Induite cellules souches pluripotentes génération de cellules sanguines utilisant Sendai Virus et Centrifugation

Developmental Biology

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Rim, Y. A., Nam, Y., Ju, J. H. Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation. J. Vis. Exp. (118), e54650, doi:10.3791/54650 (2016).

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Abstract

Le développement récent de cellules souches pluripotentes humaines induites (les hiPSCs) a prouvé que les cellules somatiques matures peuvent revenir à un état pluripotent indifférenciée. Maintenant, la reprogrammation est effectuée avec divers types de cellules somatiques adultes: kératinocytes, cellules de l' urine, des fibroblastes, etc. Les premières expériences ont été généralement fait avec des fibroblastes dermiques. Cependant, cela nécessitait une intervention chirurgicale invasive pour obtenir les fibroblastes des patients. Par conséquent, les cellules de la suspension, telles que des cellules de sang et d'urine ont été considérées comme idéales pour la reprogrammation en raison de la facilité d'obtention des cellules primaires. Ici, nous rapportons un protocole efficace pour la génération COPSi à partir de cellules mononucléaires du sang périphérique (CMSP). En étalant les CMSP transduites en série à une nouvelle plaque à l'aide de la matrice centrifugation revêtu, ce protocole peut facilement fournir des colonies iPSC. Cette méthode est également applicable à des cellules mononucléées du sang du cordon ombilical (CBMCs). Cette étude présente une prot simple et efficaceocol pour la reprogrammation de CMSP et CBMCs.

Introduction

Les cellules souches ont été l' un des matériaux les plus attrayants de la thérapie clinique depuis plusieurs décennies 1. Les propriétés intéressantes de cellules souches sont pluripotence et la capacité d'auto-renouvellement. En 1981, les premières cellules souches embryonnaires (CSE) ont été isolées à partir de l'embryon de souris 2. Cependant, quand la technique a été appliquée à des embryons humains, il fait face à plusieurs questions éthiques.

En 2006, lorsque le Dr Yamanaka et son équipe reprogrammées la première cellule pluripotente à partir de cellules somatiques de souris, le champ de cellules souches a retrouvé sa possibilité et l' intérêt a été ravivé 3. En fournissant plusieurs facteurs définis, les cellules souches pluripotentes ont été avec succès "induits" à partir de cellules somatiques adultes, et ont donc été nommés «cellules souches pluripotentes induites (CSPi)." En 2007, cette technique a été appliquée à des cellules humaines 4, ce qui donne des cellules avec les caractéristiques exactes des CES , mais aucun du débat éthique. Théoriquement, iPSCs peut être générée à partir de tout type de cellule obtenue à partir de tout individu ou patient. CSPi spécifiques des patients sont en hausse comme un outil potentiel qui peut simuler les phénotypes de la maladie et les conditions épigénétiques de chaque patient. En utilisant la modification génétique ou d' autres procédés qui peuvent inverser l'état pathogène, iPSCs spécifiques à un patient peuvent également être utilisés en médecine personnalisée 5. En outre, iPSCs sont moins associée à un rejet immunitaire parce qu'ils ont la même identité immunitaire du donneur, ce qui rend l' auto-transplantation plus réalisable 6. Par conséquent, CSPi sont devenus la plate-forme la plus prometteuse dans la modélisation de la maladie, le dépistage des drogues et des thérapies régénératrices. Compte tenu de ces avantages, les protocoles améliorés qui peuvent donner plus purs et des rendements plus élevés dans le moins de temps à partir de la source de cellules plus petites sont constamment en cours de développement. Une considération majeure de trouver le protocole le plus efficace pour l'application future est le type de cellules primaires. La plupart des premières générations proto iPSCcols sont optimisés pour les cellules adhérentes puisque les lignes iPSC originales ont été induites à partir de fibroblastes de la peau 4. Cependant, l'isolement et la préparation de ces cellules sont main-d'œuvre. En outre, l'isolement des fibroblastes de peau comprend des interventions chirurgicales invasives qui peuvent devenir un défaut majeur pour une application plus large.

Par conséquent, pour l'utilisation ultérieure de iPSCs, une source de cellules à l'acquisition pratique est nécessaire. Le sang est considéré comme une source de cellules idéale car elle est obtenue par le biais d' une procédure minimalement invasive et non 09/07. Dans cette étude, nous avons développé une simple modification au protocole générant hiPSCs à partir de cellules mononucléaires du sang périphérique (CMSP). Sans que le processus d'expansion difficile d'un type cellulaire spécifique, telles que les cellules CD34 +, les cellules du sang entier ou en série PBMC ont été étalées sur des plaques de matrice revêtu par centrifugation après transduction avec le virus Sendai contenant des facteurs Yamanaka. Cette méthode réduit le temps nécessaire à lafixation des cellules flottantes transduites et une diminution de la perte de cellules reprogrammées qui ne sont pas en mesure de joindre leur propre chef.

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Protocol

Déclaration éthique: Ce protocole d'étude a été approuvé par le comité d'examen institutionnel de l'Université catholique de Corée (KC12TISI0861).

1. Isolement des cellules monocytaires du sang

  1. Isolement des cellules monocytaires (Jour -5)
    1. Obtenir au moins 10 ml de sang frais à partir d'un prélèvement de sang dans un tube de préparation de cellules (CPT).
    2. Transférer le sang dans un nouveau tube conique de 50 ml et dilué avec une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS) à un ratio de 1: 4.
      REMARQUE: Un taux plus élevé de dilution peut être utilisé pour une plus grande pureté.
    3. Ajouter 10 ml de milieu à gradient de densité dans un nouveau tube conique de 50 ml et couche avec soin le sang dilué au-dessus du milieu de gradient de densité. Centrifuger à 750 g pendant 30 min à température ambiante (RT) sans frein de centrifugation.
    4. Soigneusement transférer la couche leucocytaire dans un nouveau tube conique de 50 ml, ajouter 30 ml de PBS dans le tube, et laver les cellules.
    5. Centrifuger les cellules à 515 g pendant 5 min à température ambiante. </ Li>
    6. Jeter le PBS et remettre les cellules dans 0,5 ml de milieu de cellules sanguines.
    7. Compter les cellules et la plaque 1 x 10 6 cellules par puits d'une plaque de 24 puits. Ajouter PBS dans les puits environnants pour éviter l'évaporation.
    8. Stabiliser les cellules pendant 5 jours à 37 ° C dans 5% de CO 2 avant la transduction. Ajouter un 0,5 ml supplémentaires de milieu de cellules de sang frais sur 3-4 jours sans perturber les cellules.

2. Transduction de virus Sendai

  1. Transduction (jour 0)
    1. Recueillir et transférer les cellules du sang dans un tube conique de 15 ml et les compter en utilisant un hémocytomètre.
    2. Préparer 3 x 10 5 cellules par transduction et centrifuger les cellules à 515 xg pendant 5 min à température ambiante.
    3. Jeter le surnageant par aspiration et remettre les cellules dans 0,5 ml de milieu de cellules sanguines.
    4. Transférer les cellules dans un puits d'une plaque non revêtue 24 puits.
    5. Décongeler le mélange de virus Sendai dans la glace et l'ajouter à la sucellules spended. Ajouter virus Sendai aux cellules basées sur les recommandations du fabricant.
    6. Sceller la plaque avec un film d'étanchéité et centrifuger à 1.150 xg pendant 30 min à 30 ° C.
    7. Après centrifugation, incuber les cellules à 37 ° C dans 5% de CO2 pendant une nuit (O / N).
  2. transfert de la cellule à la matrice nourricière (jour 1)
    1. Le lendemain, le manteau, une plaque de 24 puits avec vitronectine. Diluer la solution de vitronectine dans du PBS pour obtenir une concentration finale / ml 5 pg. Ajouter 1 ml de vitronectine à un puits d'une plaque à 24 puits et incuber à température ambiante pendant au moins 1 h. Retirer la solution de revêtement avant l'utilisation. Les plaques revêtues peuvent être stockées dans la température ambiante pendant 3 jours.
    2. Transférer tous les médias contenant les cellules et le virus au bien enrobé.
    3. Recueillir les cellules restantes avec un 0,5 ml supplémentaires de milieu de cellules de sang frais et l'ajouter à la cellule contenant bien.
    4. Centrifuger la plaque à 1.150 xg pendant 10 min à 35 ° C.
    5. Après centrifugation, éliminer le surnageant, ajouter 1 ml de iPSC médias, et de maintenir les cellules à 37 ° C dans 5% de CO 2 O / N.
  3. transfert de cellules Second (Jour 2)
    1. Enduire les puits d'une nouvelle plaque de 24 puits avec 5 ug / ml de vitronectine, comme décrit à l'étape 2.2.1. Utiliser un puits de la plaque pour chaque transduction.
    2. Transférer la suspension cellulaire à partir de la première plaque à la plaque de vitronectine nouvellement revêtu.
      NOTE: Si non nécessaire, les cellules en suspension peuvent être jetés. La procédure décrite à l'étape 2.3 peut être répétée 2-3 fois avec les cellules en suspension. Si les étapes seront répétées, récolter les cellules.
    3. Pendant ce temps, ajouter 1 ml de milieux COPSi au puits de la première plaque, pour l' entretien et incuber à 37 ° C dans 5% de CO 2 O / N.
    4. Maintenir les cellules fixées à 37 ° C et 5% de CO 2 et d' effectuer un changement quotidien des médias avec les médias iPSC frais. Colonies apparaîtront sur jours 14-21 après transduction.
    5. Centrifuge la plaque fraîchement revêtue contenant les cellules en suspension à 1.150 x g et à 35 ° C pendant 10 min.
    6. Après centrifugation, incuber les cellules à 37 ° C dans 5% de CO 2 O / N.
    7. Le lendemain, retirer le surnageant et le remplacer par les médias iPSC frais.
      REMARQUE: La procédure décrite à l'étape 2.3 peut être répétée 2-3 fois avec les cellules en suspension. Si les étapes seront répétées, récolter les cellules dans le surnageant et répéter l'étape 2.3.
    8. Maintenir les cellules attachées avec des changements de médias quotidiens jusqu'à 80% de confluence est atteinte.

3. Reprogrammed Maintenance cellulaire

  1. entretien précoce après la culture de la plaque de 24 puits
    1. 7-10 jours après la transduction, une fois que les cellules sont confluentes, préparer un, de 60 mm plat vitronectine-enduit. Avec une solution diluée de vitronectine dans du PBS pour obtenir une concentration finale / ml 5 pg. Ajouter 1 ml de vitronectine au plat et incuber à température ambiante pendant au moins 1 h.
    2. laver lecellules avec du PBS et ajouter 1 ml de PBS / EDTA 1 mM pour détacher les cellules.
    3. Incuber à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant 2 min.
    4. Récolter les cellules et de les centrifuger à 250 x g et à température ambiante pendant 2 min. Retirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 3 ml de milieu iPSC frais.
    5. Plate toutes les cellules remises en suspension sur le plat nouvellement revêtue de 60 mm.
    6. Ajouter un inhibiteur de kinase 10 mM RHO aux cellules et les maintenir à 37 ° C dans 5% de CO2 jusqu'à ce que les cellules sont confluentes à 80%.
  2. Split pour l'apparence de la colonie (Subcloning Préparation)
    1. Préparer un, de 100 mm plat vitronectine revêtu, comme décrit à l'étape 3.1.2.
    2. Laver les cellules avec du PBS et ajouter 1 ml de PBS / 1 mM d'EDTA pour détacher les cellules.
    3. Incuber à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant 2 min.
    4. Récolter les cellules et de les centrifuger à 250 x g et à température ambiante pendant 2 min.
    5. Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre et préparer 1 x 10 4 cellules par boîte.
    6. Centrifuger les cellules à 250 x g et à température ambiante pendant 2 min.
    7. Resuspendre 1 x 10 4 cellules dans 6 ml de iPSC médias, la plaque - les sur le plat revêtu de 100 mm, et d' ajouter un inhibiteur de kinase 10 mM RHO aux médias.
    8. Incuber les cellules à 37 ° C dans 5% de CO 2 pendant une semaine jusqu'à ce que les grandes colonies apparaissent.
      NOTE: Maintenir et élargir les colonies pour le sous-clonage. Le sous-clonage se fait habituellement en moins de 5 passages.
  3. Colony picking en utilisant iPSC colonie solution détachant
    1. Une semaine avant la cueillette de la colonie, les graines 1 x 10 4 cellules dans un, de 100 mm plat vitronectine revêtu, comme mentionné à l' étape 3.2.7.
    2. Préparer une 60 mm Antenne vitronectine revêtu par addition de 2 ml d'une solution de la vitronectine et l'incubation à température ambiante pendant au moins 1 h.
    3. En observant à travers un microscope (40X ou 100X), marquer des colonies avec des limites claires à l'aide d'un marqueur. Retirer la solution de vitronectine de la nouvelle plaque faite à l'étape 3.3.2 et ajouter 6 mldes iPSC médias supplémenté avec 10 mM RHO kinase.
    4. Retirez le milieu de culture des cellules et les laver avec 3 ml de PBS.
    5. Ajouter 1 ml d'une solution de détachement COPSi des colonies et les incuber pendant 30 secondes à température ambiante.
    6. On élimine la solution de la plaque et incuber à température ambiante pendant 30 secondes supplémentaires.
    7. En utilisant une pipette P200, dessiner 200 ul de milieu de la plaque et détacher les colonies ciblées par pipetage. Transférer les colonies dispersées à la nouvelle boîte de 100 mm.
    8. Incuber et maintenir les cellules à 37 ° C dans 5% de CO2.
      NOTE: Après avoir obtenu une colonie iPSC pure, les cellules ont été maintenues jusqu'à ce qu'ils atteignent le passage 10. La caractérisation a été réalisée après au moins 10 passages. Des dilutions d' anticorps et les informations d' amorce sont présentées dans les tableaux 1 et 2.

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Representative Results

Ce protocole présente une méthode simple pour reprogrammer CMSP isolées à partir du sang. En utilisant la combinaison de placage série et la centrifugation, iPSCs ont été produites avec succès. Avec cette méthode, iPSCs pourraient être générés avec une petite quantité de cellules du sang total sans isoler ou de développer un type de cellule spécifique. Nous avons généré avec succès à partir iPSCs seulement 1x10 4 cellules dans une petite plaque de culture cellulaire.

Avant la reprogrammation, les cellules sanguines ont été isolées en utilisant des milieux à gradient de densité. Les cellules sanguines ont été transduites 5 jours après l'isolement. La figure 1A illustre le schéma de la méthode de reprogrammation des cellules en suspension. Après isolement, les PBMC ont été transduites avec le virus Sendai contenant des facteurs Yamanaka dans un puits non revêtu. Le lendemain, les cellules en suspension ont été récoltées et étalées sur une plaque de vitronectine revêtue par centrifugation, tandis que les cellules attfaisait mal au bien non recouvertes ont été rejetés. Les cellules attachées qui sont apparues sur la plaque revêtue de la vitronectine ont été conservées et développées plus loin. Les cellules fixées ont été maintenues avec des changements quotidiens des médias utilisant iPSC médias. Le procédé de plaquage par centrifugation a été répétée pour les cellules en suspension restantes.

CSPi reprogrammées pourraient être distingués par leur morphologie distinctes plusieurs jours après la transduction. Cependant, lors de la reprogrammation, il était difficile d'étendre les cellules reprogrammées sous une forme pure. Au stade précoce de la reprogrammation, les CSPi ont été mélangées avec des cellules attachées non différenciées reprogrammées (Figure 2A). La flèche sur la figure 2A montre les types de cellules iPSC-comme dans l'image. Avant l'expansion, les CSPi et d'autres cellules étaient difficiles à distinguer. Par conséquent, une colonie unique pure a été obtenue par le processus de prélèvement de colonie. Par ensemencement des cellules dans une faible densité, les colonies qui ont été lsuffisant pour prélever arge ont été obtenus, comme le montre la figure 2B. Après isolement de la colonie, les amas de cellules ont été dissociées en cellules isolées et mises en culture (figure 2C). Colonies pures iPSC ont été vus par la suite (figure 2D). Une fois que les iPSCs pures ont été développées, la qualité des cellules a été testée. Les cellules ont été colorées avec de la phosphatase alcaline pour confirmer l'état non différencié de la CISP (figure 3A). Colonies dérivées de CSPi isolés tous ont présenté une coloration positive. Les marqueurs pluripotentes ont été confirmés par immunofluorescence, représentée sur la figure 3B. Les cellules reprogrammées fortement exprimés marqueurs pluripotentes tels que SSEA4, OCT4, SOX2, TRA-1-81, KLF4, et, surtout, TRA-1-60. L'expression des marqueurs pluripotentes a été confirmée par RT-PCR, représentée sur la figure 3C. OCT4 et SOX2 ont été détectées, comme indiqué dans les données de fluorescence. marqueurs supplémentaires tels que NANOG, DPPA5, TDGF1 étaient positively exprimé ainsi.

Pour une analyse ultérieure, une analyse du caryotype a été fait. Comme on le voit sur la figure 4A, les iPSCs générés ont montré une caryotype normal. Pour confirmer vrai pluripotence, les cellules ont été différenciées en ectoderme, le mésoderme et l'endoderme. Les CSPi générées différenciées avec succès dans les trois couches germinales, vu dans la figure 4B. Depuis le virus Sendai est connue pour son établissement intégration, la suppression de l' ADN viral est représenté sur la figure 4C. Un sur trois cellules avaient tendance à avoir l'ADN viral restent, même après plusieurs passages. Cependant, le gène intégré a été éliminé par des processus de sous-clonage.

En conclusion, nous avons montré un protocole générant CSPi à partir de PBMC flottantes. Le protocole a montré une efficacité élevée et exige seulement une petite quantité de sang. Les CSPi générées avaient élevé pluripotence et évité vi intégration ral.

Figure 3
Figure 1: Schéma du protocole de génération iPSC à partir de PBMC. Un schéma détaillé du protocole conçu sur la base du type de support et le calendrier. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 2: Image lumineuse champ de CSPi générées à partir de PBMC. (A) de la morphologie précoce des cellules reprogrammées. (B) l' image d'une colonie avant de choisir. (C) Les cellules après le processus de purification des colonies de cueillette. (D) Morphologie de la colonie pure. Toutes les barres d'échelle indiquent 200 um. /ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54650/54650fig2large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3: pluripotence de CSPi généré à partir de CMSP. (A) Les colonies colorées avec de la phosphatase alcaline. L' image (B) Fluorescence des CSPi générées. Le rapport de dilution d' anticorps est présenté dans le tableau 1. (C) Analyse par PCR de marqueurs pluripotentes. Primer informations sont fournies dans le tableau 2. Toutes les barres d'échelle indiquent 200 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 4: Une analyse plus poussée des CSPi générées. (A) de caryotype normal du iPSC. L' image (B) , la fluorescence des cellules après la différenciation des trois couches germinales. (C) Analyse par PCR de Sendai vecteurs viraux. les cellules non transduites ont été utilisées comme témoin négatif, et les cellules récoltées d'un jour après transduction ont été utilisées comme témoin positif. Primer informations sont fournies dans le tableau 2. Toutes les barres d'échelle indiquent 200 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Nom Anticorps La concentration
SSEA4 1: 200
Oct3 / 4 1: 100
TRA-1-60 1: 200
Sox2 1: 100
TRA-1-81 1: 100
Klf4 1: 250
Alexa Fluor 488 de chèvre anti-IgG de souris (H + L) antibody 1: 400
Alexa Fluor 594 de chèvre anti-lapin IgG (H + L) de l'anticorps 1: 400

Tableau 1. Des dilutions de l' anticorps.

Nom de la cible Direction séquence d' amorce Taille
OCT3 / 4 Vers l'avant ACC CCT GGT CCG GTG AA 190
Sens inverse GGC TGA ATA CCT TCC CAA ATA
SOX2 Vers l'avant CAG CCG ATG GAC AGT TAC 321
Sens inverse GGA GTG GGA GGA AGA GGT
NANOG Vers l'avant ACT CAA CCC AAA GGC AAA 270
Sens inverse GCT ATT CTT CGG CCA GTT
LIN28 Vers l'avant GTT CGG CTT CCT GTC CAT 122
Sens inverse CTG CCT CAC CCT CCT TCA
DPPB5 Vers l'avant CGG CTG CTG AAA GCC ATT TT 215
Sens inverse AGT TTG AGC ATC CCT CGC TC
TDGF1 Vers l'avant TCC TTC TAC GGA CGG AAC TG 140
Sens inverse AGA AAT GCC TGA GGA AAG CA
SeV Vers l'avant GGA TCA CTA GGT GAT ATC GAG C 181
Sens inverse ACC AGA CAA GAG TTT AAG AGA TAT GTA TC
KOS Vers l'avant ATG CAC CGC TAC GAC GTG AGC GC 528
Sens inverse ACC TTG ACA ATC CTG ATG TGG
Klf4 Vers l'avant TTC CTG CAT GCC AGA GGA GCC C 410
Sens inverse AAT GTA TCG AAG GTG CTC AA

Tableau 2. Information Primer.

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Discussion

Puisque les cellules souches embryonnaires (CSE) ont montré plusieurs lacunes, la nécessité d'un outil de remplacement était nécessaire. Par conséquent, le développement des cellules souches pluripotentes induites (CSPi) par Yamanaka est venu sous les projecteurs internationaux. Il a été depuis près de dix ans Yamanaka a découvert que la pluripotence peut être induite en ajoutant seulement quatre gènes dans des cellules somatiques adultes. Depuis CSPi sont "induites" à partir de cellules somatiques matures, ils peuvent échapper à des questions éthiques qui étaient autrefois la préoccupation relative aux CES. Contrairement à CES, CSPi peuvent être générés à partir de chaque individu. Par conséquent, ils peuvent être utilisés dans la recherche médicale personnalisée et d'autres études, telles que le dépistage des drogues, la modélisation de la maladie, ou la médecine régénérative.

La première iPSC humaine a été généré à partir de fibroblastes dermiques en 2007. Divers groupes reprogrammés avec succès ce type de cellule, mais une intervention chirurgicale invasive a été nécessaire pour obtenir cette cellule primaire. Par conséquent, il n'a pas été l'idéel source pour générer divers CSPi de la maladie ou la conception de la médecine régénérative. Une alternative et des types cellulaires facilement obtenus étaient nécessaires, telles que les kératinocytes, les monocytes d'urine, et les cellules sanguines. Cependant, ces cellules sont difficiles à développer, et certains d'entre eux ont plus de chances de contamination 10.

Dans cette étude, nous avons présenté un protocole qui peut générer avec succès CSPi à partir de cellules de sang entier tels que les CMSP. Sans aucun processus d'expansion d'un type cellulaire spécifique, ce protocole suggère une méthode relativement simple pour générer iPSCs, même d'une petite quantité de globules primaires. Une fois que les PBMC ont été isolées à partir du sang, les cellules sont stabilisées dans un milieu de cellules sanguines pendant 5 jours. L'étape de stabilisation avant transduction était critique dans ce protocole. L'efficacité de reprogrammation était meilleure après l'incubation des cellules dans des milieux de cellules sanguines. Ce support a été utilisé pour l'expansion des cellules CD34 +. Cependant, lorsque les cellules de sang total ont été maintenues dans ce moidia pendant 5 jours, le nombre de cellules était presque identique au premier compte. En utilisant des cellules de sang total, il était difficile de confirmer si les cellules CD34 + ont été étendues. Néanmoins, l'étape de stabilisation elle-même semble être important pour la reprogrammation réussie.

Après transduction, on les cellules en série des plus généreux sur une plaque de vitronectine revêtue par centrifugation. A l'origine, les cellules reprogrammées ont coulé au fond du puits après transduction. En stimulant les cellules avec une force mécanique ou centrifugation, les cellules transduites ont été en mesure de joindre et de proliférer. Cependant, étant donné que le protocole utilisé des cellules de sang entier, la moitié des tentatives d'essais avec différents échantillons a donné lieu à différents types de morphologies lorsqu'il est déployé. Par conséquent, l'isolement des colonies pures iPSC par colonie cueillette était critique dans ce protocole. Les cellules expansées de la colonie isolée a montré toutes les caractéristiques d'un CSPi pur.

Malgré d'autres avantages, CSPi ontplusieurs obstacles à surmonter. Depuis plusieurs facteurs Yamanaka sont oncogènes connus, on craint que les CSPi peuvent se développer dans des tumeurs in vivo. Par conséquent, il est important que les cellules reprogrammées présentent pas d'expression du gène exogène restant par intégration. Dans les premières années après le développement des CSPi, des virus, tels que les rétrovirus et les lentivirus, ont été utilisés pour la reprogrammation. Le taux de reprogrammation a été avec succès élevé, mais ces virus exige une intégration aléatoire dans le génome de la cellule. Pour cette raison, plusieurs autres méthodes ont été développées. Les virus tels que le virus Sendai sont connus pour transduire les cellules sans intégration, et d'autres méthodes utilisant des petites molécules et des vecteurs épisomiques ont été développés aussi bien. Dans cette étude, nous avons utilisé le virus Sendai pour la reprogrammation. Le taux d'intégration était relativement faible par rapport à lentivirus. Nous avons également confirmé qu'il y avait des composants viraux restants dans les CSPi générées. Un sur trois essais a donné lieu à integration, même après 15-20 passages. Toutefois, cette intégration a été éliminé par sous-clonage des colonies dérivées d'une seule cellule. Dans notre expérience, la densité pour obtenir une colonie saine provenant d'une seule cellule était 1x10 4 cellules par 100 mm plat. Les colonies qui ont abouti à une forme circulaire parfaite ont été choisis et développés pour la PCR re-confirmation des composants viraux restants. Les colonies provenant de cellules non intégrées ont été maintenues pour une utilisation ultérieure. Une fois effacées, les cellules maintenues à l'état non-intégré.

Dans cette étude, nous proposons un protocole pour la reprogrammation de cellules sanguines. Nous avons ajouté plusieurs étapes, telles que le placage en série et la centrifugation, afin d'augmenter le débit des cellules flottantes de reprogrammation. Cette méthode a été effectuée avec les CMSP et les cellules mononucléaires du sang du cordon (CBMCs). Ce protocole a été utilisé pour générer des CSPi homozygotes dans les installations GMP en Corée du Sud. Notre groupe se réjouit de l'accélération du processus de reprogrammation iPSC utilisantnotre protocole.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Plasticware
100 mm Dish TPP  93100
6-well Plate TPP 92006
50 ml Cornical Tube SPL 50050
15 ml Cornical Tube SPL 50015
10 ml Disposable Pipette Falcon 7551
5 ml Disposable Pipette Falcon 7543
12-well Plate TPP 92012
24-well Plate TPP 92024
PBMC Isolation Materials
DPBS Life Technologies 14190-144
Ficoll GE Healthcare 17-1440-03
StemSpan STEMCELL Technologies 9805 Blood cell media
CC110 STEMCELL Technologies 8697 Blood cell media supplement (100x)
iPSC Generation and Culture Materials
CytoTune-iPSC Sendai Reprogramming Kit Life Technologies A16518
TeSR-E8 Media STEMCELL Technologies 5940 iPSC media
Vitronectin Life Technologies A14700
ROCK Inhibitor Sigma Aldrich Y0503
TrypLE express (TrypLE) Life Technologies 12604-039
ReleSR STEMCELL Technologies 12604-039 Colony detaching solution
Quality Control Materials
18 mm Cover Glass Superior HSU-0111580
4% Paraformaldyhyde Tech & Innovation BPP-9004
Triton X-100 BIOSESANG 9002-93-1
Bovine Serum Albumin  Vector Lab SP-5050 
Anti-SSEA4 Antibody Millipore MAB4304
Anti-Oct4 Antibody Santa Cruz SC9081
Anti-TRA-1-60 Antibody Millipore MAB4360
Anti-Sox2 Antibody Biolegend 630801
Anti-TRA-1-81 Antibody Millipore MAB4381
Anti-Klf4 Antibody Abcam ab151733
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody Molecular Probe A11029
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody Molecular Probe A11037
DAPI Molecular Probe D1306
Prolong gold antifade reagent Invitrogen P36934
Slide Glass, Coated  Hyun Il Lab-Mate HMA-S9914
Trizol Invitrogen 15596-018
Chloroform Sigma Aldrich 366919
Isoprypylalcohol Millipore 109634
Ethanol Duksan 64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit Thermo Scientfic K1622
i-Taq DNA Polymerase iNtRON BIOTECH 25021
UltraPure 10X TBE Buffer  Life Technologies 15581-044
loading star Dyne Bio A750
Agarose Sigma-Aldrich 9012-36-6
1kb (+) DNA ladder marker Enzynomics DM003
Alkaline Phosphatase Millipore SCR004
Tris base Fisher Scientific BP152-1 Rinse Buffer
Sodium Chloride Duchefa Biochemie S0520.1000 Rinse Buffer
Tween-20 BIOSESANG T1027 Rinse Buffer
Hydrochloric Acid Duksan 1129 Rinse Buffer

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References

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