Karakterisering af Multi-subunit proteinkomplekser af menneskelig MxA Brug ikke-denaturering Polyacrylamid Gel-elektroforese

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Nigg, P. E., Pavlovic, J. Characterization of Multi-subunit Protein Complexes of Human MxA Using Non-denaturing Polyacrylamide Gel-electrophoresis. J. Vis. Exp. (116), e54683, doi:10.3791/54683 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Den kvaternære struktur af et protein spiller en afgørende rolle i mange cellulære processer. Signalveje, genekspression og enzym aktivering / deaktivering alle afhængige af korrekt montering af proteinkomplekser 1-4. Denne proces kaldes også homo- eller hetero-oligomerisering skyldes irreversibel kovalente eller reversible elektrostatiske og hydrofobe protein-protein interaktioner. Oligomerisering ikke kun diversificerer de forskellige cellulære processer uden at øge genom størrelse, men også tilvejebringer en strategi for proteiner for at opbygge stabile komplekser, der er mere modstandsdygtigt over for denaturering og nedbrydning 5. Defekter i oligomerisering have en indvirkning på funktionen af ​​proteiner og kan føre til udvikling af sygdomme. For eksempel enzymet phenylalanin hydroxylase danner et tetramert kompleks. Nogle mutationer i proteinet komplekset kan svække tetrameren dannelse og føre til sygdommen phenylketonuri 6.

7. Det hører til superfamilien af dynamin-lignende store GTPaser og har kapacitet til at danne store oligomere strukturer in vitro 8. Oligomerisering er blevet foreslået for at beskytte MxA fra hurtig nedbrydning 9,10. Trods intens indsats fra mange forskergrupper, den molekylære virkningsmekanisme stort set undvigende og rolle oligomerisering staten MxA for sin antivirale funktion er under debat 9,11,12. I denne henseende Gao og medarbejdere foreslået en model, hvor MxA udøver sin antivirale aktivitet ved at interagere med virale nukleoproteiner i form af store ringlignende oligomere strukturer 11. Mere nylig demonstreret vi imidlertid, at MxA dimerer udviser antiviral aktivitet og interagerer med nucleoproteinet af influenza A-virus 12. Based på krystalstrukturen af MxA, Gao og kolleger identificeret flere aminosyrerester i grænsefladen regioner, der er afgørende for dets oligomerisering in vitro og dens antivirale funktion 11,13. Derfor, for at belyse hvilke oligomere tilstand af MxA udøver antiviral aktivitet, vi søgte at etablere en enkel protokol til hurtigt at bestemme den oligmeric stat MxA grænseflade mutanter udtrykt i humane celler samt endogene MxA udtrykte efter IFNa stimulering.

Selvom der er mange teknikker, der almindeligvis anvendes til at undersøge interaktionen mellem proteiner, såsom split-grønt fluorescerende protein (split-GFP) komplementation assay 14, overfladeplasmonresonans 15 og Forster-resonansenergioverførsel (FRET) 16, de giver ikke information om den nøjagtige støkiometri af et oligomert proteinkompleks. Til undersøgelse af dette særlige aspekt, teknikker såsommulti-vinkel lysspredning (MALS) 17 og analytisk ultracentrifugering 18 er meget nyttige. Normalt de analyserede ved hjælp af disse metoder proteiner er oprensede proteiner. Oligomerisering processer kan også afhænge af andre cellulære faktorer. Hvis disse faktorer er ukendte, analysen er vanskeligere. Derudover nogle proteiner er svært at udtrykke i E. coli og at oprense. Derfor er disse metoder ikke det optimale valg til at analysere protein oligomerisering i det cellulære miljø. Desuden er disse teknikker kræver dyre instrumenter, som ikke er let tilgængelige.

