Den Arteriovenøs (AV) Loop i et lite dyr modell for å studere Angiogenese og vaskularisert Tissue Engineering

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Vi beskriver et mikrokirurgisk metode for generering av en arteriovenøs (AV) sløyfe som en modell for å analysere vaskularisering in vivo i et isolert og godt karakterisert miljø. Denne modellen er ikke bare nyttig for etterforskningen av angiogenese, men er også optimalt egnet for ingeniør aksialt vaskularisert og trans vev.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Weigand, A., Beier, J. P., Arkudas, A., Al-Abboodi, M., Polykandriotis, E., Horch, R. E., Boos, A. M. The Arteriovenous (AV) Loop in a Small Animal Model to Study Angiogenesis and Vascularized Tissue Engineering. J. Vis. Exp. (117), e54676, doi:10.3791/54676 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

De fleste vev og organer i menneskekroppen er avhengig av en funksjonell blodkar som forsyner næringsstoffer, utveksler gasser og fjerner avfallsprodukter. Funksjonsfeil av dette system som følge av lokale eller systemiske vaskulære problemer kan føre til en rekke alvorlige sykdommer. Videre, i forskningsområder som tissue engineering eller regenerativ medisin, er en funksjonell blodåre nettverk innen kunstig generert vev eller transplanterte organer uunnværlig for vellykket klinisk anvendelse.

I flere tiår har forskere undersøkt de eksakte mekanismene som er involvert i den voksende blodkar til å få dypere innsikt i patologiske situasjoner for å finne nye terapeutiske intervensjoner og gi bedre forebygging av vaskulære lidelser. I det første trinnet, blir grunnleggende prosesser som celle-celle interaksjoner eller effekten av molekyler på celler i den vaskulære system vanligvis undersøkt ved in vitro 2D eller 3Deksperimenter. Tradisjonelle 2D modellene er enkle å utføre, er godt etablert og har i stor grad bidratt til en bedre forståelse av disse prosessene. For første gang i 1980, Folkman et al. rapporteres in vitro angiogenese såing av kapillære endoteliale celler på gelatin-belagte plater 1. Dette ga umiddelbart måte til utgivelse av et mangfold av ytterligere 2D angiogenese eksperimenter på endotelcelle rør formasjon assay 2, migrasjon analysen 3 og ko-dyrking av ulike celletyper 4, så vel som andre. Disse analysene er fortsatt brukes i dag og akseptert som standard in vitro metoder.

Dette er imidlertid eksperimentelle oppsettet ikke alltid egnet for studier av in vivo-celle oppførsel siden de fleste celletyper krever en 3D-miljø for dannelse av aktuelle fysiologiske tissuestrukturer 5. Det kan vises at arkitekturen i 3D matrix er avgjørende for kapillær morphogenesis 6 og at celle-ekstracellulær matriks (ECM) interaksjoner og 3D dyrkningsforhold regulere viktige faktorer involvert i tumor angiogenese 7. 3D-matrise gir kompliserte mekaniske innganger, kan binde effektor proteiner og etablere vev stilt oppløst stoff konsentrasjons gradienter. Videre er det anses nødvendig for å etterligne in vivo morfogenetiske og ombygging trinn i komplekse vev 5. I disse systemene kan både angiogenese og vaskulogenese skal studeres. Mens angiogenese beskriver spirende av kapillærer fra på forhånd eksisterende blodkar 8, refererer til vaskulogenese de novo dannelsen av blodkar gjennom endotelceller eller deres forløpere 9,10. Modning av skip er beskrevet i en prosess som kalles 'arteriogenesis "via rekruttering av glatte muskelceller 11. En typisk angiogen in vitro-modell er det spirende av endotelceller fra eksisterende monolags sådd ut som et monolag på gel-overflater, på overflaten av mikrokulene innleiret i en gel eller ved å bygge endotelcelle sfæroider 12. I vaskulær modeller enkelt endotelceller blir innfanget i en 3D-gel. De kommuniserer med tilstøtende endotelceller til å danne vaskulære strukturer og nettverkene de novo, typisk i kombinasjon med støttelegemer 12.

Men selv komplekse 3D in vitro-modeller kan ikke etterligne in vivo innstillingene helt gitt mangfoldet av celle-celle og celle-ECM interaksjoner 13. Stoffer med høy aktivitet in vitro ikke automatisk viser de samme effektene in vivo og vice versa 14. For en omfattende analyse av vaskularisering behandler det er et presserende behov for å utvikle in vivo modeller som bedre simulerer situasjonen i kroppen. Et stort utvalg av in vivo angiogenese-analyser er beskrevet i litteraturen, inklusivedama chorioallantoic membran assay (CAM), sebrafisk modellen, korneal angiogenese analysen, dorsal luftsekken modell, dorsal skinfold kammeret, de subkutane tumormodeller 14. Imidlertid er disse analysene ofte forbundet med begrensninger, for eksempel raske morfologiske endringer, problemer i sært nye kapillærer fra allerede eksisterende i CAM-testen, eller den begrensede plassen i hornhinnen angiogenese analysen 15. Videre er ikke-pattedyrsystemer anvendt (f.eks., Sebrafisk modell 16), som fører til problemer i xenotransplantasjon 17. I det subkutane tumormodell, kan angiogenese stammer bare fra selve tumoren ikke bli analysert ettersom det tilstøtende vev i stor grad bidrar til vaskularisering prosessen. Dessuten kan det omkringliggende vevet har en avgjørende rolle i utformingen av svulsten mikromiljøet 18.

Ikke bare for å studere angiogenese eller vaskulogenese er det en sterk need for en standardisert og godt karakterisert in vivo modell, men også for å studere ulike vaskularisering strategier i tissue engineering og regenerativ medisin. I dag er det generering av komplekse kunstige organer eller vev mulig både in vitro og in vivo. 3D bioprinting gir en on-demand fabrikasjon teknikk for generering av komplekse 3D-funksjonell levende vev 19. Videre kan bioreaktorer bli brukt for å generere vev 20 eller til og med eget legeme kan benyttes som bioreaktor 21. Men det viktigste barrieren for vellykket anvendelse av kunstig generert vev er mangelen på vaskularisering i løpet av de modifiserte konstruksjoner. Umiddelbar tilknytning til vertens blodkar etter transplantasjon er en viktig forutsetning for å overleve, særlig i tilfelle av store kunstige vev eller organer.

Ulike in vitro eller in vivo prevascularization strategier var utvikviklet for å etablere en funksjonell mikrovaskulaturen i konstrukter før implantering 22. Implantasjon av et stillas med in vitro på forhånd dannede konstruerte kapillærer på rygghuden av mus førte til hurtig anastomose av blodkar mus i løpet av en dag 23. I motsetning til dette, en sfæroide ko-kultur bestående av humane mesenchymale stamceller og humane umbilikalvene endotelceller sammen til et tredimensjonalt nettverk prevascular utvikles videre etter implantering in vivo. Imidlertid anastomose med verten vaskulaturen var begrenset 24. Fremfor alt, i dårlig vaskularisert defekter, slik som nekrotiske eller bestrålte områder, denne såkalte ytre vaskularisering - innvekst av fartøyer fra området til skafottet - mislykkes ofte. Intrinsic vaskularisering, på den annen side, er basert på en vaskulær akse som en kilde av nye kapillærer sprouting inn i stillaset 25. Ved hjelp av den aksiale vaskularisering tilnærmingDen utviklet vev kan transplanteres med sine vaskulære aksen og koblet til lokale fartøyer på mottakeren nettstedet. Umiddelbart etter transplantasjon, er vevet tilstrekkelig støttet av oksygen og næringsstoffer, som skaper de rette forholdene for optimal integrasjon.

På grunn av den begrensede tilgjengeligheten av modeller for å undersøke in vivo angiogenese og i erkjennelse av den økende betydningen av å generere aksialt vaskularisert vev, utviklet vi mikrokirurgisk tilnærming av Erol og Spira videre å generere en arteriovenøs (AV) loop i dyremodell 26. Bruken av en helt lukket implantering kammer som gjør denne fremgangsmåten meget godt egnet for å studere blodkardannelse under "styrt", vel karakterisert v in vivo betingelser (figur 1). Denne modellen er ikke bare nyttig for undersøkelse av angiogenese, men er også optimalt egnet for den aksiale vaskularisering av stillas for vev Engineering formål.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

The Animal Care komiteen av Friedrich-Alexander University of Erlangen-Nürnberg (FAU) og regjeringen i Middle Franconia, Tyskland, godkjent alle forsøkene. For forsøkene hann Lewis-rotter med en kroppsvekt på 300 - 350 g ble anvendt.

1. Arteriovenøs Loop Model i Rat

  1. Implantasjon Prosedyre (figur 2)
    1. For anestesi bruke en spesiell plast boks som er koblet via røret til isofluran vaporizer og lukket med et lokk. Slå på tilførsel av gass og flyt meter mellom 0,8 til 1,5 l / min.
    2. Plasser rotte i induksjon plastboks og forsegle toppen. Slå på isofluran vaporizer til 5%.
    3. observere nøye rotte under induksjon av anestesi. Etter 3-4 min, vil rotten bedøvet.
    4. Bekreft riktig anestesi: tap av stabiliseringsrefleks, tap av palpebral refleks, tilbaketrekking refleks, positiv hornhinnen refleks.
    5. Ta rotta ut av esken og kontrollervekt for beregning av narkotika. Påfør øye salve for å hindre tørrhet mens under anestesi.
    6. Administrere smertestillende medikamenter og antibiotika (f.eks., 7,5 mg / kg Enrofloxacin subkutant (sc), 12,5 mg / kg tramadol og 100 mg / kg metamizol både intravenøst (iv)). Administrere vekt-tilpasset krystalloider under drift (f.eks., 30 ml / kg sc).
    7. Plasser rotte på ryggen på en varmeplate ved 37 ° C under anestesi med 1 - 2% isofluran inhalasjon administreres via maske.
    8. Overvåk anestesi riktig og øke isofluran anestesi hvis nivået er for lavt (bevegelse av rotte, responsen på smerte, kjeve tone, uten tap av reflekser (se 1.1.4.), Hjertefrekvensen øker). Vær forsiktig med å overdosere isofluran (tap av hornhinnen reflekser, høy puls, redusert oksygenmetning). Bruk en spesiell pulsoksometri for små dyr for å kontrollere oksygenmetning (95 - 100%) og hjertefrekvens (250-450 / min) til rotten. I løpet av de operatipå overvåke temperaturen i rotte (36 - 40 ° C) og justerer temperaturen på varmeplaten om nødvendig.
    9. Barbere innsidene av baklemmene med en elektrisk barberhøvel og desinfisere området med antiseptiske midler. Spre baklemmene og fikse dem med tape.
    10. Lå rotte under et kirurgisk mikroskop og dekke rotte med sterile drapering. Sørg for at hele operasjonen prosedyren utføres under sterile forhold.
    11. Åpne huden på midten av venstre lår med et langsgående innsnitt fra det øvre kneet til lysken ved hjelp av en skalpell (No. 10).
    12. Skjær underhud og konseptet i lag med ca 3 cm i lengde ved hjelp dissekere saks og microforceps inntil femoral vaskulær bunt er utsatt fra bekkenarterien i lysken til forgreningen av femoral arterien i kneet.
    13. Skill fartøyene og fjern adventitia hjelp adventitia saks og microforceps.
    14. Koagulere side brancher bruker elektrisk koagulasjon. Dekk drift feltet med en fuktig kompress.
    15. Åpne huden på høyre side som på venstre side, 1.1.11 - 1.1.14.
    16. For høsting av venøse pode, ligate den høyre lårvenen ved elektrisk koagulering på den proksimale og distale ender i en avstand på 1 - 1,5 cm.
    17. Ta av venøs pode med microforceps og skyll venøs pode med en heparin-løsning (50 IE / ml i 0,9% natriumklorid oppløsning) ved hjelp av en vanning kanyle og overfør den til venstre lår. Dekk til drift feltet på høyre side med en fuktig kompress.
    18. Ligere lårvenen på venstre side proksimalt i lyskeområdet med en microvessel klemme. Koagulere lårvenen distalt av elektrisk koagulering i det øvre kne for forgrening, i en avstand på ca 2 cm.
    19. For anastomose koble den proksimale enden av den venøse pode med den proksimale ende av venen ved ende-til-ende-anastomose med en 11-0 suture. Bruk ca 8 avbrutt sting. Begynn med å plassere de to første sting på klokken 12 og 6 stillinger. Deretter satte i 2 til 3 flere sting mellom disse punktene på forsiden og deretter sette 2 til 3 flere sting i baksiden.
    20. Ligere lårarterie på samme måte som beskrevet for den femorale vene (1.1.18.). Sørg loop fartøyene ikke er vridd. Anastomose den distale ende av den venøse pode med den proksimale enden av arterien som beskrevet for den femorale vene (trinnene 1.1.19.).
    21. Administrere 25 IE heparin intravenøst. Kontroller igjen at sløyfe fartøyene ikke er vridd, Fjern klemmene og se etter lekkasjer og åpenheten av loopen i ca 5 min.
    22. Dribble papaverin (f.eks 4 mg / ml) på skipene for å hindre vaskulære spasmer. Hvis det er åpenhet, utvider sløyfen og pulsen av arterien kan observeres.
    23. Forhåndsutfyll implantasjon kammer med første halvår (500 mL) av matrisen (f.eks </ Em>, en hydrogel eller et ben matrise med eller uten celler). Embed løkken inn implantasjon kammeret.
    24. Fyll implantasjon kammeret med den andre halvdel av matriksen til et totalt volum på 1000 pl. Forsegle kammeret med kammeret lokk.
    25. Fest implantasjon kammer på låret med en ikke-absorberbare 6-0 sutur. Fix kammeret lokket med en ikke-absorberbare 6-0 sutur. Stopp mulig blødning med elektrisk koagulasjon.
    26. Lukk huden med absorberbare 4-0 sting. Dekk såret med aluminiumsspray.
    27. Administrere antibiotika og smertestillende (for eksempel 7,5 mg / kg Enrofloxacin fm, tramadol 12,5 mg / kg per os (po) (gjennom drikkevann) i 3 - 5 dager, og etterpå avhengig av oppførselen til rotte).
    28. Slå vaporizer av og la rotta å puste tilførsel gass til den begynner å våkne.
    29. Plasser rotte i en boks med termisk støtte og observere den forsiktig til den er helt restituert.
    30. Ikke la rotte undeltok inntil den har gjenvunnet nok bevissthet til å opprettholde sternal recumbency.
    31. Ikke returnere rotte til selskap med andre dyr før fullt restituert.
  2. Forklaring Prosedyre
    1. Utfør explantation etter kort tid eller lang tid implantasjon (ifølge studien design, for eksempel kan du se referanser 27-32). Anesthetize rotte i henhold til trinn 1.1.1.-1.1.9.
    2. Åpne huden på magen med en skalpell (No. 10) og bevege tarmen til side med en kompress. Utsette abdominal aorta og vena cava caudalis bruker bomullspinner.
    3. Cannulate abdominal aorta (f.eks., 24 sporvidde plast kanyle) og kutte vena cava caudalis med dissekere saks.
    4. Spyl den abdominale aorta med 0,9% natriumklorid-løsning inneholdende 100 IU / ml heparin til den lekkende væske er klar. Perfuse aorta med 30 ml perfusjon løsning (f.eks., Kontrast agent eller India ik).
    5. Avlive rotte ved injeksjon av en dødelig dose av embutramid, mebezonium jodid, tetrakain hydroklorid injiserbar oppløsning (0,1 til 0,2 ml / kg) i dyp anestesi.
    6. Ligate abdominal aorta og vena cava caudalis med en ikke-absorberbare 4-0 sutur.
    7. Lukk det åpne såret med 1 - 2 klemmer. Oppbevar rotte i 24 timer ved 4 ° C (herding av perfusjon løsning).
    8. Plasser rotte på ryggen. Spre baklemmene og fikse dem med tape.
    9. Åpne huden over kammeret med et langsgående innsnitt med en skalpell (No. 10).
    10. Fjerne bindevevet fra kammeret og sløyfen pedicle ved hjelp disseksjonssaksen og microforceps. Skjær sløyfen stilken i en avstand på 1 cm fra kammeråpningen med disseksjonssaksen og fjerne kammeret.
    11. Åpne lokket av kammeret og forsiktig fjerne konstruksjonen fra kammeret med pinsett og løse det i 4% bufret formalinoppløsning i 24 timer ved værelsestemperatur. Etterpå bruker konstruksjon for 3D mikro-computertomografi eller parafin-embedded for histologisk analyse 30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

tissue Engineering
For benvev tekniske formål, ble en rekke forskjellige skjeletterstatninger implantert i små dyr rotte AV sløyfe modell 27,28,33,34. Vaskularisering kan perfekt påvises ved 3D mikro-computertomografi (micro-CT) (figur 3A). Vaskularisering av en bearbeidet storfe cancellous bein (PBCB) matrise var signifikant høyere i loop gruppen sammenlignet med gruppen uten vaskularisering. En stadig voksende og foreldrekontroll blodåre nettverk utvikles innenfor implantasjon kammeret over 8 uker. Mellom 4 og 8 uker, ble kontinuerlig vekst av vaskularisert vev mot midten av konstruksjonene ikke observert, mens ingen økning ble påvist i ikke-vaskularisert gruppe 33. Prevascularization av PBCB matrisen i 6 uker i AV-sløyfe-modellen førte til overlegen overlevelse av de injiserte osteoblaster sammenlignet med kontroll osteoblaster. I motsetning til kontrollgruppene, ble ekspresjon av ben-spesifikke gener påvist i AV-sløyfe gruppe med implanterte osteoblaster 28. Som en ytterligere matrise, ble sintret bioaktivt glass sammen med fibringel implantert i AV ledd av rottene. Etter 3 uker, har et tett nettverk av nydannede fartøy utviklet demonstrert av mikro-CT og histologi 27.

Implantasjonen kammeret ble modifisert for å akselerere stillaset vaskularisering. Ved å bruke en perforert titan kammer, ble egenverdi vaskularisering støttet av ytre fartøy fra omkringliggende vev. På bare 2 uker etter implantasjon av et β-trikalsiumfosfat hydroksyapatitt (β-TCP / HA) / fibrin-matrise, ble 83% av fartøyene koblet til AV sløyfe med kontinuerlig økning over tid og nådde 97% forbindelse etter 8 uker 34. Ved implantering av 5 x 10 6 benmarg avledet stamceller (MSC) og benmorfogenetisk protein 2 (BMP-2), en betydelig økning i bendannelse i forhold til BMP-2 eller MSC alene gruppene kan bli indusert. Ved 6 og 12 uker, fibrin-matrise var fullstendig nedbrutt og erstattet med meget vaskularisert bindevev i alle grupper (figur 3B 6 ukers implantering). Det var en betydelig reduksjon i beholder nummer i BMP-2 / MSC gruppe mellom 6 og 12 uker, og etter 12 uker i de andre gruppene. Dette var sannsynligvis på grunn av modning av vaskulære nettverk eller den kompakte anordning av beinstrukturer som fører til en begrenset vaskulær nettverkdannelse 32.

Foruten bein, kan andre vev som muskel eller lever også være konstruert i AV sløyfe modell.

For ingeniør aksialt vaskularisert muskelvev, ble eksperimenter med primær myoblasts i en AV-sløyfe fibrin matrisen utført. Etter en prevascularization tid på 2 uker til 2, 4 og 8 uker, ble 1 x 10 6 myoblaster transplantert inn i AV-løkke kammeret. Transplanterte myoblasts kan bli oppdaget på nytt, selv etter 8 uker ved hjelp carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFDA) merking. Cellene beholdt sin myogenisk fenotype i den fibrin-matrise og ekspresjon av muskel-spesifikke markører MEF-2 og desmin var positivt etter 4 uker. Imidlertid myogenic da genekspresjon var negativ etter 8 uker, som var sannsynligvis på grunn av fravær av myogeniske stimuli og rask absorpsjon av den fibrin-matrise 35. For å øke myogenic stimulering, ble en ny modifikasjon av rotte AV sløyfen utviklet ved hjelp av magesekkens blodåre i stedet for saphena-vene for å oppnå en mer proksimal posisjonering av isolasjonskammer. Derfor, tilleggs inkorporering av obturatoren motor nerve ble geometrisk lettes. Ved å bruke denne AV løkke modifikasjon, som er referert til som EPI sløyfe, kan vi vise myogenisk differentiation av co-implantert myoblasts og MSC 36.

For lever tissue engineering 4 x 10 6 PKH-26 merkede føtale leverceller ble transplantert i en fibrin matrise i rotte AV sløyfe modell for 2 uker. I kontrollgruppen ble det matrikser uten en AV-løkke og cellefrie matriser implantert. Funksjonelle kapillærer oppsto fra AV-sløyfe fartøyene og sterkt vaskularisert neo-vev ble observert i kammeret etter 14 dager etter implantering, slik som vist ved CD31-farging og India blekk merking. Det var ingen forskjell mellom de cellefrie og hepatocytt AV sløyfe gruppe. AV-sløyfe vaskularisert den fibrin-matrise tett og levedyktige føtalceller kunne påvises etter explantation ved positiv PKH-26-farging og levercellespesifikke cytokeratin 18 (CK-18) immunohistologi hovedsakelig i nærhet av den store vaskulære aksen. mRNA nivåer av CK-18 ble forhøyet i AV-sløyfe cellegruppe. I motsetning til dette, ikke CK-18 expression kunne påvises i konstruksjoner uten en løkke eller celler 37.

angiogenese studier
AV-sløyfe består av tre segmenter: venen, den arterielle graft og interpositional venøs pode (IVG) segment (figur 1). Tredimensjonal evaluering av det vaskulære system viste at nydannede fartøy stammer både fra den venøse og arterielle del så vel som fra den venøse interponate. Det ble observert et stort antall nydannede fartøy fra IVG 33. Med in vivo MRA, scanning elektronmikroskopi av korrosjons avstøpninger og immun histologi, ble det observert angrep av angiogenese i en fibrin-matrise mellom dag 10 og 14. Fremfor alt er den venøse og IVg segmenter ga opphav til mange kapillarer og større fartøyer. En gradvis reduksjon i luminal kaliber som et tegn på arterialization av IVG på grunn av økningen i endovaskulær trykk og skjærspennings was oppdaget fra dag 7 på 38. I videre studier, kan det bekreftes at vaskulær spirende skjer hovedsakelig ved ikke-arterielle graft 39.

Den nøyaktige analyser av angiogenese prosesser og stimulering og inhibering av blodkardannelse kan bli visualisert i AV sløyfen implantasjon kammer. Den vekstfaktorer vaskulær endotelial vekstfaktor A (VEGFA) og basisk fibroblast vekstfaktor (bFGF) induserte en høyere absolutt og relativ vaskulær tetthet og raskere resorpsjon av den fibrin-matrise i forhold til vekstfaktor-fri kontroll gruppe 31. Videre ble ombygging fenomener og modning av vaskulær nettverk innen isolering kammer visualisert over en implantering periode på 8 uker. I AV sløyfe kammer prosesser intercapillary samtrafikk og intussusceptive angiogenese samt mulig lymfatisk vekst ble identifisert immunohistologically som parametre for neovascular modning 39. Ved å anvende PHD (prolylhydroksylase domene) inhibitor DMOG (dimethyloxallyl glycin) systemisk i rotter, kunne det bli vist at konsentrasjonen av den hypoksi-induserbar faktor alfa (HIF-α) korrelerer med økende vaskularisering i AV-sløyfen og er en stimulans for fartøy utvekst 40.

Figur 1
Figur 1:. Scheme av en AV Loop i Rat Model AV-sløyfe består av tre segmenter: venen (V), den arterielle (A) pode og interpositional venøs pode (IVG) segmentet. AV-sløyfe kan bygges inn i en lukket implantasjon kammer (C) for induksjon av iboende vascularization. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

ge = "1"> Figur 2
Figur 2: AV Loop Drift i rotte (A):.. Lokalisering av femoral bunt på den indre side av baklemmene i rotte (B / C): Fremstilling av femoral vaskulær bunten i venstre og høyre lyske av rotte. Skipene er separert (D), den interpositional blodåre graft er høstet fra høyre side (E) og anastomoseres med femoralvenepunksjon (F) og lårarterie av venstre side inn i en AV-sløyfe (G, pilen indikerer anastomoser). Sløyfe fartøyene blir overført til implantering kammeret på forhånd fylt med en matrise (H) og etter fullstendig fylling (I) lokket er lukket (J). A = lårarterie, V = femoralvenepunksjon, N = femoral nerve, IVG = interpositional venøs pode. Scale bar 5 mm (DJ).tp_upload / 54676 / 54676fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3: Visualisering av vaskularisering i rotte AV Loop Model (A). Mikro-CT etter perfusjon med et kontrastmiddel (gul perfusert fartøy) (B):. Hematoxylin-eosin-farging av en β-TCP / HA bensubstitutt med MSC implantert i aV-løkke i rotte som modell i 6 uker. AV-sløyfe fartøyene er dynket med tusj (svart farge). Scale bar 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I over et tiår har vi med hell brukt arteriovenøs (AV) sløyfe for tissue engineering formål og studere angiogenese in vivo i den lille dyremodell. Vi kunne vise at dette mikro modellen er svært godt egnet for prosjektering forskjellige vev, og at det også kan brukes for angiogenese eller antiangiogenesis studier.

Betydningen av Technique For eksisterende / alternative metoder
Konstruert vev eller organer krever en funksjonell blodåre nettverk for å levere næringsstoffer og oksygen de trenger for å overleve og vellykket integrering etter transplantasjon inn i det defekte området 41. En rekke ulike prevascularization strategier har blitt utviklet i løpet av de siste tiårene, noe som kan bli differensiert i henhold til in vitro vs. in vivo og ytre vs. iboende tilnærminger.

Stillaser kan være fabricated med rørformet formede strukturer og sådd med vaskulære celler som endotelceller eller progenitorceller in vitro 42. På den annen side, for in vivo prevascularization, blir stillasene implantert i et sterkt vaskularisert område, for eksempel subkutant eller muskelvev 21. Etterpå kan disse extrinsically vaskulariserte konstruksjonene bli transplantert inn i det defekte område. Imidlertid er ulempen med disse metodene er den manglende mikro forbindelse med mottakerens fartøy etter transplantasjon. Særlig i tilfelle av store konstruksjoner, i umiddelbar tilknytning til verts blodkar avgjørende for umiddelbar tilførsel av den manipulerte vev 43. Den åpenbare og mest lovende løsning på dette problemet ligger i genereringen av en egen vaskularisert vev eller organ av en vaskulær akse, slik som det AV sløyfe modell.

Foruten ved hjelp av AV sløyfe-metode som beskrevet ovenfor, aksial vaskularisering kan alså fremkalles ved hjelp av AV-bunter istedenfor 44 eller bare ett fartøy slike som magesekkens arterien 45. Men i flere publikasjoner AV sløyfen modellen vist seg å være overlegen med hensyn til grad av vaskularisering og mengden av de novo vev formasjon. Tanaka et al., Sammenlignet både arbeidsmåter og observert signifikant høyere dannelse vev og en større grad av utvikling av kapillærer i sløyfen i forhold til bunten gruppen 46. Dong et al. også gjennomført en studie ved hjelp av AV loop eller AV bunt tilnærminger for bein tissue engineering i en kanin modell, som også viste signifikant høyere vaskulær tetthet i loop i forhold til bunten gruppen 47. Vi var i stand til å bekrefte disse resultatene samt vise i en tidligere studie at AV-sløyfe-modellen har en høyere kapasitet for angiogenese 48.

Så langt vi kjenner til, er det ingen tilsvarende modell for å analyserevaskularisering in vivo i et isolert og godt karakterisert miljø. Derfor, representerer AV sløyfen modellen et kraftig verktøy for å evaluere hvordan ulike celletyper eller vekstfaktorer bidrar til fartøyet nettverkdannelse eller vaskularisering prosesser i forskjellige vev uten forstyrrelser fra omkringliggende strukturer, slik som invaderende celler eller vekstfaktorer.

Begrensninger av teknikken
Men en betydelig utfordring av den foreslåtte modellen er høy kompleksitet av operasjonen. For en, behandling av defekter ved hjelp av AV-sløyfe-modellen krever en to-trinns prosedyre - prevascularization av stillaset og transplantasjon inn i det defekte område. Dette medfører at pasienten må gjennomgå to operasjoner. I tillegg mikro ferdigheter er en nødvendig forutsetning for vellykkede anastomosering Submillimeter fartøy 49. Derfor er det AV bunten ofte ansett som mer anvendelige for klinisk anvendelse, siden jegt tilbyr også lovende, men mindre, potensial for angiogenese og vev generasjon i forhold til AV sløyfe 46. Imidlertid kan denne operasjonen læres steg-for-steg selv av ikke-kirurger, ved hjelp av små kaliber silisium rør for trening i begynnelsen og etterpå fartøyene av døde dyr (for eksempel kylling ben) før du gjør AV-sløyfe drift i en levende dyr. I kontrast, kan de fleste praktiserte mikro kirurger utfører denne operasjonen med bare en kort tid med trening.

Kritiske trinn i protokollen
Generelt, på grunn av liten kaliber av fartøyene er det en risiko for trombedannelse og lukking av sløyfe fartøy. Men i rottemodell 80% -100% av løkkene i gjennomsnitt ble patent ved hjelp av kun kort tid heparin etter operasjonen 28,30,31,34,38,39.

Videre, på grunn av den høye kompleksiteten av operasjonen vil det ta et par timer (avhengig av than kompetanse til kirurgen). Det er viktig å kontrollere riktig bedøvelse av dyr under hele operasjonen, og for å levere tilstrekkelig infusjon for å opprettholde en adekvat blodtrykket. I den postoperative perioden er det svært viktig å sjekke helsen til dyret flere ganger, for å administrere smertestillende / antibiotika og for å kontrollere driften såret. Siden i de fleste tilfeller implantasjon av et isolert kammer er utført, er det mulig at infeksjon i det indre av kammeret skjer uten merke. Derfor er det svært viktig å opprettholde sterilitet under hele operasjonen og administrasjon av antibiotika bør nøye gjøres over en periode på 3 - 5 dager.

Endringer av protokollen
Kammeret kan justeres individuelt til størrelsen og formen på mangelen. Videre er også membraner kan anvendes for å omslutte AV sløyfe som utføres av Manasseri et al., 50. I tillegg stillaset, supplemented celler og vekstfaktorer kan velges i henhold til de forskjellige vevstyper. Nylig Miomas et al. Kombinerte genet terapeutiske tilnærminger hell med AV-sløyfe-modellen og kan indusere forbedring av fartøy vekst ved transduksjon med VEGF165 51. Nylig har vi justert rotte AV sløyfe modell for muskelvev tekniske formål. I stedet for de femoral fartøy, ble magesekkens venen og saphenous arterie brukt, som gjorde implantasjon av tetningsmiddelet nerve i aksialt vaskularisert stillas for motorisk innervasjon ( "EPI sløyfe-modellen") 36. Foruten implantasjon av en motorisk nerve, den neurotization av benvev konstruert konstruksjoner med sensoriske nerver er rapportert å være fordelaktig for forbedret osteogenesis og bedre reparasjon av bendefekter 52. AV-sløyfe induserer minimal donor området sykelighet og kan lages på ulike områder av kroppen 52. Det vil være mulig å bruke overfladiske kar på andre områder avlegemet for generering av AV-sløyfe eller til og med å benytte andre dyr slik som kanin eller mus-modellen.

Fremtidige søknader eller Veibeskrivelse Etter å mestre denne teknikken
Nylig, vår arbeidsgruppe implantert et godt karakterisert murine embryonal endothelial stamcelle (EPC) linje (T17b) uttrykker guanylate bindende protein-1 (GBP-1) - en markør og intracellulær hemmer av endotelcelle funksjoner som spredning, migrasjon og invasjon - i rotte aV sløyfe modell. Den antiangiogene kapasitet på differensiert GBP-1-EPC kan bli vist ved en signifikant reduksjon av blodårer tetthet i AV-sløyfe konstruksjoner. Med hensyn til klinisk anvendelse, kunne proinflammatory antiangiogene GTPase GBP-en åpner opp nye muligheter for antiangiogenic behandling, f.eks., For kreft eller andre sykdommer 53. Basert på dette studium kan det tenkes at AV sløyfe modellen kan brukes til å etablere en patologiskvaskularisering nettverk for videre analyse og mulig modulasjon. For eksempel, gir denne modellen en optimal mulighet til å få en bedre forståelse av tumor angiogenese, dens påvirkende faktorer og den nøyaktige rollen til de forskjellige celler som er involvert i tumor kar nettverksdannelse, for eksempel EPCs, tumorceller og stamceller 54. In vivo-cancermodeller blir ofte utført i genetisk modifiserte mus for å simulere prosesser og vekstkarakteristika i forskjellige humane krefttyper, og har vist seg å være utmerket for legemiddelutvikling og prekliniske studier 55. Videre er det xenograft-modeller for omplanting tumorer i forsøksdyr, slik som immunkompromitterte mus 56. En mer relevant klinisk tilnærming involverer transplantasjon fra pasientens tumor, kjent som «tilpassede musemodeller" eller "pasientavledet tumorxenografter modeller" 57. Men disse modellene er ikke praktisk for å studere inflinnflytelse av en enkelt celle kilde eller vekstfaktor uten effekter fra omkringliggende vev.

AV-sløyfe Modellen gjør det mulig å bruke vev tekniske metoder for å studere tumorbiologi. Dette er definert som "tumor Engineering" av Ghajar et al. og involverer "bygging av sammensatte kulturmodeller som rekapitulere aspekter ved in vivo tumor-mikromiljøet for å studere dynamikken i tumorutvikling, progresjon, og terapi på flere skalaer" 58. En tumor miljø kan konstrueres innenfor det isolerte implantering kammeret, noe som gir en nøyaktig analyse av celle-celleinteraksjoner, angiogenese, modulering, forsterkning og hemming. Videre kan AV-sløyfe modell vise seg å være fordelaktig for å utvikle eller validere terapier om avbrytelse av neoangiogenesis eller inhibering av tumorvekst.

Ved hjelp av denne metode for indusering av vaskularisering, er det mulig å engineer vev i en klinisk relevant størrelse. I ytterligere studier, var vi i stand til å generere aksial vaskularisert benvev for transplantasjon med et betydelig volum på ca. 15 cm³ i en forholdsvis kort tid av 12 uker 59,60. For å oversette disse resultatene til klinisk praksis vil et bevis for prinsippet undersøkelse ved hjelp av tibia defekten modellen utføres i nær fremtid tidligere for anvendelse i mennesker. Som et første skritt, kan vi med hell demonstrere in situ benvev engineering i et stort volum defekt i en klinisk scenario med langsiktig stabilitet 61. Bruk av den beskrevne AV sløyfe-modell gjør det mulig å gi en behandling tilpasset den enkelte pasients behov. Basert på våre resultater ideen om menneskekroppen i seg selv fungerer som en levende bioreaktor fortsatt har store løftet for fremtiden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Vi ønsker å takke følgende institusjoner for å støtte vår AV sløyfe forskning: Staedtler Stiftung, Dr. Fritz Erler Fonds, Else Kröner Fesenius Stiftung, Baxter Healthcare GmbH, DFG, IZKF / ELAN / EFI / Kontor for kjønn og mangfold, Forschungsstiftung Medizin Friedrich-Alexander University of Erlangen-Nürnberg (FAU), AO Foundation, Manfred Roth Stiftung, Xue Hong, Hans Georg Geis Foundation, Deutscher Akademischer Austauschdienst (DAAD), Tyskland, og departementet for høyere utdanning og forskning, Irak. Vi vil gjerne takke Stefan Fleischer, Marina Milde, Katrin Köhn og Ilse Arnold-Herberth for deres utmerkede teknisk støtte.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9% sodium chloride Berlin-Chemie AG 34592508
11-0 Ethilon / polyamide 6/6 Ethicon EH7438G
4-0 Vicryl / polygalactin 910 Ethicon V392H
6-0 Prolene / polypropylene Ethicon 8695H
aluminium spray Pharma Partner Vertriebs-GmbH 1020
antiseptics  BODE Chemie GmbH 
Catheter  B Braun Meslungen AG 4251612-02
contrast agent Flowtech  MV-122
embutramide, mebezonium iodide, tetracaine hydrochloride injectable solution  Intervet International GmbH
encre de chine intense Indian ink Lefranc & Bourgeois
Enrofloxacin Bayer AG
eye ointment Bayer AG
Formalin 4% Carl Roth GmbH & Co. KG P087.4
Heparin Ratiopharm GmbH
isoflurane  Abbott Laboratories 6055482
Lewis rat, male Charles River Laboratories
Metamizol-Natrium  Ratiopharm GmbH
papaverine / Paveron N Linden Arzneimittel-Vertrieb-GmbH
tramadol / Tramal Grünenthal GmbH

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Folkman, J., Haudenschild, C. Angiogenesis in vitro. Nature. 288, (5791), 551-556 (1980).
  2. DeCicco-Skinner, K. L., et al. Endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis. J Vis Exp. (91), e51312 (2014).
  3. Puddu, A., Sanguineti, R., Traverso, C. E., Viviani, G. L., Nicolo, M. Response to anti-VEGF-A treatment of endothelial cells in vitro. Exp Eye Res. 146, 128-136 (2016).
  4. Li, H., Daculsi, R., Bareille, R., Bourget, C., Amedee, J. uPA and MMP-2 were involved in self-assembled network formation in a two dimensional co-culture model of bone marrow stromal cells and endothelial cells. J Cell Biochem. 114, (3), 650-657 (2013).
  5. Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nat Rev Mol Cell Biol. 7, (3), 211-224 (2006).
  6. Nehls, V., Herrmann, R. The configuration of fibrin clots determines capillary morphogenesis and endothelial cell migration. Microvasc Res. 51, (3), 347-364 (1996).
  7. Fischbach, C., et al. Cancer cell angiogenic capability is regulated by 3D culture and integrin engagement. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (2), 399-404 (2009).
  8. Logsdon, E. A., Finley, S. D., Popel, A. S., Mac Gabhann, F. A systems biology view of blood vessel growth and remodelling. J Cell Mol Med. 18, (8), 1491-1508 (2014).
  9. Kaully, T., Kaufman-Francis, K., Lesman, A., Levenberg, S. Vascularization--the conduit to viable engineered tissues. Tissue Eng Part B Rev. 15, (2), 159-169 (2009).
  10. Risau, W. Mechanisms of angiogenesis. Nature. 386, (6626), 671-674 (1997).
  11. Carmeliet, P. Mechanisms of angiogenesis and arteriogenesis. Nat Med. 6, (4), 389-395 (2000).
  12. Morin, K. T., Tranquillo, R. T. In vitro models of angiogenesis and vasculogenesis in fibrin gel. Exp Cell Res. 319, (16), 2409-2417 (2013).
  13. Ucuzian, A. A., Greisler, H. P. In vitro models of angiogenesis. World J Surg. 31, (4), 654-663 (2007).
  14. Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int J Exp Pathol. 90, (3), 195-221 (2009).
  15. Tahergorabi, Z., Khazaei, M. A review on angiogenesis and its assays. Iran J Basic Med Sci. 15, (6), 1110-1126 (2012).
  16. Agostini, S., et al. Barley beta-glucan promotes MnSOD expression and enhances angiogenesis under oxidative microenvironment. J Cell Mol Med. 19, (1), 227-238 (2015).
  17. Zhang, B., Xuan, C., Ji, Y., Zhang, W., Wang, D. Zebrafish xenotransplantation as a tool for in vivo cancer study. Fam Cancer. 14, (3), 487-493 (2015).
  18. Devaud, C., et al. Tissues in different anatomical sites can sculpt and vary the tumor microenvironment to affect responses to therapy. Mol Ther. 22, (1), 18-27 (2014).
  19. Min, Z., Shichang, Z., Chen, X., Yufang, Z., Changqing, Z. 3D-printed dimethyloxallyl glycine delivery scaffolds to improve angiogenesis and osteogenesis. Biomater Sci. 3, (8), 1236-1244 (2015).
  20. Sundaram, S., et al. Tissue-engineered vascular grafts created from human induced pluripotent stem cells. Stem Cells Transl Med. 3, (12), 1535-1543 (2014).
  21. Hori, A., Agata, H., Takaoka, M., Tojo, A., Kagami, H. Effect of Cell Seeding Conditions on the Efficiency of In Vivo Bone Formation. Int J Oral Maxillofac Implants. 31, (1), 232-239 (2016).
  22. Laschke, M. W., Menger, M. D. Prevascularization in tissue engineering: Current concepts and future directions. Biotechnol Adv. (2015).
  23. Wong, H. K., et al. Novel method to improve vascularization of tissue engineered constructs with biodegradable fibers. Biofabrication. 8, (1), 015004 (2016).
  24. Rouwkema, J., de Boer, J., Van Blitterswijk, C. A. Endothelial cells assemble into a 3-dimensional prevascular network in a bone tissue engineering construct. Tissue Eng. 12, (9), 2685-2693 (2006).
  25. Lokmic, Z., Mitchell, G. M. Engineering the microcirculation. Tissue Eng Part B Rev. 14, (1), 87-103 (2008).
  26. Erol, O. O., Spira, M. New capillary bed formation with a surgically constructed arteriovenous fistula. Surg Forum. 30, 530-531 (1979).
  27. Arkudas, A., et al. Evaluation of angiogenesis of bioactive glass in the arteriovenous loop model. Tissue Eng Part C Methods. 19, (6), 479-486 (2013).
  28. Arkudas, A., et al. Axial prevascularization of porous matrices using an arteriovenous loop promotes survival and differentiation of transplanted autologous osteoblasts. Tissue Eng. 13, (7), 1549-1560 (2007).
  29. Arkudas, A., et al. Composition of fibrin glues significantly influences axial vascularization and degradation in isolation chamber model. Blood Coagul Fibrinolysis. 23, (5), 419-427 (2012).
  30. Arkudas, A., et al. Dose-finding study of fibrin gel-immobilized vascular endothelial growth factor 165 and basic fibroblast growth factor in the arteriovenous loop rat model. Tissue Eng Part A. 15, (9), 2501-2511 (2009).
  31. Arkudas, A., et al. Fibrin gel-immobilized VEGF and bFGF efficiently stimulate angiogenesis in the AV loop model. Mol Med. 13, (9-10), 480-487 (2007).
  32. Buehrer, G., et al. Combination of BMP2 and MSCs significantly increases bone formation in the rat arterio-venous loop model. Tissue Eng Part A. 21, (1-2), 96-105 (2015).
  33. Kneser, U., et al. Engineering of vascularized transplantable bone tissues: induction of axial vascularization in an osteoconductive matrix using an arteriovenous loop. Tissue Eng. 12, (7), 1721-1731 (2006).
  34. Arkudas, A., et al. Combination of extrinsic and intrinsic pathways significantly accelerates axial vascularization of bioartificial tissues. Plast Reconstr Surg. 129, (1), 55e-65e (2012).
  35. Bach, A. D., et al. A new approach to tissue engineering of vascularized skeletal muscle. J Cell Mol Med. 10, (3), 716-726 (2006).
  36. Bitto, F. F., et al. Myogenic differentiation of mesenchymal stem cells in a newly developed neurotised AV-loop model. Biomed Res Int. 2013, 935046 (2013).
  37. Fiegel, H. C., et al. Foetal hepatocyte transplantation in a vascularized AV-Loop transplantation model in the rat. J Cell Mol Med. 14, (1-2), 267-274 (2010).
  38. Polykandriotis, E., et al. The venous graft as an effector of early angiogenesis in a fibrin matrix. Microvasc Res. 75, (1), 25-33 (2008).
  39. Polykandriotis, E., et al. Regression and persistence: remodelling in a tissue engineered axial vascular assembly. J Cell Mol Med. 13, (10), 4166-4175 (2009).
  40. Yuan, Q., et al. PHDs inhibitor DMOG promotes the vascularization process in the AV loop by HIF-1a up-regulation and the preliminary discussion on its kinetics in rat. BMC Biotechnol. 14, 112 (2014).
  41. Dew, L., MacNeil, S., Chong, C. K. Vascularization strategies for tissue engineers. Regen Med. 10, (2), 211-224 (2015).
  42. Kang, Y., Mochizuki, N., Khademhosseini, A., Fukuda, J., Yang, Y. Engineering a vascularized collagen-beta-tricalcium phosphate graft using an electrochemical approach. Acta Biomater. 11, 449-458 (2015).
  43. Novosel, E. C., Kleinhans, C., Kluger, P. J. Vascularization is the key challenge in tissue engineering. Adv Drug Deliv Rev. 63, (4-5), 300-311 (2011).
  44. Zimmerer, R., Jehn, P., Spalthoff, S., Kokemuller, H., Gellrich, N. C. Prefabrication of vascularized facial bones. Chirurg. 86, (3), 254-258 (2015).
  45. Dunda, S. E., et al. In Vitro and In Vivo Biocompatibility of a Novel, 3-Dimensional Cellulose Matrix Structure. Handchir Mikrochir Plast Chir. 47, (6), 378-383 (2015).
  46. Tanaka, Y., et al. Tissue engineering skin flaps: which vascular carrier, arteriovenous shunt loop or arteriovenous bundle, has more potential for angiogenesis and tissue generation? Plast Reconstr Surg. 112, (6), 1636-1644 (2003).
  47. Dong, Q. S., et al. Prefabrication of axial vascularized tissue engineering coral bone by an arteriovenous loop: a better model. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 32, (6), 1536-1541 (2012).
  48. Polykandriotis, E., et al. Prevascularisation strategies in tissue engineering. Handchir Mikrochir Plast Chir. 38, (4), 217-223 (2006).
  49. Mofikoya, B. O., Ugburo, A. O., Bankole, O. B. Does open guide suture technique improve the patency rate in submillimeter rat artery anastomosis? Handchir Mikrochir Plast Chir. 46, (2), 105-107 (2014).
  50. Manasseri, B., et al. Microsurgical arterovenous loops and biological templates: a novel in vivo chamber for tissue engineering. Microsurgery. 27, (7), 623-629 (2007).
  51. Moimas, S., et al. AAV vector encoding human VEGF165-transduced pectineus muscular flaps increase the formation of new tissue through induction of angiogenesis in an in vivo chamber for tissue engineering: A technique to enhance tissue and vessels in microsurgically engineered tissue. J Tissue Eng. 6, (2015).
  52. Fan, J., et al. Microsurgical techniques used to construct the vascularized and neurotized tissue engineered bone. Biomed Res Int. 2014, 281872 (2014).
  53. Bleiziffer, O., et al. Guanylate-binding protein 1 expression from embryonal endothelial progenitor cells reduces blood vessel density and cellular apoptosis in an axially vascularised tissue-engineered construct. BMC Biotechnol. 12, 94 (2012).
  54. Horch, R. E., et al. Cancer research by means of tissue engineering--is there a rationale? J Cell Mol Med. 17, (10), 1197-1206 (2013).
  55. Lee, H. Genetically engineered mouse models for drug development and preclinical trials. Biomol Ther (Seoul). 22, (4), 267-274 (2014).
  56. Willey, C. D., Gilbert, A. N., Anderson, J. C., Gillespie, G. Y. Patient-Derived Xenografts as a Model System for Radiation Research). Semin Radiat Oncol. 25, (4), 273-280 (2015).
  57. Guiro, K., Arinzeh, T. L. Bioengineering Models for Breast Cancer Research. Breast Cancer (Auckl). 9, (Suppl 2), 57-70 (2015).
  58. Ghajar, C. M., Bissell, M. J. Tumor engineering: the other face of tissue engineering. Tissue Eng Part A. 16, (7), 2153-2156 (2010).
  59. Boos, A. M., et al. Engineering axially vascularized bone in the sheep arteriovenous-loop model. J Tissue Eng Regen Med. 7, (8), 654-664 (2013).
  60. Weigand, A., et al. Acceleration of vascularized bone tissue-engineered constructs in a large animal model combining intrinsic and extrinsic vascularization. Tissue Eng Part A. 21, (9-10), 1680-1694 (2015).
  61. Horch, R. E., Beier, J. P., Kneser, U., Arkudas, A. Successful human long-term application of in situ bone tissue engineering. J Cell Mol Med. 18, (7), 1478-1485 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics