction

Zellen enthalten eine Vielzahl von Biomakromolekülen, die ständig miteinander in Wechselwirkung treten. Diese Vereinigung führt zu Komplexen, die in den zellulären Wege, die für ihre Funktion in der Signaltransduktion, die Regulation der Genexpression und der Zellmigration unter anderem teilnehmen. Alle Protein-Protein-Wechselwirkungen, die in einer Zelle auftreten, umfassen ein Netzwerk wie das Interaktom bekannt. In Saccharomyces cerevisiae mehr als 70% ihrer Proteine wurden Interaktionspartner 1 gezeigt zu haben. Das Verständnis der Interaktom einer Zelle und deren Funktionen liefern relevante Informationen über die Komplexität und Vielfalt der Lebewesen. Verschiedene Methoden wurden Protein-Protein-Interaktionen beschrieben zu identifizieren und zu charakterisieren. Verschiedene Hochdurchsatzverfahren, wie Hefe - Zwei-Hybrid - 2 - Protein-Fragment Komplementierung Assays 3, Affinitätsreinigung 4 gekoppelt mit der Massenspektrometrie und Protein microarrays verwendet 5,6 eine Interaktion zu identifizieren. Einmal identifiziert, ist es notwendig, sie zu überprüfen und diese auf einer Fall-zu-Fall-Basis variieren. Typischerweise umfassen diese Versuche die Wechselwirkung selbst auf der Ebene der einzelnen Mitglieder des Wechselwirkungspaares zu stören, beispielsweise durch Gendeletion oder Überexpression eines der Proteine, und dann auf Änderungen in den Eigenschaften oder der Funktion des anderen Elements bei der Suche zellulärer Ebene. Anschließend werden biophysikalische Techniken 7 verwendet , um die Protein-Protein - Wechselwirkung auf molekularer Ebene zu charakterisieren. Zu diesem Zweck sind die Struktur von Protein-Komplexe, die durch Röntgenkristallographie bestimmt, kernmagnetische Resonanz und Kryo-Elektronenmikroskopie während Kalorimetrie und Fluoreszenzspektroskopie verwendet werden, um quantitativ und sie mechanistisch beschreiben.

In dieser Arbeit wurde Fluoreszenzanisotropie als eine Technik verwendet, um die Wechselwirkung zwischen dem GTPase EFL1 und der SBD zu charakterisierenS-Protein. Diese Proteine beteiligen sich an der Synthese von Ribosomen durch die Freisetzung von eukaryotischen Initiationsfaktor Förderung 6 von der Oberfläche der 60S ribosomalen Untereinheit 8. Das SBDS Protein wird in einer Krankheit als Shwachman-Diamond - Syndrom 9 und wirkt als ein Guaninnukleotid - Austauschfaktor für EFL1 abnehm seine Affinität für Guanosindiphosphat 10,11 bekannt mutiert. Krankheit Mutationen in SBDS die Interaktion mit EFL1 abzuschaffen und somit ihre Aktivierung verhindern.

Fluoreszenzanisotropie wird in biologischen Anwendungen zu untersuchen Protein-Peptid- oder Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen verwendet. Sie basiert auf dem Prinzip, dass ein Fluorophor mit polarisiertem Licht führt zu einer teilweise polarisierte Emission angeregt. Fluoreszenzanisotropie wird durch Gleichung 1 definiert:

Equation1

wo ich VV und ich VH sind dieFluoreszenzintensitäten des vertikal (VV) und horizontal (VH) polarisierte Emission , wenn die Probe angeregt wird , mit vertikal polarisiertem Licht 12. Fluoreszenzanisotropie ist empfindlich gegenüber Faktoren, die die Geschwindigkeit der Rotationsdiffusion des Fluorophors beeinflussen und somit abhängig von der Temperatur, der Viskosität der Lösung und die scheinbare Molekülgröße des Fluorophors. Die scheinbare Grße eines Proteins ein Fluorophor enthält, erhöht, wenn es mit einem anderen Protein und eine solche Änderung in Wechselwirkung kann dann als eine Änderung der Anisotropie ausgewertet werden. Genauer gesagt, der Wert und kleiner I VH Wert mit einem großen I VV und daher eine relativ große Anisotropie wird zeigen müssen ein Fluorophor, die sich langsam in Lösung relativ zu seiner Fluoreszenzlebensdauer dreht. Für Fluorophore, die sich schnell in Bezug auf ihre Fluoreszenzlebensdauer im Trockner, ich VV und ich VH wird wird ähnlich und ihre Anisotropie sein klein sein 12 (Abbildung 1). Darüber hinaus ist für eine gute Anisotropie Signal-Rausch-Messung ist es notwendig, ein Fluorophor mit einer Fluoreszenzlebensdauer ähnlich der Rotationskorrelationszeit des Moleküls von Interesse zu haben. Andernfalls ist es nicht möglich, genau den Unterschied in der Anisotropie zwischen dem freien Protein aufnehmen, und dass in der Anlage. Zum Beispiel kann die Anisotropie einer fluoreszierenden Sonde mit einer Lebensdauer der Nähe von 4 nsec, wie beispielsweise Fluorescein oder Rhodamin zu einer niedermolekularen Verbindung gebunden von 100 Da beträgt 0,05. Die Bindung an ein Molekül von 160 kDa seine Anisotropiewertes auf 0,29 zu erhöhen; ein Unterschied, der genau gemessen werden kann. Im Gegensatz dazu ging es um die gleiche Fluoreszenzsonde in einer Bindungsreaktion, deren Anstieg in Molekülgröße variiert von 65 bis 1.000 kDa führt nur in einer Anisotropie Änderung von 0,28 bis 0,3 ist, die zu klein ist, genau gemessen werden. In diesem Szenario wäre eine Sonde mit einer Lebensdauer von 400 ns mehr geeignet 12.


Abbildung 1 : Schematische Darstellung der Einrichtung zur Messung der Fluoreszenz - Anisotropie und die Prozedur. Schematische Darstellung der verwendeten Ausrüstung verwendet , um eine Protein-Protein - Wechselwirkung Experiment die Messung der Fluoreszenz - Anisotropie auszuführen. Fluorophore , die schnelle Anzeige geringe Anisotropie im Trockner , die bei der Bindung an einen Wechselwirkungspartner erhöht. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Fluoreszenzanwendungen erfordern das Vorhandensein eines Fluorophors in einem der untersuchten Moleküle. Zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen gibt es drei Arten von Fluorophore: 1) die Tryptophan-Reste in den Proteinen, 2) chemisch gebunden Fluorophore und 3) fluoreszierende Fusionspartner wie das grün fluoreszierende Protein (GFP) und dessen derivativen. Die meisten Proteine ​​haben Tryptophanreste auf seine Struktur und damit die einfachste Weg, um eine Interaktion zu messen, ist durch die Änderungen in dem entsprechenden Fluoreszenzspektren Überwachung oder durch Veränderungen in der Fluoreszenzintensität der Tryptophanreste zu überwachen. Jedoch können Tryptophanreste in beiden Proteinen vorhanden sein, die Analyse erschwert wird. Auf der anderen Seite, für ein Fluorophor aufgrund einer Wechselwirkung muss seine fluoreszierenden Eigenschaften ändern sie auf oder in der Nähe der Bindungsstelle lokalisiert werden und es könnte mit der Interaktion selbst stören. Dies erfordert besondere Aufmerksamkeit, wenn sperrige Fluorophore wie GFP verwenden. Wenn keine dieser Fluorophore können für Bindungsstudien verwendet werden, ist es notwendig, dann, um extrinsische Fluorophore an die eine der beteiligten Proteine ​​einzuführen. Viele chemisch synthetisierte Fluorophore existieren und können kovalent an Proteine ​​über ihre reaktiven Gruppen, wie den Amingruppen (Seitenkette von Lysinen oder N-Terminus) und die Thiolgruppen in Cystein gebunden sein. Fluorophore Derivate mit Isothiocyanat und Succinimidylester reagieren mit Amidgruppen während iodoacetamide und Maleimid sind thiolreaktives Gruppen 13. Die am häufigsten verwendeten Farbstoffe in Fluoreszenzanwendungen verwendet werden, sind Derivate des Fluorescein und Rhodamin grüne Farbstoffe, Cumarine, BODIPY Fluorophore und Alexa Fluor Farbstoffe. Eine detaillierte Liste der im Handel erhältlichen Fluorophore und ihre Verwendung finden Sie in Referenzen 14,15 gefunden werden. Für eine erfolgreiche Markierung muss die reaktive Gruppe auf der Oberfläche des Proteins exponiert werden, aber aufgrund der großen Anzahl von reaktiven funktionellen Gruppen typischerweise in Polypeptiden ist es sehr schwer ortsspezifische Modifikation zu erhalten. Das Protein von Interesse in dieser Studie SBDS, enthält 5 freie Cysteine ​​und 33 Lysine, die in mehreren Standorten Kennzeichnung führen kann. Uneinheitliche Kennzeichnung kann die Bindung beeinflussen und Datenanalyse komplizieren als unterschiedliche Fluorophormoleküle unterschiedlichen Fluoreszenzintensitätssignale bei der Bindung auslösen kann. ÖVErcome dieses Problem haben wir den FlAsH Fluorophore, 4 ', 5'-Bis (1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein orts direkt das SBDS Protein-Label. Dies ist ein arsenoxide Farbstoff mit einer hohen Affinität für vier beabstandete Cysteine in einem Motiv kennen als Flash-tag der Sequenz CCXXCC aus wobei X für jede Aminosäure außer Cystein ist 16,17. Dieses Motiv wird Tetracysteinmotiv gentechnologisch zusammen mit einem geeigneten Linker an den N- oder C-Terminus des Proteins hinzugefügt, um die Störung des Gesamtfaltung des Proteins zu verhindern. Das Paar , das aus FlAsH Farbstoff und FlAsH-Tag wurde ursprünglich auf ortsspezifische Label Proteine entwickelt in lebenden Zellen 17 , sondern es kann auch gereinigte Proteine verwendet werden , in vitro zu beschriften , wie sie hier veranschaulicht wird. Zusätzlich haben enzymatische Strategien auch 18 ortsspezifische Funktionalisierung von Proteinen zu ermöglichen , entwickelt worden.

In diesem Manuskript beschreiben wir die Nützlichkeit von Fluoreszenzanisotropiemessungen einsa Werkzeug Protein-Protein-Wechselwirkungen zu untersuchen. Die Bindung kann durch einfache Inspektion der Bindungskurvenform bewertet werden, während quantitative Informationen können aus der Anpassung der experimentellen Daten erhalten werden.

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Protocol

1. SBDS-Flash Tag Proteinexpression und -reinigung

HINWEIS: Für die Anisotropie Experimenten wurde eine FlAsH-tag entsprechend der Sequenz Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys an den C-Terminus des humanen SBDS hinzugefügt wurde durch PCR-codierende Sequenz. Dieses Konstrukt wurde der Expressionsvektor pRSET-A subkloniert und in Escherichia coli C41 - Zellen transformiert , um ein Protein exprimieren Codieren eines N-terminalen Hexahistidin - Tag (His-Tag), die menschlichen SBDS kodierenden Sequenz und einen C-Terminus Flash Tag 10.

  1. SBDS-FlAsH Proteinexpression
    1. Transformation von kompetenten E. coli C41 - Zellen mit dem Plasmid pRSET-HisSBDS-Blitz , ein Standard Hitzeschock - Protokoll 19. Platte, die die Zellen in fester Luria-Bertani (LB) Medium mit 100 ug / ml Ampicillin ergänzt. LB feste Medien Zusammensetzung besteht aus 10 g NaCl, 5 g Hefeextrakt, 10 g Trypton und 20 g Agar für 1 l Volumen.
    2. Kultur transformierten Bakterien bei 37 ° C, bisExtinktion bei 600 nm (A 600) erreicht 0,5-0,7 in 1 l LB - Flüssigmedium mit 100 ug / ml Ampicillin ergänzt.
    3. Induzieren die Proteinexpression durch Zugabe von 0,5 mM Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid zur Kultur und weiterhin die Inkubation für weitere 5 Std.
    4. Sammeln Sie die Bakteriensuspension durch Zentrifugation bei 3.800 xg für 10 min bei 4 ° C. Entfernen Sie den Überstand. Zu diesem Zeitpunkt entweder speichern Sie die Zellpellet bei -20 ° C oder verwenden Sie sofort zur Proteinreinigung.
  2. SBDS-FlAsH Proteinreinigung
    HINWEIS: Alle chromatographischen Schritte werden eine schnelle Protein-Flüssigchromatographie (FPLC) -Systems oder eine peristaltische Pumpe. Ni 2+ -Affinitätschromatographie verwendet eine 5 ml Fast Flow - Säule. Anionenaustauschchromatographie verwendet ein 5 ml stark sulfopropyl Kationenaustauschersäule. Eine Fließgeschwindigkeit von 3 ml / min wurde für alle chromatographischen Schritten verwendet.
    1. Resuspendieren der Zellen in 35 ml Lysis b SBDSUffer (50 mM Phosphatpuffer pH 7,5, 300 mM NaCl, 20 mM Imidazol), ergänzt mit 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) und Lyse durch Beschallung für eine Gesamtzeit von 4 min Zyklen von 10 sec zum Verwenden und 30 sec OFF, bei 4 ° C.
    2. Zentrifugieren Sie die Probe bei 9000 × g für 50 min bei 4 ° C.
    3. Halten Sie den Überstand und verwerfen das Pellet Zelltrümmer zu entfernen.
    4. Äquilibrieren der Ni 2+ Affinitätssäule mit 3 Säulenvolumina (CV) von SBDS Lysis - Puffer und führen die gesamte Überstand auf die Säule geklärt.
    5. Entfernen ungebundenen Proteins durch Waschen mit 3 CV des SBDS Lysis-Puffer und Eluieren mit 3 CV des SBDS Elutionspuffer (50 mM Phosphatpuffer pH 7,5, 300 mM NaCl, 250 mM Imidazol).
    6. Verdünne das eluierte Protein 6-fach mit 50 mM Phosphatpuffer pH 6,5 und Entfernen möglich Aggregate durch Filtration durch einen 0,22 & mgr; m Cellulosemembran.
    7. Äquilibrieren der sulfopropyl Kationenaustauschersäule mit 3 CV von Low-Salz-S-SäulePuffer (50 mM Phosphatpuffer pH 6,5, 50 mM NaCl) und die Proteinprobe aus dem vorherigen Schritt einzuführen.
    8. Wasch ungebundenes Material mit 3 CV des Low Spaltenpuffersalz S und das Protein in einem Schritt mit 50 mM Phosphatpuffer pH 6,5, 1 M NaCl eluieren.
    9. Verdünne das eluierte Protein 3,3-fach mit 50 mM Phosphatpuffer pH 6,5. Konzentriere das Protein mit Ultrafiltrationseinheiten durch Zentrifugation bei 3.800 xg für 15 min. Blitzeis, das Protein in flüssigem Stickstoff und lagern Sie es bei -80 ° C bis zur weiteren Verwendung.
    10. Überprüfen , um die Reinheit des Proteins durch SDS-PAGE - Analyse und Coomassie - Färbung 20.

2. EFL1 Protein Expression and Purification

HINWEIS: EFL1 wurde unter der Regulation des divergenten Promotors 21 1/10 Gal exprimiert und das Saccharomyces cerevisiae MAT A 3'UTR in dem Vektor pRS426. Das rekombinante Protein codiert, das menschliche EFL1 Isoform 1 auf einen Etch Virus Protease Tabak fusioniert (TEV) Erkennungsstelle und ein Hexahistidin-Tag am C-Terminus.

  1. EFL1 Proteinexpression
    1. Verwandeln S. cerevisiae BCY123 Zellen mit dem Plasmid pRS426-EFL1TevHis ein Standard - Lithium - Acetat - Protokoll 22. Platte alle transformierten Zellen in synthetischen Dropout Medien ohne Uracil (SD-Ura), ergänzt mit 2% (w / v) Glukose. Zusammensetzung der SD-URA Medien besteht aus 8 g Hefe-Stickstoffbase ohne Aminosäuren, 11 g Casaminosäuren, 55 mg Adenin Sulfat, 55 mg Tyrosin, 60 mg Leucin und 60 mg Tryptophan für 1 L Volumen.
    2. Kultur transformierter Hefe bei 30 ° C bis 600 A 1.8 in 1 l SD-URA - Medien mit 0,5% (w / v) Glucose ergänzt erreicht.
    3. Induzieren Proteinexpression durch Zugabe von 2,8% (w / v) Galactose zu der Kultur und weiterhin die Inkubation für weitere 18 Stunden bei 30 ° C.
    4. Sammeln Sie die Hefesuspension durch Zentrifugation bei 3.800 xg für 10 min bei 4 ° C. Entfernen Sie den Überstand.Zu diesem Zeitpunkt entweder speichern Sie die Zellpellet bei -20 ° C oder verwenden Sie sofort zur Proteinreinigung.
  2. EFL1 Proteinreinigung
    HINWEIS: Alle chromatographischen Schritte werden ein FPLC-System oder eine peristaltische Pumpe. Ni 2+ -Affinitätschromatographie verwendet eine 5 ml Fast - Flow - Säule bei einer Fließgeschwindigkeit von 3 ml / min. Grßenausschlußchromatographie verwendet eine 125 ml-Säule vorverpackt mit Superdex 200-Harz mit einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml / min.
    1. Resuspendieren der Zellen in 50 ml EFL1 Lysis - Puffer (50 mM Tris-HCl pH 8, 300 mM NaCl, 20 mM Imidazol, 5 mM MgCl 2, 10% Glycerin) , ergänzt mit 1 mM PMSF und 1 mM Benzamidin und stören die Zellen durch Reibung auf einer Perlmühle beater mit Glasperlen (Ø = 0,5 mm) für eine Gesamtzeit von 6 min mit Zyklen von 2 min und 15 min oN OFF, bei 4 ° C.
    2. Zentrifugieren Sie die Probe bei 9000 × g für 50 min bei 4 ° C.
    3. Halten Sie den Überstand und verwerfen das Pellet Zelltrümmer zu entfernen. Äquilibrieren Sie die Ni 2+ Affinitätssäule mit 3 CV von EFL1 Lysepuffer und einzuführen alle geklärte Überstand auf die Säule.
    4. Entfernen ungebundenen Proteins durch Waschen mit 3 CV des EFL1 Lysis - Puffer und Eluieren mit 3 CV des EFL1 Elutionspuffer (50 mM Tris-HCl pH 8, 300 mM NaCl, 250 mM Imidazol, 5 mM MgCl 2, 10% Glycerol).
    5. Äquilibrieren der Grßenausschluß - Säule mit 1,5 CV von Anisotropy - Puffer (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 300 mM NaCl, 5 mM MgCl 2, 10% Glycerin, 5 mM β-Mercaptoethanol).
    6. Konzentrat zu 1 ml der EFL1 Protein aus der Säule 2+ Affinitäts Ni eluiert mit Ultrafiltrationseinheiten durch Zentrifugation bei 3.800 xg auf das gewünschte Volumen. Einzuführen, um die Probe auf der Grßenausschlußsäule.
    7. Sammeln der eluierten Protein und konzentriert durch Ultrafiltration bis zu einer Endkonzentration von etwa 30 uM. Blitzeis, das Protein in flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C bis zur weiteren Verwendung. Stellen Sie sicher, the Reinheit des Proteins durch SDS-PAGE - Analyse und Coomassie - Färbung 20.

3. Kennzeichnung von SBDS-FlAsH mit dem Flash-Fluoreszenzfarbstoff 4 ', 5'-Bis (1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein

  1. Mix 3 nmol des SBDS-FlAsH Protein mit 3 nmol des 4 ', 5'-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein Farbstoff in 5 & mgr; l Volumen von Anisotropy Puffer.
  2. Ließ die Reaktion für 8 h bei 4 ° C stattfindet. Dialysiere die Probe gegen Anisotropy Puffer über Nacht, um den freien Farbstoff zu entfernen.
  3. Verwenden Sie das Lambert-Beer-Gesetz die% des markierten Proteins zu quantifizieren. Messen der Extinktion bei 280 nm und 508 nm in einem Spektrophotometer eine Quarzküvette geeigneter Lautstärke. HINWEIS: Beachten Sie die folgenden molaren Absorptionskoeffizienten (M -1 cm -1):
    Equation1B
  4. Berechnen Sie die Konzentration des markierten SBDS-FlAsH Protein unter Verwendung von Gleichung 2.
    Equation2
  5. Berechnen Sie die Konzentration des gesamten SBDS Protein unter Verwendung von Gleichung 3 durch den berechneten C SBDS-FlAsH aus dem vorherigen Schritt zu ersetzen.
    Equation3
  6. Der prozentuale Anteil von markiertem Protein unter Verwendung von Gleichung 4.
    Equation4

4. Fluoreszenzanisotropiemessungen Experimente

HINWEIS: Anisotropy Experimente wurden in einem Spectrofluorometer getan, ausgestattet mit einem Polarisations Toolbox und die Datenerhebung wurde in der Software des Geräts bereitgestellt, um die Anisotropie-Programm durchgeführt werden. Die Anregungswellenlänge wurde bei 494 nm mit einer spektralen Bandbreite von 8 nm eingestellt und die Emission wurde mit einem Bandpassfilter von 530 ± 25 nm aufgezeichnet. Die Messungen wurden bei 25 ° C in einem 200 & mgr; l Küvette mit einem 5 mm Weglänge 10 durchgeführt.

  1. In einer Fluoreszenzküvette legen 200 ul 30 nM SBDS-FlAsH Anisotropie Puffer und titrieren 2 ul 30 uM EFL1. Gut mischen und lassen Sie die Reaktion für 3 Minuten stehen, bevor die Anisotropie Wert zu messen.
  2. Wiederholen Sie Schritt 4.1 bis ein Gesamtvolumen von 40 ul EFL1 wurde hinzugefügt.

5. Datenanalyse

  1. Montieren Sie die Daten an die entsprechende Bindungsmodell eine nicht-lineare Regression der kleinsten Quadrate-Algorithmus. Die Gleichungen für die gängigsten Bindungsmodelle sind in Tabelle 1 dargestellt.
  2. Bewerten Sie das beste Modell, das die Wechselwirkung zwischen den Proteinen beschreibt , indem sie die Reste des Sitzes 23 Inspektion. Unterstützen Sie das gewählte Modell mit weiteren Experimenten.

Tabelle 1. Gemeinsame Protein-Protein - Wechselwirkung Bindungsmodelle und die mathematischen Gleichungen , die sie beschreiben.0 / 54640table1large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Tabelle anzuzeigen.
Tabelle 1

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Representative Results

Auszuführen Experiment jede Anisotropie ist es wichtig, große Änderungen in der Fluoreszenzintensität des Fluorophors, um auszuschließen, da die beobachtete Anisotropie eines Gemisches von Spezies, die durch die Gleichung 5:

Equation5

wobei F i die fraktionierte Fluoreszenz jeder Komponente und r i ist die entsprechende Anisotropie. Die fraktionierte Fluoreszenz jeder Komponente hängt sowohl seine Konzentration und seine relative Fluoreszenz, die durch Gleichung 6 definiert ist:

Equation6

wobei X i die Molfraktion von the th i natura und Ø i ist die Quantenausbeute des i - ten specie.

Somit wird, wenn die Fluoreszenzintensität dramatisch entlang der Titration ändert, ist es besser, entweder Komplexbildung als eine Funktion der Änderung des Fluoreszenzsignals und nicht der Anisotropie Signals messen oder zu korrigieren, die beobachtete Anisotropiewert durch sowohl die Fluoreszenzintensität Fitting und die Anisotropie Daten. Die Fluoreszenz von SBDS-Blitz nicht spürbare Veränderung zu EFL1 bei der Bindung (Abbildung 2) darauf hindeutet , dass Fluoreszenzanisotropiemessungen die Bindung zur Messung zwischen den beiden Proteinen ausreichend ist.

Figur 2
Abbildung 2. Die Fluoreszenzemission von SBDS-FlAsH bei der Titration von Konzentrationen EFL1 erhöht. Änderungen in der Fluoreszenzemission des Fluorophors sind negligible und zufällig entlang der Titration. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Ein Beispiel der Fluoreszenzanisotropie Kurve aus der Titration von EFL1 zu SBDS-FlAsH erhaltene Bindung wird in Figur 3 gezeigt. Qualitativ zeigt die Form des Graphs deutlich , dass die beiden Proteine , die durch eine Erhöhung der Anisotropie Signal nach der Zugabe von als belegt interagieren EFL1. Weiterhin erreicht Anisotropiewerte ein Plateau nahe legt, dass mit EFL1 am Ende der Titration alle in einem komplexen SBDS-FlAsH Protein vorhanden war. Es ist möglich, dann, um quantitativ die Wechselwirkung zwischen diesen Proteinen beschreiben und die Daten unter Verwendung von nichtlinearen Regression der kleinsten Quadrate auf einen vermuteten Bindungsmodell passen und erhalten die entsprechenden Dissoziationskonstante Gleichgewicht. Montage an einem Modell einer Bindungsstelle hat nicht entsprebeschreiben züglich der experimentellen Daten (3A). Dies ergibt sich nicht nur aus der Armatur Spur in der Bindungskurve, sondern auch aus den Abweichungen der Residuen der Anpassung (die Differenz zwischen den theoretischen und experimentellen Daten), die nennenswerte und nonrandom sind. Dies stimmt gut mit der Tatsache , dass eine einzige Bindungsstelle Modell durch eine hyperbolische Kurve mathematisch beschrieben wird , eher als eine sigmoidale Kurve wie bei den experimentellen Daten in Abbildung 3 dargestellt beobachtet. Andererseits Modelle wie beispielsweise zwei gleiche oder zwei verschiedene Bindungs Websites besser beschreiben die experimentellen Daten und die Residuen der Anpassung zeigen keine systematische Abweichung eine zwei-Stellen Assoziationsmodell (3B-C) zu unterstützen. In Ermangelung einer anderen experimentellen Daten ist schwierig, welche der beiden Modelle zu schaffen, um die Bindungsmechanismus zwischen EFL1 und SBDS entsprechen. Dennoch sind SBDS und EFL1 sowohl monomere Proteine, so ist es schwierult ein zwei identische Bindungsstellen-Modell in Betracht zu ziehen.

Figur 3
. Abbildung 3. Fluoreszenz Anisotropie Bindungsisotherme der Wechselwirkung zwischen EFL1 und SBDS-FlAsH Die durchgezogene Linie in jeder der oberen Plots entspricht der Anpassung der Daten an unterschiedlichen Bindungsmodelle: (A) Single - Site, (B) zwei identischen Stellen und (C) zwei nicht identische Seiten. Niedrigere Plots die Residuen der Anpassung an das entsprechende Modell dar. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Die meisten biochemischen Experimenten mit Proteinen erfordern nicht nur reines Protein, sondern auch große Mengen von ihnen unabhängig von der verwendeten Technik. Aus diesem Grund werden die Proteine ​​für diese Art von Versuchen verwendet werden, durch die heterologe Expression erhalten wird, wie es der Fall vorgestellt hier war. Florescence Spektroskopie erfordert die Anwesenheit eines Fluorophors in der untersuchten Moleküls. Aromatische Reste darstellen, die intrinsischen Fluorophoren eines Proteins jedoch ihr Signal unter Verwendung von Protein-Protein-Interaktionen zu studieren, um die Analyse erschwert, da sie zu den meisten Proteinen gemeinsam sind und in beiden, das Rezeptorprotein und dem Liganden vorhanden sein. Darüber hinaus ist die Lebensdauer von Tryptophan zu kurz für Fluoreszenzanisotropie Experimenten. Aus diesem Grund ist es üblich, extrinsische Fluorophore mit einem der untersuchten Proteine ​​zu addieren. Zu diesem Zweck wurde ein Fluorophor an den C-Terminus von SBDS durch eine Koordinationsbindung zwischen dem Farbstoff 4 'hinzugefügt, 5'-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein mit einem Tetracysteinmotiv Motiv in dem Protein durch Gentechnik eingeführt. Die Wahl des Proteins, die das Fluorophor entblößt ist kein Zufalls Materie. Aufgrund der Größe der hier (SBDS 29 kDa und EFL1 127 kDa) untersuchten Proteine, erwarteten wir eine größere Änderung der Anisotropie zwischen freien markierten-SBDS und dass im Komplex mit EFL1, im Vergleich zu dem Wechsel zwischen freien markierten-EFL1 erwartet und dass gebunden SBDS. Vor diesem Hintergrund wurde ein Flash Tag in SBDS eingeführt, anstatt zu EFL1. Ein weiterer Parameter wichtig zu berücksichtigen, wenn eine Fluoreszenzanisotropiemessungen Experiment aufbauen, ist die Absorption der verwendeten Lösungen. Die optische Dichte der Lösung in der Küvette sollte nicht größer als 0,1 bei der Anregungswellenlänge und Emissions und sollte entlang der gesamten Titration konstant bleiben. Andernfalls kann die innere Filterwirkung in die Messung stören und muss korrigiert werden. In dem hier vorgestellten Experiment untersuchten die Proteine ​​nicht absorbieren bei der Wellenlänge von excitatIonen- oder Emission des 4 ', 5'-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein Farbstoff; somit innere Filtereffekt stellt kein Problem dar.

Zur Datenerfassung und passen nachfolgend die Daten richtig, ist es notwendig, gut definierte untere und obere Basislinien mit mehreren Datenpunkten durch den Übergang entlang der Bindungskurve zu haben. Andernfalls der Datenanpassung ist ungenau und Informationen, um die Bindungsmodus in Bezug verloren gehen können. Um eine annehmbare Bindungskurve beschreiben es notwendig ist, dass die Konzentration an freiem Liganden unterscheidet sich durch zwei logarithmische Einheiten unterhalb und oberhalb der Dissoziationskonstante jedoch experimentell kann dies schwer zu erreichen sein. In der unteren Grenze, Probleme mit der Empfindlichkeit der Ausrüstung können insbesondere entstehen, wenn die Affinität zwischen den Proteinen sehr hoch ist, während hohe Konzentrationen aufgrund Löslichkeitsprobleme des Liganden möglicherweise nicht erreichbar sein. Dies wurde deutlich veranschaulicht, wenn die Prüfung der Wechselwirkung zwischen dem SBDSS143L Krankheit Mutante und EFL1. Diese Mutante gestört die Bindung an EFL1 in einem solchen Ausmaß , daß es nicht möglich war , eine geeignete Bindungskurve zu erhalten , da nur EFL1 bis 70 uM konzentriert werden kann , und das Protein wird ≈ 5 - fache während der Titration 10 verdünnt. Daher ist es notwendig, eine grobe Abschätzung der Affinität haben, um die Titrationsschemas zu optimieren und sicherzustellen, dass in der Ligandenkonzentration springt an Positionen nicht vorkommen, dass eine weniger genaue Passung verursachen würde. Zum Beispiel stellte die Anfangspunkte der Bindungskurve fehlt in Abbildung 3 wird es wie ein Hyperbel aussehen zu lassen , die Forscher auf eine einzige Bindungsstelle Modell irreführend.

Sobald gesammelt wurden Daten zu einem mutmaßlichen Bindungsmodell ausgestattet. Im Vergleichsdaten zur Fluoreszenz kann Anisotropie Daten ohne weitere Manipulation verwendet werden und keine Korrektur für die Verwässerungseffekte benötigen. Die Gleichungen , die in Tabelle 1 der Ansicht , dass [L] ≈[L] 0 an jedem Punkt der Titration. Dies kann nicht geschehen, wenn die Affinität zwischen den Proteinen ist sehr hoch, so dass in den ersten Punkten der Titration Ligandenverarmungs auftritt. In diesem Szenario beschrieben komplexere quadratische Gleichungen anderswo 23 werden benötigt , um die Daten anzupassen. In dem hier beschriebenen Experiment war der Ligand EFL1 stets in großem Überschuß im Vergleich zur Konzentration des SBDS-Blitz und der Änderung in EFL1 Konzentration an jedem Punkt der Titration kann vernachlässigt werden. Wie im Ergebnisteil diskutiert, ein zwei nicht identische Bindungsstellen - Modell am besten beschreiben die experimentellen Daten (3C). Zusätzliche biochemische Daten in der Gruppe erhalten, die Idee unterstützt, dass dies das richtige Modell ist die Wechselwirkung zwischen EFL1 und SBDS (Daten nicht gezeigt) zu beschreiben. Diese Art der Wechselwirkung ist üblich in mehreren Domänen Proteine, wie EFL1 und SBDS sind, und mehrere Beispiele gibt es in der Literatur 24-26. Es ist jedoch einlso wichtig, um eine nicht-spezifische Interaktion auszuschließen, die als Interaktionsmodell von unterschiedlichen Bindungsstellen mit unterschiedlichen Affinitäten für ihre Liganden auftreten können. Zu diesem Zweck ist ein Scatchard-Plot sehr nützlich. Im Vergleich zu anderen Techniken, berichtet Fluoreszenzanisotropie Signal, das die Menge des gebildeten Komplexes und somit ist es möglich, eine Scatchard-Plot mit den Daten aufzubauen. Eine konvexe Scatchard - Kurve deutet auf eine zwei verschiedene Bindungsstellen - Modell mit negativer Kooperativität oder unspezifische Bindung, während eine konkave Scatchard - Plot eine zwei verschiedene Bindungsstellen - Modell mit positiver Kooperativität oder Ligand Instabilität (Abbildung 4) impliziert. Die Analyse der experimentellen Daten zeigten eine Scatchard - Plot mit einer konkaven Form des Modells von zwei unabhängigen Bindungsstellen für EFL1 und SBDS (4D) zu unterstützen. Darüber hinaus wurde bestätigt positive Kooperativität nach einem Hill-Analyse durchführen, die in einem Hill-Koeffizienten-Wert von 1,8 ± 0,02 ergab (Daten nicht gezeigt).


Abbildung 4. Scatchard - Plots für verschiedene Protein-Protein - Bindungsmodelle. (A) Einzelbindungsstelle oder mehrere identische Seiten , die nicht in Wechselwirkung treten. (B) Mehrere verschiedene Bindungsstellen mit negativer Kooperativität oder unspezifische Bindung. (C) Mehrere verschiedene Bindungsstellen mit positiver Kooperativität oder Ligand Instabilität. (D) Scatchard - Plot aus Analyse der experimentellen Anisotropie Daten aus der Titration von EFL1 zu SBDS-FlAsH erhalten. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Die Fluoreszenz-Anisotropie ist eine lösungsbasierte echte Gleichgewicht Technik, die die untersuchten Moleküle erfordert bei den Bedingungen in Lösung bleiben getestet. Es kann zu studieren nicht verwendet werdenly die Wechselwirkung zwischen Proteine ​​in voller Länge, sondern auch die Wechselwirkung zwischen Protein-Domänen, mutierten Proteine ​​oder auch Peptide mit post-translationale Modifikationen. Außerdem kann Fluoreszenzanisotropie auch die Bindung von Proteinen an Lipidmembranen unter Verwendung von fluoreszierenden empfindlichen Membranen Sonden zur Messung verwendet werden. Dieser Ansatz wurde verwendet , um erfolgreich die Wirkung studieren , die & agr; -Synuclein hat auf die synaptische Vesikel 27 zu packen. Einer der wichtigsten Vorteile der Fluoreszenzanisotropie ist, dass es quantitative Informationen über die Bindung der untersuchten Moleküle, so dass echte Dissoziationskonstanten zusammen mit mechanistische Informationen erhalten werden können, zur Verfügung stellt. Obwohl andere biophysikalische Techniken auch solche Informationen zu erhalten, verwendet werden kann, erfordert Fluoreszenzanisotropie geringe Mengen an Probe und kann nicht nur im Gleichgewicht durchgeführt werden, wie hier dargestellt, aber auch eine schnelle Kinetik, wie Stopped-Flow-Fluorometrie verwendet, um die Zuordnung zu erhalten, und DissoziationsrateKonstanten (k on und k off, jeweils) 28. Eine Vergleichstabelle mit den Vor- und Nachteilen der Fluoreszenzanisotropiemessungen in Bezug auf andere biophysikalische Techniken ist in Tabelle 2 dargestellt. Alle beschriebenen Methoden sind wahre Gleichgewichtstechniken , da keiner von ihnen einen Prozess der mechanischen Trennung der freien und gebundenen Fraktionen umfassen. Wie in den Ergebnissen Abschnitt, wenn die Fluoreszenzintensität einer Protein-markiertem weitgehend von Interaktion ändert, kann diese Eigenschaft dann die Affinität der Bindung zu quantifizieren. Jedoch Intensitätsänderungen der Fluoreszenz aus der Wechselwirkung resultierende deuten auf eine mögliche Störung des extrinsischen Fluorophor auf der molekularen Wechselwirkung selbst; nämlich eine mögliche Veränderung der Dissoziationskonstante (K d) Wert des entsprechenden nicht-markierten Proteinen. Als solches kann Fluoreszenzanisotropie eine weniger invasive Technik als ch betrachtet werdenanges in der Fluoreszenzintensität, da die erstere, wenn die Fluoreszenzintensität bei Wechselwirkung ändert sich nicht angewendet werden soll. In diesem Sinne, auch wenn große Mengen des Proteins benötigt werden, kann der Isothermen Titrations - Kalorimetrie (ITC) eine echte K d -Wert der molekularen Interaktion bieten , da es eine markierungsfreie Methode. Auf der anderen Seite wird mechanistische Informationen erhalten nicht , weil Unterschiede in der Hitze nur auf der Enthalpie des Prozesses berichten und nicht die Menge der gebildeten Komplex 29.

Im Vergleich dazu nicht gereinigten Proteine erfordern in vivo - Methoden, wie Hefe - Zwei-Hybrid oder ein Fragment Komplementations - Assays aber sie bieten nur semiquantitative Informationen über die Art der Bindung. Trotz der Tatsache, dass in der Hefe-Zwei-Hybrid-Technik möglich ist, die Stärke der Bindung unter Verwendung von Miller-Einheiten auszudrücken, ist dies nicht eine echte Gleichgewichtskonstante und viele Faktoren außerhalb der Kontrolle des Forschers sie verändern kann.

Tabelle 2. Vor- und Nachteile der am häufigsten verwendeten biophysikalische Techniken verwendet , um Protein-Protein - Wechselwirkungen zu untersuchen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Tabelle anzuzeigen.
Tabelle 2

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 mm Glass beads Biospec Products 11079105
Tris Base Formedium TRIS01 Ultra pure
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
dye 4’,5’-bis(1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein ThermoFischer Scientific LC6090 This kit contains the dye to label a FlAsH tag
Ampiciline IBI Shelton Scientific, Inc IB02040
D(+)-Glucose Anhydrous Formedium GLU03
D(+)-Galactose Formedium GAL03
L-Leucine Formedium DOC0157
L-Tryptofan  Formedium DOC0189
Bezamidine hydrochloride Sigma-Aldrich B6506-5G
PMSF Gold Biotechnology, Inc P-470-25 Phenylmethylsulfonyl fluoride
NaCl Formedium NAC02 Sodium Chloride 
Glycerol Tecsiquim, S.A. de C.V. GT1980-6
MgCl2 Merck Millipore Corporation 1725711000 Magnesium Chloride
Imidazole Sigma-Aldrich I2399-500G
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250-100ML
K2HPO4 Sigma-Aldrich P3786-500G Potassium phosphate dibasic
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S3139-500G Sodium phosphate monobasic
Yeast nitrogen base without amino acids Formedium CYN0410
Yeast extract Formedium YEM03 Micro Granulated
L-Tyroisne Formedium DOC0193
Adenine sulphate Formedium DOC0230
Casamino acids Formedium CAS03
Tryptone IBI Shelton Scientific, Inc IB49182
IPTG Formedium IPTG025
Filtration units Merck Millipore Corporation UFC901096 Amicon Ultra-15, membrana PLGC Ultracel-PL, 10 kDa
Membrane Filter Merck Millipore Corporation GSWP04700 Membrane Filter, mixed cellulose esters, Hydrophilic, 0.22 µm, 47 mm, white, plain
Ni2+ affinity column QIAGEN 30760 Cartridge pre-filled with 5 ml Ni-NTA Superflow
Strong Sulfopropyl cation exchanger column GE Healthcare Life Science 17-5157-01 HiTrap SP Sepharose FF 5 ml
Size Exclusion column GE Healthcare Life Science 28989335 HiLoad 16/600 Superdex 200 PG
Fluorescence cell Hellma Analytics 111-057-40
Spectrophotometer Agilent Technologies G6860AA Cary 60 UV-Vis
Shaker ThermoFischer Scientific SHKA4000-7 MaxQ 4000 Benchtop temperature range Ambient-15° to 60°C
Centrifuge ThermoFischer Scientific 75004271 Heraeus Megafuge 16R
FPLC Pharmacia Biotech Discontinued FPLC system conductivity UV-MM II monitor P500 pump fraction
Spectrofluorometer Olis No applicable Olis DM 45 with Polarization Toolbox

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References

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