Ikke-denaturerende polyacrylamidgelelektroforese (PAGE), gelpermeationskromatografi eller kemisk tværbinding efterfulgt af konventionel natriumdodecylsulfat (SDS) PAGE er nyttige værktøjer til bestemmelse af dannelsen af oligomerer fra cellelysater 2,19,20. Disse metoder kræver ikke specialudstyr og kan være let performed i en standard laboratorium. Vi oprindeligt evalueret forskellige kemiske krydsbindende protokoller, invariantly førte til ikke-specifik aggregering og udfældning af MxA. Derfor vi næste testede ikke-denaturering PAGE protokoller. Som ikke-denaturerende PAGE udelukker anvendelsen af ​​SDS, migrationen af ​​proteiner afhænger af deres native ladning. Blue-nativ PAGE bruger coomassie brilliant blue G250 at indlæse proteiner med en samlet negativ ladning, svarende til SDS, men ikke denaturerer proteinet 21. Desværre Coomassie Brilliant Blue udfældninger i nærvær af høje salte og divalente kationer (f.eks Mg 2+), der ofte indgår i lysis buffere. Afhængigt af de anvendte buffere, kan det være vanskeligt at analysere prøven uden yderligere optimering af trin, der kan have en effekt på den oligomere proteinkompleks.

Vi præsenterer her en simpel protokol baseret på en tidligere publiceret metode 22 til bestemmelse oligomerisering afhumant MxA protein af cellelysater ved hjælp af ikke-denaturerende PAGE.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BEMÆRK: Denne protokol er baseret på den tidligere offentliggjorte ikke-denaturerende PAGE protokol 12. I denne undersøgelse blev den oligomere tilstand MxA protein vurderet ved hjælp af enten Vero-celler overeksprimerer MxA eller IFN-a-stimulerede A549 celler, der udtrykker endogene MxA. Den nedenfor beskrevne protokol kan bruges til at analysere den oligomere tilstand helst protein foruden MxA. Dog kan det være nødvendigt yderligere optimering.

1. Udarbejdelse af cellelysat for Non-denaturering SIDE

BEMÆRK: For at analysere oligomere tilstand af den menneskelige MxA protein i enten Vero eller A549 celler, blev 1,0 x 10 6 celler høstet. Afhængigt af celletypen eller overflod af proteinet til at analysere, bør celleantallet justeres. Det er også vigtigt at beskytte lyseringspufferen fra lyseksponering, så snart tilsættes den lysfølsomme iodacetamid.

  1. Seed 0,3 x 10 6 A549 eller Vero-celler per brønd itil 6 brønd-skåle. Holde cellerne i 2 ml vækstmedium per brønd (se tabel 1). Cellerne inkuberes natten over i en cellekultur inkubator (37 ° C, 5% CO2).
  2. Cellerne høstes ved vaskning med 1 ml phosphatbufret saltvand (PBS) og tag ved tilsætning af 0,5 ml 0,25% trypsin-ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) 1x opløsning i ca. 5 minutter ved stuetemperatur.
  3. Så snart cellerne løsnes fra skålen, tilsæt 0,5 ml vækstmedium og omhyggeligt blandes ved pipettering op og ned.
  4. Overfør cellerne i hver brønd i en 2 ml rør og pelletere dem ved anvendelse af en bordcentrifuge (5000 xg, 4 ° C, 5 min).
  5. Fjern forsigtigt supernatanten ved pipettering uden at forstyrre cellepelleten.
  6. Vask cellerne med 1 ml iskold PBS ved omhyggeligt at pipettere cellesuspensionen op og ned.
  7. Pellet celler i en bordplade centrifuge (5000 xg, 4 ° C, 5 min).
  8. Fjern forsigtigt supernatanten ved pipettering without aftagning cellepelleten.
  9. Resuspender celler i 200 pi iskold lysepuffer (se tabel 1) ved pipettering op og ned og lagt på is.
  10. Straks, beskytte lysat mod lys ved at dække rørene ved hjælp sølvpapir og inkuberes i 30 minutter på is.
    BEMÆRK: Efter inkubation i 30 minutter på is, er det ikke længere nødvendigt at beskytte lysatet fra lyseksponering, da beskyttelsen af ​​de frie thiolgrupper er irreversibel.
  11. Fjerne cellerester ved centrifugering i en præ-kølet bordcentrifuge (13.000 xg, 4 ° C, 20 min).
  12. Ækvilibrere dialyse kolonner i dialyse buffer (tabel 1) i kølerum ved 4 ° C i 20 min under centrifugering. Brug en søjle med en molekylvægtsudelukkelsesgrænse på 10.000.
    1. Fastgør kolonnerne til en float bøje og sætte dem ind i et bæger fyldt med dialyse buffer. For at sikre skånsom omrøring bruge en magnetomrører. Rør ikke ved membranen.
      BEMÆRK: Dialyser kolonner kan købes eller forberedt fra 1,5 ml rør ifølge protokollen beskrevet af Fiala og medarbejdere 19.
  13. Fjern kolonnerne fra dialysebufferen og svømmeren bøjen. Overfør klarede lysater i den klargjorte dialyse søjlen ved pipettering uden at røre membranen. Fastgør kolonnerne til en float bøje og sætte dem tilbage i bægeret fyldt med dialyse buffer.
  14. Dialysere lysatet i et bægerglas indeholdende iskold dialyse puffer (tabel 1) i mindst 4 timer (eller fortrinsvis natten over) ved 4 ° C under omhyggeligt omrøring med en magnetomrører. Brug mindst 100 ml dialysepuffer til 200 pi lysat.
  15. Overfør dialyseret prøve i et 1,5 ml rør. Fjern præcipitater ved centrifugering i en bordcentrifuge (13.000 xg, 4 ° C, 20 min). For at forhindre dissociation af oligomere protein komplekser fortsætter med protokollen (afsnit 2) umiddelbart efter dialyse. Må ikke frysesde forberedte lysater.

2. Elektroforese

BEMÆRK: Elektroforese blev udført som beskrevet før med nogle ændringer 22. I protokollen beskrevet nedenfor, blev præ-støbte gradient geler anvendt (4-15% gradient). Alternativt kan gelerne fremstilles i laboratoriet. Det er meget vigtigt at udelukke enhver denatureringsmiddel, såsom SDS at forhindre dissociation af de oligomere proteinkomplekser. Tid af elektroforese blev optimeret til de forskellige oligomere tilstande af det humane MxA protein. Det kan imidlertid variere for andre proteiner, afhængigt af størrelsen af ​​den oligomere kompleks samt udvalget af adskillelse, der formodes at være opnået at analysere komplekset. Derfor bør det optimale tidspunkt for elektroforese bestemmes empirisk. For optimal opløsning af oligomererne skal analyseres den nuværende bør ikke overstige 25 mA.

  1. Saml ikke-denaturerende PAGE-gel i gelen kammeret. Fyld than indre og ydre kammer med præ-kølet drift puffer (tabel 1).
  2. Pre-run gelen med præ-kølet kører buffer ved 25 mA per gel i 15 minutter i det kolde rum ved 4 ° C.
  3. Bland 15 pi af den ovenfor fremstillede lysater med 5 pi 4x prøvebuffer (tabel 1). Du må ikke koge prøven.
  4. Læg 15 pi prøve og en naturligt forekommende protein standard valg på gelen. Kør gel ved 25 mA i 4 timer i kølerum ved 4 ° C.
    BEMÆRK: semi-kvantitative analyser, et protein kvantificering protokol (f.eks Bradford proteinassay 23) kan udføres for at sikre indlæsning af lige mængder af total protein per bane.

3. Western Blot

BEMÆRK: Beskrevet nedenfor er den protokol af en våd western blot systemet. Alle Blottingmembranen kan anvendes. Aktiver polyvinylidenfluorid (PVDF) membraner i 100% methanol før ækvilibrering i blotting buffer. Den halvtørre western blot-teknik kan anvendes alternativt, men har skal optimeres for store oligomere komplekser.

  1. Skil gelen og omhyggeligt overføre det ind i SDS buffer (tabel 1).
  2. Inkuber i 10 minutter ved stuetemperatur under forsigtig omrystning.
  3. Forbered 2 svampe, 4 cellulosefilterpapir ark og en Blottingmembranen per gel. Suge dem i blotting-puffer (tabel 1).
  4. Saml sandwich som følger (bund til top): 1 svamp, 2 cellulose- filter papirark, membran, gel, 2 cellulose- filter papirark, 1 svamp.
  5. Sæt sandwich i blotting tank. Sørg for, at membranen vender mod plus pol, mens gelen vender minus pol.
  6. Fyld blotting tanken med præ-kølet blotting buffer.
  7. Blot 90 mA natten over ved 4 ° C i bedste protein transfer resultater.
  8. Skil sandwich og visualisere proteinstandarden ved at inkubere membranen i Ponceau S opløsning i 5 minutter ved stuetemperatur.
  9. Affarves membranen ved forsigtigt at vaske off Ponceau S med deioniseret vand, indtil du tydeligt kan se bands af proteinet standard.
  10. Marker bånd proteinet standard ved hjælp af en pen.
    BEMÆRK: Residual Ponceau S kan interferere med immunfarvning. For at undgå dette, kan membranen affarvet yderligere ved inkubering i 0,1 M NaOH i 1 min og efterfølgende vask med deioniseret vand.
  11. Blokere membranen med blokerende buffer (se tabel 1) i mindst 1 time ved stuetemperatur eller natten over ved 4 ° C.
  12. Visualisere protein (er) af interesse ved immunofarvning under anvendelse af antistoffer rettet mod proteinet, der skal analyseres.
    BEMÆRK: Det humane MxA protein blev visualiseret under anvendelse af kanin-polyklonalt antistof specifikt for humant Mx1 fortyndet 1: 1.000 i blokeringsbuffer (tabel 1). Antistofopløsningen blev inkuberet natten over ved 4 ° C. Alternativt det monoklonale enNTI-MxA antistof (klon 143) kan anvendes (data ikke vist) 24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Anvendelse af ikke-denaturerende PAGE analyserede vi den oligomere tilstand af den humane vildtype MxA, de dimere grænseflade mutanter MxA (R640A) og MxA (L617D) samt den monomere grænseflade mutant MxA (M527D) fra cellelysater 12. Celler blev lyseret i en buffer indeholdende 1% octylphenoxypolyethoxyethanol (NP-40) og iodacetamid at sikre proteinopløseliggørelse og beskyttelse af frie thiolgrupper (se figur 1). Som beskrevet før, blev salt og små metabolitter fjernes ved dialyse 19. Protein adskillelse blev udført af ikke-denaturerende PAGE. For at lette effektiv western blotting blev gelen inkuberet i SDS buffer inden blotting. De MxA proteiner blev visualiseret ved immunfarvning under anvendelse af et kanin-polyklonalt antistof rettet mod MxA. Arbejdsgangen er beskrevet i figur 2.

At sammenligne den oligomere tilstand af endogene humane MxA protein fra IFN-α ; stimulerede A549-celler, transficerede vi Vero-celler (der mangler endogene MxA) med rekombinant vildtype, monomere og dimere MxA varianter. Disse rekombinante vildtype, monomere og dimere MxA varianter dannet stabile tetramerer, monomerer og dimerer, når det blev sammenlignet med en ufarvet native protein markør (figur 3A). Derfor brugte vi disse rekombinante proteiner til at vurdere den oligomere tilstand af endogene humane MxA protein afledt af IFN-α stimulerede A549-celler. Figur 3B viser, at størrelsen af MxA i lysater af IFN-a-stimulerede A549-celler svarer til en tetramer.

Tilsammen beskriver vi en metode til at bestemme den oligomere tilstand af det humane MxA proteinet fra cellelysat. Vores ikke-denaturerende PAGE tilgang kan også anvendes til at vurdere den oligomere tilstand af andre oligomere proteinkomplekser.

83 / 54683fig1.jpg "/>
Figur 1:. Struktur og reaktionsskema af iodacetamid Iodacetamid irreversibelt beskytter thiolgruppen af frie cysteiner ved dannelse af en thioetherbinding. Denne stabile modifikation resultater fra nukleofil substitution af jod med svovlatomet fra cystein. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2:. Arbejdsgang diagram af ikke-denaturerende PAGE En systematisk repræsentation af ikke-denaturerende PAGE tilgang af cellelysater. Under cellelyse, detergenter solubilisere proteinerne og thiolgrupper er beskyttet af iodacetamid til at forhindre proteinaggregering. Dialyse fjerner små metabolitter og salte, der kan forstyrre ikke-denaturerende PAGE Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3: Bestemmelse af den oligomere tilstand af det humane MxA proteinet ved hjælp af ikke-denaturerende PAGE og Western blotting (A) Rekombinant MxA varianter ektopisk udtrykt i Vero-celler.. De komplekser af vildtype MxA (tetramer) grænseflade mutanter MxA (R640A), MxA (L617D) (dimerer) og MxA (M527D) migrere på deres forventede molekylvægte, bekræfter deres oligomere tilstand. (B) A549-celler blev stimuleret med 1000 IU pr IFN-α at inducere MxA ekspression. Den endogene MxA shOWS et band, der svarer til den tetrameriske formularen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Buffer navn Tilfreds Kommentarer
lyseringsbuffer 20 mM Tris-HCI (pH 7,5),
150 mM NaCl,
5 mM MgCl2,
100 uM iodacetamid,
50 mM NaF,
1 mM Na 3 VO 4,
1% NP-40,
50 mM β-glycerophosphat,
1 tablet per 50 ml lysepuffer af frie EDTA, protease inhibitor cocktail
Tilføj iodacetamid, NaF, Na 3 VO 4, octylphenoxypolyethoxyethanol (NP-40), β-glycerophosphat og protease inhibitor cocktail lige før cellelysis

Iodacetamid er lysfølsomt og ustabile når i opløsning. Undgå lys eksponering og opløse lige før brug.
dialysepuffer 20 mM Tris-HCI (pH 6,8),
10% glycerol,
0,1% CHAPS,
0,5 mM DTT
CHAPS kan raplaced af andre ikke-denaturering rengøringsmidler
løbebuffer 25 mM Tris-HCI (pH 8,3),
192 mM glycin,
0,1% CHAPS,
0,5 mM DTT
Ved pH 8,3, er negativt ladede fleste proteiner. Men for basiske proteiner, bør anvendes en sur pH. Ellers vil proteinerne løbe ind i den modsatte retning og vil gå tabt.

CHAPS kan erstattes af andre ikke-denaturering rengøringsmidler
prøvepuffer 310 mM Tris-HCI (pH 6,8),
0,05% bromphenolblåt,
50% glycerol
SDS buffer 25 mM Tris-HCI (pH 8,3),
192 mM glycin,
0,1% SDS
blottingpuffer 25 mM Tris,
192 mM glycin,
20% methanol
For meget store komplekser, kan Methanol udelades,
blokerende buffer 50 mM Tris-HCI (pH 7,4)
150 mM NaCl
0,05% Tween 20
5% mælkepulver
vækstmedium Dulbeccos modificerede medium
1x penicillin / streptomycin
2 mM glutamin
10% føtalt kalveserum

Tabel 1: Buffer opskrifter kræves til ikke-denaturerende PAGE.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her beskriver vi en simpel metode, der tillader hurtig bestemmelse af den oligomere tilstand proteiner udtrykt i mammale celler ved ikke-denaturerende PAGE efterfulgt af Western blot analyse. Den største fordel ved denne fremgangsmåde er, at den oligomere tilstand af et givet protein kan bestemmes ud fra helcellelysater uden forudgående oprensning protein. Dette kan være vigtigt for proteiner, oligomerisere eller udøver deres funktion i forbindelse med hjælpestoffer faktorer. Desuden er proteinerne stadig i deres native tilstand, og hvis yderligere ekstraheret fra gelen, kan bestemmes den enzymatiske aktivitet eller andre protein fungerer og korreleret til den oligomere tilstand.

Et kritisk aspekt af denne protokol er valget af rengøringsmidler under forberedelsen. Dette er af særlig betydning for proteiner associeret med cellulære membraner. MxA synes at være primært forbundet med membraner af den glatte endoplasmatiske reticulum 25 19 nærvær af 0,1% 3 - [(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propansulfonat (CHAPS) var påkrævet for at forhindre udfældning af MxA under gel elektroforese. Hertil kommer, at CHAPS ikke interfererer med den enzymatiske aktivitet af MxA som bestemt med renset rekombinant MxA protein udtrykt i E. coli 12. Det er af stor betydning, at rengøringsmidlet ikke denaturerer proteinerne eller afbryder protein-protein interaktioner under lysis. Ikke-denaturerende detergenter, såsom NP40, octoxinol 9, digitonin og CHAPS er egnede til opløseliggørelse. Valget af vaskemiddel og dets koncentration skal bestemmes empirisk. Vaskemidlet kan også påvirke downstream eksperimenter f.eks for visse analyser vaskemiddel skalfjernet som opnås nemt med CHAPS ved dialyse, men ikke med octoxinol 9 26.

Da den beskrevne fremgangsmåde analyserer proteiner fra cellelysater under ikke-denaturerende betingelser, er ingen forudgående oprensning af proteinerne er påkrævet. Dette er en fordel, da oprensning af rekombinante proteiner undertiden kræver pufferbetingelser optimeringer ved tilsætning af høje salte og andre tilsætningsstoffer for at forhindre proteinet fra aggregering eller udfældning. disse tilsætningsstoffer og koncentrationerne høje salt, kan dog have en indvirkning på oligomerisering af proteinet, der måske ikke nødvendigvis ligne sin naturlige tilstand. Især i tilfælde af det humane MxA protein, saltkoncentrationen og tilstedeværelse af nukleotider spiller en afgørende rolle i dannelsen af højere oligomere stater 27. I cellelysater, proteiner lettere stabiliseret sig siden de cellulære stabilisering faktorer er stadig til stede. Derfor er det muligt at analysere PRotein komplekser under mere celle fysiologiske betingelser (f.eks fysiologiske saltkoncentrationer, og pH). Denne protokol bør også gælde for andre proteiner danner oligomerer, for eksempel til strukturelt beslægtede MXB eller dynamin 8.

Et andet vigtigt aspekt af protokollen er at beskytte frie thiolgrupper for at forhindre dannelsen af kunstige disulfidbroer af cytoplasmatiske proteiner under lysis (figur 1). Indledende forsøg viste, at tilsætning af 1,4-dithiothreitol (DTT) eller β-mercaptethanol ikke er tilstrækkelig til at forhindre dannelsen af ​​kunstige disulfidbindinger under forberedelsen. Begge reduktionsmidler beskytte thiolgruppen reversibelt dannes disulfidbroer. Denne reversible beskyttelse måske ikke er tilstrækkelig til at beskytte alle thiol grupper permanent. I tilfælde af MxA proteinet, dette fører til irreversibel aggregering af proteinet. Men tilsætning af iodacetamid der irrevers,ibly beskytter de frie thiolgrupper af cysteiner stærkt reduceret aggregation af MxA proteinet Endvidere iodacetamid behandling af lysater fremstillet fra MxA udtrykkende pattedyrceller havde nogen indflydelse på GTPase aktivitet af immunopræcipiteret MxA sammenlignet med MxA fra lysater behandlet med DTT (data ikke vist ).

Andre vigtige overvejelser for den nøjagtige bestemmelse af antallet af protomerer i en oligomer er valget af polyacrylamid koncentrationsområdet samt proteinet molekylvægt reference. Rækken af ​​polyacrylamid fusionen bør først etableret for at muliggøre maksimal adskillelse af båndene på de forventede molekylære masser af oligomerer. Ikke-denaturerende PAGE indeholder ikke nogen SDS. Mangler SDS, ladningen, molekylmasse og formen af ​​proteinet bestemmer dets elektroforetiske mobilitet. Derfor er valget af proteinet molekylvægtmarkør er afgørende. Ideelt set ville en molekylvægt henvisning være arecombinant oprenset form af proteinet af interesse med kendte oligomere stater. Da dette ikke altid er til rådighed, skal der anvendes en ikke-denatureret eller nativt protein markør. Da MxA har vist sig at associere med andre cellulære proteiner, såsom UAP56 eller virale nukleoproteiner af Thogotovirus, La Crosse-virus eller influenzavirus 12,28-30, vi også testet ved immunofarvning under anvendelse af specifikke antistoffer, om UAP56 eller influenza-A nukleoprotein ville co-separate med MxA på de ikke-denaturering PA geler. Men vi fandt ingen beviser for dannelsen af ​​MxA hetero-oligomerer. Dette er sandsynligvis på grund af det faktum, at MxA-UAP56 og MxA-nukleoprotein interaktioner er af lav affinitet 12,24. Endvidere kan den del af MxA protein associere med UAP56 eller virale nukleoproteiner være meget lav og dermed vanskelige at påvise ved denne fremgangsmåde.

Endvidere er det vigtigt at tage hensyn til den pKa af proteinet, der skal analyseres. I den beskrevne ikke-denaturing PAGE protokol proteinerne separeret ved elektroforese ved pH 8,3. De fleste proteiner er negativt ladet ved denne pH. Imidlertid basiske proteiner udviser en positiv nettoladning ved pH 8,3, og derfor vil løbe ind i den modsatte retning. Som følge heraf er det vigtigt, for analysen af ​​basiske proteiner for at indstille pH af den løbende buffer for at sikre en samlet negativ ladning af proteinet.

Tilsammen præsenterer vi her en protokol til hurtig vurdering af den oligomere tilstand proteiner udtrykt i pattedyrceller uden behov for forudgående oprensning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Units, 10K MWCO, 0.5 ml Thermo Fisher Scientific 69570 Pre-equilibrate in dialysis buffer (if Glycerol removal is desired)
Can be self-made according to Fiala et al. 2011
4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, Bio-Rad 456-1083 Pre-run in running buffer to adjust buffer system
cOmplete, Mini, EDTA-free Roche  11836170001 use 1 tablet per 50 ml
PBS, pH 7.4  bottle a 500 ml Gibco Thermo Fisher Scientific 14190-094
Ponceau S solution Sigma-Aldrich P7170 TOXIC wear gloves and protect eyes
NativeMark Unstained Protein Standard  50 µl Invitrogen P/N 57030 load 5 µl/well
A549 cells ATCC ATCC CCL185 Grow in growth medium (see Table 1)
Vero cells ATCC ATCC CCL81 Grow in growth medium (see Table 1)
anti-Mx1 antibody Novus Biologicals H00004599_D01P Use at a 1:1,000 dilution
ECL Anti-rabbit IgG, Horseradish Peroxidase linked whole antibody (from donkey) GE-Healthcare NA934V Use at a 1:10,000 dilution
0.5% Trypsin-EDTA (1x)        Life Technologies Thermo Fisher 15400-054
Iodoacetamide   5 g Sigma-Aldrich I-6125 stock  100 mM
Bromphenolblue Sigma-Aldrich B0126-25G
DMEM +4.5g/l Gluc,+L-Glut,+Pyruvate life technologies Thermo Fisher Scientific 41966-029
Pen  Strep 100 x     100ml               life technologies Thermo Fisher Scientific 15140 - 130
Glutamax 100x Stock, 100 ml     life technologies Thermo Fisher Scientific 350500-038
Fetal Bovine Serum, Dialyzed , US Origin 500 ml Gibco Lot:42G9552K Thermo Fisher Scientific 10270-106
Cellulose filter paper Bio-Rad 1703965
PVDF blotting  membrane GE-Healthcare 10600022
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Biosolve 0020092391BS
sodium fluoride (NaF) Sigma Aldrich S-7920
NP-40 Calbiochem 492015
cOmplete, Mini, EDTA-free Roche  11836170001
Tween 20 Calbiochem 6555204
CHAPS 10% solution Amresco N907
DL-Dithiothreitol (DTT) Sigma Aldrich 43819
Glycine Biosolve 0007132391BS
sodium orthovanadate (Na3VO4) Sigma Aldrich 450243
Glycerol Sigma Aldrich G7757
β-Glycerophospate Sigma Aldrich G9422
Milk powder Migros/Switzerland
Methanol Millipore 1.06009
sodium cloride (NaCl) Sigma Aldrich 71380
magnesium chloride (MgCl2) Amresco 288
Sodium dodecyl sulphate (SDS) Sigma Aldrich L4509
sodium hydroxide (NaOH) Sigma Aldrich S-8045

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baisamy, L., Jurisch, N., Diviani, D. Leucine zipper-mediated homo-oligomerization regulates the Rho-GEF activity of AKAP-Lbc. J Biol Chem. 280, 15405-15412 (2005).
  2. Chen, C. P., Posy, S., Ben-Shaul, A., Shapiro, L., Honig, B. H. Specificity of cell-cell adhesion by classical cadherins: Critical role for low-affinity dimerization through beta-strand swapping. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 8531-8536 (2005).
  3. Jackson-Fisher, A. J., Chitikila, C., Mitra, M., Pugh, B. F. A role for TBP dimerization in preventing unregulated gene expression. Mol Cell. 3, 717-727 (1999).
  4. Torshin, I. Activating oligomerization as intermediate level of signal transduction: analysis of protein-protein contacts and active sites in several glycolytic enzymes. Front Biosci. 4, 557-570 (1999).
  5. Goodsell, D. S., Olson, A. J. Structural symmetry and protein function. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 29, 105-153 (2000).
  6. Flydal, M. I., Martinez, A. Phenylalanine hydroxylase: function, structure, and regulation. IUBMB Life. 65, 341-349 (2013).
  7. Haller, O., Kochs, G. Human MxA protein: an interferon-induced dynamin-like GTPase with broad antiviral activity. J Interferon Cytokine Res. 31, 79-87 (2011).
  8. Haller, O., Staeheli, P., Schwemmle, M., Kochs, G. Mx GTPases: dynamin-like antiviral machines of innate immunity. Trends Microbiol. 23, 154-163 (2015).
  9. Di Paolo, C., Hefti, H. P., Meli, M., Landis, H., Pavlovic, J. Intramolecular backfolding of the carboxyl-terminal end of MxA protein is a prerequisite for its oligomerization. J Biol Chem. 274, 32071-32078 (1999).
  10. Janzen, C., Kochs, G., Haller, O. A monomeric GTPase-negative MxA mutant with antiviral activity. J Virol. 74, 8202-8206 (2000).
  11. Gao, S., et al. Structure of myxovirus resistance protein a reveals intra- and intermolecular domain interactions required for the antiviral function. Immunity. 35, 514-525 (2011).
  12. Nigg, P. E., Pavlovic, J. Oligomerization and GTP-binding Requirements of MxA for Viral Target Recognition and Antiviral Activity against Influenza A Virus. J Biol Chem. 290, 29893-29906 (2015).
  13. Gao, S., et al. Structural basis of oligomerization in the stalk region of dynamin-like MxA. Nature. 465, 502-506 (2010).
  14. Ghosh, I., Hamilton, A. D., Regan, L. Antiparallel leucine zipper-directed protein reassembly: Application to the green fluorescent protein. J Am Chem Soc. 122, 5658-5659 (2000).
  15. Patching, S. G. Surface plasmon resonance spectroscopy for characterisation of membrane protein-ligand interactions and its potential for drug discovery. Biochim Biophys Acta. 1838, 43-55 (2014).
  16. Kenworthy, A. K. Imaging protein-protein interactions using fluorescence resonance energy transfer microscopy. Methods. 24, 289-296 (2001).
  17. Wyatt, P. J. Light-Scattering and the Absolute Characterization of Macromolecules. Analytica Chimica Acta. 272, (93), 1-40 (1993).
  18. Howlett, G. J., Minton, A. P., Rivas, G. Analytical ultracentrifugation for the study of protein association and assembly. Curr Opin Chem Biol. 10, 430-436 (2006).
  19. Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates. J Vis Exp. (2011).
  20. Zou, H., Li, Y., Liu, X., Wang, X. An APAF-1.cytochrome c multimeric complex is a functional apoptosome that activates procaspase-9. J Biol Chem. 274, 11549-11556 (1999).
  21. Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal Biochem. 217, 220-230 (1994).
  22. Walker, J. M. Nondenaturing polyacrylamide gel electrophoresis of proteins. Methods Mol Biol. 32, 17-22 (1994).
  23. Stoscheck, C. M. Quantitation of protein. Methods Enzymol. 182, 50-68 (1990).
  24. Wisskirchen, C., Ludersdorfer, T. H., Muller, D. A., Moritz, E., Pavlovic, J. Interferon-induced antiviral protein MxA interacts with the cellular RNA helicases UAP56 and URH49. J Biol Chem. 286, 34743-34751 (2011).
  25. Stertz, S., et al. Interferon-induced, antiviral human MxA protein localizes to a distinct subcompartment of the smooth endoplasmic reticulum. J Interferon Cytokine Res. 26, 650-660 (2006).
  26. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochim Biophys Acta. 1666, 105-117 (2004).
  27. Kochs, G., Haener, M., Aebi, U., Haller, O. Self-assembly of human MxA GTPase into highly ordered dynamin-like oligomers. J Biol Chem. 277, 14172-14176 (2002).
  28. Kochs, G., Haller, O. GTP-bound human MxA protein interacts with the nucleocapsids of Thogoto virus (Orthomyxoviridae). J Biol Chem. 274, 4370-4376 (1999).
  29. Reichelt, M., Stertz, S., Krijnse-Locker, J., Haller, O., Kochs, G. Missorting of LaCrosse virus nucleocapsid protein by the interferon-induced MxA GTPase involves smooth ER membranes. Traffic. 5, 772-784 (2004).
  30. Wisskirchen, C., Ludersdorfer, T. H., Muller, D. A., Moritz, E., Pavlovic, J. The cellular RNA helicase UAP56 is required for prevention of double-stranded RNA formation during influenza A virus infection. J Virol. 85, 8646-8655 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics