센다이 바이러스 원심 분리를 이용하여 혈액 세포로부터 유도 만능 줄기 세포의 생성

Developmental Biology

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Rim, Y. A., Nam, Y., Ju, J. H. Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation. J. Vis. Exp. (118), e54650, doi:10.3791/54650 (2016).

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Abstract

인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs)의 최근의 발전은 성숙한 체세포는 미분화, 만능 상태로 돌아갈 수 있음을 증명했다. 초기 실험은 일반적으로 피부 섬유 아세포로 행해졌 각질 세포, 소변 세포, 섬유 아세포, : 지금, 프로그래밍 다양한 성인 체세포의 종류 이루어집니다. 그러나 이는 환자의 섬유 아세포를 수득 침습 수술이 필요했다. 따라서, 혈액 및 소변 세포와 같은 세포 현탁액이 때문에 일차 세포를 얻는 편리함 프로그래밍 이상적으로 간주 하였다. 여기서, 우리는 말초 혈 단핵 세포 (PBMC)에서 IPSC 생성하는 효율적인 프로토콜을보고한다. 새로운 매트릭스 도장 판하여 원심 직렬로 형질 도입 된 PBMC를 도금함으로써,이 프로토콜은 쉽게 IPSC 콜로니를 제공 할 수있다. 이 방법은 또한 제대혈 단핵구 (CBMCs)에 적용 가능하다. 본 연구는 간단하고 효율적인 PROT를 제시PBMC를하고 CBMCs의 재 프로그래밍에 대한 ocol.

Introduction

줄기 세포는 최근 몇 년간 임상 치료에서 가장 매력적인 물질 중 하나이었다. 줄기 세포의 분화능 매력적인 특성과 자기 갱신 할 수있는 기능이다. 1981 년, 제 배아 줄기 세포 (는 ESC)는 마우스 배아 (2)로부터 분리 하였다. 이 기술은 인간 배아에 적용된 때, 그것은 여러 윤리적 문제에 직면했다.

박사 야마나카와 그의 팀이 마우스 체세포에서 첫 번째 만능 세포를 재 프로그램 할 때 2006 년, 줄기 세포 분야는 가능성을 회복하고 관심은 3 재연했다. 여러 정의 요소를 제공함으로써, 다 능성 줄기 세포가 성공적으로 성숙한 체세포에서 "유도"이었고, 따라서 지명되었다 "(iPSCs)를 유도 만능 줄기 세포." 2007 년,이 기술은는 ESC의 정확한 특성을 가진 세포를 산출, 인간 세포 4에 적용되었지만 윤리적 논쟁 없음. 이론적으로 유도 만능 줄기CS는 개인 또는 환자로부터 얻은 세포 유형에서 생성 될 수있다. 환자 별 iPSCs는 질병 표현형 및 각 개별 환자의 후생 유전 학적 조건을 시뮬레이션 할 수있는 잠재적 인 도구로 상승하고있다. 유전자 편집 또는 병원성 상태를 반전 할 수있는 다른 방법을 사용하여 환자 별 iPSCs 또한 개인화 된 약 5에서 사용될 수있다. 그들은 6 자동 이식을 더욱 가능하게, 도너와 같은 면역 ID를 가지고 있기 때문에 또한 iPSCs 덜 면역 거부 반응과 연관된다. 따라서, iPSCs 질병 모델링, 약물 검사, 및 재생 치료에서 가장 유망한 플랫폼이되었다. 이러한 혜택, 지속적으로 개발 중에있는 작은 셀 소스에서 시간의 최소 금액에서 순수하고 높은 수율을 줄 수있는 개선 된 프로토콜을 감안할 때. 미래의 애플리케이션에 가장 효율적인 프로토콜을 찾는 하나의 중요한 고려 사항은 일차 전지 유형이다. 초기 IPSC 생성 프로토 대부분의COLS은 원래 IPSC 라인은 피부 섬유 아세포 (4)로부터 유도 된 이후 부착 세포에 최적화되어 있습니다. 그러나, 이들 세포의 분리 및 제조는 노동 집약적이다. 또한, 피부 섬유 아세포의 분리는 광범위한 응용 프로그램의 주요 단점이 될 수 침습 수술 절차가 포함되어 있습니다.

따라서, iPSCs의 추가 사용, 편리한 수집과 셀 소스가 필요합니다. 그것은 오히려 최소 침습 절차 7-9 통해 획득하기 때문에 혈액 이상적인 셀 소스로서 간주된다. 본 연구는 말초 혈 단핵 세포 (PBMC)에서 hiPSCs 발생 프로토콜에 대한 간단한 수정을 개발 하였다. 예컨대 CD34 + 세포와 같은 특정 세포 유형의 어려운 팽창 과정없이 전혈 세포 또는 PBMC를 직렬 야마나카 인자 함유 센다이 바이러스 형질 도입 한 후 원심 분리하여 매트릭스 - 코팅 된 플레이트 상에 플레이 팅 하였다. 이 방법은 요구되는 시간을 단축형질 도입 부유 세포의 부착과 자신에 부착 할 수 없었다 재 프로그래밍 셀의 손실을 감소시켰다.

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Protocol

윤리 진술 : 본 연구 프로토콜 가톨릭 대학교 (KC12TISI0861)의 기관 검토위원회에 의해 승인되었다.

혈액에서 단핵구 세포의 분리 (1)

  1. 단핵구 세포의 분리 (일 -5)
    1. 셀 준비 튜브 (CPT)에서 혈액 추첨에서 신선한 혈액의 10 ml의를 얻습니다.
    2. 새로운 50ml의 원뿔형 튜브에 혈액을 전송하고 하나의 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)로 희석 : 4 비율.
      주 : 희석 높은 비율은 더 높은 순도를 위해 사용될 수있다.
    3. 새로운 50ml의 원뿔형 튜브에 밀도 구배 배지 10 ㎖를 첨가하고 신중 밀도 구배 매체 위에 희석 혈액 층을 포함한다. 원심 브레이크없이, 실온 (RT)에서 30 분 동안 750 × g으로 원심 분리기.
    4. 조심스럽게 새로운 50ml의 원뿔형 튜브에 버피 층 전송 튜브를 PBS 30 mL를 넣고 세포를 세척 하였다.
    5. RT에서 5 분 동안 515 XG에 세포를 원심 분리기. </ 리>
    6. PBS를 폐기하고 혈액 세포 배지 0.5 ml의 세포를 재현 탁.
    7. 세포를 카운트하고, 24 웰 플레이트의 웰 당 1 × 10 6 세포를 접시. 증발을 방지하기 위해 주변의 우물에 PBS를 추가합니다.
    8. 전달 전에 5 %에서 37 ° C에서 CO 2 5 일 동안 세포를 안정화. 세포를 방해하지 않고 일 3-4에 신선한 혈액 세포 미디어의 추가 0.5 ML을 추가합니다.

센다이 바이러스 2. 형질

  1. 전달 (0 일)
    1. 모아서 15 ml의 원추형 튜브에 혈액 세포를 전송하여 혈구를 사용하여 계산.
    2. 전달 당 3 × 10 5 세포를 준비하고 실온에서 5 분 동안 515 XG에서 세포를 원심 분리기.
    3. 흡인함으로써 상층 액을 제거하고 혈액 세포 배지 0.5 ml의 세포를 재현 탁.
    4. 비 코팅 24- 웰 플레이트의 웰에 세포를 옮긴다.
    5. 얼음 센다이 바이러스 액을 해동하고, SU에 추가spended 세포. 제조업체의 권장 사항에 따라 세포에 센다이 바이러스를 추가합니다.
    6. 밀봉 막 접시를 밀봉하고 30 ℃에서 30 분 동안 1150 × g으로 원심 분리하여 그것을.
    7. 원심 분리 후, 5 % CO 2 밤새 (O / N)으로 37 ℃에서 세포를 배양한다.
  2. 공급 매트릭스 셀 전송 (1 일)
    1. 다음 날, 코트 비트로 넥틴과 24 웰 플레이트. 최종 5 μg의 / ㎖ 농도에 대한 PBS의 비트로 넥틴 솔루션을 희석. 24- 웰 플레이트의 웰에 비트로 넥틴 1 ㎖를 첨가하고, 적어도 1 시간 동안 RT에서이를 부화. 사용 전에, 코팅 용액을 제거한다. 코팅 된 플레이트 3 일 동안 실온에서 저장 될 수있다.
    2. 잘 코팅에 세포와 바이러스를 포함하는 모든 미디어를 전송합니다.
    3. 신선한 혈액 세포 미디어의 추가 0.5 ㎖의 나머지 세포를 수집하고 세포를 함유 웰에 추가한다.
    4. 35 ° C에서 10 분 동안 1,150 XG에서 접시를 원심 분리기.
    5. 센트 후rifugation, 상층 액을 제거 IPSC 미디어 1 ㎖를 추가하고, 5 % CO 2 O / N 37 ° C에서 세포를 유지한다.
  3. 제 2 셀 트랜스퍼 (주 2)
    1. 코팅 단계 2.2.1에 기술 된 바와 같이 5 μg의 / ㎖ 비트로 넥틴과 새로운 24- 웰 플레이트의 웰. 각 형질에 대한 플레이트 잘 하나를 사용합니다.
    2. 새롭게 코팅 된 비트로 넥틴 플레이트에 상기 제 1 플레이트로부터 세포 현탁액을 전송.
      주의 : 필요하지 않으면, 현탁 세포는 폐기 될 수있다. 단계 2.3에서 설명한 절차는 현탁 세포를 2-3 회 반복 할 수있다. 단계가 반복 될 경우, 세포를 수확.
    3. 한편, 5 % CO 2 O / N에서 37 ℃를 유지 관리를 위해, 제 1 플레이트의 웰에 IPSC 배지 1 mL를 넣어 배양한다.
    4. 37 ° C에 부착 된 세포를 유지하고 5 % CO 2와 신선한 IPSC 미디어와 함께 매일 미디어 변경을 수행합니다. 식민지는 전달 후 일에 14-21 나타납니다.
    5. CentrifugE 1150 XG 10 분간 35 ℃에서 현탁 세포를 포함하는 새로 도장 판.
    6. 원심 분리 후, CO 2 O / N이 5 %에서 37 ℃에서 세포를 배양한다.
    7. 다음날, 상층 액을 제거하고 신선한 IPSC의 용지로 교체합니다.
      주의 : 단계 2.3에서 설명한 절차는 현탁 세포를 2-3 회 반복 할 수있다. 단계가 반복 될 경우, 상층 액에 세포를 수확 단계 2.3를 반복합니다.
    8. 80 % 포화 상태에 도달 할 때까지 매일 미디어 변화에 부착 된 세포를 유지한다.

3. 재 프로그래밍 셀 유지 보수

  1. 24 웰 플레이트 배양 후 조기 유지 보수
    1. 세포가 합류 일단 7-10일 전달 후하는 비트로 넥틴 코팅, 60-mm 요리를 준비합니다. 최종 5 μg의 / ㎖ 농도에 대한 PBS에서 비트로 넥틴 솔루션을 희석. 접시에 비트로 넥틴의 1 ML을 추가하고 적어도 1 시간 동안 실온에서 그것을 품어.
    2. 씻어PBS로 세포와 세포를 분리 PBS / 1 mM의 EDTA 1 ㎖를 추가합니다.
    3. 2 분 동안 CO 2, 37 ℃에서 인큐베이션을 5 %.
    4. 세포를 수확하고 2 분 동안 250 XG와 RT에서 그들을 원심 분리기. 상층 액을 제거하고 신선한 IPSC 미디어의 3 ml의 세포를 재현 탁.
    5. 새로 코팅 된 60 mm 접시에 모든 재현 탁 세포를 플레이트.
    6. 세포가 80 % 컨 플루 언트 될 때까지 5 % CO 2에서 37 ° C에서 그들 세포에 10 mM의 Rho 키나아제 억제제를 추가하고 유지한다.
  2. 식민지 모양에 대한 분할 (서브 클로닝 준비)
    1. 단계 3.1.2에 설명 된대로 비트로 넥틴 코팅, 100-mm 요리를 준비합니다.
    2. PBS로 세포를 세척하고 세포를 분리 PBS / 1 mM의 EDTA 1 ㎖를 추가합니다.
    3. 2 분 동안 CO 2, 37 ℃에서 인큐베이션을 5 %.
    4. 세포를 수확하고 2 분 동안 250 XG와 RT에서 그들을 원심 분리기.
    5. 혈구를 사용하여 세포를 세어 접시 당 1 × 104 세포를 준비합니다.
    6. 250 XG에서 세포를 원심 분리기 및 RT 2 분.
    7. IPSC 배지 6 ㎖, 재현 탁에 1 × 104 세포가 도포 100 mm 접시에 입혀, 미디어에 10mM의 Rho 키나아제 억제제를 추가한다.
    8. 큰 식민지가 나타날 때까지 일주일 동안 5 %에서 37 ° C에서 CO 2 세포를 품어.
      참고 : 유지 및 서브 클로닝을 위해 식민지를 확장합니다. 서브 클로닝은 일반적으로 5 구절 아래에 이루어집니다.
  3. 식민지 용액을 분리 IPSC 식민지를 사용하여 따기
    1. 식민지 따기, 씨앗 단계 3.2.7에서 언급 한 바와 같이 비트로 넥틴 코팅, 100 mm 접시에 1 × 104 세포, 전에 일주일.
    2. 비트로 넥틴 용액 2 ㎖를 추가하고 적어도 1 시간 동안 실온에서 배양하여 비트로 넥틴 코팅, 60-mm 요리를 준비합니다.
    3. 현미경 (40X 또는 100X 배율)을 통해 관찰함으로써, 마커 펜을 사용하여 명확한 경계와 식민지를 표시합니다. 단계 3.3.2에서 만든 새로운 판에서 비트로 넥틴 솔루션을 제거하고 6 ml에 추가IPSC의 매체는 10 mM의 Rho 키나아제 보충.
    4. 세포에서 배양 배지를 제거하고 PBS 3 ㎖로 씻는다.
    5. IPSC 식민지 분리 액 1ml를 추가하고 RT에서 30 초 동안 그들을 품어.
    6. 플레이트에서 솔루션을 제거하고 추가로 30 초 동안 RT에서 그것을 품어.
    7. P200 피펫을 사용하여 판에서 미디어 200 μl를 그리는 피펫 팅하여 대상 식민지를 분리합니다. 새로운 100 mm 접시에 흩어져있는 식민지를 전송합니다.
    8. 부화 및 5 % CO 2에서 37 ℃에서 세포를 유지한다.
      참고 : 그들이 10 특성이 적어도 10 구절 이후에 이루어졌다 통로에 도착할 때까지 순수한 IPSC 식민지를 획득 한 후, 세포를 유지 하였다. 항체 희석 및 프라이머 정보는 표 1 2에 나타낸다.

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Representative Results

이 프로토콜은 혈액에서 분리 된 PBMC를 재 프로그램 할 수있는 간단한 방법을 제시한다. 직렬 원심 도금의 조합을 사용 iPSCs 성공적으로 생성되었다. 이 방법은 iPSCs 단리 또는 특정 세포 유형을 확장하지 않고 전체 혈액 세포의 적은 양으로 생성 될 수있다. 우리는 성공적으로 작은 세포 배양 접시 만 1 × 104 세포에서 iPSCs를 생성합니다.

프로그래밍 전에, 혈액 세포를 밀도 구배 매체를 사용하여 분리 하였다. 혈액 세포는 오일 분리 한 후 형질 도입 하였다. 도 1a는 현탁 세포 리 프로그래밍 방법의 방식을 도시한다. 분리 후, PBMC를 센다이 바이러스가 비 코팅 웰 야마나카 인자를 함유하는 형질 도입 하였다. 다음날, 세포 현탁액을 원심 분리를 이용하여 비트로 넥틴 코팅 된 플레이트 상에 수거하고 도금 된 셀 ATT 반면비 코팅 된 웰에 아팠다는 폐기되었다. 비트로 넥틴 코팅 된 플레이트에 출연 첨부 된 세포를 유지하고 더욱 확대되었다. 첨부 세포 IPSC 미디어를 사용하여 매일 미디어의 변화와 유지 하였다. 원심 분리로 도금 처리가 나머지 현탁액을 셀에 대해 반복 하였다.

재 프로그램 iPSCs는 전달 후 자신의 고유 한 형태 며칠에 의해 구별 될 수있다. 그러나, 프로그래밍 동안, 순수한 형태로 세포 리 프로그래밍을 확장하는 것은 어려웠다. 프로그래밍의 초기 단계에서, iPSCs 부착 비 분화 된 세포 리 프로그래밍 (도 2a)와 혼합 하였다. 도 2A의 화살표는 화상의 IPSC 같은 세포 유형을 나타낸다. 확장하기 전에, iPSCs 및 다른 세포를 구별하기 어려웠다. 따라서, 순수한 콜로니 만 콜로니 피킹 방법에 의해 수득 하였다. 낮은 밀도 리터했다 식민지 세포를 파종하여도 2b에 도시 된 바와 같이 피킹 충분한 ARGE가 얻어졌다. 콜로니를 분리 한 후, 세포 덩어리는 단세포 배양 하였다 (도 2C)로 분해 하였다. 순수 IPSC 식민지 (그림 2D) 이후에 볼 수 있었다. 순수한 iPSCs가 확장시킨 후, 셀의 품질을 시험 하였다. 세포가 iPSCs (그림 3A)의 미분화 상태를 확인하기 위해 알칼리성 포스파타제으로 염색 하였다. 격리 된 iPSCs 모두에서 파생 된 식민지는 긍정적 인 얼룩을 보여 주었다. 만능 마커는 그림 3b에 도시 면역 형광 염색법에 의해 확인되었다. 재 프로그램 세포는 매우 같은 가장 중요한 SSEA4, OCT4, SOX2, TRA-1-81, KLF4, 및, TRA-1-60로 만능 마커를 표명했다. 다 능성 마커의 발현은도 3c에 도시 된 RT-PCR에 의해 확인되었다. 형광 데이터에 도시 된 바와 같이, OCT4 및 SOX2가 검출되었다. 이러한 NANOG, DPPA5, TDGF1 등의 추가 마커는 positiv했다엘리도 표명했다.

추가 분석을 들어, 핵형 분석을 시행 하였다. 도 4a에 도시 된 바와 같이, 상기 생성 된 iPSCs 정상적인 염색체 패턴을 보였다. 사실 능성을 확인하기 위해 세포는 외배엽, 중배엽과 내배엽으로 분화되었다. 생성 iPSCs 성공적도 4b에 보이는 세 개의 배엽으로 분화. 센다이 바이러스의 통합없는 속성 알려져 있기 때문에, DNA 바이러스의 제거는도 4c에 도시된다. 바이러스 성 DNA를 가지고하는 경향이 세 가지 세포 중 하나는 심지어 몇 구절 후, 남아있다. 그러나, 통합 유전자는 서브 클로닝 과정에 의해 탈착했다.

결론적으로, 우리는 부동 한 PBMC에서 iPSCs를 생성 프로토콜을 보여 주었다. 프로토콜은 높은 효율을 보였다 혈액 소량 만이 필요했다. 생성 된 iPSCs 높은 능성이 있고 VI를 피할 RAL 통합.

그림 3
그림 1 : PBMC를에서 IPSC 생성 프로토콜의 계획. 매체 유형 및 타임 라인에 기초하여 설계된 프로토콜의 상세도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 2 : PBMC를에서 생성 된 iPSCs의 밝은 필드 이미지입니다. (A) 재 프로그래밍 세포의 초기 형태. 따기 전에 식민지의 (B) 이미지. 콜로니 피킹 정제 공정 후에 (C) 세포를 포함한다. 순수한 식민지의 (D) 형태학. 모든 스케일 바는 200 μm의를 나타냅니다. /ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54650/54650fig2large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3 : iPSCs의 다 능성이 PBMC를에서 생성 된. (A) 콜로니 알칼리성 포스파타제 염색. 생성 된 iPSCs의 (B) 형광 이미지입니다. 항체의 희석 비율을 표 1에 나타낸다. 다 능성 마커 (C) PCR 분석. 프라이머는 표 2에 제공된다. 모든 스케일 바는 200 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 4 : 생성 된 iPSCs의 추가 분석. (A)를 IPSC의 정상 karyogram. 세 배엽의 분화 후 세포의 (B) 형광 이미지입니다. 센다이 바이러스 벡터의 (C) PCR 분석. 비 형질 세포는 음성 대조군으로 사용하였으며, 형질 도입은 양성 대조군으로 사용 된 후 세포를 수확 일. 프라이머는 표 2에 제공된다. 모든 스케일 바는 200 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

항체 이름 집중
SSEA4 1 : 200
Oct3 / 4 1 : 100
TRA-1-60 1 : 200
SOX2 1 : 100
TRA-1-81 1 : 100
Klf4 1 : 250
알렉사 플 루어 488 염소 항 - 마우스 IgG (H + 1) 항체 1 : 400
알렉사 형석 594 염소 항 - 토끼 IgG를 (H + 1) 항체 1 : 400

표 1. 항체 희석.

대상 이름 방향 프라이머 시퀀스 크기
OCT3 / 4 앞으로 ACC CCT GGT GCC GTG AA (190)
GGC TGA ATA CCT TCC CAATA
SOX2 앞으로 CAG CGC ATG GAC AGT TAC (321)
GGA GTG GGA GGA AGA GGT
NANOG 앞으로 AAA GGC AAA CAA의 CCC의 ACT (270)
GCT ATT CTT CGG CCA GTT
LIN28 앞으로 GTT CGG CTT CCT의 GTC의 CAT (122)
CTG CCT CAC CCT CCT의 TCA
DPPB5 앞으로 CGG CTG CTG AAA GCC ATT TT (215)
AGT TTG AGC ATC CCT CGC TC
TDGF1 앞으로 TCC TTC TAC GGA CGG AAC TG (140)
AGA AAT GCC TGA GGA AAG의 CA
SEV 앞으로 GGA TCA CTA GGT GAT ATC GAG C (181)
ACC AGA CAA GAG TTT AAG AGA TAT GTA TC
KOS 앞으로 ATG CAC CGC TAC GAC GTG AGC의 GC (528)
ACC TTG ACA ATC CTG ATG TGG
Klf4 앞으로 TTC CTG CAT GCC AGA GGA GCC C (410)
AAT GTA TCG AAG GTG CTC의 AA

표 2. 프라이머 정보를 제공합니다.

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Discussion

배아 줄기 세포 (는 ESC)는 여러 단점을 보였다 때문에, 다른 도구의 필요성이 요구되었다. 따라서 야마나카에 의해 유도 된 다 능성 줄기 세포의 발달 (iPSCs)은 국제 주목 받게되었다. 야마나카는 만능 성인이 체세포에 네 개의 유전자를 추가로 유도 될 수 있다는 것을 발견한지 거의 10이었다. iPSCs 성숙한 체세포에서 "유도"된다 때문에, 한번는 ESC 관련된 문제이었던 윤리적 문제를 회피 할 수있다. 는 ESC 달리 iPSCs 개개인으로부터 생성 될 수있다. 따라서, 이들은 개인 의료 연구 및 약물 스크리닝, 질병 모델링 또는 다른 재생 의학 연구에 사용될 수있다.

첫 번째 인간의 IPSC 성공적으로이 셀 유형을 재 프로그래밍 2007 년 다양한 그룹에서 피부 섬유 아세포에서 생성되었지만, 침습적 수술이 일차 전지를 얻기 위해 필요했다. 따라서, 아이디어 아니었다다양한 질병 iPSCs를 생성하거나 재생 의학을 설계 리터 소스. 대안 쉽게 얻어진 세포 유형은 예 각화 세포, 단핵구, 소변 및 혈액 세포로 필요 하였다. 그러나, 이들 세포는 확장하기 어려운, 그들 중 일부는 오염 (10)의 더 높은 가능성을 갖는다.

본 연구는 성공적 PBMC를 전혈 세포에서 iPSCs를 생성 할 수있는 프로토콜을 제시 하였다. 특정 세포 유형의 팽창 과정없이,이 프로토콜은 짝수 차 혈액 세포의 소량으로부터 iPSCs를 생성하는 상대적으로 단순한 방법을 제안한다. PBMC를 상기 혈액으로부터 분리 한 후, 세포를 5 일 동안 혈액 세포 배지에서 안정화되었다. 전달하기 전에 안정화 단계는이 프로토콜의 핵심이었다. 리 프로그래밍 효율 혈액 세포 배지에서 세포를 배양 한 후 좋았다. 이 매체는 CD34 + 세포의 확장을 위해 사용 하였다. 그러나, 전체 혈액 세포 나이 유지되었다5 일간 직경은 셀 번호는 제 개수와 거의 동일 하였다. 전혈 세포를 이용하여, 상기 CD34 + 세포가 확대 된 경우 확인하기 어려웠다. 그럼에도 불구하고, 안정화 단계 자체는 성공적으로 재 프로그래밍에 대한 중요 할 것 같았다.

전달 후, 우리는 직렬 원심 분리에 의해 비트로 넥틴 코팅 접시에 세포를 도금. 원래, 재 프로그램 세포 형질 도입 후 웰의 바닥에 가라 앉았다. 기계적인 힘 또는 원심 분리로 세포를 강화함으로써, 형질 세포 부착 및 증식 할 수 있었다. 프로토콜은 전체 혈액 세포를 사용 때문에 팽창 그러나, 다른 샘플 시도 시험 절반 모폴로지 다양한 형태의 결과. 따라서, 식민지 따기에 의해 순수 IPSC 식민지의 분리는이 프로토콜의 핵심이었다. 단리 된 콜로니로부터 확장 세포를 순수 iPSCs의 모든 특성을 보였다.

다른 혜택에도 불구하고, iPSCs는이여러 장애물을 극복하기 위해. 여러 야마나카 인자는 종양 유전자 알려져 있기 때문에, iPSCs는 생체 내 종양으로 발전 할 우려가있다. 따라서, 재 프로그래밍 셀 적분에 의해 남아있는 외래 유전자의 발현이없는 것이 중요하다. 같은 레트로 바이러스와 렌티 바이러스로 iPSCs, 바이러스, 개발 후 초기 몇 년 동안, 프로그래밍에 사용 하였다. 리 프로그래밍 속도가 성공적으로 높고, 또 이들 바이러스는 세포 게놈에 랜덤 통합을 요구했다. 이 때문에, 몇 가지 다른 방법들이 개발되고있다. 센다이 바이러스와 같은 바이러스는 통합하지 않고 세포를 형질 도입하기 위해 공지되어 있으며, 작은 분자 및 에피 솜 벡터를 사용하는 다른 방법도 개발되었다. 본 연구에서는 리 프로그래밍 센다이 바이러스를 사용 하였다. 통합 속도는 렌티 바이러스에 비해 상대적으로 낮다. 우리는 또한 생성 된 iPSCs의 일부 남아있는 바이러스 구성 요소가 있었다는 것을 확인했다. 세 가지 시험 중 하나는 아웃 integrat 결과이온 통로 후에도 15-20. 그러나, 이러한 통합은 하나의 세포에서 파생 된 식민지를 서브 클로닝하여 제거 하였다. 우리의 경험에서, 단일 세포에서 유래하는 건강 콜로니를 얻었다 밀도는 100 mm 접시 당 1 × 104 세포였다. 완벽한 원형의 결과 식민지가 들었고, 나머지 바이러스 구성 요소의 PCR 다시 확인을 확장했다. 비 통합 된 세포에서 파생 된 식민지 더 사용하기 위해 유지 하였다. 삭제되면, 셀은 비 통합 상태를 유지 하였다.

본 연구에서는 혈액 세포 리 프로그래밍을위한 프로토콜을 제안한다. 우리는 부유 셀의 프로그래밍 속도를 증가시키기 위해, 시리얼 도금 및 원심 분리와 같은 여러 단계를 추가했다. 이 방법은 PBMC를 제대혈 단핵구 (CBMCs)로 이루어졌다. 이 프로토콜은 한국 GMP 시설 동형의 iPSCs를 생성하기 위해 사용되었다. 우리 그룹은 사용 IPSC의 재 프로그래밍 과정의 가속화 기대우리의 프로토콜입니다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Plasticware
100 mm Dish TPP  93100
6-well Plate TPP 92006
50 ml Cornical Tube SPL 50050
15 ml Cornical Tube SPL 50015
10 ml Disposable Pipette Falcon 7551
5 ml Disposable Pipette Falcon 7543
12-well Plate TPP 92012
24-well Plate TPP 92024
PBMC Isolation Materials
DPBS Life Technologies 14190-144
Ficoll GE Healthcare 17-1440-03
StemSpan STEMCELL Technologies 9805 Blood cell media
CC110 STEMCELL Technologies 8697 Blood cell media supplement (100x)
iPSC Generation and Culture Materials
CytoTune-iPSC Sendai Reprogramming Kit Life Technologies A16518
TeSR-E8 Media STEMCELL Technologies 5940 iPSC media
Vitronectin Life Technologies A14700
ROCK Inhibitor Sigma Aldrich Y0503
TrypLE express (TrypLE) Life Technologies 12604-039
ReleSR STEMCELL Technologies 12604-039 Colony detaching solution
Quality Control Materials
18 mm Cover Glass Superior HSU-0111580
4% Paraformaldyhyde Tech & Innovation BPP-9004
Triton X-100 BIOSESANG 9002-93-1
Bovine Serum Albumin  Vector Lab SP-5050 
Anti-SSEA4 Antibody Millipore MAB4304
Anti-Oct4 Antibody Santa Cruz SC9081
Anti-TRA-1-60 Antibody Millipore MAB4360
Anti-Sox2 Antibody Biolegend 630801
Anti-TRA-1-81 Antibody Millipore MAB4381
Anti-Klf4 Antibody Abcam ab151733
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody Molecular Probe A11029
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody Molecular Probe A11037
DAPI Molecular Probe D1306
Prolong gold antifade reagent Invitrogen P36934
Slide Glass, Coated  Hyun Il Lab-Mate HMA-S9914
Trizol Invitrogen 15596-018
Chloroform Sigma Aldrich 366919
Isoprypylalcohol Millipore 109634
Ethanol Duksan 64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit Thermo Scientfic K1622
i-Taq DNA Polymerase iNtRON BIOTECH 25021
UltraPure 10X TBE Buffer  Life Technologies 15581-044
loading star Dyne Bio A750
Agarose Sigma-Aldrich 9012-36-6
1kb (+) DNA ladder marker Enzynomics DM003
Alkaline Phosphatase Millipore SCR004
Tris base Fisher Scientific BP152-1 Rinse Buffer
Sodium Chloride Duchefa Biochemie S0520.1000 Rinse Buffer
Tween-20 BIOSESANG T1027 Rinse Buffer
Hydrochloric Acid Duksan 1129 Rinse Buffer

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References

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