血管新生および血管組織工学を研究するための小さな動物モデルにおける動静脈(AV)ループ

Bioengineering

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Summary

我々は、単離され、十分に特徴付けられた環境で、in vivoで血管新生を分析するためのモデルとして動静脈(AV)ループの生成のための顕微的なアプローチを説明します。このモデルだけでなく、血管新生の研究のために有用であるだけでなく、最適なエンジニアリングを軸方向に血管および移植組織に適しています。

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Weigand, A., Beier, J. P., Arkudas, A., Al-Abboodi, M., Polykandriotis, E., Horch, R. E., Boos, A. M. The Arteriovenous (AV) Loop in a Small Animal Model to Study Angiogenesis and Vascularized Tissue Engineering. J. Vis. Exp. (117), e54676, doi:10.3791/54676 (2016).

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Abstract

Introduction

人体のほとんどの組織や器官は、栄養素を供給するガスを交換し、老廃物を除去する機能血管網に依存しています。局所または全身の血管の問題によって引き起こされるこのシステムの機能不全は、深刻な病気の多数につながることができます。また、このような組織工学や再生医療などの研究分野において、人工的に生成された組織または移植された臓器内の機能的血管網が成功臨床応用のために不可欠です。

何十年もの研究者らは、新規な治療的介入を見つけて、血管障害のより良い予防を提供するために、病理学的な状況へのより深い洞察を得るために成長している血管系に関与する正確なメカニズムを調査してきました。第1のステップでは、そのような細胞-細胞相互作用または血管系の細胞上の分子の影響のような基本的なプロセスは、通常、インビトロ 2Dまたは3Dによって調査されています実験。従来の2Dモデルは、実行が容易であり、十分に確立されており、これらのプロセスのより良い理解に大きく貢献してきました。 1980年に初めて、フォークマン 。ゼラチンコーティングしたプレート1上の毛細血管内皮細胞のin vitroでの血管新生の播種報告しました。これはすぐに、さらに2D血管新生内皮細胞管形成アッセイ2、遊走アッセイ3と異なる細胞タイプ4の共培養上の実験と同様に、他の多数の出版物に道を譲りました。これらのアッセイは、今日でも使用され、 インビトロ方法における標準として受け入れられています。

ほとんどの細胞型は、関連する生理学的組織構造5を形成するために、3D環境を必要とするので、この実験は、常に、 インビボ細胞挙動の研究には適していません。三次元マトリックスのアーキテクチャは、毛細管morphogenesiために決定的であることを示すことができS 6と、その細胞の細胞外マトリックス(ECM)相互作用および3D培養条件は、腫瘍の血管新生7に関与する重要な因子を調節します。 3Dマトリックスは、エフェクタータンパク質と結合し、組織規模溶質濃度勾配を確立することができ、複雑な機械的な入力を提供します。また、それは複雑な組織5においてインビボ形態形成およびリモデリング手順模倣するために必要であると考えられます。これらのシステムでは、血管新生および脈管の両方を研究することができます。血管新生は、血管8既存の毛細血管の出芽を説明しているが、脈管形成は、内皮細胞またはその前駆体9,10を介して血管のデノボ形成を指します。血管の成熟は、平滑筋細胞11の動員を介して 「動脈形成」と呼ばれるプロセスに記載されています。 インビトロモデルにおける典型的な血管新生は、既存の単層からの内皮細胞の発芽でありますSは、ゲル内または内皮細胞スフェロイド12を構築することにより、埋め込まれたミクロスフェアの表面に、ゲル表面上の単層として播種しました。血管性のモデルでは、単一の内皮細胞は3Dゲル内に捕捉されています。それらは、典型的には支持セル12と組み合わせて、新規血管構造とネットワークを形成するために隣接の内皮細胞と相互作用します。

しかし、 インビトロモデルさえ複雑な3Dは完全に細胞-細胞および細胞- ECMは13の相互作用の多数与えられたin vivoでの設定模倣することはできません。高いインビトロ活性を有する物質は、自動的にその逆も 14と同じin vivoでの効果とを示していません。血管新生プロセスの総合的な分析のためのより良い体内の状況をシミュレートするin vivoモデル開発することが急務です。 インビボ血管新生アッセイの広い範囲を含めて、文献に記載されていますヒヨコ漿尿膜アッセイ(CAM)、ゼブラフィッシュモデル、角膜血管新生アッセイ、背気嚢モデル、背側皮下脂肪チャンバー、皮下腫瘍モデル14。しかし、これらのアッセイは、多くの場合、このような急速な形態学的変化、CAMアッセイ、または角膜血管新生アッセイ15内の限られたスペース内にすでに存在するものから区別する新たな毛細血管内の問題などの制限に関連しています。また、非哺乳動物システムが使用されている( 例えば 、ゼブラフィッシュモデル16)異種移植17で問題につながります。隣接する組織が大幅に血管新生プロセスに寄与するため、皮下腫瘍モデルでは、腫瘍自体からのみ由来する血管新生を分析することはできません。また、周囲の組織は、腫瘍微小環境18の形成に決定的な役割を持つことができます。

血管新生又は脈管形成を研究するためだけでなく、強いneがありますEDのための標準化およびin vivoモデルも組織工学と再生医療における異なる血管新生の戦略を研究するための十分に特徴付けられました。今日、複雑な人工器官または組織の発生は、 インビトロおよびインビボの両方が可能です。 3Dのbioprintingは、複雑な3D機能的なリビング組織19を生成するためオンデマンド製造技術を提供します。さらに、バイオリアクターは、組織20、あるいは自身の体を生成するために使用することができるバイオリアクター21として使用することができます。しかし、人工的に生成された組織の成功のアプリケーションに対する主な障壁は工学構成物内の血管新生の欠如です。移植後の宿主の血管系への即時の接続は、特に大規模な人工組織または器官の場合には、生存のための主要な前提条件です。

in vitroまたはin vivo prevascularization戦略異なるがdevelにしましたOPEDは移植前22に構築物における機能的な微小血管系を確立します。マウスの背部皮膚へのin vitroでの予備形成工学毛細血管と足場の移植は23日以内に、マウスの血管系の急速な吻合につながりました。対照的に、三次元の前血管ネットワークに組み立てヒト間葉系幹細胞およびヒト臍静脈内皮細胞からなるスフェロイド共培養は、in vivo移植後さらに開発しました。しかし、ホスト血管系との吻合は24限られていました。中でも、このような壊死性や照射領域として不十分に血管新生の欠陥で、このいわゆる外因性血管新生 - 足場に周辺地域からの血管の内部成長は - 多くの場合失敗します。内因性血管新生は、他の一方で、足場25に発芽新しい毛細血管のソースとして、血管の軸に基づいています。軸方向の血管新生のアプローチを使用して、改変された組織は、その血管軸を移植し、レシピエント部位での局所血管に接続することができます。すぐに移植後、組織が適切に最適な統合のための適切な条件を作成し、酸素と栄養、によってサポートされています。

in vivoでの血管新生を調査するために軸方向血管組織の生成の重要性が増していることの認識におけるモデルの利用が限らに、我々は動物モデル26における動静脈(AV)ループを生成するために、さらにエロルとスピラの顕微手法を開発しました。完全に閉じた注入室を使用することは、この方法は非常によくよくインビボ条件特徴とする 「制御」( 図1)の下で血管形成を研究するために最適です。このモデルだけでなく、血管新生の研究のために有用であるだけでなく、最適な組織ENGINのための足場の軸方向の血管新生に適していますeering目的。

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Protocol

エアランゲン・ニュルンベルク(FAU)のフリードリヒ・アレクサンダー大学の動物実験委員会とミッテルフランケン、ドイツ政府は、すべての実験を承認しました。実験のため、300の体重を有する雄のLewisラット - 350 gを使用しました。

1.ラットにおける動静脈ループモデル

  1. 移植手順(図2)
    1. 麻酔のためにイソフルラン気化器にチューブを介して接続されており、蓋によって閉鎖されている特殊なプラスチック製のボックスを使用します。供給ガスをオンにして、0.8との間の流量計 - 1.5 L /分。
    2. 誘導プラスチックの箱にラットを置き、上部を密封します。 5パーセントにイソフルラン気化器の電源をオンにします。
    3. 慎重に麻酔の導入時にラットを観察します。 3後 - 4分、ラットを麻酔されます。
    4. 適切な麻酔の確認:正向反射の消失、眼瞼反射の消失、引っ込め反射、正の角膜反射を。
    5. 箱からラットを削除し、そのを確認します薬物の計算のための重量。麻酔下ながら乾燥を防ぐために、眼軟膏を適用します。
    6. 鎮痛薬と抗生物質投与( 例えば 、7.5ミリグラム/キログラムのエンロフロキサシン皮下(s)、12.5ミリグラム/キログラムトラマドール及び/ kgのメタミゾール100mgの両方の静脈内(IV))。動作中の体重に適応クリスタを管理する( 例えば 、30ミリリットル/ kg皮下)。
    7. マスクを介して投与2%イソフルラン吸入- 1麻酔下で、37℃で加温プレート上にその背中にラットを置きます。
    8. 適切に麻酔を監視し、麻酔のレベルが低すぎる場合(ラットの運動、痛みに応じて、顎のトーン、反射の損失なし(1.1.4を参照。)、心拍数が増加)をイソフルランを高めます。イソフルラン(角膜反射の消失、高い心拍数、酸素飽和度の低下)を過剰摂取しないように注意してください。ラットの - (450 /分250) - (100%95)と心拍数、酸素飽和度をチェックするための小動物のための特別なパルス酸素濃度計を使用してください。 operati中、ラットのモニタ温度に(36から40°C)、必要に応じて加温プレートの温度を調整します。
    9. 電気かみそりで後肢の内側を剃るし、防腐剤を有する領域を消毒します。後肢を広げ、粘着テープで固定し。
    10. 手術用顕微鏡下でラットを置き、滅菌ドレープでラットをカバーしています。全体の操作手順は、無菌条件下で行われることを確認してください。
    11. メス(10号)を使用して、鼠径部への上位膝から縦切開で左太ももの真ん中で肌を開きます。
    12. 大腿維管束が膝大腿動脈の分岐部に鼠径部の骨盤動脈から露出するまで解剖ハサミとマイクロピンセットを用いて、長さが約3cmの層における皮下組織および筋膜をカットします。
    13. 血管を分離し、外膜のハサミとマイクロピンセットを用いて、外膜を除去します。
    14. b側を凝固電気凝固を使用して牧場。湿った圧縮とオペレーションフィールドをカバーしています。
    15. 1.1.14 - 左サイドで説明したように、1.1.11を右側の皮膚を開きます。
    16. 1.5センチメートル - 静脈グラフトを採取するために、1の距離で近位端と遠位端上の電気凝固により右大腿静脈を結紮。
    17. マイクロピンセットで静脈グラフトを除去し、ヘパリン溶液で静脈グラフトをフラッシュ(0.9%塩化ナトリウム溶液中にmlの50 IU /)灌漑カニューレを使用して、左大腿部に転送します。湿った湿布で右側のオペレーションフィールドをカバーしています。
    18. 微小血管クランプと鼠径部に近位左側の大腿静脈を結紮。約2cmの距離で、分岐する前に上部膝で、電気凝固によって遠位大腿静脈を凝固。
    19. 吻合のため11-0 suturでエンドツーエンドの吻合によって静脈の近位端と静脈グラフトの近位端に接続電子。約8中断縫合糸を使用してください。 12時と6時の位置に最初の2本の縫合糸を配置することで始まります。そして、フロント側のこれらの点の間に2〜3以上の縫合糸に入れ、裏面に3以上の縫合糸に2を入れました。
    20. 大腿静脈(1.1.18。)のために説明したのと同じ方法で、大腿動脈を結紮。ループ血管がねじれていないことを確認してください。大腿静脈に記載のように動脈の近位端を有する静脈グラフトの遠位端を吻合(1.1.19ステップ)。
    21. 静脈内に25 IUのヘパリンを管理します。ループ血管がねじれていないされ、再びていることを確認し、クランプを外し、約5分間ループの漏れや開通性を確認してください。
    22. 血管のドリブルパパベリン( 例えば、4 mg / mlで)は、血管痙攣を防止します。開通性がある場合、ループが展開され、動脈の脈拍を観測することができます。
    23. 例えば(行列の最初の半分(約500μL)で注入室を事前入力</ em>の、細胞の有無にかかわらず、ヒドロゲルまたは骨基質)。注入チャンバ内にループを埋め込みます。
    24. 千マイクロリットルの総容量に行列の後半で注入チャンバーを埋めます。チャンバ蓋付き容器を密閉。
    25. 非吸収性縫合糸6-0と大腿部に注入チャンバーを修正しました。非吸収性の6-0縫合糸でチャンバ蓋を固定してください。電気凝固で可能な出血を止めます。
    26. 吸収性4-0縫合糸で皮膚を閉じます。アルミスプレーで傷をカバーしています。
    27. 抗生物質や鎮痛剤を投与する( 例えば、7.5ミリグラム/キログラムエンロフロキサシン皮下、飲料水を介して、OS(PO当たりトラマドール12.5ミリグラム/キログラム)()3 -ラットの行動に応じて5日間、その後)。
    28. オフ気化器の電源を入れ、目覚め始めるまでラットは、供給ガスを呼吸することができます。
    29. 熱サポート付きのボックスにラットを置き、完全に回復するまで慎重に観察します。
    30. ラット解除のままにしないでくださいそれは胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻したまで出席しました。
    31. 完全に回復するまで、他の動物の会社にラットを返さないでください。
  2. 外植手順
    1. 短時間または長時間注入後の外移植を行う(研究デザインに応じて、例のための参考資料27-32を参照してください)。ステップ1.1.1.-1.1.9に従ってラットを麻酔。
    2. メス(10号)で腹部の皮膚を開き、圧縮して脇に腸を動かします。綿棒を使用して、尾腹部大動脈と大静脈を公開します。
    3. 腹部大動脈( 例えば 、24ゲージのプラスチックカニューレ)をカニューレを挿入し、解剖ハサミで大静脈尾を切りました。
    4. 漏出液が透明になるまで100 IU / mlのヘパリンを含む0.9%塩化ナトリウム溶液で腹部大動脈をフラッシュします。 30 mlの灌流液( 例えば 、造影剤またはインドで大動脈を灌流K)。
    5. 深い麻酔中 - (0.2ミリリットル/キログラム0.1)embutramide、mebezonium、ヨウ化テトラカイン塩酸塩注射液の致死量の注射によってラットを安楽死させます。
    6. 非吸収性4-0縫合糸で腹部大動脈と大静脈尾を連結。
    7. 2クランプ - 1で開いた創傷領域を閉じます。 4°C(灌流液の硬化)で24時間、ラットを保管してください。
    8. その背中にラットを置きます。後肢を広げ、粘着テープで固定し。
    9. メス(10号)で縦切開でチャンバー上の皮膚を開きます。
    10. 解剖ハサミとマイクロピンセットを用いてチャンバとループ茎から結合組織を削除します。解剖ハサミでチャンバ開口部から1センチメートルの距離でループ茎をカットし、室内を削除します。
    11. チャンバーの蓋を開け、慎重にピンセットでチャンバーから構造物を除去し、室温で24時間、4%緩衝ホルマリン溶液中でそれを修正温度。その後、3Dマイクロコンピュータ断層撮影法またはパラフィン包埋組織学的分析の30ための構築物を使用しています。

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Representative Results

ヒト組織工学
骨組織工学の目的のために、異なる代用骨の数は、小動物ラットAVループモデル27,28,33,34に移植しました。血管新生は、完全な3Dマイクロコンピュータ断層撮影(マイクロCT)( 図3A)によって実証することができます。処理された牛海綿骨(PBCB)行列の血管新生は、血管新生のない群と比較してループ群で有意に高かったです。常に成長とmaturating血管網は、8週間にわたって注入チャンバー内で開発します。いかなる増加は、非血管新生群33で検出されなかった4および8週の間に、構築物の中心に向かって血管組織の継続的な成長が観察されました。 AVループモデルでの6週間のPBCB行列のPrevascularizationは、コントロール骨芽細胞と比較して、注入された骨芽細胞の優れた生存につながりました。対照群とは対照的に、骨特異的遺伝子の発現は、移植骨芽細胞28とAVループ群で検出されました。さらに、マトリックスのように、一緒にフィブリンゲル焼結生体活性ガラスは、ラットのAVループに移植しました。 3週間後、新たに形成された血管の密なネットワークは、マイクロCTおよび組織学27によって実証開発しました。

注入チャンバーは足場血管新生を促進するために修飾しました。穿孔チタンチャンバを使用することによって、固有の血管新生は、周囲の組織からの外因性血管によって支持されました。 βリン酸三カルシウムハイドロキシアパタイト(β-TCP / HA)/フィブリンマトリックスの移植後わずか2週間で、血管の83%は、時間をかけて連続的に増加したAVループに接続し、8週間34後に97%の接続に達しました。 5×10 6個の骨髄由来間葉系幹細胞の移植(とMSC)および骨形成タンパク質2(BMP-2)、BMP-2またはMSC単独群と比較して骨形成の有意な増加を誘導することができます。 6および12週で、フィブリンマトリックスは完全に分解し、全てのグループにおいて高度に血管結合組織( 図3B 6週間の移植)に置き換えられました。 6と12週の間および他のグループの12週間後のBMP-2 / MSCグループ内の血管数の有意な減少が認められました。これはおそらく、血管網または制限された血管ネットワーク形成32につながる骨構造のコンパクトな配置の成熟によるものでした。

骨以外にも、例えば、筋肉又は肝臓のような他の組織も、AVループモデルで操作することができます。

工学のための軸方向に筋組織を血管新生、AVループフィブリンマトリックスの主要な筋芽細胞を用いた実験を行いました。 prevascul後2,4、および8週間の2週間の値化時間は、1×10 6筋芽細胞は、AVループ室に移植しました。移植された筋芽細胞は、さらにカルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル(CFDA)の標識を使用して、8週間後に再検出することができました。細胞は、MEF-2およびデスミンは4週間後に陽性であった筋特異的なマーカーのフィブリンマトリックスと式の中でその筋形成表現型を維持しました。しかし、筋原性マーカー遺伝子発現は、おそらく筋形成刺激とフィブリンマトリックス35の迅速な吸収がないためだった、8週間後に陰性でした。筋原性の刺激を増大させるために、ラットのAVループの新しい変更は、分離チャンバのより近位の位置合わせを達成するために、代わりに、伏在静脈の上腹部静脈を使用して開発されました。したがって、栓子運動神経の追加の取り込みは、幾何学的に促進されました。 EPIループと呼ばれ、このAVループ改変を用いて、我々は、筋原Dを示すことができ同時移植した筋芽細胞及びMSC 36のifferentiation。

肝組織工学のために4×10 6 PKH-26標識された胎児肝臓細胞を、2週間のラットAVループモデルにおけるフィブリンマトリックス内に移植しました。対照群では、AVループ無細胞マトリックスなしのマトリックスを移植しました。機能性毛細血管は、AVループ血管から生じたとCD31染色と墨汁標識により示されるように高度に血管新生組織は、移植の14日後にチャンバ内に観察されました。無細胞と肝細胞AVループ群間に差はなかったです。 AVループは密フィブリンマトリックスを血管新生、生存胎児細胞は、主に主要な血管軸の近傍で正PKH-26染色と肝細胞特異的サイトケラチン18(CK-18)免疫組織学によって植後に検出することができました。 CK-18のmRNAレベルは、AVループ細胞群において上昇しました。これとは対照的に、何のCK-18 expressioありませんnがループまたは細胞37せずに構築物において検出することができました。

血管新生の研究
静脈、動脈グラフトと中間物挿入静脈グラフト(IVG)のセグメント( 図1):AVループは三つのセグメントから構成されています。血管系の三次元評価が新たに形成された血管は静脈および動脈部分からだけでなく、静脈interponateの両方から発信されていることを実証しました。新たに形成された血管の多くがIVG 33から観察されました。 インビボ MRA、腐食キャスト及び免疫組織学の走査型電子顕微鏡を用いて、フィブリンマトリックス中の血管形成の開始がとりわけ10日目と14との間に観察され、静脈およびIVGセグメントは、多くの毛細管および大きい血管を生じました。血管内の圧力とせん断応力府の増加にIVGの動脈化の符号と管腔口径の漸減38日7から検出秒。さらなる研究では、血管の発芽は、主に非動脈グラフト39で行われていることが確認できました。

血管形成プロセスの正確な分析及び血管形成の刺激および阻害は、AVループ注入チャンバ内で可視化することができます。増殖因子、血管内皮増殖因子A(VEGFA)および塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)は、成長因子を含まない対照群31と比較してより高い絶対的および相対的血管密度およびフィブリンマトリックスのより速い吸収を誘導しました。さらに、分離チャンバ内のリモデリング現象および血管網の成熟は、8週間の移植期間にわたって可視化しました。 AVループ室では毛細血管間の相互接続およびintussusceptive血管新生並びに可能なリンパ管の成長のプロセスは、NEのパラメータとして、免疫組織学的に同定されましたovascular成熟39。全身ラットでPHD(プロリルヒドロキシラーゼドメイン)阻害剤DMOG(dimethyloxallylグリシン)を適用することにより、低酸素誘導因子α(HIF-α)の濃度は、AVループで成長している血管新生と相関し、であることを示すことができました血管の成長40のための刺激。

図1
図1:静脈(V)、動脈(A)移植片と中間物挿入静脈グラフト(IVG)セグメント: ラットモデルにおけるAVループのスキームは、AVループは三つのセグメントから構成されています。 AVループは、固有の血管新生を誘導するための閉じた注入室(C)に埋め込むことができます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

GE = "1"> 図2
図2:ラットにおけるAVループ操作(A):ラットの後肢の内側の大腿バンドルのローカライズ(B / C):の左右の脚の付け根の大腿維管束の調製ラット。容器は、(D)に分離されている、中間物挿入静脈グラフトは、右側(E)から採取し、大腿静脈(F)及びAVループに左側の大腿動脈と吻合さ(G、矢印は、吻合を示します)。ループ容器は行列(H)を予め充填注入室に蓋が閉じられた完全な充填(I)(J)の後に転送されます。 =大腿動脈、V =大腿静脈、N =大腿神経、IVG =中間物挿入静脈グラフト。スケールバー5ミリメートル(DJ)。tp_upload / 54676 / 54676fig2large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
図3:ラットAVループモデルにおける血管新生の可視化(A):マイクロCT造影剤(黄色灌流隻)による灌流後(B):。とβ-TCP / HAの骨代用のヘマトキシリン-エオシン染色MSCは、6週間AVループモデルのラットに移植します。 AVループ容器は墨汁(黒色)で灌流されています。スケールバー1ミリメートル。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Discussion

10年以上にわたり、我々は、組織工学のために動静脈(AV)ループを正常に使用していると、小さな動物モデルにおいてin vivoでの血管新生を研究します。我々は、この顕微モデルが異なる組織を操作するための、それはまた、血管新生または抗血管新生研究のために使用することができる非常によく適していることを示している可能性があります。

既存の/代替方法に関して技術の意義
操作された組織または器官は、彼らが欠損部位41への移植後の生存および統合の成功のために必要な栄養と酸素を供給するために機能的な血管網を必要とします。異なるprevascularization戦略の数は、in vitroin vivoで 、固有のアプローチ外因性に応じて区別することができる、過去数十年にわたって開発されてきました。

足場はファブリカすることができます管状の構造とテッドと、このような試験管42中の内皮細胞や前駆細胞などの血管細胞を播種しました。一方、 インビボ prevascularizationため、足場は、皮下または筋肉組織21のように高度に血管新生の領域に注入されます。その後、これらの外因性血管新生の構築物は、欠損部位に移植することができます。しかしながら、これらのアプローチの欠点は、移植後のレシピエントの血管との顕微接続がないことです。特に大規模な構築物の場合には、ホストの血管系への即時の接続は、改変された組織43の即時供給のために不可欠です。この問題に対する明らかな最も有望な解決策は、このようなAVループモデルなどの血管軸に本質的に血管新生した組織または器官の発生です。

前述のようにAVループ方式を使用するだけでなく、軸方向の血管新生は、Al缶そのように上腹部動脈45などの代わりに44か一方のみの容器などのAVバンドルを使用することによって誘発されます。しかし、いくつかの刊行物にAVループモデルは、血管新生の程度及び新規組織形成の量に関して優れていることが判明しました。田中らは方法論的アプローチと観察有意に高い組織形成および束群46と比較して、ループ内の毛細血管を開発し、より大きな程度の両方を比較しました。洞 。また、AVループまたはAV・バンドルを使用して研究を行っ同様に束群47と比較して、ループ内で有意に高い血管密度を示したウサギモデルにおいて、骨組織工学のために近づきます。我々は、これらの結果だけでなく、AVループモデルは、血管新生48のための高い能力を持っていることを以前の研究でのショーを確認することができました。

我々の知る限り、分析のための同等のモデルがありません単離され、よく特徴付けられた環境でのin vivoでの血管新生。したがって、AVループモデルは、細胞または成長因子の侵入などの周囲の構造からの妨害なく、異なる組織における血管ネットワーク形成または血管形成プロセスに寄与するか、異なる細胞タイプまたは成長因子を評価するための強力なツールを表しています。

テクニックの制限事項
しかし、提案されたモデルの一つの重要な課題は、手術の高い複雑です。一つは、AVループモデルを用いて欠損の治療は、2段階の手順が必要 - 欠損部位に足場移植のprevascularizationを。これは、患者が2つの手術を受けることがあることを意味します。また、顕微スキルが成功した吻合サブミリ容器49のために必要な前提条件です。したがって、AV束は時々私ので、臨床応用のために、より有用であると考えられますトンものAVループ46に比べて、血管新生および組織の生成のための有望な、しかしあまり、可能性を提供しています。しかし、この操作はでAVループ操作を行う前に、その後最初の訓練とのために死んだ動物( 例えば、鶏の足)の血管を小口径のシリコンチューブを使用して、ステップバイステップであっても非外科医によってを学習することができます生きている動物。これとは対照的に、ほとんどの練習マイクロ外科医は、トレーニングのほんの短い時間でこの操作を実行することができます。

プロトコル内の重要なステップ
一般的に、原因血管の小口径のループ血管の血栓形成及び閉鎖の危険性があります。しかし、平均的にループのラットモデル80%-100%で、特許抗凝固術後28,30,31,34,38,39をヘパリンのみ短時間を使用していました。

また、手術の高い複雑なため、それはトンに応じて(数時間かかります彼外科医の専門知識)。全体の動作中に、動物の適切な麻酔を確認し、適切に十分な血圧を維持するための輸液を供給することが不可欠です。術後の期間中には、鎮痛剤/抗生物質を投与するために、操作の傷をチェックするために、動物に数回の健康状態をチェックするために非常に重要です。ほとんどの場合、隔離室の注入が行われるので、室内での感染は、気付かずに発生する可能性があります。 5日 - したがって、抗生物質の全体の動作および投与は慎重に3の期間にわたって行われるべき時に無菌性を維持することは非常に重要です。

議定書の修正
チャンバは、個別に、欠陥の大きさ及び形状に調整することができます。さらに、また、膜はManasseri 50によって実行されるAVループを封入するために使用することができます。また、足場、サップlemented細胞および成長因子は、異なる組織の種類に応じて選択することができます。最近、Miomas らは、AVループモデルで正常に遺伝子治療アプローチを組み合わせ、VEGF165 51で形質導入によって血管成長の増強を誘導することができます。最近、我々は、筋肉組織工学の目的のために、ラットAVループモデルを調整しました。代わりに、大腿血管の、上腹部静脈および伏在動脈は、運動神経支配(「EPIループモデル」)36のための軸方向に血管新生化足場に閉鎖神経の移植を可能にする、使用されました。 、運動神経の移植に加えて、感覚神経と骨組織工学構築物の神経再生を高める骨形成及び骨欠損52のより良好な修復のために有益であると報告されています。 AVループは最小限のドナー部位の病的状態を誘発し、本体52の様々な部位に作成することができます。他の部位での表在血管を使用することも可能ですAVループまたは偶数の世代のためのボディは、ウサギまたはマウスモデルとして他の動物を使用しています。

このテクニックをマスターした後、将来のアプリケーションや行き方
このような増殖、移動、およびなどの内皮細胞機能のマーカーおよび細胞内阻害剤 - 最近、私たちのワーキンググループは、タンパク質-1(GBP-1)を結合グアニル酸を発現して十分に特徴づけられたマウス胚性内皮前駆細胞(EPC)ライン(T17b)を移植しました侵略 - ラットAVループモデルインチ分化したGBP-1-EPCの抗血管新生能力は、AVループ構造の血管密度の有意な減少によって証明することができます。臨床応用に関しては、前炎症性抗血管新生のGTPase GBP-1は、 例えば 、抗血管新生療法の新たな道を開くことができます。、癌または他の疾患53。この研究に基づいて、AVループモデルは、病理学を確立するために使用することができると考えられますさらなる分析および可能な変調のための血管新生ネットワーク。例えば、このモデルは、腫瘍血管新生、その影響因子などのEPC、腫瘍細胞および細胞54を幹として腫瘍血管網の形成に関与する異なる細胞の正確な役割のよりよい理解を得るために最適な機会を提供する。 インビボ癌モデルしばしばプロセスと異なるヒトの癌の型の増殖特性をシミュレートするために遺伝的に改変されたマウスで行われ、薬物の開発および前臨床試験55のために優れていることが証明されています。さらに、このような免疫不全マウス56などの実験動物に腫瘍を移植する異種移植モデルがあります。より臨床的に関連するアプローチは、「パーソナライズマウスモデル」または「患者由来の腫瘍異種移植片モデル」57として知られている、患者の腫瘍からの移植を含みます。しかし、これらのモデルは、INFLを研究するための実用的ではありません周囲の組織からの影響のない1つの単一細胞源または増殖因子のuence。

AVループモデルは、腫瘍生物学を研究するために、組織工学的手法を使用することができます。これはGhajar による「腫瘍エンジニアリング」と定義されます。 58「複数のスケールに腫瘍の発生、進行、および治療のダイナミクスを研究するためにin vivoでの腫瘍微小環境の側面を再現複雑な培養モデルの構築」を伴います。腫瘍環境は、細胞 - 細胞相互作用、血管形成、変調、増強および阻害の正確な分析を可能にする、単離された注入チャンバー内で構築することができます。また、AVループモデルは、血管新生の中断または腫瘍増殖の阻害に関する治療法の開発や検証のために有益で証明することができます。

血管新生を誘導するためのこのアプローチを用いて、エンジンEすることが可能です臨床的に関連するサイズのR組織。さらなる研究では、我々は12週59,60の比較的短い時間で約15cm³のかなりのボリュームで移植のための軸方向に血管新生骨組織を生成することができました。臨床診療へのこれらの結果を翻訳するために、脛骨欠損モデルを使用して原理研究の証明は、従来、ヒトにおける適用のために、近い将来に行われます。最初のステップとして、我々は成功し、長期安定性61の臨床シナリオで大量の欠陥にその場で骨組織工学実証することができます。記載AVループモデルを適用することは、個々の患者の要求に合わせた治療を提供することが可能であることができます。我々の結果に基づいて、人間の体自体が生きたバイオリアクターとしてのアイデアは、まだ将来のために非常に有望です。

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Acknowledgements

私たちは、AVループ研究を支援するために、次の機関に感謝したいと思います:ステッドラー財団、博士フリッツエルラーフォン、ジェンダーと多様性のためのエルスクローネFesenius財団、バクスター・ヘルスケア社、DFG、IZKF / ELAN / EFI /オフィス、Forschungsstiftung Medizin 、エアランゲン・ニュルンベルク(FAU)、AO財団、マンフレッド・ロス財団、雪香港、ハンス・ゲオルク・ガイス財団、ドイツ学術交流会(DAAD)、ドイツ、および高等教育省と科学研究、イラクのフリードリヒ・アレクサンダー大学。私たちは、その優れた技術サポートのためのステファン・フライシャー、マリーナミルデ、カトリン・コーンとイルゼアーノルド・Herberthに感謝したいと思います。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9% sodium chloride Berlin-Chemie AG 34592508
11-0 Ethilon / polyamide 6/6 Ethicon EH7438G
4-0 Vicryl / polygalactin 910 Ethicon V392H
6-0 Prolene / polypropylene Ethicon 8695H
aluminium spray Pharma Partner Vertriebs-GmbH 1020
antiseptics  BODE Chemie GmbH 
Catheter  B Braun Meslungen AG 4251612-02
contrast agent Flowtech  MV-122
embutramide, mebezonium iodide, tetracaine hydrochloride injectable solution  Intervet International GmbH
encre de chine intense Indian ink Lefranc & Bourgeois
Enrofloxacin Bayer AG
eye ointment Bayer AG
Formalin 4% Carl Roth GmbH & Co. KG P087.4
Heparin Ratiopharm GmbH
isoflurane  Abbott Laboratories 6055482
Lewis rat, male Charles River Laboratories
Metamizol-Natrium  Ratiopharm GmbH
papaverine / Paveron N Linden Arzneimittel-Vertrieb-GmbH
tramadol / Tramal Grünenthal GmbH

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