Karakterisering av Multi-subenhet proteinkomplex av Human MxA användning av icke-denaturerande polyakrylamidgel-elektrofores

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Nigg, P. E., Pavlovic, J. Characterization of Multi-subunit Protein Complexes of Human MxA Using Non-denaturing Polyacrylamide Gel-electrophoresis. J. Vis. Exp. (116), e54683, doi:10.3791/54683 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Den kvartära strukturen hos ett protein spelar en avgörande roll i många cellulära processer. Signalvägar, genuttryck och enzymaktivering / avaktivering alla beroende av korrekt montering av proteinkomplex 1-4. Denna process kallas även homo- eller hetero-oligomerisering beror på irreversibel kovalent eller reversibla elektrostatiska och hydrofoba protein-proteininteraktioner. Oligomerisering diversifierar inte bara de olika cellulära processer utan att öka genomstorlek, men ger också en strategi för proteiner för att bygga stabila komplex som är mer motståndskraftiga mot denaturering och nedbrytning 5. Defekter i oligomerisering ha en inverkan på funktionen av proteiner och kan leda till utvecklingen av sjukdomar. Exempelvis bildar enzymet fenylalaninhydroxylas ett tetramert komplex. Vissa mutationer inom proteinkomplexet kan försvaga tetrameren bildas och leda till sjukdomen fenylketonuri 6.

7. Det hör till superfamiljen av dynamin liknande stora GTPases och har förmåga att bilda stora oligomera strukturer in vitro 8. Oligomerisering har föreslagits för att skydda MxA från snabb nedbrytning 9,10. Trots intensiva ansträngningar av många forskargrupper, den molekylära verkningsmekanism är i stort sett svårfångad och roll oligomerisering delstaten MxA för sin antivirala funktion är under debatt 9,11,12. I detta avseende, Gao och medarbetare föreslagits en modell där MxA utövar sin antivirala aktivitet genom att interagera med virala nukleoproteiner i form av stora ringliknande oligomera strukturer 11. Men på senare tid, visade vi att MXA dimerer uppvisar antiviral aktivitet och interagera med nukleoprotein av influensa A-virus 12. Bvisar därmed kristallstrukturen hos MxA, Gao och medarbetare identifierat flera aminosyrarester i de regioner gränssnitt som är kritiska för dess oligomerisering in vitro och dess antivirala funktion 11,13. Därför, för att belysa vilken oligomert tillstånd av MxA utövar antiviral aktivitet, försökte vi skapa ett enkelt protokoll för att snabbt bestämma oligmeric tillstånd av mutanter MXA gränssnitt som uttrycks i humana celler liksom endogena MxA uttryckte efter IFNa stimulering.

Även om det finns många tekniker som vanligen används för att undersöka interaktionen mellan proteiner såsom split-grönfluorescerande protein (split-GFP) kompletteringsanalys 14, ytplasmonresonans 15 och Förster resonansenergiöverföring (FRET) 16, de ger inte information av den exakta stökiometrin för ett oligomert proteinkomplex. För undersökning av denna särskilda aspekt, tekniker såsomflera vinklar ljusspridning (MALS) 17 och analytisk ultracentrifugering 18 är mycket användbara. Vanligtvis proteinerna analyseras med hjälp av dessa metoder är renade proteiner. Oligomerisering processer kan också bero på andra cellulära faktorer. Om dessa faktorer är okända, är svårare analysen. Dessutom kan vissa proteiner är svåra att uttrycka i E. coli och att rena. Därför är dessa metoder inte är det optimala valet för att analysera protein oligomerisering i den cellulära miljön. Dessutom är dessa tekniker kräver dyra instrument som inte är lätt tillgängliga.

Icke-denaturerande polyakrylamidgelelektrofores (PAGE), storleksuteslutande kromatografi eller kemisk tvärbindning följt av konventionell Natriumdodecylsulfat (SDS) -PAGE är användbara verktyg för karakterisering av bildningen av oligomerer från cellysat 2,19,20. Dessa metoder kräver inte specialutrustning och kan lätt performed i en standard laboratorium. Vi inledningsvis utvärderat olika kemiska tvärbindningsprotokoll som invariantly ledde till icke-specifik aggregation och utfällning av MxA. Därför nästa testade vi icke-denaturerande PAGE-protokoll. Som icke-denaturerande PAGE utesluter användning av SDS, migration av proteinerna beror på deras nativa laddning. Blue-naturlig PAGE använder coomassie brilliant blue G250 att ladda proteiner med en total negativ laddning, som liknar SDS, men inte denaturerar proteinet 21. Tyvärr, Coomassie brilliant blue fällningar i närvaro av höga salterna och divalenta katjoner (t.ex. Mg 2+) som ofta ingår i lyseringsbuffertar. Beroende på de använda buffertarna, kan det vara svårt att analysera provet utan ytterligare optimering av åtgärder som kan ha en effekt på den oligomera proteinkomplex.

Här presenterar vi ett enkelt protokoll baserat på en tidigare publicerad metod 22 för att bestämma oligomerisering avhumant MxA protein från cellulära lysat med hjälp av icke-denaturerande PAGE.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

OBS: Detta protokoll är baserad på den tidigare publicerade icke-denaturerande PAGE protokoll 12. I denna studie var den oligomera tillstånd MxA protein utvärderas med hjälp av antingen Vero-celler som överuttrycker MxA eller IFN-a-stimulerade A549-celler som uttrycker endogen MxA. Protokollet som beskrivs nedan kan användas för att analysera den oligomera tillståndet för något protein förutom MxA. Emellertid kan ytterligare optimering krävas.

1. Framställning av cell-lysat för icke-denaturerande PAGE

OBS: För att analysera den oligomera tillståndet av den mänskliga MxA proteinet i antingen Vero eller A549-celler, var 1,0 x 10 6 celler skördas. Beroende på celltypen eller överflödet av proteinet för att analysera, bör cellantalet justeras. Det är också viktigt att skydda lysbufferten från ljusexponering, så snart som den ljuskänsliga jodacetamid tillsätts.

  1. Seed 0,3 x 10 6 A549 eller Vero-celler per brunn itill 6-brunnsskålar. Hålla cellerna i 2 ml tillväxtmedium per brunn (se tabell 1). Inkubera cellerna över natten i en cellodlingsinkubator (37 ° C, 5% CO2).
  2. Skörda cellerna genom tvättning med 1 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och lossa genom att tillsätta 0,5 ml 0,25% trypsin-etylendiamintetraättiksyra (EDTA) 1x lösning under ca 5 min vid rumstemperatur.
  3. Så snart cellerna lossnar från skålen, tillsätt 0,5 ml tillväxtmedium och försiktigt blanda genom att pipettera upp och ned.
  4. Överföra cellerna i varje brunn i en 2 ml-rör och pelletera dem med hjälp av en bordscentrifug (5000 x g, 4 ° C, 5 min).
  5. Försiktigt bort supernatanten genom pipettering utan att störa cellpelleten.
  6. Tvätta cellerna med 1 ml iskall PBS genom att försiktigt pipettera cellsuspensionen upp och ner.
  7. Pellets celler i en bordscentrifug (5000 xg, 4 ° C, 5 min).
  8. Försiktigt bort supernatanten genom pipettering without lösgöra cellpelleten.
  9. Resuspendera cellerna i 200 | il iskall lysbuffert (se tabell 1) genom att pipettera upp och ner och sätta på is.
  10. Omedelbart skydda lysat från ljus genom att täcka rören med hjälp av aluminiumfolie och inkubera i 30 minuter på is.
    OBS: Efter inkubation under 30 min på is, är det inte längre nödvändigt att skydda lysatet från ljusexponering, eftersom skyddet av de fria tiolgrupperna är irreversibel.
  11. Avlägsna cellrester genom centrifugering i en pre-kyld bordscentrifug (13000 xg, 4 ° C, 20 min).
  12. Jämvikt dialys kolumner i dialysbuffert (tabell 1) i kylrummet vid 4 ° C under 20 min under centrifugeringssteget. Använda en kolonn med en molekylviktsgräns av 10.000.
    1. Fäst kolumner till en flottör boj och sätta dem i en bägare fylld med dialysbuffert. För att säkerställa försiktig omrörning, använd en magnetomrörare. Rör inte membranet.
      OBS: Dialysär kolonner kan köpas eller framställas från 1,5 ml rör enligt protokollet beskrivet av Fiala och medarbetare 19.
  13. Ta bort kolumner från dialysbufferten och flyt boj. Överför rensas lysaten i den förberedda dialyskolonn genom att pipettera utan att vidröra membranet. Fäst kolumner till en flottör boj och sätta dem tillbaka i bägaren fylld med dialysbuffert.
  14. Dialysera lysatet i en bägare innehållande iskall dialysbuffert (tabell 1) under minst 4 h (eller företrädesvis över natten) vid 4 ° C medan man omsorgsfullt omröring med användning av en magnetomrörare. Använd minst 100 ml dialysbuffert för en 200 pl lysat.
  15. Överför dialyse provet i ett 1,5 ml rör. Avlägsna fällningar genom centrifugering i en bordscentrifug (13000 xg, 4 ° C, 20 min). För att förhindra dissociation av oligomera proteinkomplex fortsätter med protokollet (avsnitt 2) omedelbart efter dialys. Får ej frysasförberedda lysat.

2. Elektrofores

OBS: Elektrofores utfördes såsom beskrivits tidigare med vissa modifikationer 22. I protokollet som beskrivs nedan, prefabricerade gradientgeler används (4-15% gradient). Alternativt kan gelerna framställas i laboratoriet. Det är mycket viktigt att utesluta varje denatureringsmedel såsom SDS för att förhindra dissociation av de oligomera proteinkomplex. Tid för elektrofores var optimerad för olika oligomera tillstånd hos människa MxA proteinet. Det kan dock variera för andra proteiner, beroende på storleken hos den oligomera komplexa samt intervallet separation som är tänkt att uppnås för att analysera komplexa. Därför bör den optimala tiden för elektrofores bestämmas empiriskt. För optimal upplösning av oligomererna som skall analyseras strömmen inte bör överstiga 25 mA.

  1. Montera den icke-denaturerande PAGE-gel i gelén kammaren. Fyll than inre och yttre kammare med i förväg kyld rinnande buffert (Tabell 1).
  2. Pre-run gelén med pre-kyld rinnande buffert vid 25 mA per gel under 15 minuter i kylrum vid 4 ° C.
  3. Blanda 15 | il av de ovan framställda lysaten med 5 | il 4x provbuffert (tabell 1). Koka inte provet.
  4. Ladda 15 | il prov och ett nativt protein standard val på gelén. Kör gelen vid 25 mA under 4 timmar i kylrum vid 4 ° C.
    OBS: För semikvantitativ analys, ett protein kvantifiering protokoll (t.ex. en Bradford-proteinanalys 23) kan utföras för att säkerställa laddning av lika mängder av totalt protein per bana.

3. Western blot

OBS: Nedan beskrivs är protokollet av en våt western blot-systemet. Varje blotting-membran kan användas. Aktivera polyvinylidenfluorid (PVDF) membran i 100% metanol före ekvilibrering i läsk buffer. Den halvtorra western blot-teknik kan användas alternativt, men har optimeras för stora oligomera komplex.

  1. Ta isär gelén och noggrant överföra den i SDS-buffert (Tabell 1).
  2. Inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur under försiktig skakning.
  3. Förbered 2 svampar, 4 cellulosafilterpappersark och en läsk membran per gel. Blötlägg dem i blottningsbuffert (tabell 1).
  4. Montera smörgås enligt följande (nerifrån och upp): 1 svamp, två cellulosafilterpappersark, membran, gel, två cellulosafilterpappersark, en svamp.
  5. Sätta sandwich in i blotting tanken. Se till att membranet är vänd mot den pluspol medan gelén vänd mot minuspolen.
  6. Fylla läsk tank med pre-kyld blotting-buffert.
  7. Blot vid 90 mA över natten vid 4 ° C för bästa proteinöverföringsresultat.
  8. Isär smörgås och visualisera proteinstandard genom att inkubera membranet i Ponceau S lösningen under 5 min vid rumstemperatur.
  9. Avfärgning membranet genom att försiktigt tvätta bort Ponceau S med avjoniserat vatten tills du kan tydligt se band av proteinstandard.
  10. Markera banden av proteinstandard med hjälp av en penna.
    OBS: Rest Ponceau S kan störa immunfärgning. För att undvika detta, kan membranet avfärgades ytterligare genom inkubation i 0,1 M NaOH under 1 min och efterföljande tvättning med avjoniserat vatten.
  11. Blockera membranet med blockeringsbuffert (se tabell 1) i minst 1 h vid rumstemperatur eller över natten vid 4 ° C.
  12. Visualisera protein (er) av intresse genom immunfärgning med användning av antikroppar riktade mot det protein som skall analyseras.
    OBS: Det humana MxA protein visualiserades med användning av kanin-polyklonal antikropp specifik för humant Mx1 utspätt 1: 1000 i blockeringsbuffert (tabell 1). Antikroppslösningen inkuberades över natten vid 4 ° C. Alternativt kan monoklonala enNTI-MxA antikropp (klon 143) kan användas (data visas ej) 24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Användning av icke-denaturerande PAGE, analyserade vi oligomera tillståndet av den mänskliga vildtyp MxA de dimera mutangränssnitts MxA (R640A) och MxA (L617D) samt mono gränssnitt mutanten MxA (M527D) från cellysat 12. Cellerna lyserades i en buffert innehållande 1% oktylfenoxipolyetoxietanol (NP-40) och jodacetamid för att säkerställa protein solubilisering och skydd av fria tiolgrupper (se figur 1). Såsom beskrivits tidigare, var salt och små metaboliter avlägsnas genom dialys 19. Proteinseparation utfördes genom icke-denaturerande PAGE. Att underlätta effektiv western blotting gelén inkuberades i SDS-buffert före blotting. De MXA proteinerna visualiserades genom immunfärgning med användning av en kanin polyklonal antikropp riktad mot MxA. Arbetsflödet beskrivs i figur 2.

Att jämföra den oligomera tillstånd av endogent humant MxA protein från IFN-α ; stimulerade A549-celler, transfekterade vi Vero-celler (som saknar endogen MxA) med rekombinant vildtyp, monomera och dimera MXA varianter. Dessa rekombinanta vildtyp, monomert och dimert MxA varianter bildade stabila tetramerer, monomerer och dimerer, respektive, vid jämförelse med en ofärgade nativt protein markör (figur 3A). Därför använde vi dessa rekombinanta proteiner för att bedöma den oligomera tillstånd av endogent humant MxA protein som härrör från IFN-α stimulerade A549-celler. Figur 3B visar att storleken på MxA i lysat av IFN-a-stimulerade A549-celler motsvarar en tetramer.

Tagna tillsammans, beskriver vi en metod för att bestämma den oligomera tillståndet i det humana MxA proteinet från cellysatet. kan också användas vår icke-denaturerande PAGE metod för att bedöma den oligomera tillståndet av andra oligomera proteinkomplex.

83 / 54683fig1.jpg "/>
Figur 1:. Struktur och reaktionsschema av jodacetamid Jodacetamid skyddar irreversibelt tiolgruppen av fria cysteiner genom att bilda en tioeterbindning. Denna stabila modifieringen resulterar från nukleofil substitution av jod med svavelatomen från cystein. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2:. Workflow diagram av icke-denaturerande PAGE En systematisk representation av den icke-denaturerande PAGE tillvägagångssätt cellysat. Under cellys, tvättmedel lösa proteinerna och tiolgrupper skyddas av jodacetamid för att förhindra protein aggregation. Dialys bort små metaboliter och salter som kan störa icke-denaturerande PAGE Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3: Bestämning av den oligomera tillståndet i det humana MxA proteinet med användning av icke-denaturerande PAGE och Western blotting (A) Rekombinant MxA varianter ektopiskt uttryckt i Vero-celler.. Komplexen av mutanter vild typ MxA (tetramer) gränssnitt MxA (R640A), MxA (L617D) (dimerer) och MxA (M527D) migrerar till deras förväntade molekylvikter som bekräftar deras oligomera tillstånd. (B) A549-celler stimulerades med 1000 IE per ml av IFN-α att inducera MxA uttryck. Den endogena MxA shows ett band som motsvarar tetrameriska formen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

buffertnamn Innehåll kommentarer
lysbuffert 20 mM Tris-HCl (pH 7,5),
150 mM NaCl,
5 mM MgCl2,
100 ^ M jodacetamid,
50 mM NaF,
1 mM Na 3 VO 4,
1% NP-40,
50 mM β-glycerofosfat,
1 tablett per 50 ml Lysis buffert av EDTA-fri, cocktail proteashämmare
Lägg iodacetamide, NaF, Na 3 VO 4, oktylfenoxipolyetoxietanol (NP-40), β-glycerofosfat och proteas inhibitor cocktail strax före cellysering

Iodacetamide är ljuskänslig och instabila i lösning. Förhindra ljusexponering och lös strax före användning.
dialysbuffert 20 mM Tris-HCl (pH 6,8),
10% glycerol,
0,1% CHAPS,
0,5 mM DTT
CHAPS kan raplaced av andra icke-denaturer tvättmedel
löpbuffert 25 mM Tris-HCl (pH 8,3),
192 mM glycin,
0,1% CHAPS,
0,5 mM DTT
Vid pH 8,3 är de flesta proteiner negativt laddade. Men för basiska proteiner, ett surt pH bör användas. Annars kommer proteinerna stöter motsatt riktning och kommer att gå förlorade.

CHAPS kan ersättas av andra icke-denaturerande detergenter
provbuffert 310 mM Tris-HCI (pH 6,8),
0,05% bromfenolblått,
50% glycerol
SDS-buffert 25 mM Tris-HCl (pH 8,3),
192 mM glycin,
0,1% SDS
blottningsbuffert 25 mM Tris,
192 mM glycin,
20% metanol
För mycket stora komplex, kan Metanol kan utelämnas
blockeringsbuffert 50 mM Tris-HCl (pH 7,4)
150 mM NaCl
0,05% Tween 20
5% Mjölkpulver
tillväxt~~POS=TRUNC Dulbeccos modifierat medium
1x Penicillin / Streptomycin
2 mM glutamin
10% fetalt kalvserum

Tabell 1: Buffert recept krävs för icke-denaturerande PAGE.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Här beskriver vi en enkel metod som möjliggör snabb bestämning av den oligomera tillståndet i proteiner uttryckta i däggdjursceller genom icke-denaturerande PAGE, följt av Western blot-analys. Den största fördelen med denna metod är att den oligomera tillståndet hos ett givet protein kan bestämmas från helcellslysat utan föregående proteinrening. Detta kan vara viktigt för proteiner som oligomerisera eller utövar sin funktion i förening med hjälp faktorer. Dessutom proteinerna fortfarande är i sitt nativa tillstånd och om ytterligare extraheras från gelén, kan den enzymatiska aktiviteten eller andra proteinfunktioner bestämmas och korreleras till den oligomera tillståndet.

En kritisk aspekt av detta protokoll är valet av tvättmedel under provberedning. Detta är av särskild betydelse för proteiner associerade med cellmembran. MxA verkar i första hand förknippas med membran av slät endoplasmatiska nätverket 25 19 närvaro av 0,1% 3 - [(3-cholamidopropyl) dimetylammonio] -1-propansulfonat (CHAPS) krävdes för att förhindra utfällning av MxA under gel elektrofores. Dessutom betyder CHAPS inte interfererar med den enzymatiska aktiviteten för MxA såsom bestämt med renat rekombinant MxA protein uttryckt i E. coli 12. Det är av stor vikt att detergenten inte denaturerar proteinerna eller avbryter protein-proteininteraktioner under lys. Icke-denaturer detergenter såsom NP40, oktoxinol 9, digitonin och CHAPS är lämpliga för solubilisering. Valet av detergenten och dess koncentration bör bestämmas empiriskt. Tvättmedlet kan även påverka nedströms experiment t.ex. för vissa analyser tvättmedels behöver varatas bort, vilket är lätt att uppnå med CHAPS genom dialys, men inte med oktoxinol 9 26.

Eftersom den beskrivna metoden analyserar proteiner härledda från cellysat under icke-denaturerande betingelser, krävs ingen tidigare rening av proteinerna. Detta är en fördel eftersom rening av rekombinanta proteiner ibland kräver buffert optimeringar genom tillsats av höga salter och andra tillsatser för att förhindra proteinet från aggregation eller utfällning. Dock kan dessa tillsatser och höga saltkoncentrationer påverkar oligomerisering av proteinet som kanske inte nödvändigtvis likna sitt naturliga tillstånd. Speciellt i fallet av det humana MxA protein, saltkoncentrationen och närvaron av nukleotider spelar en avgörande roll i bildandet av högre oligomera tillstånd 27. I cellysat, proteiner lättare stabiliserats sedan de cellulära stabiliseringsfaktorer är fortfarande närvarande. Därför är det möjligt att analysera protein komplex enligt flera cell fysiologiska förhållanden (t.ex. fysiologiska saltkoncentrationer och pH). Detta protokoll bör också gälla för andra proteiner bildar oligomerer, t ex för strukturellt relaterade MXB eller dynamin 8.

En annan viktig aspekt i protokollet är att skydda fria tiolgrupper för att förhindra bildandet av artificiella disulfidbryggor av cytoplasmiska proteiner under lys (Figur 1). Initiala experiment visade att tillsats av 1,4-ditiotreitol (DTT) eller β-mercaptethanol inte är tillräcklig för att förhindra bildningen av konstgjorda disulfidbindningar vid provberedningen. Båda reduktionsmedel skyddar tiolgruppen reversibelt från att bilda disulfidbryggor. Denna reversibla skydd kanske inte är tillräckligt för att skydda alla tiolgrupper permanent. I fallet med MxA proteinet, leder detta till irreversibel aggregation av proteinet. Emellertid tillsats av jodacetamid som irreversibly skyddar de fria tiolgrupperna av cysteiner kraftigt reducerad aggregering av MxA proteinet Vidare jodacetamid behandling av lysat framställda från MxA uttrycker däggdjursceller hade ingen inverkan på GTPas aktivitet immunoutfällt MxA jämfört med MxA från lysat behandlade med DTT (data ej visade ).

Andra viktiga faktorer för att exakt bestämma antalet protomerer i en oligomer är valet av polyakrylamid koncentrationsområdet samt proteinmolekylvikt referens. Utbudet av polyakrylamiden koncentrationen bör fastställas för första gången för att möjliggöra maximal separation av banden vid den förväntade molekylmassorna av oligomerer. Icke-denaturerande PAGE innehåller inte någon SDS. Saknas SDS, laddningen, molekylmassa och formen av proteinet bestämmer dess elektroforetiska rörligheten. Därför är det avgörande att valet av proteinet molekylviktsmarkör. Helst skulle en molekylvikt referens vara arecombinant renad form av proteinet av intresse med kända oligomera tillstånd. Eftersom detta är inte alltid tillgängliga, bör en icke-denaturerat eller nativ proteinmarkör användas. Sedan MxA har visat sig associera med andra cellulära proteiner såsom UAP56 eller virala nukleoproteiner av Thogotovirus, La Crosse virus eller influensavirus 12,28-30, testade vi också genom immunfärgning med användning av specifika antikroppar om UAP56 eller influensa A nukleoprotein skulle samarbeta separat med MxA på de icke-denaturering PA geler. Men vi fann inga bevis för bildningen av MXA hetero oligomerer. Detta beror förmodligen på det faktum att MxA-UAP56 och MxA-nukleoprotein interaktioner är av låg affinitet 12,24. Dessutom skulle den fraktion av MxA protein associera med UAP56 eller virala nukleoproteiner vara mycket låg och därmed svåra att upptäcka med denna metod.

Vidare är det viktigt att ta hänsyn till pKa för det protein som skall analyseras. I det beskrivna icke-denatnder PAGE-protokollet, är proteinerna separerades genom elektrofores vid pH 8,3. De flesta proteiner är negativt laddade vid detta pH. Emellertid basiska proteiner uppvisar en positiv nettoladdning vid pH 8,3 och därför kommer att köra in i den motsatta riktningen. Som en konsekvens, är det viktigt, för analysen av basiska proteiner för att justera pH i löpbufferten för att säkerställa en total negativ laddning av proteinet.

Tagna tillsammans presenterar vi här ett protokoll för snabb bedömning av den oligomera tillståndet i proteiner uttryckta i däggdjursceller utan behov av dess föregående rening.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Units, 10K MWCO, 0.5 ml Thermo Fisher Scientific 69570 Pre-equilibrate in dialysis buffer (if Glycerol removal is desired)
Can be self-made according to Fiala et al. 2011
4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, Bio-Rad 456-1083 Pre-run in running buffer to adjust buffer system
cOmplete, Mini, EDTA-free Roche  11836170001 use 1 tablet per 50 ml
PBS, pH 7.4  bottle a 500 ml Gibco Thermo Fisher Scientific 14190-094
Ponceau S solution Sigma-Aldrich P7170 TOXIC wear gloves and protect eyes
NativeMark Unstained Protein Standard  50 µl Invitrogen P/N 57030 load 5 µl/well
A549 cells ATCC ATCC CCL185 Grow in growth medium (see Table 1)
Vero cells ATCC ATCC CCL81 Grow in growth medium (see Table 1)
anti-Mx1 antibody Novus Biologicals H00004599_D01P Use at a 1:1,000 dilution
ECL Anti-rabbit IgG, Horseradish Peroxidase linked whole antibody (from donkey) GE-Healthcare NA934V Use at a 1:10,000 dilution
0.5% Trypsin-EDTA (1x)        Life Technologies Thermo Fisher 15400-054
Iodoacetamide   5 g Sigma-Aldrich I-6125 stock  100 mM
Bromphenolblue Sigma-Aldrich B0126-25G
DMEM +4.5g/l Gluc,+L-Glut,+Pyruvate life technologies Thermo Fisher Scientific 41966-029
Pen  Strep 100 x     100ml               life technologies Thermo Fisher Scientific 15140 - 130
Glutamax 100x Stock, 100 ml     life technologies Thermo Fisher Scientific 350500-038
Fetal Bovine Serum, Dialyzed , US Origin 500 ml Gibco Lot:42G9552K Thermo Fisher Scientific 10270-106
Cellulose filter paper Bio-Rad 1703965
PVDF blotting  membrane GE-Healthcare 10600022
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Biosolve 0020092391BS
sodium fluoride (NaF) Sigma Aldrich S-7920
NP-40 Calbiochem 492015
cOmplete, Mini, EDTA-free Roche  11836170001
Tween 20 Calbiochem 6555204
CHAPS 10% solution Amresco N907
DL-Dithiothreitol (DTT) Sigma Aldrich 43819
Glycine Biosolve 0007132391BS
sodium orthovanadate (Na3VO4) Sigma Aldrich 450243
Glycerol Sigma Aldrich G7757
β-Glycerophospate Sigma Aldrich G9422
Milk powder Migros/Switzerland
Methanol Millipore 1.06009
sodium cloride (NaCl) Sigma Aldrich 71380
magnesium chloride (MgCl2) Amresco 288
Sodium dodecyl sulphate (SDS) Sigma Aldrich L4509
sodium hydroxide (NaOH) Sigma Aldrich S-8045

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baisamy, L., Jurisch, N., Diviani, D. Leucine zipper-mediated homo-oligomerization regulates the Rho-GEF activity of AKAP-Lbc. J Biol Chem. 280, 15405-15412 (2005).
  2. Chen, C. P., Posy, S., Ben-Shaul, A., Shapiro, L., Honig, B. H. Specificity of cell-cell adhesion by classical cadherins: Critical role for low-affinity dimerization through beta-strand swapping. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 8531-8536 (2005).
  3. Jackson-Fisher, A. J., Chitikila, C., Mitra, M., Pugh, B. F. A role for TBP dimerization in preventing unregulated gene expression. Mol Cell. 3, 717-727 (1999).
  4. Torshin, I. Activating oligomerization as intermediate level of signal transduction: analysis of protein-protein contacts and active sites in several glycolytic enzymes. Front Biosci. 4, 557-570 (1999).
  5. Goodsell, D. S., Olson, A. J. Structural symmetry and protein function. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 29, 105-153 (2000).
  6. Flydal, M. I., Martinez, A. Phenylalanine hydroxylase: function, structure, and regulation. IUBMB Life. 65, 341-349 (2013).
  7. Haller, O., Kochs, G. Human MxA protein: an interferon-induced dynamin-like GTPase with broad antiviral activity. J Interferon Cytokine Res. 31, 79-87 (2011).
  8. Haller, O., Staeheli, P., Schwemmle, M., Kochs, G. Mx GTPases: dynamin-like antiviral machines of innate immunity. Trends Microbiol. 23, 154-163 (2015).
  9. Di Paolo, C., Hefti, H. P., Meli, M., Landis, H., Pavlovic, J. Intramolecular backfolding of the carboxyl-terminal end of MxA protein is a prerequisite for its oligomerization. J Biol Chem. 274, 32071-32078 (1999).
  10. Janzen, C., Kochs, G., Haller, O. A monomeric GTPase-negative MxA mutant with antiviral activity. J Virol. 74, 8202-8206 (2000).
  11. Gao, S., et al. Structure of myxovirus resistance protein a reveals intra- and intermolecular domain interactions required for the antiviral function. Immunity. 35, 514-525 (2011).
  12. Nigg, P. E., Pavlovic, J. Oligomerization and GTP-binding Requirements of MxA for Viral Target Recognition and Antiviral Activity against Influenza A Virus. J Biol Chem. 290, 29893-29906 (2015).
  13. Gao, S., et al. Structural basis of oligomerization in the stalk region of dynamin-like MxA. Nature. 465, 502-506 (2010).
  14. Ghosh, I., Hamilton, A. D., Regan, L. Antiparallel leucine zipper-directed protein reassembly: Application to the green fluorescent protein. J Am Chem Soc. 122, 5658-5659 (2000).
  15. Patching, S. G. Surface plasmon resonance spectroscopy for characterisation of membrane protein-ligand interactions and its potential for drug discovery. Biochim Biophys Acta. 1838, 43-55 (2014).
  16. Kenworthy, A. K. Imaging protein-protein interactions using fluorescence resonance energy transfer microscopy. Methods. 24, 289-296 (2001).
  17. Wyatt, P. J. Light-Scattering and the Absolute Characterization of Macromolecules. Analytica Chimica Acta. 272, (93), 1-40 (1993).
  18. Howlett, G. J., Minton, A. P., Rivas, G. Analytical ultracentrifugation for the study of protein association and assembly. Curr Opin Chem Biol. 10, 430-436 (2006).
  19. Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates. J Vis Exp. (2011).
  20. Zou, H., Li, Y., Liu, X., Wang, X. An APAF-1.cytochrome c multimeric complex is a functional apoptosome that activates procaspase-9. J Biol Chem. 274, 11549-11556 (1999).
  21. Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal Biochem. 217, 220-230 (1994).
  22. Walker, J. M. Nondenaturing polyacrylamide gel electrophoresis of proteins. Methods Mol Biol. 32, 17-22 (1994).
  23. Stoscheck, C. M. Quantitation of protein. Methods Enzymol. 182, 50-68 (1990).
  24. Wisskirchen, C., Ludersdorfer, T. H., Muller, D. A., Moritz, E., Pavlovic, J. Interferon-induced antiviral protein MxA interacts with the cellular RNA helicases UAP56 and URH49. J Biol Chem. 286, 34743-34751 (2011).
  25. Stertz, S., et al. Interferon-induced, antiviral human MxA protein localizes to a distinct subcompartment of the smooth endoplasmic reticulum. J Interferon Cytokine Res. 26, 650-660 (2006).
  26. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochim Biophys Acta. 1666, 105-117 (2004).
  27. Kochs, G., Haener, M., Aebi, U., Haller, O. Self-assembly of human MxA GTPase into highly ordered dynamin-like oligomers. J Biol Chem. 277, 14172-14176 (2002).
  28. Kochs, G., Haller, O. GTP-bound human MxA protein interacts with the nucleocapsids of Thogoto virus (Orthomyxoviridae). J Biol Chem. 274, 4370-4376 (1999).
  29. Reichelt, M., Stertz, S., Krijnse-Locker, J., Haller, O., Kochs, G. Missorting of LaCrosse virus nucleocapsid protein by the interferon-induced MxA GTPase involves smooth ER membranes. Traffic. 5, 772-784 (2004).
  30. Wisskirchen, C., Ludersdorfer, T. H., Muller, D. A., Moritz, E., Pavlovic, J. The cellular RNA helicase UAP56 is required for prevention of double-stranded RNA formation during influenza A virus infection. J Virol. 85, 8646-8655 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics