Loop Arteriovenous (AV) в модели мелких животных для изучения ангиогенеза и васкуляризированных тканевой инженерии

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Мы описываем микрохирургической подход к генерации артериовенозные (AV) петли в качестве модели для анализа васкуляризации в естественных условиях в изолированном и хорошо охарактеризованного окружающей среды. Эта модель не только полезно для исследования ангиогенеза, но и оптимально подходит для инженерных и аксиально васкуляризированных перевивных тканей.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Weigand, A., Beier, J. P., Arkudas, A., Al-Abboodi, M., Polykandriotis, E., Horch, R. E., Boos, A. M. The Arteriovenous (AV) Loop in a Small Animal Model to Study Angiogenesis and Vascularized Tissue Engineering. J. Vis. Exp. (117), e54676, doi:10.3791/54676 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Большинство тканей и органов в организме человека зависят от функциональной сети сосудов крови, которая поставляет питательные вещества, газы и обменивает удаляет продукты жизнедеятельности. Неисправность этой системы, вызванной местными или системными проблемами сосудов может привести к множеству серьезных заболеваний. Кроме того, в научных областях, таких как тканевой инженерии или восстановительной медицины, функциональная сеть кровеносных сосудов в искусственно созданных тканей или пересаженных органов является необходимым условием для успешного клинического применения.

В течение десятилетий исследователи исследовали точные механизмы, участвующие в растущей сосудистую сеть, чтобы получить более глубокое понимание патологических ситуаций, с тем чтобы найти новые терапевтические вмешательства и обеспечить более профилактики сосудистых расстройств. На первом этапе, основные процессы , такие как межклеточных взаимодействий или влияния молекул на клетках сосудистой системы, как правило , исследовали с помощью экстракорпорального 2D или 3Dэксперименты. Традиционные 2D модели легко выполнить, хорошо известны и в значительной степени способствовали лучшему пониманию этих процессов. Впервые в 1980 году, Фолкман и др. сообщили в пробирке ангиогенеза высева клеток эндотелия капилляров на желатине планшетах , покрытых 1. Это сразу же уступила публикации множества дальнейших экспериментов 2D ангиогенеза на клеточной трубки эндотелиальной формирования анализа 2, 3 анализа миграции и совместного культивирования различных типов клеток 4, а также другие. Эти анализы все еще используются сегодня и принят в качестве стандарта в пробирке методами.

Тем не менее, эта экспериментальная установка не всегда подходит для изучения поведения клеток в естественных условиях , так как большинство типов клеток требуют 3D - среде , чтобы сформировать соответствующие физиологические структуры ткани 5. Можно показать, что архитектура 3D-матрицы имеет решающее значение для капиллярного morphogenesiS 6 и что клеточно-внеклеточного матрикса (ECM) взаимодействия и 3D культуры условия регулируют важные факторы , связанные с опухолевого ангиогенеза 7. 3D матрица обеспечивает сложные механические входы, могут связывать эффекторные белки и устанавливают ткани масштабные градиенты концентрации растворенного вещества. Кроме того, считается необходимым для того , чтобы имитировать в естественных условиях морфогенетических и ремоделирования шагов в сложных тканей 5. В этих системах, как ангиогенез и образование и развитие сосудов могут быть изучены. В то время как ангиогенез описывает прорастание капилляров из уже существующих кровеносных сосудов 8, образование и развитие сосудов относится к образованию де Novo кровеносных сосудов через эндотелиальных клеток или их предшественников 9,10. Созревание судов описывается в процессе , называемом 'артериогенеза' с помощью набора гладких мышечных клеток 11. Типичным развитие кровеносных сосудов в пробирке модель является разрастание эндотелиальных клеток из существующих монослояс затравку в виде монослоя на поверхности геля, на поверхности микросфер , внедренных в геле или путем создания эндотелиальные сфероиды 12 клеток. В моделях васкулогенных одиночные эндотелиальные клетки захватываются в 3D-гель. Они взаимодействуют с соседними эндотелиальными клетками с образованием структур и сетей De Novo сосудов, как правило , в сочетании с поддерживающими клетками 12.

Тем не менее, даже комплекс 3D в моделях пробирке не могут имитировать в условиях естественных условиях полностью учитывая множество межклеточных и клеточно-ECM взаимодействиях 13. Вещества , обладающие высокой активностью в пробирке автоматически не показывают те же эффекты в естественных условиях и наоборот 14. Для всестороннего анализа процессов васкуляризации существует острая необходимость в разработке в естественных условиях модели , которые лучше имитируют ситуацию в организме. Большой диапазон в естественных условиях ангиогенеза анализы описаны в литературе, в том числехорионалантоисной анализ мембраны (САМ), то модель данио, роговичный ангиогенез анализа, спинной модель воздушный мешок, спинной складка камеры, подкожные модели опухоли 14. Тем не менее, эти анализы часто связаны с ограничениями, такими как быстрые морфологические изменения, проблемы в различении новых капилляров из уже существующих в анализе САМ, или ограниченное пространство в роговице ангиогенеза анализе 15. Кроме того, системы немлекопитающего используются (например., То данио модель 16), что приводит к проблемам в ксенотрансплантации 17. В модели подкожной опухоли, ангиогенез, происходящих только из самой опухоли не могут быть проанализированы, так как прилежащие ткани в значительной степени способствует процессу васкуляризации. Кроме того, окружающие ткани могут иметь решающую роль в формировании микросреды 18 опухолей.

Не только для изучения ангиогенеза или васкулогенеза есть сильный пее изд для стандартизированной и хорошо охарактеризованный в естественных условиях модели , но и для изучения различных стратегий васкуляризации в тканевой инженерии и регенеративной медицины. На сегодняшний день создание сложных искусственных органов или тканей возможно как в пробирке и в естественных условиях. 3D-Биопринтинг обеспечивает технологию изготовления по требованию для создания сложных 3D - ткани функциональной жизни 19. Кроме того, биореакторы могут быть использованы для создания тканей 20 или даже собственное тело может быть использован в качестве биореактора 21. Тем не менее, основным препятствием для успешного применения искусственно созданных тканей является отсутствие васкуляризации в инженерно-технических конструкций. Немедленное соединение с сосудистой сетью хозяина после трансплантации является важной предпосылкой для выживания, особенно в случае крупных искусственных тканей или органов.

Различные в пробирке или в естественных условиях стратегий prevascularization были развиOped установить функциональную микроциркуляторного русла в конструкциях до имплантации 22. Имплантация помост с ин витро предварительно сформированных сконструированных капилляров на коже спины мышей приводило к быстрому анастомоза мышей сосудистую систему в течение 23 -й день. В противоположность этому , сфероид совместно культуры , состоящей из человеческих мезенхимальных стволовых клеток и эндотелиальных клеток пупочной вены человека , собранных в трехмерную сеть prevascular дальнейшее развитие после имплантации в естественных условиях. Тем не менее, анастомоз с принимающей сосудистую сеть была ограничена 24. Прежде всего, в плохо васкуляризированных дефектов, таких как некротических или облученные областях, это так называемая внешняя васкуляризация - врастание сосудов из окрестностей в эшафоте - часто выходит из строя. Характеристическая васкуляризации, с другой стороны, основано на сосудистом оси в качестве источника новых капилляров прорастающих в строительные леса 25. Используя васкуляризации подход осевой, Инженерией ткани можно пересаживать с его осью сосудистых и соединен с местным судам на месте получателя. Сразу же после трансплантации, ткань адекватно поддерживается кислородом и питательными веществами, что создает благоприятные условия для оптимальной интеграции.

Из - за ограниченной доступности моделей для исследования ангиогенеза в естественных условиях и в знак признания растущей важности создания осевого васкуляризированных ткани, мы разработали микрохирургической подход Эрол и Спира далее для создания артериовенозного (AV) цикл в животной модели 26. Использование полностью закрытой имплантации камеры делает этот метод очень хорошо подходит для изучения формирования кровеносных сосудов под "контролируемой", хорошо охарактеризованы в условиях естественных условиях (рисунок 1). Эта модель не только полезно для исследования ангиогенеза, но также оптимально подходит для осевого васкуляризации каркасы для Engin тканиЦели eering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Уход за комитет Животный Фридриха-Александра университета Эрланген-Нюрнберга (FAU) и правительство Средней Франконии, Германия, одобрила все эксперименты. Для экспериментов, самцов крыс линии Lewis с массой тела 300 - использовали 350 г.

1. Цикл Модель Arteriovenous в Rat

  1. Процедура Имплантация (рисунок 2)
    1. Для анестезии используют специальный пластмассовый ящик , который подключен через трубку к изофлурановым испарителем и закрыто крышкой. Включите подачу газа и расходомер в пределах 0,8 - 1,5 л / мин.
    2. Поместите крысу в пластиковой коробке индукции и запечатать верхнюю часть. Включите изофлуран испаритель до 5%.
    3. Тщательно наблюдать за крысу во время индукции анестезии. После 3 - 4 мин, крыса будет наркоз.
    4. Подтверждение надлежащего анестезии: потеря рефлекса выпрямления, потеря рефлекса, пальпебральной снятие рефлекс, положительный рефлекс роговицы.
    5. Удалить крысу из коробки и проверьте еговес для расчета лекарственных средств. Нанесите мазь для глаз, чтобы предотвратить сухость под наркозом.
    6. Администрирование обезболивающее и антибиотики (например., 7,5 мг / кг Энрофлоксацин подкожно (п), 12,5 мг / кг трамадола и 100 мг / кг , метамизол внутривенно (IV)). Администрирование вес адаптированный кристаллоидов во время работы (например., 30 мл / кг подкожно).
    7. Поместите крысу на спине на разогреве пластине при 37 ° С под анестезией 1 - 2% изофлуран ингаляции вводимого через маску.
    8. Монитор анестезии правильно и увеличить изофлуран, если уровень анестезии слишком низкое (движение крыс, реакция на боль, челюсть тон, отсутствие потери рефлексов (см 1.1.4.), Частота сердечных сокращений увеличивается). Будьте осторожны, чтобы не передозировать изофлуран (потеря рефлексов роговицы, высокая частота сердечных сокращений, снижение насыщения кислородом). С помощью специального пульсоксиметрию для маленьких животных для проверки насыщения кислородом (95 - 100%) и частоту сердечных сокращений (250 - 450 / мин) у крыс. Во время Operatiна монитор температуры крысы (36 - 40 ° C) и регулировать температуру согревающей пластины при необходимости.
    9. Бритье внутренние стороны задних конечностей с электробритвы и дезинфицировать области с антисептиками. Разведите задние конечности и закрепить их с помощью клейкой ленты.
    10. Положите крысу под хирургическим микроскопом и покрывают крысу стерильной драпировки. Убедитесь в том, что вся процедура выполняется операция в стерильных условиях.
    11. Открыть кожу в середине левого бедра с продольным разрезом от верхнего колена к паху скальпелем (№ 10).
    12. Обрежьте подкожную ткань и фасции в слоях примерно 3 см в длину, используя рассекает ножницы и microforceps до бедренной кости сосудистый пучок не подвергается от тазовой артерии в паху к бифуркации бедренной артерии в колене.
    13. Отдельные сосуды и удалить адвентиции с помощью адвентиции ножницы и microforceps.
    14. Коагулировать сторона бRANCHES с помощью электрокоагуляции. Накройте поле работы с влажным компрессом.
    15. Откройте кожу на правой стороне, как описано для левой стороны, 1.1.11 - 1.1.14.
    16. Для уборки венозного трансплантата, перевязывать правую бедренную вену электрической коагуляции на проксимальных и дистальных концов на расстоянии 1 - 1,5 см.
    17. Удалите венозный трансплантат с microforceps и промойте венозный трансплантат с раствором гепарина (50 МЕ / мл в 0,9% раствора хлорида натрия), используя оросительную канюлю и передать его на левое бедро. Накройте поле операции на правой стороне с влажным компрессом.
    18. Лигирования бедренной вены на левой стороне в проксимальном направлении в паховой области с фиксатором микрососудов. Коагулировать бедренной вены дистально с помощью электрической коагуляции, на верхнем колене перед тем ветвления, на расстоянии около 2 см.
    19. Для анастомоза соединить проксимальный конец венозной трансплантата с проксимальным концом вены по впритык анастомоза с 11-0 suturе. Используйте около 8 узловыми швами. Начните с размещения первых двух швов на 12 часов и 6 часов позиции. Затем положить в 2 до 3 больше швами между этими точками на лицевой стороне, а затем положить 2 до более 3 наложения швов на заднюю сторону.
    20. Лигирования бедренной артерии таким же способом, описанным для бедренной вены (1.1.18.). Убедитесь в том, что сосуды петли не перекручены. Анастомозировать дистальный конец венозной трансплантата с проксимальным концом артерии, как описано для бедренной вены (шаги 1.1.19.).
    21. Администрирование 25 МЕ гепарина внутривенно. Сделайте еще раз убедиться, что сосуды петли не перекручены, снимите зажимы и проверьте на наличие утечек и проходимость цикла в течение примерно 5 мин.
    22. Капать папаверин (например, 4 мг / мл) на сосудах , чтобы предотвратить спазмы сосудов. Если есть проходимость, цикл расширяется и может наблюдаться пульс артерии.
    23. Предварительного заполнения имплантации камеры с первой половины (около 500 мкл) матрицы (например , </ EM>, гидрогелем или матрицу кости с или без клеток). Вставить в петлю имплантации камеры.
    24. Заполните вживления камеру со второй половины матрицы до общего объема 1000 мкл. Уплотнение камеры с крышки камеры.
    25. Закрепить имплантации камеры на бедре с нерассасывающегося 6-0 швом. Закрепите крышку отсека с нерассасывающегося 6-0 швом. Стоп возможное кровотечение с электрической коагуляции.
    26. Закройте кожу с рассасывающиеся 4-0 швами. Накройте рану с алюминиевой спрея.
    27. Администрирование антибиотики и обезболивающие препараты (например, 7,5 мг / кг подкожно Энрофлоксацин, трамадол 12,5 мг / кг перорально (п.о.) (через питьевую воду) в течение 3 - 5 дней , а после этого в зависимости от поведения у крыс).
    28. Включите испарителем и дайте крысе дышать подачи газа, пока она не начнет пробуждаться.
    29. Поместите крысу в коробку с тепловой поддержкой и наблюдать его тщательно, пока полностью не выздоровел.
    30. Не оставляйте ип крысыприсутствовал, пока он не пришел в сознание достаточное для поддержания грудины лежачее.
    31. Не вернуть крысу в компании других животных, пока полностью не выздоровел.
  2. Эксплантация Процедура
    1. Выполните эксплантация после короткого времени или длительной имплантации (в соответствии с дизайном исследования, примеры смотрите Ссылки 27-32). Обезболить крыса в соответствии с этапами 1.1.1.-1.1.9.
    2. Откройте кожу живота с скальпелем (№ 10) и двигаться в сторону кишечника с компрессом. Expose брюшной аорты и полая caudalis с помощью ватного тампона.
    3. Иглу брюшной аорты (например., 24 калибра пластиковой канюли) и сократить полая caudalis с рассекающих ножницами.
    4. Промойте брюшной аорты с 0,9% раствором натрия хлорида, содержащего 100 МЕ / мл гепарина, пока утечка жидкости не станет прозрачным. Заливать аорту с 30 мл раствора перфузии (например., Контрастный агент или Индии вк).
    5. Эвтаназии крысы путем инъекции смертельной дозы embutramide, йодид mebezonium, тетракаина гидрохлорид раствор для инъекций (0,1 - 0,2 мл / кг) в глубокой анестезии.
    6. Перевязывать брюшной аорты и полая caudalis с нерассасывающегося 4-0 швом.
    7. Закройте открытую область раны с 1 - 2 зажимами. Хранить крысе в течение 24 ч при 4 ° С (отверждение перфузионный раствор).
    8. Поместите крысу на его спине. Разведите задние конечности и закрепить их с помощью клейкой ленты.
    9. Открыть кожу над камерой с продольным разрезом скальпелем (№ 10).
    10. Удалите соединительную ткань из камеры и ножку петли, используя рассекает ножницы и microforceps. Вырезать ножку петли на расстоянии 1 см от отверстия камеры с рассекающих ножницами и снимите камеру.
    11. Откройте крышку камеры и осторожно удалите конструкцию из камеры с пинцетом и зафиксировать его в 4% буферном растворе формалина в течение 24 ч при комнатнойтемпература. После этого использовать конструкцию для 3D микро-компьютерной томографии или залитых парафином для гистологического анализа 30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

тканевая инженерия
Для технических целей костной ткани, были имплантированы целый ряд различных заменителей костной ткани в небольшом животных крысы модели AV петля 27,28,33,34. Васкуляризация вполне может быть продемонстрировано с помощью 3D микро-компьютерной томографии (микро-КТ) (рис 3А). Васкуляризация обработанной бычьей губчатой ​​кости (PBCB) матрицы была значительно выше в группе петель по сравнению с группой без васкуляризации. Постоянно растет и созревающих сеть кровеносных сосудов, разработанная в рамках имплантации камеры в течение 8 недель. От 4 до 8 недель, наблюдалось непрерывный рост сосудами ткани к центру конструкций, в то время как увеличение не было обнаружено в не васкуляризированной группе 33. Prevascularization матрицы PBCB в течение 6 недель в модели AV-петля привела к превосходной выживаемости инжектированных остеобластов по сравнению с контрольными остеобластов, В отличие от контрольных групп, экспрессия генов , специфической для кости была обнаружена в группе петель AV с имплантированными остеобластов 28. В качестве еще одной матрицы, спеченный биоактивный стекло вместе с гелем фибрина был имплантирован в принимающем АВ-петлями крыс. Через 3 недели, плотная сеть новообразованных сосудов разработала продемонстрировали микро-КТ и гистологии 27.

Имплантация камера была изменена с целью ускорения строительных лесов васкуляризации. Используя перфорированный титановый камеру, внутренняя васкуляризация была поддержана несвойственных сосудов от окружающей ткани. Как раз в 2 недели после имплантации β-трикальцийфосфат гидроксиапатита (β-TCP / HA) / матрица фибрина, 83% судов были подключены к петле AV с непрерывным увеличением с течением времени и достиг 97% соединения после 8 недель 34. При имплантации 5 х 10 6 из костного мозга мезенхимальных стволовых клеток (MSC), и костного морфогенетического белка 2 (BMP-2), значительное увеличение образования костной ткани по сравнению с БМП-2 или MSC группами отдельного введения препаратов могут быть индуцированы. Через 6 и 12 недель, матрица фибрина была полностью деградировали и заменены насыщена сосудами соединительной ткани во всех группах (фигура 3В 6 недель имплантации). Был значительное уменьшение числа сосудов в БМП-2 / MSC группе от 6 до 12 недель и после 12 недель в других группах. Вероятно , это было связано с созреванием сосудистой сети или компактного расположения костных структур , приводящих к образованию 32 сети с ограниченной сосудистой.

К тому же кости, другие ткани, такие как мышца или печень могут быть также сконструированы в модели AV-петли.

Для инженерной оси васкуляризации мышечной ткани, эксперименты с первичными миобластов в матрице фибрина AV петли были выполнены. После prevasculВремя поля- ризация от 2 -х недель в течение 2 -х , 4 и 8 недель, 1 х 10 6 миобласты были пересажены в камеру AV - петли. Пересаживают миобластов может быть даже после повторного обнаружения 8 недель с использованием карбоксифлуоресцеин диацетат сукцинимидил эфира (CFDA) маркировки. Клетки держали их миогенный фенотип в пределах матрицы фибринового и экспрессии маркеров специфических для мышц MEF-2 и десмина был положительным после 4-х недель. Тем не менее, миоген- экспрессии маркерного гена был отрицательным через 8 недель, что, вероятно , из - за отсутствия миогенными стимулов и быстрое поглощение матрицы фибринового 35. Для увеличения миогенной стимуляции, новая модификация петли крысы AV была разработана с использованием эпигастральной вены вместо подкожной вены для того, чтобы достичь более проксимального позиционирование сурдокамере. Таким образом, дополнительное включение Запирательный двигательного нерва геометрически облегчается. С помощью этой модификации контура AV, который упоминается как петли EPI, мы могли бы показать миогенный дifferentiation ко-имплантированных миобластов и MSC 36.

Для проектирования печеночной ткани 4 × 10 6 PKH-26 меченых фетальные клетки печени были пересажены в матрицу фибрина в модели петли крысы AV в течение 2 -х недель. В контрольной группе, были имплантированы матрицы без петли АВ и бесклеточных матриц. Функциональные капилляры возник из сосудов А. В. петлевых и насыщена сосудами нео- ткани наблюдалась в камере после того, как 14 дней после имплантации, как показано с помощью CD31 окрашивания и Индии маркировки чернилами. Там не было никакой разницы между группой петель бесклеточной и гепатоцитов AV. Петля А. В. васкуляризации матрицу фибринового плотно и жизнеспособные клетки плода могут быть обнаружены после того, как УВК положительным результатом PKH-26 окрашивания и клеточно-специфической цитокератин 18 (CK-18) иммуногистологии печени, главным образом, в непосредственной близости от основных сосудистых оси. уровни мРНК CK-18 были подняты в группе клеток цикла AV. нет В противоположность этому, не CK-18 expressioN может быть обнаружено в конструкциях без петли или ячеек 37.

ангиогенеза Исследования
Цикл AV состоит из трех сегментов: вены, артерии трансплантата и interpositional венозного трансплантата (ИДК) сегмента (рисунок 1). Трехмерная оценка сосудистой системы показал, что новообразованные сосуды возникла как из венозной и артериальной части, а также из венозной interponate. Наблюдалось большое количество вновь образованных сосудов из ИДК 33. С в естественных условиях MRA, сканирующей электронной микроскопии коррозионных слепков и иммунной гистологии, наблюдалось возникновение ангиогенеза в матрице фибрина между днем 10 и 14. Прежде всего, венозная и сегменты IVG породило множество капилляров и крупных сосудов. Постепенное снижение полостной калибра, как знак артериализации в ИДК в связи с увеличением внутрисосудистого давления и сдвига ва напряженийы обнаруживается с 7 -й день на 38. В дальнейших исследованиях было подтверждено , что сосудистый прорастает в основном происходит в не-артериального трансплантата 39.

Точный анализ процессов ангиогенеза и стимуляции и ингибирования образования кровеносных сосудов может быть визуализированы в имплантации петли AV камеры. Факторы роста сосудистого эндотелиального фактора роста А (VEGFA) и основной фактор роста фибробластов (bFGF) индуцировала выше абсолютной и относительной плотности сосудов и более быстрое рассасывание фибриновой матрицы по сравнению с фактором роста свободной контрольной группы 31. Кроме того, ремоделирование явления и созревании сосудистой сети в изоляционной камере визуализировали в течение имплантации течение 8 недель. В AV были определены камеры петли процессы intercapillary взаимосвязи и intussusceptive ангиогенеза, а также возможно лимфатической рост immunohistologically в качестве параметров пеovascular Созревание 39. Применяя PHD (пролил домена гидроксилазы) ингибитор DMOG (dimethyloxallyl глицин) системно на крысах, можно показать, что концентрация индуцированного гипоксией альфа-фактор (HIF-a) коррелирует с ростом васкуляризации в петле АВ и является стимул для выроста 40 судов.

Рисунок 1
Рисунок 1:. Схема петли AV в крысиной модели Цикл AV состоит из трех сегментов: вены (V), артериальную (А) трансплантата и interpositional венозный трансплантат (ИДК) сегмента. Цикл AV может быть встроен в закрытую камеру имплантации (С) для индукции внутренней васкуляризации. Нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

GE = "1"> фигура 2
Рисунок 2: AV - петля работает в Крысы (А):.. Локализация бедренного пучка на внутренней стороне задних конечностей у крыс (В / С): Приготовление бедренную сосудистого пучка в левой и правой паховой области из крыса. Сосуды разделены (D), то interpositional вены трансплантата собирают с правой стороны (E) и анастомозируют с бедренной вены (F) и бедренную артерию с левой стороны в петлю AV (G, стрелка указывает на анастомозов). Сосуды петли переносят в имплантационной камеру предварительно заполненном с матрицей (Н) и после полного заполнения (I) , крышка закрыта (J). A = бедренную артерию, V = бедренная вена, N = бедренного нерва, IVG = interpositional венозный трансплантат. Шкала бар 5 мм (DJ).tp_upload / 54676 / 54676fig2large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3: Визуализация васкуляризации в петле крысиной модели AV (А):. Микро-КТ после перфузии с контрастным агентом (желтый перфузию сосудов) (В):. Окрашивание гематоксилином-эозином костного заменителя β-TCP / HA с MSC имплантировали в AV-модели цикла крыс в течение 6 недель. Сосуды А.В. петлевые перфузировались тушью (черный цвет). Шкала масштаба 1 мм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Уже более десяти лет мы успешно использовали артериовенозного (AV) петля для тканевой инженерии целей и изучения ангиогенеза в естественных условиях в небольшой животной модели. Можно показать, что эта микрохирургической модель очень хорошо подходит для создания модифицированных тканей и что он также может быть использован для развития кровеносных сосудов или antiangiogenesis исследований.

Значимость техники в отношении существующих / альтернативных методов
Engineered ткани или органы требуют функциональной сети кровеносных сосудов , чтобы поставлять питательные вещества и кислород, необходимые им для их выживания и успешной интеграции после трансплантации в месте дефекта 41. Ряд различных стратегий prevascularization были разработаны в течение последних десятилетий, которые могут быть дифференцированы в соответствии с ин витро против в естественных условиях и приобретенную против собственных подходов.

Каркасы могут быть FabricaTed с трубчатой структуры в форме и засевали клетки сосудов , таких как эндотелиальные клетки или клетки - предшественники в пробирке 42. С другой стороны, для prevascularization в естественных условиях, каркасы имплантируют в насыщена сосудами области , такие , как подкожной или мышечной ткани 21. Затем эти наружно васкуляризирована конструкции могут быть пересажены в месте дефекта. Однако недостатком этих подходов является отсутствие микрохирургической связи с судами реципиента после трансплантации. В частности , в случае крупномасштабных конструктов, непосредственное подключение к хост - сосудистую систему имеет важное значение для немедленной поставки сконструированной ткани 43. Очевидный и наиболее перспективным решением этой проблемы заключается в генерации внутренне сосудами ткани или органа по сосудистой оси, например, модель AV цикла.

К тому же с помощью метода А. В. рамочную, как описано выше, осевая васкуляризация может Alтак быть вызвана с помощью AV пучков вместо 44 или только один сосуд , такой как эпигастральной артерии 45. Тем не менее, в ряде публикаций модель цикла АВ оказалась превосходит в отношении степени васкуляризации и количества Novo формирования де тканей. Танака и др. По сравнению как методологические подходы и формирование значительно более высокую тканевую наблюдаемыми и большую степень развивающихся капилляров в цикле по сравнению с группой 46 расслоению. Донг и др. также провели исследование с помощью петли или AV AV - расслоением подходы к инженерии костной ткани в модели кролика, которые также показали значительно более высокую плотность сосудов в контуре по сравнению с группой расслоения 47. Мы смогли подтвердить эти результаты, а также шоу в предыдущем исследовании , что модель цикла AV имеет более высокую способность к ангиогенеза 48.

Насколько нам известно, не существует сопоставимого модель для анализаваскуляризация в естественных условиях в изолированном и хорошо охарактеризованного окружающей среды. Таким образом, модель AV цикл представляет собой мощный инструмент для оценки того, как различные типы клеток или факторы роста способствуют процессам сети Сосуд формирования или васкуляризации в различных тканях без нарушений от окружающих структур, таких как вторжение в клетки или факторы роста.

Ограничения техники
Тем не менее, одна важная задача предлагаемой модели является высокая сложность операции. С одной стороны, лечение дефектов с использованием модели AV петли требует процедура двухступенчатую - prevascularization эшафота и трансплантации в месте дефекта. Это означает, что пациент должен пройти две операции. Кроме того, микрохирургические навыки являются необходимым условием для успешных анастомоз субмиллиметровом судов 49. Таким образом, AV расслоение иногда считается более полезным для клинического применения, так как ят также предлагает перспективным, хотя и менее, потенциал для ангиогенеза и формирования ткани по сравнению с контуром 46 AV. Тем не менее, эта операция может быть выучен шаг за шагом , даже не-хирургов, с использованием малого калибра кремниевых труб для обучения в начале и после него сосуды мертвых животных (например, куриные ножки) перед выполнением операции AV цикла в живое животное. В противоположность этому, наиболее практикуемые микро-хирурги могут выполнить эту операцию только на короткое время обучения.

Критические шаги в рамках Протокола
В общем случае, из-за малого калибра сосудов существует риск образования тромбов и закрытия сосудов цикла. Тем не менее, в модели на крысах 80% -100% контуров в среднем были на патент с использованием только кратковременную гепарин антикоагулянтной после операции 28,30,31,34,38,39.

Кроме того, из-за высокой сложности операции займет несколько часов (в зависимости от тон опыт хирурга). Важно, чтобы проверить правильную анестезии животных в течение всей операции и адекватно поставлять вливание для поддержания адекватного артериального давления. В послеоперационном периоде это имеет большое значение, чтобы проверить здоровье животных несколько раз, чтобы управлять анальгетическими / антибиотики, и проверить рану работы. Так как в большинстве случаев производится имплантация изолированной камеры, то возможно, что инфекция во внутренней части камеры происходит, не заметив. Поэтому очень важно поддерживать стерильность в течение всей операции и введение антибиотиков следует тщательно быть сделано в течение 3 - 5 дней.

Модификации протокола
Камера может быть индивидуально отрегулированы по размеру и форме дефекта. Кроме того, также мембраны могут быть использованы для ограждающих петлю AV в исполнении Manasseri и др. 50. Кроме того, строительные леса, зиррlemented клетки и факторы роста могут быть выбраны в соответствии с различными типами тканей. В последнее время , Miomas и др. Успешно сочетал генные терапевтические подходы с моделью AV цикла и может вызвать усиление роста сосудов путем трансдукции с VEGF165 51. В последнее время, мы скорректировали модель контура AV крысиный для технических целей мышечной ткани. Вместо того , чтобы бедренных сосудов, использовались эпигастральной вены и артерии подкожный, что позволило имплантации запирательного нерва в осевом васкуляризированной помост для двигательную иннервацию ( "модель петли EPI") 36. Кроме имплантации двигательную нерва, невротизации костной ткани инженерных конструкций с чувствительных нервов , как сообщается, быть полезным для повышения остеогенеза и лучшего ремонта костных дефектов 52. Цикл AV индуцирует минимальную болезненность донорского сайта и могут быть созданы на различных участках тела 52. Можно было бы использовать поверхностные сосуды на других сайтахтело для формирования контура AV или даже использовать другие животные, такие как кролики или мышиной модели.

Будущие приложения или направления после освоения этой технике
В последнее время наша рабочая группа имплантировали хорошо характеризуется мышиный эмбриональная эндотелиальной клеток-предшественников (EPC) линии (T17b), выражающая гуанилатциклазы связывающий белок-1 (GBP-1) - ингибитор маркера и внутриклеточный функций эндотелиальных клеток, таких как пролиферации, миграции и вторжение - в крысиной модели AV цикла. Антиангиогенного мощность дифференцированной GBP-1-EPC может быть продемонстрировано значительным уменьшением плотности кровеносного сосуда в конструкциях А. В. петлевых. Что касается клинического применения, провоспалительный антиангиогенная GTPase GBP-1 может открыть новые возможности для лечения антиангиогенных . , Например, для лечения рака или других заболеваний 53. На основании этого исследования, можно предположить, что модель AV-петля может использоваться для установления патологическоговаскуляризация сеть для дальнейшего анализа и возможной модуляции. Например, эта модель обеспечивает оптимальную возможность получить лучшее понимание ангиогенеза опухоли, ее влияющих факторов и точной роли различных клеток , участвующих в формировании сети опухоли сосудов , таких как ЕРС, опухолевые клетки и стволовые клетки 54. В естественных условиях модели рака часто проводят в генетически модифицированных мышей , чтобы имитировать процессы и характеристики роста различных типов рака человека и оказались отлично подходит для разработки лекарственных средств и доклинических испытаний 55. Кроме того, существуют модели ксенотрансплантатов для рассады опухолей экспериментальным животным , такие как иммунодефицитами мышей 56. Более клинически связанных подход включает в себя трансплантация от опухоли пациента, известный как "индивидуализированных моделей мыши" или "пациент полученных ксенотрансплантатов моделей" 57. Однако эти модели не практичны для изучения Влиянuence одного источника клеток или фактор роста одного без эффектов от окружающей ткани.

Модель AV цикл позволяет использовать методы тканевой инженерии для изучения биологии опухоли. Это определяется как "опухолевой инженерия" по Гаджар и др. и включает в себя "построение сложных моделей культуры , что резюмировать аспекты микросреды опухоли в естественных условиях для изучения динамики развития опухоли, прогрессии и терапии на различных масштабах" 58. Среда опухоль может быть построена в изолированной имплантации камеры, что позволяет точный анализ межклеточных взаимодействий, ангиогенез, модуляции, усиления и торможения. Кроме того, модель цикла AV может оказаться полезным для разработки или проверки терапии по поводу прерывания неоангиогенезом или ингибирования роста опухоли.

При использовании этого подхода для индукции васкуляризации, можно Engineeг ткани в клинически значимых размеров. В дальнейших исследованиях, мы смогли произвести аксиально развитую сосудистую сеть костной ткани для трансплантации со значительным объемом около 15 куб.см в относительно короткий промежуток времени 12 недель 59,60. Для того, чтобы претворить эти выводы к клинической практике, доказательство принципа исследования с использованием модели дефекта голени будет выполнена в ближайшее время перед для применения у людей. В качестве первого шага, мы смогли успешно продемонстрировать на месте инженерии костной ткани в в большом объеме дефекта в клиническом сценарии с долговременной стабильностью 61. Применение модели петли, описанной AV делает это возможным обеспечить терапию с учетом требований индивидуального пациента. На основании полученных результатов идея человеческого тела сама по себе, выступающей в качестве живого биореактора по-прежнему имеет большие перспективы на будущее.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Мы хотели бы поблагодарить следующие институты за поддержку нашего исследования AV цикла: Staedtler Stiftung, д-р Фриц Эрлер Fonds, Else Kröner Fesenius Stiftung, Baxter Healthcare GmbH, ДФГ, IZKF / ELAN / EFI / Бюро по гендерным вопросам и разнообразию, Forschungsstiftung MEDIZIN Фридрих-Александер университет Эрлангена-Нюрнберга (FAU), АО Фонд, Манфред Рот Stiftung, Сюэ Хонг, Ганс Георг Гайс Foundation, Deutscher Akademischer Austauschdienst (DAAD), Германии и Министерством высшего образования и научных исследований, Ирак. Мы хотели бы поблагодарить Стефан Флейшер, Марина Milde, Katrin Кона и Ильзе Арнольда-Герберта за их отличную техническую поддержку.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9% sodium chloride Berlin-Chemie AG 34592508
11-0 Ethilon / polyamide 6/6 Ethicon EH7438G
4-0 Vicryl / polygalactin 910 Ethicon V392H
6-0 Prolene / polypropylene Ethicon 8695H
aluminium spray Pharma Partner Vertriebs-GmbH 1020
antiseptics  BODE Chemie GmbH 
Catheter  B Braun Meslungen AG 4251612-02
contrast agent Flowtech  MV-122
embutramide, mebezonium iodide, tetracaine hydrochloride injectable solution  Intervet International GmbH
encre de chine intense Indian ink Lefranc & Bourgeois
Enrofloxacin Bayer AG
eye ointment Bayer AG
Formalin 4% Carl Roth GmbH & Co. KG P087.4
Heparin Ratiopharm GmbH
isoflurane  Abbott Laboratories 6055482
Lewis rat, male Charles River Laboratories
Metamizol-Natrium  Ratiopharm GmbH
papaverine / Paveron N Linden Arzneimittel-Vertrieb-GmbH
tramadol / Tramal Grünenthal GmbH

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Folkman, J., Haudenschild, C. Angiogenesis in vitro. Nature. 288, (5791), 551-556 (1980).
  2. DeCicco-Skinner, K. L., et al. Endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis. J Vis Exp. (91), e51312 (2014).
  3. Puddu, A., Sanguineti, R., Traverso, C. E., Viviani, G. L., Nicolo, M. Response to anti-VEGF-A treatment of endothelial cells in vitro. Exp Eye Res. 146, 128-136 (2016).
  4. Li, H., Daculsi, R., Bareille, R., Bourget, C., Amedee, J. uPA and MMP-2 were involved in self-assembled network formation in a two dimensional co-culture model of bone marrow stromal cells and endothelial cells. J Cell Biochem. 114, (3), 650-657 (2013).
  5. Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nat Rev Mol Cell Biol. 7, (3), 211-224 (2006).
  6. Nehls, V., Herrmann, R. The configuration of fibrin clots determines capillary morphogenesis and endothelial cell migration. Microvasc Res. 51, (3), 347-364 (1996).
  7. Fischbach, C., et al. Cancer cell angiogenic capability is regulated by 3D culture and integrin engagement. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (2), 399-404 (2009).
  8. Logsdon, E. A., Finley, S. D., Popel, A. S., Mac Gabhann, F. A systems biology view of blood vessel growth and remodelling. J Cell Mol Med. 18, (8), 1491-1508 (2014).
  9. Kaully, T., Kaufman-Francis, K., Lesman, A., Levenberg, S. Vascularization--the conduit to viable engineered tissues. Tissue Eng Part B Rev. 15, (2), 159-169 (2009).
  10. Risau, W. Mechanisms of angiogenesis. Nature. 386, (6626), 671-674 (1997).
  11. Carmeliet, P. Mechanisms of angiogenesis and arteriogenesis. Nat Med. 6, (4), 389-395 (2000).
  12. Morin, K. T., Tranquillo, R. T. In vitro models of angiogenesis and vasculogenesis in fibrin gel. Exp Cell Res. 319, (16), 2409-2417 (2013).
  13. Ucuzian, A. A., Greisler, H. P. In vitro models of angiogenesis. World J Surg. 31, (4), 654-663 (2007).
  14. Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int J Exp Pathol. 90, (3), 195-221 (2009).
  15. Tahergorabi, Z., Khazaei, M. A review on angiogenesis and its assays. Iran J Basic Med Sci. 15, (6), 1110-1126 (2012).
  16. Agostini, S., et al. Barley beta-glucan promotes MnSOD expression and enhances angiogenesis under oxidative microenvironment. J Cell Mol Med. 19, (1), 227-238 (2015).
  17. Zhang, B., Xuan, C., Ji, Y., Zhang, W., Wang, D. Zebrafish xenotransplantation as a tool for in vivo cancer study. Fam Cancer. 14, (3), 487-493 (2015).
  18. Devaud, C., et al. Tissues in different anatomical sites can sculpt and vary the tumor microenvironment to affect responses to therapy. Mol Ther. 22, (1), 18-27 (2014).
  19. Min, Z., Shichang, Z., Chen, X., Yufang, Z., Changqing, Z. 3D-printed dimethyloxallyl glycine delivery scaffolds to improve angiogenesis and osteogenesis. Biomater Sci. 3, (8), 1236-1244 (2015).
  20. Sundaram, S., et al. Tissue-engineered vascular grafts created from human induced pluripotent stem cells. Stem Cells Transl Med. 3, (12), 1535-1543 (2014).
  21. Hori, A., Agata, H., Takaoka, M., Tojo, A., Kagami, H. Effect of Cell Seeding Conditions on the Efficiency of In Vivo Bone Formation. Int J Oral Maxillofac Implants. 31, (1), 232-239 (2016).
  22. Laschke, M. W., Menger, M. D. Prevascularization in tissue engineering: Current concepts and future directions. Biotechnol Adv. (2015).
  23. Wong, H. K., et al. Novel method to improve vascularization of tissue engineered constructs with biodegradable fibers. Biofabrication. 8, (1), 015004 (2016).
  24. Rouwkema, J., de Boer, J., Van Blitterswijk, C. A. Endothelial cells assemble into a 3-dimensional prevascular network in a bone tissue engineering construct. Tissue Eng. 12, (9), 2685-2693 (2006).
  25. Lokmic, Z., Mitchell, G. M. Engineering the microcirculation. Tissue Eng Part B Rev. 14, (1), 87-103 (2008).
  26. Erol, O. O., Spira, M. New capillary bed formation with a surgically constructed arteriovenous fistula. Surg Forum. 30, 530-531 (1979).
  27. Arkudas, A., et al. Evaluation of angiogenesis of bioactive glass in the arteriovenous loop model. Tissue Eng Part C Methods. 19, (6), 479-486 (2013).
  28. Arkudas, A., et al. Axial prevascularization of porous matrices using an arteriovenous loop promotes survival and differentiation of transplanted autologous osteoblasts. Tissue Eng. 13, (7), 1549-1560 (2007).
  29. Arkudas, A., et al. Composition of fibrin glues significantly influences axial vascularization and degradation in isolation chamber model. Blood Coagul Fibrinolysis. 23, (5), 419-427 (2012).
  30. Arkudas, A., et al. Dose-finding study of fibrin gel-immobilized vascular endothelial growth factor 165 and basic fibroblast growth factor in the arteriovenous loop rat model. Tissue Eng Part A. 15, (9), 2501-2511 (2009).
  31. Arkudas, A., et al. Fibrin gel-immobilized VEGF and bFGF efficiently stimulate angiogenesis in the AV loop model. Mol Med. 13, (9-10), 480-487 (2007).
  32. Buehrer, G., et al. Combination of BMP2 and MSCs significantly increases bone formation in the rat arterio-venous loop model. Tissue Eng Part A. 21, (1-2), 96-105 (2015).
  33. Kneser, U., et al. Engineering of vascularized transplantable bone tissues: induction of axial vascularization in an osteoconductive matrix using an arteriovenous loop. Tissue Eng. 12, (7), 1721-1731 (2006).
  34. Arkudas, A., et al. Combination of extrinsic and intrinsic pathways significantly accelerates axial vascularization of bioartificial tissues. Plast Reconstr Surg. 129, (1), 55e-65e (2012).
  35. Bach, A. D., et al. A new approach to tissue engineering of vascularized skeletal muscle. J Cell Mol Med. 10, (3), 716-726 (2006).
  36. Bitto, F. F., et al. Myogenic differentiation of mesenchymal stem cells in a newly developed neurotised AV-loop model. Biomed Res Int. 2013, 935046 (2013).
  37. Fiegel, H. C., et al. Foetal hepatocyte transplantation in a vascularized AV-Loop transplantation model in the rat. J Cell Mol Med. 14, (1-2), 267-274 (2010).
  38. Polykandriotis, E., et al. The venous graft as an effector of early angiogenesis in a fibrin matrix. Microvasc Res. 75, (1), 25-33 (2008).
  39. Polykandriotis, E., et al. Regression and persistence: remodelling in a tissue engineered axial vascular assembly. J Cell Mol Med. 13, (10), 4166-4175 (2009).
  40. Yuan, Q., et al. PHDs inhibitor DMOG promotes the vascularization process in the AV loop by HIF-1a up-regulation and the preliminary discussion on its kinetics in rat. BMC Biotechnol. 14, 112 (2014).
  41. Dew, L., MacNeil, S., Chong, C. K. Vascularization strategies for tissue engineers. Regen Med. 10, (2), 211-224 (2015).
  42. Kang, Y., Mochizuki, N., Khademhosseini, A., Fukuda, J., Yang, Y. Engineering a vascularized collagen-beta-tricalcium phosphate graft using an electrochemical approach. Acta Biomater. 11, 449-458 (2015).
  43. Novosel, E. C., Kleinhans, C., Kluger, P. J. Vascularization is the key challenge in tissue engineering. Adv Drug Deliv Rev. 63, (4-5), 300-311 (2011).
  44. Zimmerer, R., Jehn, P., Spalthoff, S., Kokemuller, H., Gellrich, N. C. Prefabrication of vascularized facial bones. Chirurg. 86, (3), 254-258 (2015).
  45. Dunda, S. E., et al. In Vitro and In Vivo Biocompatibility of a Novel, 3-Dimensional Cellulose Matrix Structure. Handchir Mikrochir Plast Chir. 47, (6), 378-383 (2015).
  46. Tanaka, Y., et al. Tissue engineering skin flaps: which vascular carrier, arteriovenous shunt loop or arteriovenous bundle, has more potential for angiogenesis and tissue generation? Plast Reconstr Surg. 112, (6), 1636-1644 (2003).
  47. Dong, Q. S., et al. Prefabrication of axial vascularized tissue engineering coral bone by an arteriovenous loop: a better model. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 32, (6), 1536-1541 (2012).
  48. Polykandriotis, E., et al. Prevascularisation strategies in tissue engineering. Handchir Mikrochir Plast Chir. 38, (4), 217-223 (2006).
  49. Mofikoya, B. O., Ugburo, A. O., Bankole, O. B. Does open guide suture technique improve the patency rate in submillimeter rat artery anastomosis? Handchir Mikrochir Plast Chir. 46, (2), 105-107 (2014).
  50. Manasseri, B., et al. Microsurgical arterovenous loops and biological templates: a novel in vivo chamber for tissue engineering. Microsurgery. 27, (7), 623-629 (2007).
  51. Moimas, S., et al. AAV vector encoding human VEGF165-transduced pectineus muscular flaps increase the formation of new tissue through induction of angiogenesis in an in vivo chamber for tissue engineering: A technique to enhance tissue and vessels in microsurgically engineered tissue. J Tissue Eng. 6, (2015).
  52. Fan, J., et al. Microsurgical techniques used to construct the vascularized and neurotized tissue engineered bone. Biomed Res Int. 2014, 281872 (2014).
  53. Bleiziffer, O., et al. Guanylate-binding protein 1 expression from embryonal endothelial progenitor cells reduces blood vessel density and cellular apoptosis in an axially vascularised tissue-engineered construct. BMC Biotechnol. 12, 94 (2012).
  54. Horch, R. E., et al. Cancer research by means of tissue engineering--is there a rationale? J Cell Mol Med. 17, (10), 1197-1206 (2013).
  55. Lee, H. Genetically engineered mouse models for drug development and preclinical trials. Biomol Ther (Seoul). 22, (4), 267-274 (2014).
  56. Willey, C. D., Gilbert, A. N., Anderson, J. C., Gillespie, G. Y. Patient-Derived Xenografts as a Model System for Radiation Research). Semin Radiat Oncol. 25, (4), 273-280 (2015).
  57. Guiro, K., Arinzeh, T. L. Bioengineering Models for Breast Cancer Research. Breast Cancer (Auckl). 9, (Suppl 2), 57-70 (2015).
  58. Ghajar, C. M., Bissell, M. J. Tumor engineering: the other face of tissue engineering. Tissue Eng Part A. 16, (7), 2153-2156 (2010).
  59. Boos, A. M., et al. Engineering axially vascularized bone in the sheep arteriovenous-loop model. J Tissue Eng Regen Med. 7, (8), 654-664 (2013).
  60. Weigand, A., et al. Acceleration of vascularized bone tissue-engineered constructs in a large animal model combining intrinsic and extrinsic vascularization. Tissue Eng Part A. 21, (9-10), 1680-1694 (2015).
  61. Horch, R. E., Beier, J. P., Kneser, U., Arkudas, A. Successful human long-term application of in situ bone tissue engineering. J Cell Mol Med. 18, (7), 1478-1485 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics