Geïnduceerde pluripotente stamcellen Generation van Blood Cells Met behulp van Sendai Virus en Centrifugeren

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Rim, Y. A., Nam, Y., Ju, J. H. Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation. J. Vis. Exp. (118), e54650, doi:10.3791/54650 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

De recente ontwikkeling van de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) bewees dat volwassen lichaamscellen kan terugkeren naar een ongedifferentieerde, pluripotente toestand. Nu is herprogrammering uitgevoerd met diverse typen volwassen somatische cellen: keratinocyten, urine cellen, fibroblasten, enz Vroege experimenten meestal door dermale fibroblasten. Maar dit vereist een invasieve chirurgische procedure om fibroblasten van patiënten te verkrijgen. Daarom suspensie cellen, zoals bloed en urine cellen werden beschouwd als ideaal voor herprogrammering vanwege het gemak van het verkrijgen van de primaire cellen. Hier melden wij een efficiënt protocol voor iPSC generatie uit perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC). Door uitplating de getransduceerde PBMC serieel een nieuwe matrix gecoate platen middels centrifugatie, kan deze eenvoudig protocol bieden iPSC kolonies. Deze methode is ook toepasbaar op navelstrengbloed mononucleaire cellen (CBMCs). Deze studie geeft een eenvoudige en efficiënte protocol voor de herprogrammering van PBMCs en CBMCs.

Introduction

Stamcellen zijn een van de meest aantrekkelijke materialen klinische therapie voor de laatste decennia 1 geweest. De aantrekkelijke eigenschappen van stamcellen pluripotentie en de mogelijkheid om te hernieuwen. In 1981, werden de eerste embryonale stamcellen (SER) geïsoleerd uit de muizenembryo 2. Wanneer echter de techniek werd toegepast op menselijke embryo, het keek aantal ethische vragen.

In 2006, toen Dr. Yamanaka en zijn team geherprogrammeerd de eerste pluripotente cellen uit muizen somatische cellen, het gebied stamcel weer zijn mogelijkheid en interesse werd aangewakkerd 3. Door het leveren van een aantal factoren bepaald, pluripotente stamcellen waren succesvol "opgewekt" uit volwassen lichaamscellen, en werden dus de naam "geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs)." In 2007 werd deze techniek toegepast op menselijke cellen 4, waardoor de cellen met de exacte kenmerken van de SER, maar geen van de ethische discussie. Theoretisch iPSCs kunnen uit elke celsoort die bij een individu of patiënt. Patiëntspecifieke iPSCs stijgen als een potentieel middel dat de ziekte fenotypes en epigenetische omstandigheden van elke individuele patiënt kan simuleren. Middels gen bewerken of andere methoden die de pathogene conditie kan omkeren, kan patiëntspecifieke iPSC worden gebruikt in gepersonaliseerde geneeskunde 5. Bovendien worden iPSCs minder geassocieerd met afstoting, omdat ze dezelfde immunologische identiteit als donor, waardoor auto-transplantatie haalbaarder 6. Daarom hebben iPSCs de meest veelbelovende platform bij de ziekte modelleren, drug discovery, en regeneratieve therapieën. Gezien deze voordelen, verbeterde protocollen die zuiverder en hogere opbrengsten kan geven in de minste hoeveelheid tijd van de kleinste cel bron zijn voortdurend in ontwikkeling. Een belangrijke overweging van het vinden van de meest efficiënte protocol voor toekomstige toepassing is het primaire celtype. De meeste vroege iPSC generatie protocols zijn geoptimaliseerd voor hechtende cellen sinds de oorspronkelijke iPSC lijnen geïnduceerd door huidfibroblasten 4. De isolatie en bereiding van deze cellen zijn arbeidsintensief. Ook de isolatie van huidfibroblasten omvat invasieve chirurgische procedures die een belangrijke tekortkoming bredere toepassing kan worden.

Daarom is voor het verdere gebruik van iPSCs, een cel bron met handige overname is vereist. Bloed wordt beschouwd als een ideale bron van cellen omdat het wordt verkregen door een nogal minimaal invasieve procedure 7-9. In deze studie hebben we een eenvoudige wijziging van het protocol genereren hiPSCs uit perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC). Zonder de moeilijke expansieproces van een specifiek celtype, zoals CD34 + cellen werden volledig bloed cellen of PBMC's uitgeplaat op serieel-matrix gecoate platen door centrifugeren na transductie met Sendaivirus met Yamanaka factoren. Deze werkwijze verminderde de tijd die dehechting van zwevende getransduceerde cellen en verminderde het verlies van geherprogrammeerd cellen die niet kunnen hechten op eigen kracht.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Ethiek Verklaring: Deze studie protocol werd goedgekeurd door de institutionele review board van de Katholieke Universiteit van Korea (KC12TISI0861).

1. Isolatie van monocytische cellen van bloed

  1. Isolatie van monocytische cellen (dag -5)
    1. Verkrijgen van ten minste 10 ml vers bloed van een bloed trekken in een celpreparaat buis (CPT).
    2. Breng het bloed naar een nieuwe 50-ml conische buis en verdunnen met steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) bij een 1: 4 verhouding.
      OPMERKING: Een hogere verhouding van verdunning kan worden gebruikt voor hogere zuiverheid.
    3. Voeg 10 ml dichtheidsgradiënt media in nieuw 50-ml conische buis en voorzichtig laag het verdunde bloed bovenop de dichtheidsgradiënt media. Centrifugeer bij 750 xg gedurende 30 min bij kamertemperatuur (RT) zonder centrifugeren rem.
    4. Breng voorzichtig de buffy laag op een nieuwe 50-ml conische buis, voeg 30 ml PBS aan de buis en was de cellen.
    5. Centrifugeer de cellen bij 515 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </ Li>
    6. Gooi de PBS en resuspendeer de cellen in 0,5 ml bloed celmedium.
    7. Tel de cellen en de plaat 1 x 10 6 cellen per putje van een 24-wells plaat. Voeg PBS om de omringende putjes om verdamping te voorkomen.
    8. Stabiliseren van de cellen gedurende 5 dagen bij 37 ° C in 5% CO 2 voor transductie. Voeg een extra 0,5 ml vers bloedcel media op dagen 3-4 zonder verstoring van de cellen.

2. Transductie door Sendai Virus

  1. Transductie (Dag 0)
    1. Verzamelen en overdragen van de bloedcellen aan een 15-ml conische buis en tel ze met behulp van een hemocytometer.
    2. Bereid 3 x 10 5 cellen per transductie en centrifugeer de cellen bij 515 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    3. Verwijder het supernatant door afzuigen en resuspendeer de cellen in 0,5 ml bloed celmedium.
    4. Overdracht van de cellen om een ​​putje van een niet-gecoate 24-well plaat.
    5. Ontdooi de Sendai virus mengsel in ijs en voeg deze toe aan de suspended cellen. Voeg Sendaivirus aan de cellen op basis van de aanbevelingen van de fabrikant.
    6. Dicht de plaat met een afdichtfilm en Centrifugeer bij 1150 xg gedurende 30 min bij 30 ° C.
    7. Na centrifugatie Incubeer de cellen bij 37 ° C in 5% CO2 gedurende de nacht (O / N).
  2. Celoverdracht naar voedermatrix (Dag 1)
    1. De volgende dag, jas een 24-wells plaat met vitronectine. Verdun de oplossing vitronectine in PBS gedurende een laatste 5 ug / ml concentratie. Voeg 1 ml vitronectine aan een putje van een 24-wells plaat en incubeer deze bij kamertemperatuur gedurende tenminste 1 uur. Verwijder de bekledingsoplossing voor gebruik. Beklede platen kunnen worden opgeslagen kamertemperatuur 3 dagen.
    2. Breng al de media die de cellen en het virus aan de beklede put.
    3. Verzamel de resterende cellen met een extra 0,5 ml vers bloed celmedium toevoegen aan de cel-bevattende put.
    4. Centrifugeer de plaat bij 1150 xg gedurende 10 min bij 35 ° C.
    5. na centrifugation Verwijder het supernatant, voeg 1 ml iPSC media te houden en de cellen bij 37 ° C in 5% CO 2 O / N.
  3. Tweede cel overdracht (dag 2)
    1. Bekleden van de putjes van een nieuwe plaat met 24 putjes met 5 ug / ml vitronectine, zoals beschreven in stap 2.2.1. Gebruik een putje van de plaat voor elke transductie.
    2. Breng de celsuspensie van de eerste plaat van de nieuw beklede vitronectine plaat.
      LET OP: Als dit niet nodig is, kan schorsing cellen worden weggegooid. De in stap 2.3 genoemde procedure kan 2-3 keer worden herhaald met de opschorting cellen. Als de stappen worden herhaald, de oogst van de cellen.
    3. Ondertussen, voeg 1 ml iPSC media om de bron van de eerste plaat, onderhoud en incubeer deze bij 37 ° C in 5% CO 2 O / N.
    4. Handhaaf de aangehechte cellen bij 37 ° C en 5% CO 2 en voeren een dagelijkse media verandering iPSC verse media. Kolonies zal verschijnen op de dagen 14-21 na transductie.
    5. Centrifuge de nieuw beklede plaat met de celsuspensie bij 1150 xg en 35 ° C gedurende 10 minuten.
    6. Na centrifugatie Incubeer de cellen bij 37 ° C in 5% CO 2 O / N.
    7. De volgende dag, verwijder het supernatant en te vervangen door verse iPSC media.
      OPMERKING: De bij stap 2.3 genoemd kan 2-3 keer worden herhaald met de suspensie cellen. Als de stappen worden herhaald, de oogst van de cellen in het supernatant en herhaal stap 2,3.
    8. Handhaving van de bijgevoegde cellen met dagelijkse media veranderingen tot 80% samenvloeiing wordt bereikt.

3. geherprogrammeerd Cell Onderhoud

  1. Vroeg onderhoud na de 24-well plaat cultuur
    1. 7-10 dagen na transductie, wanneer de cellen confluent, stelt een vitronectine gecoate, 60 mm schaal. Vitronectine verdunde oplossing in PBS gedurende een laatste 5 ug / ml concentratie. Voeg 1 ml van vitronectine aan de schaal en incubeer deze bij kamertemperatuur gedurende tenminste 1 uur.
    2. was decellen met PBS en voeg 1 ml PBS / 1 mM EDTA om de cellen los te maken.
    3. Incubeer ze op 37 ° C en 5% CO2 gedurende 2 min.
    4. Oogst de cellen en centrifugeer ze op 250 xg en KT 2 min. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 3 ml vers iPSC media.
    5. Plaat alle geresuspendeerde cellen op de nieuw beklede 60-mm schaal.
    6. Voeg 10 mM RHO kinase remmer aan de cellen en te onderhouden bij 37 ° C in 5% CO2 totdat de cellen 80% confluent.
  2. Split voor kolonie uiterlijk (Subklonering Voorbereiding)
    1. Bereid een vitronectine beklede, 100-mm schaaltje, zoals beschreven in stap 3.1.2.
    2. Was de cellen met PBS en voeg 1 ml PBS / 1 mM EDTA om de cellen los te maken.
    3. Incubeer ze op 37 ° C en 5% CO2 gedurende 2 min.
    4. Oogst de cellen en centrifugeer ze op 250 xg en KT 2 min.
    5. Tel de cellen met een hemocytometer en bereiden 1 x 10 4 cellen per schaal.
    6. Centrifugeer de cellen bij 250 xg en KT 2 min.
    7. Resuspendeer 1 x 10 4 cellen in 6 ml iPSC media, plaat ze op het beklede 100-mm schaaltje en voeg 10 mM RHO kinaseremmer aan de media.
    8. Incubeer de cellen bij 37 ° C in 5% CO2 gedurende een week tot grote kolonies verschijnen.
      LET OP: Onderhouden en uitbreiden van de kolonies voor subklonering. Subklonering gebeurt meestal in minder dan 5 passages.
  3. Kolonie plukken met behulp van iPSC kolonie los oplossing
    1. Een week voor kolonie picking zaad 1 x 10 4 cellen op vitronectine beklede, 100-mm schaaltje, zoals vermeld in stap 3.2.7.
    2. Bereid een vitronectine beklede, 60-mm schaal door toevoeging van 2 ml vitronectine oplossing en incubatie bij kamertemperatuur gedurende ten minste 1 uur.
    3. Door het observeren door een microscoop (40X of 100X vergroting), markeer kolonies met duidelijke grenzen met behulp van een markeerstift. Verwijder de vitronectine oplossing uit de nieuwe plaat gemaakt in stap 3.3.2 en voeg 6 mlvan iPSC medium, aangevuld met 10 mM RHO kinase.
    4. Verwijder het kweekmedium van de cellen en wassen met 3 ml PBS.
    5. Voeg 1 ml iPSC kolonie losmaken oplossing en incubeer ze gedurende 30 s bij kamertemperatuur.
    6. Verwijder de oplossing van de plaat en incubeer het op kamertemperatuur gedurende nog 30 sec.
    7. Met behulp van een P200 pipet, trek 200 ul van de media van de plaat en verwijder de beoogde kolonies door pipetteren. Breng de verstrooide koloniën de nieuwe 100-mm schaaltje.
    8. Incubeer en onderhouden van de cellen bij 37 ° C in 5% CO2.
      NB: Na het verkrijgen van een zuivere iPSC kolonie, werden de cellen gehandhaafd totdat zij passage bereikt 10. karakterisatie werd gedaan na ten minste 10 passages. Antilichaam verdunningen en primer gegevens worden in tabellen 1 en 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dit protocol geeft een eenvoudige methode om PBMC's geïsoleerd uit bloed herprogrammeren. Door gecombineerde seriële platen en centrifugeren, werden iPSCs succes gegenereerd. Met deze methode kan iPSC worden gegenereerd met een kleine hoeveelheid bloed cellen zonder isoleren of expanderen van een specifiek celtype. Wij hebben met succes gegenereerd iPSCs van slechts 1x10 4 cellen in een kleine celcultuur plaat.

Voordat herprogrammering, werden bloedcellen geïsoleerd met behulp van dichtheidsgradiënt media. Bloedcellen werden getransduceerd 5 dagen na isolatie. Figuur 1A illustreert de opzet van de herprogrammering methode voor de schorsing cellen. Na isolatie werden PBMC's getransduceerd met Sendai-virus dat Yamanaka factoren in een onbeklede put. De volgende dag, de suspensie cellen werden geoogst en uitgeplaat op een met vitronectine beklede platen middels centrifugatie, terwijl de cellen attached de niet-beklede putje werden weggegooid. De bijgevoegde cellen die verscheen op de-vitronectine gecoate plaat werden behouden en verder uitgebreid. Bijgevoegde cellen werden onderhouden met de dagelijkse media veranderingen met behulp van iPSC media. Het galvaniseringsproces met centrifugatie werd herhaald voor de resterende suspensie cellen.

Geherprogrammeerd iPSCs kan worden onderscheiden door hun verschillende morfologie enkele dagen na transductie. Echter, tijdens het herprogrammeren, was het moeilijk om de geherprogrammeerde cellen uit te breiden in een zuivere vorm. In een vroeg stadium van herprogrammering, de iPSCs werden gemengd met aangehechte niet- geherprogrammeerd gedifferentieerde cellen (Figuur 2A). De pijl in Figuur 2A toont de iPSC-achtige celtypes in het beeld. Vóór expansie, de iPSCs en andere cellen waren moeilijk te onderscheiden. Daarom werd een zuivere kolonie alleen verkregen door de kolonie picken. Door enten van de cellen in een lage dichtheid, kolonies die waren large genoeg voor het plukken werden verkregen, zoals getoond in figuur 2B. Na het isoleren van de kolonie, werden de cel klonten gescheiden in afzonderlijke cellen en gekweekt (figuur 2C). Zuivere iPSC kolonies werden vervolgens waargenomen (Figuur 2D). Nadat de zuivere iPSCs werden uitgebreid, werd de kwaliteit van de cellen getest. Cellen werden gekleurd met alkalische fosfatase om de ongedifferentieerde toestand van de iPSCs (figuur 3A) te bevestigen. Kolonies afgeleid van geïsoleerde iPSCs vertoonden allemaal positieve kleuring. Pluripotent merkers werden bevestigd door immunofluorescentie kleuring, zie figuur 3B. De geherprogrammeerd cellen sterk tot expressie pluripotent markers zoals SSEA4, OCT4, SOX2, TRA-1-81, KLF4, en, belangrijker nog, TRA-1-60. De expressie van pluripotente merkers werd bevestigd door RT-PCR, zie figuur 3C. OCT4 en SOX2 werden gedetecteerd, zoals in de fluorescentiegegevens. Extra markers zoals NANOG, DPPA5, TDGF1 waren PositivEly uitgedrukt ook.

Voor verdere analyse, werd een karyotype analyse gedaan. Zoals getoond in figuur 4A, de gegenereerde iPSCs vertoonden een normaal chromosomaal patroon. Om waar te pluripotentie te bevestigen, werden de cellen gedifferentieerd in ectoderm, mesoderm en endoderm. De gegenereerde iPSCs succesvol onderscheiden in alle weefsels gezien in figuur 4B. Aangezien Sendaivirus is bekend om de integratie accommodatie, is de verwijdering van viraal DNA in figuur 4C. Eén op de drie cellen de neiging om virale DNA moet blijven, ook na een aantal passages. De geïntegreerde gen werd verwijderd door subklonering processen.

Concluderend, hebben wij een protocol genereren iPSCs drijven PBMCs getoond. Het protocol toonden hoge efficiency en vereist slechts een kleine hoeveelheid bloed. De opgewekte iPSCs had hoge pluripotentie en vermeden vi ral integratie.

figuur 3
Figuur 1: Schema van de generatie protocol iPSC uit PBMCs. Een gedetailleerd schema van de ontworpen protocol gebaseerd op het type medium en de tijdlijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3
Figuur 2: Helder-gebied afbeelding van iPSCs gegenereerd uit PBMCs. (A) Vroege morfologie van cellen geherprogrammeerd. (B) Afbeelding van een kolonie voor het kiezen. (C) Cellen na de kolonie picking zuiveringsproces. (D) Morfologie van een zuivere kolonie. Alle schaal balken geven 200 urn. /ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54650/54650fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3
Figuur 3: Pluripotentie van iPSCs gegenereerd uit PBMCs. (A) Andere gekleurd met alkalische fosfatase. (B) Fluorescentie beeld van de gegenereerde iPSCs. Het antilichaam verdunningsverhouding wordt weergegeven in tabel 1. (C) PCR-analyse van pluripotente markers. Primer informatie wordt verstrekt in tabel 2. Alle schaal balken geven 200 urn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

uploaden / 54650 / 54650fig4.jpg "/>
Figuur 4: Een verdere analyse van de gegenereerde iPSCs. (A) Normaal karyogram van de iPSC. (B) Fluorescentie beeld van de cellen na drie-kiemlaag differentiatie. (C) PCR-analyse van Sendai virale vectoren. Niet-getransduceerde cellen werden gebruikt als negatieve controle, en cellen geoogst dag na transductie werden gebruikt als positieve controle. Primer informatie wordt verstrekt in tabel 2. Alle schaal balken geven 200 urn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

antilichaam Naam Concentratie
SSEA4 1: 200
Oct3 / 4 1: 100
TRA-1-60 1: 200
Sox2 1: 100
TRA-1-81 1: 100
Klf4 1: 250
Alexa Fluor 488 geit anti-muis IgG (H + L) antilichaam 1: 400
Alexa Fluor 594 geit anti-konijn IgG (H + L) antilichaam 1: 400

Tabel 1. Antilichaam verdunningen.

Target Naam Richting primer Sequence Grootte
Oct3 / 4 vooruit ACC CCT GGT GCC GTG AA 190
Omgekeerde GGC TGA ATA CCT TCC CAEen ATA
SOX2 vooruit CAG CGC ATG GAC AGT TAC 321
Omgekeerde GGA GTG GGA GGA AGA GGT
NANOG vooruit AAA AAA GGC CAA CCC ACT 270
Omgekeerde GCT ATT CTT CGG CCA GTT
LIN28 vooruit GTT CGG CTT CCT GTC CAT 122
Omgekeerde CTG CCT CAC CCT CCT TCA
DPPB5 vooruit CGG CTG CTG AAA GCC ATT TT 215
Omgekeerde AGT TTG AGC ATC CCT CGC TC
TDGF1 vooruit TCC TTC TAC GGA CGG AAC TG 140
Omgekeerde AGA AAT GCC TGA GGA AAG CA
SeV vooruit GGA TCA GGT CTA GAT ATC GAG C 181
Omgekeerde ACC AGA CAA GAG TTT AAG AGA TAT GTA TC
KOS vooruit ATG CAC CGC TAC GAC GTG AGC GC 528
Omgekeerde ACC TTG ACA ATC CTG TGG ATG
Klf4 vooruit TTC CTG CAT GCC AGA GGA GCC C 410
Omgekeerde AAT GTA TCG AAG GTG CTC AA

Tabel 2. Primer informatie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Omdat embryonale stamcellen (SER) toonde diverse tekortkomingen, werd de behoefte aan een alternatief gereedschap nodig. Daarom is de ontwikkeling van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) door Yamanaka kwam onder de internationale schijnwerpers. Het is bijna tien jaar geleden Yamanaka ontdekt dat pluripotentie kan worden geïnduceerd door toevoeging van slechts vier genen in volwassen somatische cellen. Sinds iPSCs worden "opgewekt" van volwassen lichaamscellen, kunnen zij ethische kwesties die ooit de zorg met betrekking tot de SER had ontlopen. In tegenstelling tot de SER, kan iPSCs worden gegenereerd op basis van elk individu. Daarom kunnen zij worden gebruikt in gepersonaliseerde medisch onderzoek en andere onderzoeken, zoals drugs screening, ziektemodel of regeneratieve geneeskunde.

De eerste menselijke iPSC werd gegenereerd uit huidfibroblasten in 2007. Verschillende groepen succesvol geherprogrammeerd dit type cel, maar een invasieve chirurgische ingreep nodig was om deze primaire cel te verkrijgen. Daarom was het niet de bedoelingl bron voor het genereren van verschillende ziekte iPSCs of het ontwerpen van regeneratieve geneeskunde. Een alternatieve en gemakkelijk te verkrijgen celtypes nodig waren, zoals keratinocyten, urine monocyten en bloedcellen. Echter, deze cellen zijn moeilijk te breiden, en sommige hebben een hogere kans op besmetting 10.

In deze studie, die we een protocol dat succesvol iPSCs uit volbloed cellen zoals PBMC's kunnen genereren. Zonder expansieproces van een specifiek celtype, dit protocol suggereert een relatief eenvoudige methode om iPSCs genereren, zelfs een kleine hoeveelheid primaire bloedcellen. Zodra de PBMC's werden geïsoleerd uit het bloed, werden de cellen gestabiliseerd bloedcel media gedurende 5 dagen. De stabilisatie stap voordat transductie was kritisch in dit protocol. De herprogrammering efficiëntie was beter na incubatie van de cellen in het bloed cel media. Dit medium werd gebruikt voor de expansie van CD34 + cellen. Wanneer echter geheel bloedcellen werden deze gehandhaafd media gedurende 5 dagen, het celaantal was bijna identiek aan de eerste telling. Met behulp van hele bloedcellen, was het moeilijk om te bevestigen dat de CD34 + cellen werden uitgebreid. Toch is de stabilisatiestap zelf leek belangrijk voor een succesvolle herprogrammering te zijn.

Na transductie, we serieel vergulde de cellen op een-vitronectine gecoate plaat door centrifugeren. Oorspronkelijk was de cellen geherprogrammeerd zonk naar de bodem van de put na transductie. Door het stimuleren van de cellen met mechanische kracht of centrifugeren, de getransduceerde cellen in staat waren om te bevestigen en te vermenigvuldigen. Aangezien het protocol volbloed cellen, de helft van de poging onderzoeken met verschillende monsters resulteerde in diverse morfologieën indien uitgezet. Daarom, isolatie van pure iPSC kolonies door kolonie picking was kritisch in dit protocol. De cellen uitgebreid van de geïsoleerde kolonie vertoonde alle kenmerken van een pure iPSCs.

Ondanks andere voordelen, iPSCs hebbeneen aantal hindernissen te overwinnen. Sinds enkele Yamanaka factoren bekend oncogenen, zijn er zorgen dat iPSCs kan ontwikkelen tot tumoren in vivo. Daarom is het belangrijk dat de cellen geherprogrammeerd geen resterende exogene genexpressie door integratie. In de eerste jaren na de ontwikkeling van iPSCs, virussen, zoals retrovirussen en lentivirussen, werden gebruikt voor herprogrammering. De herprogrammering bedroeg succes hoog, maar deze virussen vereist willekeurige integratie in het genoom. Daarom zijn verschillende andere werkwijzen ontwikkeld. Virussen zoals Sendaivirus is bekend dat het transduceren zonder integratie, en andere methoden gebruik van kleine moleculen en episomale vectoren zijn eveneens ontwikkeld. In deze studie hebben we gebruik Sendaivirus de herprogrammering. De integratie tarief was relatief laag in vergelijking met lentivirussen. We bevestigde ook dat er een aantal resterende virale componenten in de gegenereerde iPSCs. Eén op de drie proeven resulteerde in integration, zelfs na 15-20 passages. Echter, deze integratie werd verwijderd door subkloneren van de kolonies afgeleid uit één enkele cel. In onze ervaring, de dichtheid van een gezonde kolonie afgeleid van een enkele cel te verkrijgen was 1x10 4 cellen per 100 mm schaal. De kolonies die resulteerden in een perfecte cirkelvorm gepikt en verder uitgegroeid voor PCR herbevestiging van de overblijvende virale componenten. De kolonies afkomstig van niet-geïntegreerde cellen werden gedurende verder gebruik. Eenmaal verwijderd, de cellen handhaafde de niet-geïntegreerde toestand.

In deze studie, raden we een protocol voor bloedcel herprogrammering. Wij voegden verschillende stappen, zoals seriële platen en centrifugeren, aan de herprogrammering snelheid van de drijvende cellen te verhogen. Deze methode werd uitgevoerd met PBMC's en navelstrengbloed mononucleaire cellen (CBMCs). Dit protocol werd gebruikt om homozygote iPSCs in GMP installaties in Zuid-Korea te genereren. Onze groep kijkt uit naar de versnelling van de iPSC herprogrammering proces met behulp vanons protocol.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Plasticware
100 mm Dish TPP  93100
6-well Plate TPP 92006
50 ml Cornical Tube SPL 50050
15 ml Cornical Tube SPL 50015
10 ml Disposable Pipette Falcon 7551
5 ml Disposable Pipette Falcon 7543
12-well Plate TPP 92012
24-well Plate TPP 92024
PBMC Isolation Materials
DPBS Life Technologies 14190-144
Ficoll GE Healthcare 17-1440-03
StemSpan STEMCELL Technologies 9805 Blood cell media
CC110 STEMCELL Technologies 8697 Blood cell media supplement (100x)
iPSC Generation and Culture Materials
CytoTune-iPSC Sendai Reprogramming Kit Life Technologies A16518
TeSR-E8 Media STEMCELL Technologies 5940 iPSC media
Vitronectin Life Technologies A14700
ROCK Inhibitor Sigma Aldrich Y0503
TrypLE express (TrypLE) Life Technologies 12604-039
ReleSR STEMCELL Technologies 12604-039 Colony detaching solution
Quality Control Materials
18 mm Cover Glass Superior HSU-0111580
4% Paraformaldyhyde Tech & Innovation BPP-9004
Triton X-100 BIOSESANG 9002-93-1
Bovine Serum Albumin  Vector Lab SP-5050 
Anti-SSEA4 Antibody Millipore MAB4304
Anti-Oct4 Antibody Santa Cruz SC9081
Anti-TRA-1-60 Antibody Millipore MAB4360
Anti-Sox2 Antibody Biolegend 630801
Anti-TRA-1-81 Antibody Millipore MAB4381
Anti-Klf4 Antibody Abcam ab151733
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody Molecular Probe A11029
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody Molecular Probe A11037
DAPI Molecular Probe D1306
Prolong gold antifade reagent Invitrogen P36934
Slide Glass, Coated  Hyun Il Lab-Mate HMA-S9914
Trizol Invitrogen 15596-018
Chloroform Sigma Aldrich 366919
Isoprypylalcohol Millipore 109634
Ethanol Duksan 64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit Thermo Scientfic K1622
i-Taq DNA Polymerase iNtRON BIOTECH 25021
UltraPure 10X TBE Buffer  Life Technologies 15581-044
loading star Dyne Bio A750
Agarose Sigma-Aldrich 9012-36-6
1kb (+) DNA ladder marker Enzynomics DM003
Alkaline Phosphatase Millipore SCR004
Tris base Fisher Scientific BP152-1 Rinse Buffer
Sodium Chloride Duchefa Biochemie S0520.1000 Rinse Buffer
Tween-20 BIOSESANG T1027 Rinse Buffer
Hydrochloric Acid Duksan 1129 Rinse Buffer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Serra, M., Brito, C., Correia, C., Alves, P. M. Process engineering of human pluripotent stem cells for clinical application. Trends Biotechnol. 30, (6), 350-359 (2012).
  2. Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 78, (12), 7634-7638 (1981).
  3. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, (4), 663-676 (2006).
  4. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, (5), 861-872 (2007).
  5. Chun, Y. S., Byun, K., Lee, B. Induced pluripotent stem cells and personalized medicine: current progress and future perspectives. Anat Cell Biol. 44, (4), 245-255 (2011).
  6. Seki, T., Fukuda, K. Methods of induced pluripotent stem cells for clinical application. World J Stem Cells. 7, (1), 116-125 (2015).
  7. Churko, J. M., Burridge, P. W., Wu, J. C. Generation of human iPSCs from human peripheral blood mononuclear cells using non-integrative Sendai virus in chemically defined conditions. Methods Mol Biol. 1036, 81-88 (2013).
  8. Loh, Y. H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7, (1), 15-19 (2010).
  9. Ohmine, S., et al. Induced pluripotent stem cells from GMP-grade hematopoietic progenitor cells and mononuclear myeloid cells. Stem Cell Res Ther. 2, (6), (2011).
  10. Mae, S., et al. Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells. Nat Commun. 4, 1367 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics