La boucle artério (AV) dans un modèle Small Animal pour étudier l'angiogenèse et du génie tissulaire vascularisé

Bioengineering

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Summary

Nous décrivons une méthode microchirurgie pour la génération d'une boucle artérioveineuse (AV) en tant que modèle pour l' analyse de la vascularisation in vivo dans un environnement isolé et bien caractérisés. Ce modèle est non seulement utile pour l'étude de l'angiogenèse, mais est également parfaitement adaptée pour l'ingénierie axialement vascularisé et les tissus transplantables.

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Weigand, A., Beier, J. P., Arkudas, A., Al-Abboodi, M., Polykandriotis, E., Horch, R. E., Boos, A. M. The Arteriovenous (AV) Loop in a Small Animal Model to Study Angiogenesis and Vascularized Tissue Engineering. J. Vis. Exp. (117), e54676, doi:10.3791/54676 (2016).

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Abstract

Introduction

La plupart des tissus et des organes du corps humain dépendent d'un réseau de vaisseaux sanguins fonctionnels qui fournit des nutriments, échange des gaz et supprime les déchets. Dysfonctionnement du système causé par des problèmes vasculaires locales ou systémiques peut conduire à une multitude de maladies graves. En outre, dans des domaines de recherche tels que l'ingénierie tissulaire ou la médecine régénérative, un réseau de vaisseaux sanguins dans les tissus fonctionnels générés artificiellement ou organes transplantés est indispensable pour une application clinique réussie.

Pendant des décennies, les chercheurs ont étudié les mécanismes exacts impliqués dans la vascularisation de plus en plus d'avoir un aperçu plus profond dans des situations pathologiques afin de trouver de nouvelles interventions thérapeutiques et de fournir une meilleure prévention des troubles vasculaires. Dans la première étape, les procédés de base tels que les interactions cellule-cellule ou l'effet de molécules sur les cellules du système vasculaire sont généralement étudiés en 2D ou en 3D in vitroexpériences. Les modèles traditionnels 2D sont faciles à réaliser, sont bien établis et ont grandement contribué à une meilleure compréhension de ces processus. Pour la première fois en 1980, Folkman et al. rapporté angiogenèse in vitro l' ensemencement de cellules endothéliales capillaires sur des plaques revêtues de gélatine 1. Cela a immédiatement cédé la place à la publication d'une multitude d'autres expériences 2D de l' angiogenèse sur le tube de cellules endothéliales formation test 2, la migration test 3 et la co-culture de différents types de cellules 4, ainsi que d' autres. Ces essais sont encore utilisés aujourd'hui et acceptées comme standard dans les méthodes in vitro.

Cependant, cette configuration expérimentale est pas toujours approprié pour l'étude du comportement in vivo de cellules puisque la plupart des types de cellules ont besoin d' un environnement 3D pour former des structures physiologiques pertinentes des tissus 5. On a pu montrer que l'architecture de la matrice 3D est déterminante pour capillaire morphogenesis 6 et que la matrice cellulaire (ECM) interactions cellulaires-extra et la culture 3D conditions régissent les facteurs importants impliqués dans l' angiogenèse tumorale 7. La matrice 3D fournit des entrées mécaniques complexes, peuvent lier des protéines effectrices et établir des tissus à l'échelle des gradients de concentration de soluté. En outre, il est jugé nécessaire afin d'imiter en morphogénétique vivo et étapes de remodelage dans les tissus complexes 5. Dans ces systèmes, à la fois l'angiogenèse et la vasculogenèse peuvent être étudiés. Alors que l' angiogenèse décrit le bourgeonnement des capillaires à partir de vaisseaux sanguins préexistants 8, vasculogenèse se réfère à la formation de novo des vaisseaux sanguins par les cellules endothéliales ou leurs progéniteurs 9,10. Maturation des navires est décrite dans un processus appelé «artériogenèse» via le recrutement de cellules musculaires lisses 11. Un angiogénique typique modèle in vitro est le bourgeonnement des cellules endothéliales de monocouche existantess ensemencée en monocouche sur une surface de gel, sur la surface des microsphères noyées dans un gel ou en construisant des sphéroïdes de cellules endothéliales 12. Dans les modèles vasculogéniques cellules endothéliales simples sont piégés dans un gel 3D. Ils interagissent avec les cellules endothéliales adjacentes pour former des structures et des réseaux de novo vasculaires, généralement en combinaison avec des cellules de soutien 12.

Cependant, même en 3D complexes modèles in vitro ne peuvent pas imiter dans les paramètres in vivo complètement donné la multitude de cellule-cellule et cellule-ECM Interactions 13. Les substances ayant une forte activité in vitro ne montrent pas automatiquement les mêmes effets in vivo et vice versa 14. Pour une analyse complète de la vascularisation traite il y a un besoin urgent de développer des modèles in vivo que mieux simuler la situation dans le corps. Une large gamme d'essais in vivo de l' angiogenèse sont décrits dans la littérature, y compris lapoussin test chorio membranaire (CAM), le modèle zebrafish, le dosage de l' angiogenèse de la cornée, le modèle de sac d'air dorsal, la chambre dorsale du pli cutané, les modèles de tumeurs sous - cutanées 14. Cependant, ces tests sont souvent associés à des limitations, telles que des changements morphologiques rapides, des problèmes dans de nouveaux capillaires distinctifs de ceux qui existent déjà dans l'essai de CAM, ou l'espace limité dans le dosage de l' angiogenèse cornéenne 15. En outre, les systèmes non-mammifères sont utilisés (par exemple., Le modèle zebrafish 16), ce qui conduit à des problèmes dans la xénotransplantation 17. Dans le modèle de tumeur sous-cutanée, l'angiogenèse provenant uniquement de la tumeur elle-même ne peut être analysée puisque les tissus adjacents contribue fortement au processus de vascularisation. En outre, le tissu environnant peut avoir un rôle décisif dans la formation du microenvironnement de la tumeur 18.

Non seulement pour l'étude de l'angiogenèse ou la vasculogenèse est-il une forte need pour un standard et bien caractérisé en ce modèle in vivo , mais également pour l' étude des différentes stratégies de vascularisation dans l' ingénierie tissulaire et la médecine régénératrice. De nos jours, la production d'organes ou de tissus artificiels complexes est possible à la fois in vitro et in vivo. Bioprinting 3D fournit une technique à la demande de fabrication pour la production 3D complexes tissus vivants fonctionnels 19. En outre, les bioréacteurs peuvent être utilisés pour générer des tissus 20 ou même le corps propre peut être utilisé comme bioréacteur 21. Cependant, le principal obstacle à l'application réussie de tissus générés artificiellement est l'absence de vascularisation dans les constructions artificielles. Connexion immédiate à la vascularisation de l'hôte après la transplantation est une condition préalable importante pour la survie, en particulier dans le cas des tissus ou des organes artificiels à grande échelle.

In vitro ou différent dans les stratégies de prévascularisation vivo ont été déveau point pour établir une microvascularisation fonctionnelle dans des constructions avant l'implantation 22. L'implantation d'un échafaudage avec des capillaires in vitro par génie préformées sur la peau dorsale de souris a conduit à une anastomose rapide du système vasculaire de la souris dans un 23 jour. En revanche, une co-culture de sphéroïdes comprenant des cellules souches mésenchymateuses humaines et des cellules endothéliales de veine ombilicale humaine assemblés en un réseau tridimensionnel prévasculaire développé davantage après implantation in vivo. Cependant, anastomose avec la vascularisation hôte a été limitée 24. Surtout, des défauts mal vascularisés, comme les zones nécrotiques ou irradiés, cette soi-disant vascularisation extrinsèque - la croissance de vaisseaux de la région environnante dans l'échafaudage - échoue souvent. Vascularisation intrinsèque, d'autre part, est situé sur un axe vasculaire en tant que source de nouveaux capillaires poussent dans l'échafaudage 25. En utilisant l'approche de la vascularisation axiale, L'ingénierie tissulaire peut être transplanté avec son axe vasculaire et relié aux navires locaux sur le site destinataire. Immédiatement après la transplantation, le tissu est suffisamment pris en charge par l'oxygène et de nutriments, ce qui crée les conditions d'une intégration optimale.

En raison de la disponibilité limitée des modèles d'enquête sur l' angiogenèse in vivo et dans la reconnaissance de l'importance croissante de générer des tissus axialement vascularisé, nous avons développé l'approche microchirurgicale de Erol et Spira en outre pour générer un artérioveineuse (AV) boucle dans le modèle animal 26. L'utilisation d'une chambre d'implantation complètement fermée rend ce procédé très bien adapté pour étudier la formation des vaisseaux sanguins sous "contrôlée", bien caractérisés dans des conditions in vivo (figure 1). Ce modèle est non seulement utile pour l'étude de l'angiogenèse, mais est également parfaitement adaptée pour la vascularisation axiale de échafauds pour engin de tissudes fins ingé-.

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Protocol

Le Comité des soins aux animaux de l'Université Friedrich-Alexander d'Erlangen-Nuremberg (FAU) et le gouvernement du Moyen-Franconie, Allemagne, a approuvé toutes les expériences. Pour les expériences, des rats Lewis mâles avec un poids corporel de 300-350 g ont été utilisés.

1. La artério boucle Modèle dans le Rat

  1. Implantation Procédure (Figure 2)
    1. Pour l' anesthésie utiliser une boîte en plastique spécial qui est relié par un tube au vaporisateur isoflurane et fermé par un couvercle. Allumez le gaz d'alimentation et le débitmètre entre 0,8 à 1,5 L / min.
    2. Placez le rat dans la boîte en plastique d'induction et sceller le dessus. Allumez vaporisateur isoflurane à 5%.
    3. Observer attentivement le rat pendant l'induction de l'anesthésie. Après 3 - 4 min, le rat sera anesthésié.
    4. Confirmer l'anesthésie appropriée: la perte du réflexe de redressement, la perte de réflexe palpébral, réflexe de retrait, réflexe cornéen positif.
    5. Retirez le rat de la boîte et vérifiez sonpoids pour le calcul des médicaments. Appliquer une pommade oculaire pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
    6. Administrer des médicaments de la douleur et des antibiotiques (par exemple., 7,5 mg / kg par voie sous cutanée enrofloxacine (sc), 12,5 mg / kg tramadol et 100 mg / kg par voie intraveineuse à la fois metamizole (iv)). Administrer cristalloïdes poids adapté pendant le fonctionnement (par exemple., 30 ml / kg sc).
    7. Placez le rat sur son dos sur une plaque chauffante à 37 ° C sous anesthésie avec 1 - 2% d' isoflurane inhalation administrée par masque.
    8. Surveiller l'anesthésie correctement et augmenter isoflurane si le niveau d'anesthésie est trop faible (mouvement du rat, la réponse à la douleur, à la mâchoire ton, sans perte de réflexes (voir 1.1.4.), La fréquence cardiaque croissante). Veillez à ne pas surdoser isoflurane (perte de réflexes cornéens, fréquence cardiaque élevée, diminution de la saturation en oxygène). Utiliser une oxymétrie de pouls particulier pour les petits animaux pour le contrôle de la saturation en oxygène (95-100%) et la fréquence cardiaque (250-450 / min) du rat. Au cours des operatià surveiller la température du rat (36 - 40 ° C) et régler la température de la plaque chauffante si nécessaire.
    9. Raser les côtés intérieurs des pattes arrière avec un rasoir électrique et désinfecter la zone avec des antiseptiques. Répartir les membres postérieurs et les fixer avec du ruban adhésif.
    10. Poser le rat sous un microscope chirurgical et couvrir le rat avec drapage stérile. Faire en sorte que l'ensemble de la procédure d'opération est réalisée dans des conditions stériles.
    11. Ouvrir la peau, au milieu de la cuisse gauche avec une incision longitudinale du genou supérieure à l'aine en utilisant un scalpel (n ° 10).
    12. Couper le tissu sous-cutané et le fascia en couches d'environ 3 cm de longueur à l'aide de ciseaux de dissection et microforceps jusqu'à ce que le faisceau vasculaire fémorale est exposée à partir de l'artère pelvienne de l'aine jusqu'à la bifurcation de l'artère fémorale du genou.
    13. Séparer les vaisseaux et retirer l'adventice en utilisant des ciseaux de adventice et microforceps.
    14. Coaguler le côté bRanches utilisant la coagulation électrique. Couvrir le champ opératoire avec une compresse humide.
    15. Ouvrez la peau sur le côté droit comme décrit pour le côté gauche, 1.1.11 - 1.1.14.
    16. Pour la récolte du greffon veineux, ligaturer la veine fémorale droite par coagulation électrique sur les extrémités proximale et distale à une distance de 1 - 1,5 cm.
    17. Retirer le greffon veineux avec microforceps et rincer le greffon veineux avec une solution d'héparine (50 Ul / ml dans une solution de chlorure de sodium à 0,9%) en utilisant une canule d'irrigation et de le transférer à la cuisse gauche. Couvrir le champ opératoire sur le côté droit avec une compresse humide.
    18. Ligaturer la veine fémorale sur le côté gauche de manière proximale à la région inguinale avec un collier de microvaisseaux. Coaguler la veine fémorale de manière distale par coagulation électrique, au niveau du genou supérieur avant de bifurquer, à une distance d'environ 2 cm.
    19. Anastomose pour relier l'extrémité proximale du greffon veineux avec l'extrémité proximale de la veine d'anastomose bout-à-bout avec une 11-0 Suture. Utilisez environ 8 sutures interrompues. Commencez par placer les deux premiers points de suture au niveau des positions 12 heures et 6 heures. Ensuite, mettre en 2 à 3 autres sutures entre ces points sur la face avant, puis mettre 2 à 3 autres sutures sur le côté arrière.
    20. Ligaturer l'artère fémorale de la même manière que décrit pour la veine fémorale (1.1.18.). Assurez-vous que les vaisseaux de la boucle ne sont pas tordus. Anastomose à l'extrémité distale du greffon veineux avec l'extrémité proximale de l'artère, comme décrit pour la veine fémorale (étapes 01.01.19.).
    21. Administrer 25 UI d'héparine par voie intraveineuse. Faire à nouveau que les navires de la boucle ne sont pas tordus, Retirer les pinces et vérifier les fuites et la perméabilité de la boucle pendant environ 5 min.
    22. Papavérine dégouliner (par exemple, 4 mg / ml) sur les vaisseaux pour prévenir les spasmes vasculaires. S'il y a une perméabilité, la boucle se dilate et le pouls de l'artère peut être observée.
    23. Pré - remplir la chambre d'implantation avec la première moitié (environ 500 pi) de la matrice (par exemple </ Em>, un hydrogel ou une matrice osseuse avec ou sans cellules). Incorporer la boucle dans la chambre d'implantation.
    24. Remplir la chambre d'implantation avec la seconde moitié de la matrice à un volume total de 1000 pi. Sceller la chambre avec le couvercle de la chambre.
    25. Fixer la chambre d'implantation sur la cuisse avec un non-absorbable 6-0 suture. Fixer le couvercle de la chambre avec un non-absorbable 6-0 suture. Arrêtez possible saignement à la coagulation électrique.
    26. Fermer la peau avec résorbables 4-0 sutures. Couvrir la plaie avec de l'aluminium par pulvérisation.
    27. Administrer des antibiotiques et des analgésiques (par exemple, 7,5 mg / kg d' enrofloxacine ms, le tramadol 12,5 mg / kg per os (PO) (par l' intermédiaire de l' eau de boisson) pendant 3 - 5 jours , et ensuite en fonction du comportement du rat).
    28. Tourner le vaporisateur et laissez le rat à respirer les gaz d'alimentation jusqu'à ce qu'il commence à se réveiller.
    29. Placez le rat dans une boîte avec support thermique et d'observer attentivement jusqu'à guérison complète.
    30. Ne laissez pas le non ratassisté jusqu'à ce qu'il ait repris connaissance suffisante pour maintenir décubitus sternale.
    31. Ne pas retourner le rat à la compagnie d'autres animaux jusqu'à guérison complète.
  2. procédure Explantation
    1. Effectuer l'explantation après un temps court ou une implantation de longue date (selon la conception de l'étude, des exemples s'il vous plaît voir les références 27-32). Anesthetize le rat selon les étapes 1.1.1.-1.1.9.
    2. Ouvrez la peau de l'abdomen avec un scalpel (n ° 10) et déplacer les intestins de côté avec une compresse. Exposer l'aorte abdominale et les tampons de coton veine cave caudale à l'aide.
    3. Cathétériser l'aorte abdominale (par exemple., Calibre 24 plastique canule) et couper la veine cave caudale avec des ciseaux de dissection.
    4. Rincer l'aorte abdominale avec une solution de chlorure de sodium à 0,9% contenant 100 UI / ml d'héparine jusqu'à ce que le liquide qui fuirait est clair. Perfuser l'aorte avec 30 ml de solution de perfusion (par exemple., Agent de contraste ou de l' Inde dansk).
    5. Euthanize le rat par injection d'une dose létale d'embutramide, mebezonium iodure, d'une solution injectable de chlorhydrate de tetracaine (0,1 à 0,2 ml / kg) dans une anesthésie profonde.
    6. Ligaturer l'aorte abdominale et la veine cave caudale avec un non absorbable suture 4-0.
    7. Fermez la zone de la plaie ouverte avec 1 - 2 pinces. Stocker le rat pendant 24 heures à 4 ° C (polymérisation de la solution de perfusion).
    8. Placez le rat sur son dos. Répartir les membres postérieurs et les fixer avec du ruban adhésif.
    9. Ouvrez la peau au-dessus de la chambre avec une incision longitudinale avec un scalpel (n ° 10).
    10. Retirez le tissu conjonctif de la chambre et le pédicule en boucle avec des ciseaux de dissection et microforceps. Couper le pédicule en boucle à une distance de 1 cm de l'ouverture de la chambre avec des ciseaux de dissection et enlever la chambre.
    11. Ouvrez le couvercle de la chambre et retirer soigneusement la construction de la chambre avec une pince et le fixer dans 4% solution de formol tamponné pendant 24 heures à la salletempérature. Utiliser ensuite la construction pour la 3D micro-tomodensitométrie ou paraffine pour l' analyse histologique 30.

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Representative Results

Création de tissus
À des fins d'ingénierie du tissu osseux, un certain nombre de substituts osseux ont été implantés dans le petit animal de rat modèle de boucle AV 27,28,33,34. Vascularisation pourrait parfaitement être démontrée en 3D micro-tomographie par ordinateur (micro-CT) (figure 3A). Vascularisation d'une matrice bovine traitée os spongieux (PBCB) était significativement plus élevée dans le groupe de la boucle par rapport au groupe sans vascularisation. Un réseau de vaisseaux sanguins en croissance constante et maturating développée dans la chambre d'implantation de plus de 8 semaines. Entre 4 et 8 semaines, on a observé une croissance continue du tissu vascularisé vers le centre des constructions, alors qu'aucune augmentation n'a été détectée dans le groupe non vascularisé 33. Prévascularisation de la matrice PBCB pendant 6 semaines dans le modèle de boucle AV a conduit à la survie supérieure des ostéoblastes injectées par rapport aux ostéoblastes de commande. Par contraste avec les groupes témoins, l' expression de gènes spécifiques de l' os a été détecté dans le groupe de boucle AV avec 28 ostéoblastes implantés. En tant que matrice en outre, le verre bioactif fritté conjointement avec le gel de fibrine a été implanté dans les boucles AV des rats. Après 3 semaines, un réseau dense de vaisseaux nouvellement formés a développé démontré par micro-CT et histologie 27.

La chambre d'implantation a été modifiée afin d'accélérer échafaudage vascularisation. En utilisant une chambre de titane perforé, vascularisation intrinsèque a été soutenue par les vaisseaux extrinsèques provenant du tissu environnant. A seulement 2 semaines après l' implantation d'une hydroxyapatite β-tricalcique (β-TCP / HA) / matrice de fibrine, 83% des navires ont été connectés à la boucle AV avec une augmentation continue au fil du temps et a atteint 97 connexion% après 8 semaines 34. Grâce à l'implantation de cellules souches mésenchymateuses dérivées de moelle 5 x 10 6 osseuses (MSC) et la protéine morphogénétique osseuse 2 (BMP-2), une augmentation significative de la formation de l'os par rapport à la BMP-2 ou des groupes MSC seuls peuvent être induits. 6 et 12 semaines, la matrice de fibrine a été complètement dégradé et remplacé par du tissu conjonctif très vascularisé dans tous les groupes (Figure 3B 6 semaines d'implantation). Il y avait une diminution significative du nombre de vaisseaux dans le groupe BMP-2 / MSC entre 6 et 12 semaines et après 12 semaines dans les autres groupes. Cela est probablement dû à la maturation du réseau vasculaire ou de l'agencement compact des structures osseuses conduisant à une formation d' un réseau vasculaire 32 limité.

En plus de l'os, d'autres tissus tels que le foie ou les muscles peuvent également être conçus dans le modèle de boucle AV.

Pour l'ingénierie axialement vascularisé tissu musculaire, des expériences avec des myoblastes primaires dans une matrice de fibrine en boucle AV ont été réalisées. Après une prevascularization temps de 2 semaines 2, 4 et 8 semaines, 1 x 10 6 myoblastes ont été transplantés dans la chambre de boucle AV. myoblastes transplantées pourraient être redétectés même après 8 semaines en utilisant carboxyfluorescéine ester diacétate succinimidyl (CFDA) étiquetage. Les cellules ont conservé leur phénotype myogénique dans la matrice de fibrine et l'expression des marqueurs spécifiques du muscle MEF-2 et desmine a été positive après 4 semaines. Cependant, l' expression myogénique du gène marqueur a été négatif au bout de 8 semaines, ce qui est probablement dû à l'absence de stimuli myogéniques et une absorption rapide de la matrice de fibrine 35. Pour augmenter la stimulation myogénique, une nouvelle modification de la boucle AV de rat a été développé en utilisant la veine épigastrique au lieu de la veine saphène afin d'obtenir un positionnement plus proximale de la chambre d'isolement. Par conséquent, l'incorporation supplémentaire du nerf moteur obturatrice est géométriquement facilitée. En utilisant cette modification de la boucle AV, qui est appelée la boucle EPI, nous avons pu montrer d myogéniqueifferentiation de myoblastes co-implanté et MSC 36.

Pour l' ingénierie du tissu hépatique 4 x 10 6 PKH-26 des cellules de foie foetal marqués ont été transplantés dans une matrice de fibrine dans le modèle de boucle AV de rat pendant 2 semaines. Dans le groupe témoin, des matrices sans une boucle AV et des matrices sans cellules ont été implantées. capillaires fonctionnels ont été soulevées par les vaisseaux de la boucle AV et très vascularisée néo-tissu a été observée au sein de la chambre au bout de 14 jours d'implantation, comme le montre la coloration de CD31 et de l'Inde marquage d'encre. Il n'y avait aucune différence entre le groupe de boucle sans cellule hépatocyte et AV. La boucle AV vascularisé la matrice de fibrine et à forte densité de cellules foetales viables n'a pu être détectée après l'explantation positif par PKH-26 et une coloration spécifique des cellules hépatiques cytokératine 18 (CK-18) immunohistologie principalement autour de l'axe vasculaire majeur. taux d'ARNm de la CK-18 ont été élevées dans le groupe de cellules de boucle AV. En revanche, aucune CK-18 expression a pu être détectée dans les constructions sans une boucle ou des cellules 37.

Les études de l' angiogenèse
La boucle de AV se compose de trois segments: la veine, la greffe artérielle et le segment d' interposition du greffon veineux (GAV) (figure 1). évaluation tridimensionnelle du système vasculaire a démontré que les vaisseaux nouvellement formés proviennent à la fois de la veineuse et artérielle partie ainsi que de la interponate veineuse. Un grand nombre de vaisseaux nouvellement formés ont été observés à partir de la GAV 33. In vivo MRA, la microscopie électronique à balayage de moulages de corrosion et histologie immunitaire, l'apparition de l' angiogenèse dans une matrice de fibrine a été observée entre les jours 10 et 14. Surtout, le veineux et les segments GAV ont donné lieu à de nombreux capillaires et les vaisseaux plus gros. Une réduction progressive de calibre luminal comme un signe de artérialisation du GAV en raison de l'augmentation de la pression et de cisaillement endovasculaire wa stresss détecté du jour 7 sur 38. Dans d' autres études, on a pu confirmer que la germination vasculaire a lieu principalement à la greffe non-artérielle 39.

L'analyse exacte des processus d'angiogenèse et de la stimulation et de l'inhibition de la formation de vaisseaux sanguins peut être visualisé dans la chambre AV boucle d'implantation. Les facteurs de croissance vasculaire , facteur de croissance endothélial A (VEGFA) et le facteur de croissance des fibroblastes (bFGF) ont induit une densité vasculaire plus élevée relative et absolue et la résorption plus rapide de la matrice de fibrine par rapport au groupe témoin sans facteur de croissance 31. En outre, les phénomènes de remodelage et la maturation du réseau vasculaire dans la chambre d'isolement ont été visualisés pendant une période d'implantation de 8 semaines. Dans AV chambres de boucle processus d'interconnexion intercapillaire et de l'angiogenèse intussusceptive aussi bien que possible la croissance lymphatique ont été identifiés immunohistologically en tant que paramètres de nematuration ovascular 39. En appliquant le PHD (domaine prolyl hydroxylase) inhibiteur DMOG (dimethyloxallyl glycine) par voie systémique chez le rat, il a pu être montré que la concentration du facteur alpha inductible par l'hypoxie (HIF-α) est en corrélation avec la vascularisation croissante dans la boucle AV et est stimulus pour navire excroissance 40.

Figure 1
Figure 1:. Schéma d'une boucle AV dans le modèle de rat La boucle AV se compose de trois segments: la veine (V), l'artère (A) greffé et le segment d' interposition du greffon veineux (GAV). La boucle AV peut être intégré dans une chambre d'implantation fermée (C) pour l' induction de la vascularisation intrinsèque. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

ge = "1"> Figure 2
Figure 2: AV boucle de commande dans le sens de rat (A).. La localisation du faisceau fémoral sur le côté intérieur des pattes postérieures du rat (B / C): Préparation du faisceau vasculaire fémorale gauche et à droite aine le rat. Les récipients sont séparés (D), la greffe de veine d' interposition est récolté à partir de la droite (E) et anastomosée avec la veine fémorale (F) et de l' artère fémorale du côté gauche dans une boucle AV (G, la flèche indique les anastomoses). Les vaisseaux de la boucle sont transférés dans la chambre d'implantation pré - remplie avec une matrice (H) et après le remplissage complet (I) , le couvercle est fermé (J). A = artère fémorale, V = veine fémorale, N = nerf fémoral, GAV = greffe veineuse d'interposition. Barre d'échelle 5 mm (DJ).tp_upload / 54676 / 54676fig2large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3: Visualisation de la vascularisation chez le rat AV boucle du modèle (A). Micro-TDM après perfusion avec un agent de contraste (jaune navires perfusé) (B). Hématoxyline-éosine d'un substitut osseux β-TCP / HA avec MSC implantée dans l'AV modèle de rat en boucle pendant 6 semaines. Les vaisseaux de la boucle d'AV sont perfusés avec l'encre de Chine (de couleur noire). Barre d' échelle 1 mm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Depuis plus d' une décennie, nous avons utilisé avec succès l'artérioveineuse (AV) boucle à des fins d'ingénierie tissulaire et de l' angiogenèse étude in vivo dans le modèle des petits animaux. Nous pourrions démontrer que ce modèle microchirurgicale est très bien adapté pour l'ingénierie des tissus différents et qu'il peut également être utilisé pour les études de l'angiogenèse ou antiangiogéniques.

Importance de la technique par rapport aux méthodes existantes / alternatives
Tissus ou organes artificiels ont besoin d' un réseau de vaisseaux sanguins fonctionnels pour fournir les nutriments et l' oxygène dont ils ont besoin pour leur survie et leur intégration réussie après transplantation dans le site du défaut 41. Un certain nombre de différentes stratégies de prévascularisation ont été développés au cours des dernières décennies, qui peuvent être différenciées selon l'in vitro contre in vivo et des approches intrinsèques vs extrinsèque.

Scellants peuvent être fabricated avec des structures et ensemencé avec des cellules vasculaires tels que des cellules endothéliales ou des cellules souches in vitro 42 de forme tubulaire. D'autre part, pour prévascularisation in vivo, les échafaudages sont implantés dans une région très vascularisée tels que le tissu musculaire sous - cutanée ou 21. Par la suite, ces constructions extrinsèquement vascularisées peuvent être transplantées dans le site du défaut. Cependant, l'inconvénient de ces approches est le manque de connexion microchirurgicale avec les vaisseaux du receveur après la transplantation. En particulier dans le cas des constructions à grande échelle, d'une connexion immédiate à la vasculature hôte est essentiel pour l' approvisionnement immédiat du génie tissulaire 43. La solution évidente et la plus prometteuse à ce problème réside dans la génération d'un tissu ou d'un organe vascularisé intrinsèquement par un axe vasculaire, tel que le modèle de boucle AV.

Outre l'utilisation de la méthode de la boucle AV comme décrit ci-dessus, peut vascularisation axiale aldonc être induite en utilisant des faisceaux AV au lieu 44 ou un seul navire tels que l'artère épigastrique 45. Cependant, dans plusieurs publications , le modèle de boucle AV avéré être supérieur en ce qui concerne le degré de vascularisation et la quantité de formation de novo d' un tissu. Tanaka et al. , Comparé les deux approches méthodologiques et la formation de tissu significativement plus élevée observée et un degré plus élevé de capillaires en développement dans la boucle par rapport au groupe 46 du faisceau. Dong et al. également mené une étude à l' aide de la boucle ou du faisceau AV AV approches pour l' ingénierie tissulaire osseuse dans un modèle de lapin, qui montre également la densité vasculaire significativement plus élevée dans la boucle par rapport au groupe 47 du faisceau. Nous avons été en mesure de confirmer ces résultats, ainsi que de montrer dans une étude précédente que le modèle de boucle de AV a une plus grande capacité pour l' angiogenèse 48.

Au meilleur de notre connaissance, il n'y a pas de modèle comparable pour l'analysevascularisation in vivo dans un environnement isolé et bien caractérisés. Par conséquent, le modèle de la boucle AV représente un outil puissant pour évaluer comment les différents types de cellules ou facteurs de croissance contribuent à des processus de formation ou de vascularisation réseau de vaisseaux dans différents tissus sans perturbations des structures environnantes, comme l'invasion des cellules ou des facteurs de croissance.

Limites de la technique
Cependant, un défi important du modèle proposé est la grande complexité de la chirurgie. D'une part, le traitement des défauts à l'aide du modèle de boucle AV nécessite une procédure en deux étapes - prévascularisation de l'échafaudage et de la transplantation au niveau du site du défaut. Cela signifie que le patient doit subir deux interventions chirurgicales. En outre, les compétences de microchirurgie sont une condition préalable nécessaire à succès des navires de submillimétriques anastomosées 49. Par conséquent, le faisceau AV est parfois considéré comme plus utile pour l'application clinique depuis iT offre également prometteurs, mais moins, le potentiel de l' angiogenèse et de la production de tissu par rapport à la boucle 46 AV. Cependant, cette opération peut être appris étape par étape , même par des non-chirurgiens, en utilisant de petits tubes de calibre de silicium pour la formation au début et après , les vaisseaux d'animaux morts (par exemple, cuisses de poulet) avant de faire l'opération de boucle de AV dans un animal vivant. En revanche, les micro-chirurgiens les plus pratiqués peuvent effectuer cette opération avec seulement une courte période de formation.

Étapes critiques dans le Protocole
D'une manière générale, en raison du petit calibre des vaisseaux il existe un risque de formation de thrombus et de la fermeture des vaisseaux de la boucle. Cependant, dans le modèle de rat de 80% -100% des boucles en moyenne ont été brevets en utilisant seulement de courte durée héparine anticoagulation post-chirurgie 28,30,31,34,38,39.

En outre, en raison de la grande complexité de la chirurgie, il faudra quelques heures (en fonction de til expertise du chirurgien). Il est essentiel de vérifier une bonne anesthésie des animaux pendant toute l'opération et de fournir suffisamment de perfusion pour maintenir une pression sanguine adéquate. Au cours de la période postopératoire, il est d'une grande importance pour vérifier la santé des animaux à plusieurs reprises, pour administrer les analgésiques / antibiotiques et de vérifier la plaie opératoire. Etant donné que dans la plupart des cas l'implantation d'une chambre isolée est effectuée, il est possible que l'infection dans l'intérieur de la chambre se produit sans remarquer. Par conséquent, il est très important de maintenir la stérilité pendant toute l'opération et l'administration d'antibiotiques doivent être effectués avec soin sur une période de 3 - 5 jours.

Des modifications du protocole
La chambre peut être ajustée individuellement à la taille et la forme du défaut. En outre, également les membranes peuvent être utilisées pour entourer la boucle AV interprété par Manasseri et al. , 50. En outre, l'échafaud, supplemented des cellules et des facteurs de croissance peuvent être choisies en fonction des différents types de tissus. Récemment, miomas et al approches thérapeutiques du gène associé avec succès avec le modèle de boucle AV. Et pourrait induire une amélioration de la croissance des vaisseaux par transduction avec VEGF165 51. Récemment, nous avons ajusté l'AV modèle de boucle de rat à des fins d'ingénierie de tissu musculaire. Au lieu des vaisseaux fémoraux, la veine épigastrique et de l' artère saphène ont été utilisés, ce qui a permis l' implantation du nerf obturateur dans l'échafaudage axialement vascularisé pour innervation motrice ( «modèle de boucle EPI") 36. Outre l' implantation d'un nerf motorique, l'neurotisation du tissu osseux conçu constructions avec les nerfs sensoriels est rapporté pour être bénéfique pour une meilleure ostéogenèse et une meilleure réparation des défauts osseux 52. La boucle AV induit minimale morbidité du site donneur et peut être créé à divers endroits du corps 52. Il serait possible d'utiliser des vaisseaux superficiels sur d'autres sites dele corps pour la génération de la boucle AV ou encore d'utiliser d'autres animaux tels que le lapin ou le modèle de la souris.

Applications futures ou les directions après Maîtriser cette technique
Récemment, notre groupe de travail implanté une cellule bien caractérisée murin embryo progénitrices endothéliales (EPC) en ligne (T17b) exprimant la protéine de liaison-1 (GBP-1) guanylate - un inhibiteur de marqueur et intracellulaire des fonctions des cellules endothéliales telles que la prolifération, la migration et invasions - dans le modèle de boucle AV de rat. La capacité de différencier antiangiogénique GBP-1-EPC a pu être démontrée par une réduction significative de la densité des vaisseaux sanguins dans les constructions en boucle AV. En ce qui concerne l' application clinique, la proinflammatoire antiangiogénique GTPase GBP-1 pourrait ouvrir de nouvelles voies de thérapies anti - angiogéniques, par exemple., Pour le cancer ou d' autres maladies 53. Sur la base de cette étude, il est concevable que le modèle de boucle AV peut être utilisé pour l'établissement d'une pathologieréseau de vascularisation pour une analyse et une modulation possible. Par exemple, ce modèle offre une occasion optimale pour obtenir une meilleure compréhension de l' angiogenèse tumorale, ses facteurs d' influence et le rôle exact des différentes cellules impliquées dans la formation d' un réseau de vaisseaux tumoraux tels que EPCs, les cellules tumorales et les cellules souches 54. Modèles in vivo de cancer sont souvent effectuées dans des souris génétiquement modifiées pour simuler les processus et les caractéristiques des différents types de cancer humain de croissance et se sont avérés excellents pour le développement de médicaments et d' essais précliniques 55. En outre, il existe des modèles de xénogreffes de tumeurs pour la transplantation dans des animaux de laboratoire tels que des souris immunodéficientes 56. Une approche plus cliniquement liée implique la transplantation de la tumeur du patient, appelé "modèles de souris personnalisés" ou des "modèles de xénogreffes de tumeurs provenant de patients" 57. Cependant, ces modèles ne sont pas pratiques pour étudier la influence d'une seule source de cellules ou de facteur de croissance sans effets du tissu environnant.

Le modèle de boucle AV permet d'utiliser des méthodes d'ingénierie tissulaire pour étudier la biologie tumorale. Ceci est défini comme « l' ingénierie de la tumeur" par Ghajar et al. et implique "la construction de modèles de culture complexes qui récapitulent les aspects du microenvironnement tumorale in vivo pour étudier la dynamique du développement de la tumeur, la progression et la thérapie sur plusieurs échelles" 58. Un environnement de la tumeur peut être construit à l'intérieur de la chambre d'implantation d'isolement, ce qui permet une analyse précise des interactions cellule-cellule, l'angiogénèse, la modulation, la mise en valeur et d'inhibition. En outre, le modèle de boucle AV peut se révéler bénéfique pour le développement ou la validation des traitements concernant l'interruption de néovascularisation ou l'inhibition de la croissance tumorale.

En utilisant cette approche pour induire une vascularisation, il est possible de engineetissus r dans une taille cliniquement pertinente. Dans d' autres études, nous avons été en mesure de générer un tissu osseux vascularisé axialement pour la transplantation d'un important volume d'environ 15 cm³ dans un temps relativement court de 12 semaines 59,60. Afin de traduire ces résultats à la pratique clinique, une preuve d'études principe en utilisant le modèle de défaut du tibia sera réalisée dans un avenir proche avant pour une application chez l'homme. Dans un premier temps, nous avons pu démontrer avec succès in situ l' ingénierie du tissu osseux dans un grand défaut de volume dans un scénario clinique avec la stabilité à long terme 61. L'application du modèle de boucle AV décrit permet, il est possible de prévoir un traitement adapté aux besoins du patient individuel. Sur la base de nos résultats, l'idée du corps humain lui-même servant de bioréacteur vivant détient toujours très prometteur pour l'avenir.

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Acknowledgements

Nous tenons à remercier les institutions suivantes pour soutenir notre recherche en boucle AV: Staedtler Stiftung, Dr Fritz Erler Fonds, Else Kröner Fesenius Stiftung, Baxter Healthcare GmbH, DFG, IZKF / ELAN / EFI / Bureau pour l'égalité et la diversité, la Forschungsstiftung Medizin , Université Friedrich-Alexander d'Erlangen-Nuremberg (FAU), AO Foundation, Manfred Roth Stiftung, Xue Hong, Fondation Hans Georg Geis, DAAD (DAAD), en Allemagne, et le Ministère de l'Enseignement supérieur et de la recherche scientifique, Irak. Nous tenons à remercier Stefan Fleischer, Marina Milde, Katrin Köhn et Ilse Arnold-Herberth pour leur excellent support technique.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9% sodium chloride Berlin-Chemie AG 34592508
11-0 Ethilon / polyamide 6/6 Ethicon EH7438G
4-0 Vicryl / polygalactin 910 Ethicon V392H
6-0 Prolene / polypropylene Ethicon 8695H
aluminium spray Pharma Partner Vertriebs-GmbH 1020
antiseptics  BODE Chemie GmbH 
Catheter  B Braun Meslungen AG 4251612-02
contrast agent Flowtech  MV-122
embutramide, mebezonium iodide, tetracaine hydrochloride injectable solution  Intervet International GmbH
encre de chine intense Indian ink Lefranc & Bourgeois
Enrofloxacin Bayer AG
eye ointment Bayer AG
Formalin 4% Carl Roth GmbH & Co. KG P087.4
Heparin Ratiopharm GmbH
isoflurane  Abbott Laboratories 6055482
Lewis rat, male Charles River Laboratories
Metamizol-Natrium  Ratiopharm GmbH
papaverine / Paveron N Linden Arzneimittel-Vertrieb-GmbH
tramadol / Tramal Grünenthal GmbH

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