Развитие стволовых клеток, полученных из антиген-специфических регуляторных Т-клеток против аутоиммунитета

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Haque, M., Fino, K., Sandhu, P., Song, J. Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity. J. Vis. Exp. (117), e54720, doi:10.3791/54720 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Аутоиммунные заболевания возникают из-за потери иммунологической аутотолерантности. Регуляторные Т-клетки (Tregs) являются важными медиаторами иммунологической аутотолерантности. Tregs составляют около 5 - 10% от зрелого субпопуляции CD4 + Т - клеток у мышей и людей, с примерно 1 - 2% от тех Tregs , циркулирующих в периферической крови. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) можно дифференцировать в функциональную Tregs, которые имеют потенциал для использования в клеточной терапии аутоиммунных заболеваний. Здесь мы представляем метод для разработки антигена (Ag) Tregs из - специфических ИПСК (т.е. IPSC-Tregs). Метод основан на включении фактор транскрипции FoxP3 и антиген-специфические Т-клеточного рецептора (TCR) в ИПСК, а затем дифференцированием по OP9 стромальных клеток, экспрессирующих Notch лигандов дельта-подобный (DL), 1 и DL4. После дифференцировки в пробирке, в IPSC-Tregs экспрессировать CD4, CD8, CD3, CD25, FoxP3 и АГ-специфических TCR и способны реагировать на стимуляцию Ag.Этот метод был успешно применен к клеточной терапии аутоиммунного артрита в мышиной модели. Приемные передачи этих Ag-специфической иПСК-Tregs в Ag-индуцированного артрита (AIA) водоносного мышей обладает способностью снижать воспаление суставов и отек и предотвратить потерю костной массы.

Protocol

Все эксперименты на животных одобрены Университета штата Пенсильвания колледжа медицины животных комитета Care (IACUC протокол № 45470) и проводятся в соответствии с руководящими принципами ассоциации по оценке и аккредитации лабораторных животных.

1. стволовой клетки культуры

  1. Инкубировать 10 см чашку с 10 мл 0,1% желатина в течение не менее 30 мин при 37 ° С (инкубатор) для того, чтобы покрыть пластины.
  2. Удалить желатин из чашки и пластины 3 х 10 6 облучают SNL76 / 7 клеток и инкубируют в течение одного дня при температуре 37 ° С (инкубатор) с использованием 10% DMEM среды (10% FBS и 1% пенициллина стрептомицин).
  3. Извлеките носитель из пластины и культуры оттаивают ИПСК над / 7 слой фидера клеток SNL76 с использованием IPSC СМИ (DMEM среде, содержащей 15% фетальной телячьей сыворотки, 0,1 ммоль / л несущественные аминокислоты, 1 ммоль / л L-глутамина, и 0,1 ммоль / л β-меркаптоэтанол) 9. Элементная литий мышь ИПС-MEF-Нг-20D-17пе, который индуцируется из эмбриональных фибробластов мыши по ретро вирусной трансфекции Oct3 / 4, Sox2, Klf4 и с-Мус, был получен от доктора Яманака (Институт пограничных медицинских наук, Университета Киото, Киото, Япония).
  4. Изменение носителя на 3-й день со свежей средой и наблюдать IPSC колонии под микроскопом.
    Примечание: Эти колонии маленькие, блестящие кластеры или круглые клетки с четкой демаркации показывает экспрессию GFP под флуоресцентным микроскопом.

2. Экстракорпоральное Дифференциация Ag-специфических IPSC-Tregs

  1. Генерирование конструкции , которые будут использоваться в ретровирусной трансдукции сублимитами клонировании генов ОТ-II TCR и FoxP3 в плазмиду MIDR 10 , связанного с саморасщепляющиеся пептидной 2А , чтобы сделать MIDR-TCRα-2A-TCR & beta ; -2A-FoxP3 конструкцию.
  2. Выполнение ретровирусной трансдукции 9 из ИПСК с использованием Plat E клеток в качестве упаковочной клеточной линии.
  3. В день 0 клетки семян OP9-DL1-DL4-IA B Aта минимальная плотность 10 4 клеток / см 2 с помощью OP-9 средств массовой информации (α-MEM носитель , содержащий 20% FCS и 2,2 г / л бикарбоната натрия. Пластина 1 × 10 6 клеток на 10 см чашку.
  4. На 3 -й день, когда клетки OP9-DL1-DL4-IA б становятся 80-90% сплошности, удалите носитель и семян 0,5 - 1 х 10 5 ИПСК над OP9-DL1-DL4 - IA В - клеток в ОП-9 средах.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это устанавливает совместное культивирование ИПСК на клетках OP9-DL1-DL4-IA б и считается день 0 дифференциации 9.
  5. На 5-й день, удалить носитель из 10 см чашку путем аспирации, промыть клетки с 10 мл 1x PBS и аспирация PBS. Добавляют 4 мл 0,25% трипсина и инкубировать при 37 ° С в течение 10 мин. Добавить еще 8 мл иПСК сред к клеткам, повторно приостанавливать их, и центрифуге при 400 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре.
    1. Аспирата супернатант и повторно приостанавливать клеток в 10 мл иПСК сред. Выдержите эти ресуспендировали клетки на свежий 10 см чашкуи вернуться в инкубаторе в течение 30 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Удалите б фидерные клетки OP9-DL1-DL4-IA и держать дифференцирующие ИПСК плавающие в средствах массовой информации. Поддерживайте клетки OP9-DL1-DL4-IA б непрерывно достичь 80 - 90% слитности для дальнейшего сотрудничества культуры.
    2. Через 30 мин собирают плавающих клеток, фильтровать их через клеточный фильтр 70 мкм, и подсчет клеток с помощью гемоцитометра.
  6. Семя 5 х 10 5 ИПСК к новому 80 - 90% сплошности клеток OP9-DL1-DL4-IA б в OP9 средах. Дополнение СМИ с mFlt-3L при конечной концентрации 5 нг / мл.
  7. На 8-й день, собирают частично дифференцированные ИПСК путем промывания планшета со средствами массовой информации от самой чашки с помощью 10 мл пипетки. Используйте еще 5 мл ОП-9 средств массовой информации в блюдо, чтобы аккуратно смыть полу-прилипшие клетки путем тщательного, силового пипеткой так, чтобы не нарушать OP9 монослой на дне тарелки. Повторите мыть с 10 мл PBS, чтобы собрать все полуприцеп объявлениерентны дифференциации клеток.
    1. Объединить оба мойками, центрифуге при 400 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре, вновь приостановить в 10 мл OP9 сред, содержащих mFlt-3L (5 нг / мл) и Mil-7 (1 нг / мл), и фильтруют через 70 мкм клеточный фильтр.
  8. Передача клеток в культуральную пластину 6-луночный , содержащей 80 - 90% сплошности OP9-DL1-DL4-IA В - клеток, что и на шаге 1.1. Передача клетки собирают из одного 10 см чашку в одну лунку 6-луночного планшета.
  9. На 10-й день, смена половины сред от клеток к свежей OP9 среде с mFlt-3L (5 нг / мл) и Mil-7 (1 нг / мл). Повторите этот шаг каждые два дня.
  10. Каждые 4-6 дней, в зависимости от роста, повторно семена дифференцирующие иПСК на чашки со свежим слоем клеток OP9-DL1-DL4-IA B, как описано в пункте 1.1.

3. Оценка In Vitro Treg дифференцировке и созревании

  1. Морфологические изменения дифференцирующих ИПСК.
    1. Monitor совместное культивирование ИПСК с клетками OP9-DL1-DL4-IA б каждый день путем наблюдения живых клеток под обычным микроскопом светлопольному (20Х). К 5-й день, наблюдать колонии с мезодермы, как характеристики, такие как уплощенных клеток. На 8-й день, наблюдать небольшие, круглые скопления клеток, которые представляют дифференцирующие клетки.
    2. Используйте метод трипанового синего для подсчета клеток, чтобы определить количество и процент живых клеток. Рассчитать жизнеспособность клеток, как количество жизнеспособных клеток, деленное на общее число ячеек в пределах четырех сеток на гемоцитометра. Если клетки принимают трипановым синим, считают их мертвым или нежизнеспособным. Регистрируют количество живых клеток, полученных из культуры.
  2. Проточная цитометрия анализ дифференциации ИПСК.
    1. В дни, 5, 7, 11, 15, 19, 21, и 28 сокультивирования, удалить клетки с 0,25% трипсина, как на стадии 25.
    2. До поверхности окрашивания с различными флуорохромом конъюгированные антитела, incubatе 1 х 10 6 клеток с 100 мкл Fc блокатора 2.4G2 разведенного в PBS (конечная концентрация 10 мкг / мл) при 4 ° С в течение 20 мин , чтобы предотвратить связывание антитела с Fc - рецептором на поверхности клетки.
    3. В дни , 5, 7, 11, 15, 19, 21, и 28, используют 1 × 10 6 клеток для проточной цитометрии с различными флуорохромом-конъюгированные антитела , чтобы обнаружить маркеры клеточной поверхности, включая CD3, TCR & beta ; , CD4, CD8, CD25, и CTLA4.
    4. После Fc блока, промыть клетки с 10 мл PBS и пятна с различными флуорохромом конъюгированные антитела в течение 20 мин при температуре 4 ° С, а затем выполнить анализ проточной цитометрии с 15-цвет проточном цитометре. Используйте 0,200 мкг антитела на 10 6 клеток разведенных в 100 мкл PBS.
    5. На 28 -й день, анализируют клетки с помощью проточной цитометрии 11 и ворот на CD4 CD8 - клеток + + с использованием CD4 и CD8 Флуорохром-конъюгированные окрашивание; анализировать для выражения TCRVα2, TCRVβ5, CD25, CTLA-4 И FoxP3 (Рисунок 1). Для FoxP3 окрашивания, фиксации клеток и permealize их , а затем выполняют с использованием меченых антител 11.
  3. В пробирке антигена стимуляции ИПСК.
    1. На 28-й день совместного культивирования, урожай Ipsc-Tregs из культур путем сбора плавающих клеток. Trypsinize остальные клетки с 0,25% трипсина (как на шаге 2.5) и повторно приостанавливать клеток в 8 мл иПСК сред. Центрифуга в течение 5 мин при 400 х г при комнатной температуре, аспирация СМИ, и снова повторно приостанавливать клеток в 10 мл среды.
      1. Инкубируйте ресуспендировали клетки в новую 10 см чашку при 37 ° С в течение 30 мин и собирают плавающих клеток. Вымойте клетки с холодным PBS.
    2. Выдержите 3 х 10 6 спленоцитов от селезенке мышей C57BL / 6 RAG1 - / - мышей с 5 мкМ овальбумина пептида в 200 мкл среды (OVA 323-339) при температуре 4 ° С в течение 30 мин в 96 - луночный планшет 11.
    3. Смешайте Tregs с OVA 323-339 спленоцитов в соотношении 1: 4 (используйте 0,75 × 10 6 Tregs). Инкубируют при 37 ° С в СО 2 инкубаторе в течение 40 ч. В течение последних 4 ч, добавляют 4 мкл разбавленного брефелдин А в культуре (фактическая концентрация 1,000x, разведенного в культуральной среде 1x).
    4. Урожай клетки с 0,25% трипсина (как на шаге 2.5), промывают 10% NaN 3 и 0,5 М раствора ЭДТА (FACS - буфер), блок 100 мкл разведенных (конечной концентрации 10 мкг / мл) , Fc - блокатора 2.4G2 и красителем для поверхностных маркеров, CD4, CD8, TCRVα2 и TCRVβ5, как на этапах 3.2.3-3.2.4.
    5. Закрепить клетки с 4% раствором параформальдегида в PBS и проницаемыми 100 мкл 1х пермеабилизации буфера после окрашивания поверхности клетки. Внимание! Параформальдегид аллергенным, канцерогенным и токсичным.
    6. Пятно клетки с флуорохромом-конъюгированные TGF-бета и IL-10 в течение 20 мин в темноте. Используйте 0,200 мкг антитела / 10 6 клеток dilutе изд в 100 мкл PBS. Обнаружить внутриклеточный производство TGF-бета и IL-10 с 15-цвет проточном цитометре (рисунок 2).
    7. Промыть клетки три раза холодным FACS буфером до анализа методом проточной цитометрии 11.
  4. В естественных условиях сохранения Ag-специфической иПСК-Tregs.
    1. Через 8 дней совместного культивирования клеток на OP9-DL1-DL4-IA б, передавать Ipsc полученный предварительно Tregs (Thy1.2) , как на шаге 3.3.1 в Твоими 1.1 конгенных мышей (4-6 недель) через инъекции вены хвоста без анестезии. Перед проведением инъекции в хвостовую вену, расширяются хвостовую вену с использованием инфракрасной лампой в течение 5 мин. После того, как в хвостовую вену дилатации, поместите курсор в фиксатор и адаптивно передачи 3 × 10 6 клеток ресуспендировали в 200 мкл PBS путем инъекции через хвостовую вену.
    2. Через шесть недель после переноса Treg, эвтаназии мышей СО 2 удушья с последующим смещением шейных позвонков. Убедитесь в том, что милисе не дышит. Открыть в брюшную полость, разрезав внешнюю оболочку брюшины с помощью ножниц и щипцов и осторожно потянув ее назад, чтобы обнажить внутреннюю кожу накладки в брюшную полость. Изолировать селезенки и периферических лимфатических узлов закачанного Thy 1.1 конгенных мышей.
    3. Собирают клетки из селезенки и лимфатических узлов с использованием механического нарушения для получения суспензии отдельных клеток. Инкубируйте клетки с 5 мл ACK буфера для лизиса в течение 5 мин при комнатной температуре, чтобы лизировать красные кровяные клетки. Сбор и мыть оставшиеся спленоцитов или лимфоциты с 10 мл холодного буфера FACS.
    4. После мытья, лечения клеток с блокаторами 2.4G2 Fc при 4 ° С в течение 20 минут, как в шаге 3.2.2 и пятна с 100 мкл разбавленных флуорохромом-конъюгированные анти-Thy 1.2 антител.
    5. Промыть клетки с 10 мл буфера FACS и перейти к анализа проточной цитометрии 11.

4. В Vivo Созревание и подавление аутоиммунного артрита

  • Генерирование конструкции, как в шаге 2.1.
  • Выполните ретровирусов трансдукции 9 , как в шаге 2.2.
  • В естественных условиях и дифференцировки индукции артрита у мышей.
    1. Дифференцирование ОТ-II TCR / FOXP3-трансдуцированных ИПСК (ОТ-II-FOXP3 / ИПСК), FOXP3-трансдуцированных иПСК, и DsRed трансдуцированных иПСК на б стромальных клеток OP9-DL1-DL4-IA в присутствии цитокинов mFlt-3L и Mil-7 в течение 8 дней, как описано в пунктах 2.1 - 2.6.
    2. Trypisinize все три вида клеток от 10 см пластины и повторно приостанавливать клетки от каждого 10 см пластины в 10 мл свежей среды. Добавьте клетки в свежую 10 см Столешница и вернуться в инкубаторе в течение 30 мин. Через 30 мин собирают плавающие клетки.
    3. Проходят клетки через клеточный фильтр 70 мкм для удаления клеточных кластеров и подсчета использованием гемоцитометра. Отрегулировать клеток до концентрации 1,5 х 10 7 клеток / мл в холодном PBS и фильтруют снова , если это необходимо. Держите клетки на льду до передачи приемному клеток в мышей. Вводят 200 мкл клеточной суспензии (3 × 10 6 клеток) на три различные группы 4 - 6-недельных самок / 6 мышей C57BL через хвостовую вену , как это описано в пункте 3.4.1
    4. На 10-й день после переноса клеток, вводят мышам 100 мкг с помощью программы MBSA, эмульгированного в полном адъюванте Фрейнда у основания хвоста с помощью шприца на 1 мл.
    5. На 17-й день, обезболить мышей с использованием изофлуран испарителя (в соответствии с директивами IACUC). Использование 4 - 5% изофлуран для индукции и 1 - 2% на техническое обслуживание. Индуцируют артрит путем инъекции внутрисуставной 20 мкг с помощью программы MBSA в 10 мкл PBS в левом коленном суставе и 20 мкг с помощью программы MBSA и 100 мкг OVA всего в 10 мкл PBS в правом коленном суставе. Пищевая и gelpack могут быть размещены на напластования полу после того, как артрит разработал. Мыши будут умерщвлены: Body Состояние Оценка (BCS) в 2/5 или умирающей, тяжелой кахексии и / или постоянные лежачее (период 24-ч), и тяжесть оценка 4. В счет4, эритема и сильный отек охватывает лодыжки, стопы и цифры, или ankyloses конечности.
  • Определение характеристик OT-II TCR / FOXP3-трансдуцированных ИПСК.
    1. С помощью флуоресцентного микроскопа (20х) для визуализации нефиксированных живых DsRed + GFP + клеток.
    2. Изучение интеграции и экспрессии генов с помощью как Вестерн - блоттинга и проточной цитометрии 11.
  • Развитие Трег и созревание.
    1. Через 2 недели, 4 и 6 после клеточного переноса, эвтаназии мышей. Для эвтаназии, в каждой клетке использовать 1 - 2 л СО 2 в первой стадии. После того , как животное потеряло сознание, увеличивают скорость потока СО 2 до 4 - 5 л / мин. Эвтаназии мышей CO 2 ингаляции. Изолировать селезенку и слейте лимфатические узлы, разрезав внешнюю оболочку брюшины с помощью ножниц и щипцов и осторожно потянув ее назад, чтобы обнажить внутреннюю кожу накладки в брюшную полость.
    2. Соберите одноклеточной суспензии пром селезенки и лимфатических узлов по механическому разрушению с использованием сетчатого фильтра клеток и 1 мл шприц в 1% IPSC СМИ. Центрифуга коническую пробирку, содержащую питательные среды в 400 г в течение 5 мин. Повторное приостановить осадок клеток в 5 мл буфера для лизиса ACK лизировать эритроциты. Повторно центрифуге при 1000 оборотов в минуту в течение 5 мин. Повторное приостановить осадок клеток и мыть оставшиеся спленоцитов или лимфоциты с холодным буфером FACS. Выполните шаги 3.4.4 - 3.4.5 и перейти к анализу потока цитометрии.
  • Внутриклеточное окрашивание.
    1. На 50 день после заражения, изолировать селезенку и слейте лимфатические узлы мышей (как на этапе 4.5.1) после того, как euthanization СО 2 ингаляции с последующим смещением шейных позвонков.
    2. Собирают одноклеточной суспензии клеток из селезенки и лимфатических узлов путем механической поломки с использованием сетчатого фильтра клеток и 1 мл шприца. Выдержите спленоцитов при комнатной температуре в течение 5 мин с 5 мл буфера для лизиса ACK лизировать эритроциты. Сбор и мыть оставшиеся Splenocytes или лимфоциты с холодным буфером FACS. Выполните шаги 3.2.3 - 3.2.4, но пятно с поверхностными маркерами CD4, CD8, CD25 и TCRVβ5.
    3. Продолжайте фиксировать клетки для внутриклеточного окрашивания , как описано в 3.3.5 - 3.3.7 и анализа внутриклеточной продукции цитокинов (TGF-бета и IL-10) из IPSC-производного Tregs и ворота на живом CD4 + CD25 + клеток.
  • Проникновение Ag-специфических Tregs в коленях и подавление артрита.
    1. Следующие шаги (4.3 - 4.3.6) в дни 7 - 14 после индукции артрита, усыпить мышей СО 2 ингаляции с последующим смещением шейных позвонков ( в соответствии с директивами IACUC). Удалить волосы с колен с электрической машинки для стрижки и акцизный колени с помощью хирургической процедуры.
    2. Снимите кожу с ног, сделав надрез в задней ноги с тупым концом ножниц и разрезают кожу через бедро и вплоть до лодыжки. Аккуратно отделите кожу над голени и стопы, чтобы обнажить мышцы. Удалитьмышцы от ноги осторожно, не повреждая коленного сустава.
      1. Обрежьте заднюю ногу чуть выше таза / тазобедренного сустава и вырезать большую берцовую кость с помощью острых ножниц рассекает.
    3. Закрепить колени в 4% формалине в течение 48 часов. Декальцинировать колени, используя 2,5 М муравьиной кислоты; полоскание трижды в ксилоле в течение 3 мин, полоскать дважды в 100% -ном этаноле, дважды полоскание в 95% -ном этаноле, дважды полоскание в деионизированной воде в течение 2 мин, а накипь в 1 мМ ЭДТА. Treat при температуре к югу кипения (90 ° С) в течение 20 мин.
    4. Охлаждают неподвижную ткань в течение 30 мин. Промойте его с 1x PBS в течение 4 мин и вставить ее в парафин. Обезвоживает ткани с помощью ряда этанола ванн для вытеснения воды, а затем пропитать воском. Затем встраивать инфильтрации тканей в восковых блоков. Выполнение вертикальной и горизонтальной секционирования для окрашивания. Приготовьте 4 мкм секций с выдвижным микротома.
    5. Выполните иммунофлуоресцентного окрашивания на участках после стандартных процедур deparaffiнизация и регидратации с использованием ксилола и этанола 12.
    6. Блок эндогенной пероксидазной активностью, погрузив стекло в достаточном количестве 3% раствора перекиси водорода в течение 3 мин после извлечения Ag. Блок-горок для неспецифического связывания в 3% БСА в PBS при комнатной температуре в увлажненной камере в течение 60 мин.
    7. Пятно секции с 200 мкл флюорохром-конъюгированные TCRVβ5 антитела, разведенного 1: 100 в блокирующем растворе. Инкубировать в течение 2 ч при комнатной температуре в 75 - увлажненной камере 100%, и промыть 5 раз в 1x PBS в течение 5 мин.
    8. Контрастное слайды для ядерного окрашивания с antifade реагентом, содержащим DAPI. Добавить приблизительно 300 мкл разведенного раствора для окрашивания DAPI (300 нМ в 1x PBS) с покровным, убедившись, что весь покровное покрыта. Храните слайды в темноте при 4 ° С до проведения анализа под флуоресцентным микроскопом (рисунок 3).
  • Анализ подавления артрита
    1. Измерьте отек обоих колен мышей до индукции артрита с помощью коммутируемого штангенциркулем, чтобы установить базовый уровень.
    2. Выполните шаги (4.3 - 4.3.6) для индукции артрита и передачи Treg. Измерить колени мыши с набором калибра передачи штангенциркуль пост-Treg.
    3. Вычислить процентное увеличение диаметра колена: процентное увеличение = (диаметр колена на 1-й день - диаметр колена на 0-й день) / диаметр колена на 0-й день.
  • Измерение деструкции суставов и инфильтрация воспалительных клеток в коленях гистологически (рис 4).
    1. На 7-й день после индукции артрита, усыпить мышей, как описано выше, и акцизным колени с помощью хирургической процедуры. См шаг 4.7.1 - 4.7.2.
    2. Закрепить колени в 4% формалине, накипь в ЭДТА, и встраивать в парафин. См шаг 4.7.3
    3. Удалить оба колена, фиксируют в 10% формалине и отвердевают в Formical-4. Встраивание ткани в парафин разделе на 4 мкм, и пятно с hematoxylв и эозином (H & E) или окрашивания Safranin O (как на шаге 4.7.7) и наблюдать под микроскопом.
    4. Используйте H & E окрашивание для оценки эрозии кости с полуколичественного балльной системе (0: нет эрозий; 4: расширенные эрозий и разрушение костной ткани). С помощью окрашивания Safranin O, чтобы оценить потерю протеогликанов и оценка с полуколичественного балльной системе (0: без потери протеогликанов; 3: полная потеря окрашивания для протеогликанов).
      1. Используйте полуколичественного систему подсчета очков, чтобы выиграть воспалительная инфильтрация клеток на H & E окрашенных слайдах (0: нет инфильтрацию, 4: изобиловали инфильтрацию). Оценка баллов, исследуя оба колена слепым методом.
  • 5. Измерение потери костной ткани в коленках с высокой разрешающей способностью микро-компьютерной томографии (микро-КТ) системы

    1. На 10-й день после индукции артрита, анестезию мышей с 2% изофлуран и подготовить для работы с изображениями.
    2. Положение микрофонае колени обращены вверх в камере.
    3. С помощью системы микро-КТ с высоким разрешением , чтобы приобрести в естественных изображений архитектуры кости вокруг коленей мышей.
    4. Выполните микро-КТ с длиной 2,2 мм, в том числе мыши коленных суставов со следующими параметрами: 10,5 мкм размер воксела при 55 кВ, 145 мкА 200 мсек времени интегрирования, 211 изображений.
    5. Импорт микро-КТ изображений и захвата фронтальной плоскости изображения после дальнейшей обработки изображений (объем рендеринга и преобразования) (рисунок 5).

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Как показано здесь, на 28-й день, Ag специфические Tregs существенно выражены CD3 и Ag-специфический TCR, два маркера Т-клеток. Население CD3 + TCRVβ5 + выражается CD4. Большинство клеток CD3 + TCRVβ5 + CD4 + CD25 также выраженными, CD127 и CTLA-4, которые , как правило , выраженные при повышенных уровнях в природных T (nTregs регистры) , и в Т - клетках , экспрессирующих FoxP3 эктопически. Выражение FoxP3 в IPSC-клеток , полученных сохраняется даже после длительного в пробирке стимуляции лиганда Notch, который выявляется внутриклеточного окрашивания анализировали с помощью проточной цитометрии (рисунок 1). Кроме того, Ag конкретных IPSC-Tregs производства подавляющих цитокины, такие как TGF-бета и IL-10, при стимуляции в пробирке с Ag-импульсным спленоцитов (рисунок 2), что указывает на IPSC-Tregs были потенциальные подавляющих деятельность. Люминесцентной микроскопии показало, что больше FOXP3 + клетки присутствовали в OVA обработке , чем PBS-обработанных коленях; не было никаких FOXP3 + клетки , существующие в коленях у мышей , получавших вектор-трансдуцированных ИПСК DsRed +. Намного больше CD4 + FOXP3 + TCRVβ5 + клетки , представленные в коленях у мышей , получавших ИПСК трансдуцированных с MIDR-TCR-FoxP3 чем MIDR-FoxP3 (Рисунок 3). Эти наблюдения указывают на то, что Ag-специфические IPSC-Tregs мигрируют к колену AIA после усыновителя переноса в мышей-реципиентов. Переданные IPSC-клеток , полученных значительно снизилась воспалительный отек колена , когда OVA присутствовал, но не имел никакого влияния на контроль коленного сустава , который был только вводили с помощью программы MBSA в мышиной модели (рисунок 4); уменьшается потеря костной массы в передаче клеток колено визуализируется с высокой разрешающей способностью системы микро-КТ (рисунок 5).

    tp_upload / 54720 / 54720fig1.jpg "/>
    Рисунок 1:. Дифференциация Ag-специфической IPSC-Tregs Мышиные иПСК были трансдуцированных конструкцией: MIDR-TCRα-2A-TCR & beta-2A-FoxP3 , содержащий гены OVA-специфического TCR и FoxP3. Ген-трансдуцированных клеток (DsRed +) культивировали на клетках б OP9-DL1-DL4-IA в присутствии mFlt3L и Mil-7. (А) Морфология Т регистры дифференцировку клеток в день 0, 7, 14 и 22. (в) цитометрический анализ экспрессии гена белка Ipsc клеток , полученных на 28 -й день CD3 + TCRVβ5 + клетки стробированием , как указано (R1) и анализировали на экспрессию CD4 и CD8, CD25, с CD127, CTLA- 4, и FoxP3 показано для клеток закрытого типа , как CD4 + CD8 - клеток (R2). (темные линии, затененные участки указывают элементы управления изотипа) Пожалуйста , нажмите сюда , чтобы просмотреть крупэр версия этой фигуры.

    фигура 2
    Рисунок 2: Функциональные анализы I N Vitro Дифференцированный Ag-специфической Tregs Мышиные IPSC-Tregs стимулировались спленоцитов. (АРС; Т - регуляторными / АРС = 1: 4) и в импульсном режиме с OVA 323-339 пептида. Внутриклеточной продукции цитокинов (TGF-β и IL-10) анализировали с помощью проточной цитометрии после стробирования на живой CD4 + CD25 + клеток. (Темные линии, затененные участки указывают элементы управления изотипа) Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

    Рисунок 3
    Рисунок 3:г конкретных IPSC-Tregs Проникнуть в коленных суставах. Ag-специфические IPSC-Tregs были адаптивно переносили в C57BL / 6 мышей. Вскоре после индукции артрита (дни 7 - 14), колени были удалены и окрашивали на иммуногистология (шкала баров: 20 мкм). У мышей , получавших OVA-специфическую IPSC-Tregs имеют большое число TCRVβ5 + клеток в коленях. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

    Рисунок 4
    Рисунок 4: Приемные Передача Ag-специфического иПСК-Tregs Улучшает AIA у мышей Мышиные иПСК трансдуцировали ретровирусной конструкцией MIDR, MIDR-FoxP3, или MIDR-ТКС-FoxP3 и совместно культивировали на OP9-DL1 / DL4 /. б клетки IA. На 7 -й день, клетки ген-трансдуцированных (3 × 10 6 / мышь) былиdoptively переносили в самок мышей C57BL / 6, которые индуцируют с AIA через две недели после клеточного переноса. На индукции артрита следующий день, тяжесть артрита контролировали путем измерения диаметра колена. (Переменный ток) Процентное увеличение диаметра колена. Увеличение диаметра колена был рассчитан на основе диаметра колена Предварительное введение для каждой мыши перед инъекцией в день 0. балл артрита оценивали путем изучения оба колена слепым методом; каждое колено присваивают балл (0: нет видимых опухание или обесцвечивание; 1: видимый отек с или без изменения цвета; 2: умеренная припухлость с обесцвечивание; 3: тяжелая отечность с обесцвечивание). В каждой группе использовали пять мышей, и данные являются репрезентативными для трех независимых экспериментов. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение. (D) Среднее тем самым увеличив счет на 7 -й день для обоих коленей от пяти мышей. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение от трех независимых экспериментов (** р <0,01, *** р <0,001, двусторонний ANOVA). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

    Рисунок 5
    Рис . 5: Ag конкретных IPSC-Tregs мигрируют к OVA Введенный коленного сустава и уменьшить потери косточки IPSC-Tregs были адаптивно переносили в C57BL / 6 мышей. В течение 21 дней после индукции артрита мышей наркоз и архитектура кости вокруг коленей мыши изображался системой микро-КТ. У мышей , получавших ОТ-II ТКС / FoxP3 ген-трансдуцированных мышиный Ipsc-Tregs демонстрируют значительное снижение потери костной массы по сравнению с контрольными мышами , получающих вектор-трансдуцированных ИПСК. (А) Развертки выполнены с длиной 2,2 мм, и изображения были захвачены после того, как Дальнейшая обработка изображений (объем рендеринга и преобразования;масштабные линейки:. 1 мм) (B) объем костной ткани вокруг коленного сустава оценивали с использованием трехмерной реконструкции изображений микро-КТ, и вычисляли объем кости внутри интересующего объема (масштаба баров:. 1 мм) Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    В этом протоколе, важным шагом является дифференциация в пробирке TCR / FOXP3 ген-трансдуцированных ИПСК. В пробирке передача сигналов Notch индуцирует развитие к клеточной линии Т. Чтобы дифференцировать ИПСК в CD4 + FoxP3 + Tregs, мы использовали клетки б OP9-DL1 / DL4 / IA, которые высоко экспресс MHC II (IA б) молекулы. Большинство ИПСК дифференцировке в клетки CD4 +. Тем не менее, после выражения ТКР поверхности, многие дифференцированные предварительно Т-клетки теряют способность к дифференцировке и в конце концов умирают. В результате, количество клеток из Ipsc-производных функциональных Tregs значительно сокращает после четырех недель дифференцировки в пробирке. Чтобы избежать этого, добавление IL-2 может улучшить выживаемость клеток в тех временных точках. Альтернативный способ для управления созреванием и выживание АГ-специфических предварительных Tregs является передача предварительных Tregs , которые дифференцировались в пробирке в течение недели в мышей. Эти предварительно Tregs могут взаимодействоватьntinue дифференцировки и созревания в естественных условиях в течение еще трех недель. С помощью этого метода, функциональный антиген-специфические популяции Трег могут быть сгенерированы из ИПСК, которые nTregs-как и обладают способностью подавлять аутоиммунные артрита в мышиной модели.

    С целью повышения эффективности развития АГ-специфических иПСК-Tregs в естественных условиях, различных соединений (например, ретиноевая кислота, gelectin) 13,14 или подавляющие цитокины (например, TGF-β, IL-10) , могут быть использованы после того, как адоптивной передачи из предварительного Tregs. В дополнение к увеличению выживаемости клеток, этот комбинированный подход может поддерживать экспрессию FoxP3 14,15 и повысить качество Ag-специфической иПСК-Tregs.

    Потенциальная проблема , которая может возникнуть для развития в естественных условиях Treg является общее снижение иммунитета, что приводит к осложнениям при инфекциях или последующей потере веса. Большое количество Ag-специфического Tregs развивается в VIVO может ухудшить инфекции. В этом случае ген самоубийства, индуцируемого каспазы 9 (ICasp9) 15,16, могут быть включены в вектор ТКС / FoxP3. Такой подход позволяет удаление стволовых клеток, полученных Tregs путем инжекции биологически инертного малой молекулы димеризации агента (AP1903), чтобы "выключить" генерацию стволовых клеток, полученных Tregs, что позволит преодолеть эту потенциальную проблему.

    Самостоятельно Ag представляет собой типичный белок распознается иммунной системой хостов, страдающих от индивидуального аутоиммунного расстройства. Это само-Ag является мишенью иммунной системы, а коррелированные Т-клетки не будут удалены. Для создания Self-Ag конкретных Tregs, использование TCR трансдукции является хорошим выбором. Самостоятельно Ag (например, белок теплового шока) специфический TCR может быть трансдуцированных в зрелых CD4 + CD25 + Tregs из мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК), и этот подход был использован в клинических испытаниях. В качестве альтернативы, в качестве дезсываются в этом протоколе, используя ген трансдукции собственного Ag конкретных TCR с FoxP3 и стимуляции с сигнализацией Notch, стволовых клеток, полученных Tregs может быть самостоятельной Ag конкретных Tregs.

    Клеточной терапии для аутоиммунных заболеваний с использованием сконструированных Tregs может быть полезным 17. Хотя TCR трансдукции в Т - клетках, оказалось безопасным, это возможно, и применим в клинических испытаниях, все еще существуют основные правила безопасности в связи с аутоиммунитета , вызванной перекрестной реактивности со здоровыми тканями 18. Кроме того, используя современные методы, генетически модифицированные Tregs обычно имеют кратковременный настойчивость в естественных условиях 19. В качестве альтернативы, перспективным источником для разработки большого числа моноклональных Ag-специфических Tregs является стволовые клетки. Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) имеют лучший плюрипотентности и самообновления, но это не представляется возможным, чтобы получить их от пациентов. Несмотря на то, легко выделить из периферической крови, гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) являются мульти-сильнодействующими стволовые клетки и может быть расширена в культуре клеток подобно ESCs 20. Современная технология IPSC продвинулась к более эффективной генерации PSC из соматических клеток пациента путем трансдукции различных факторов транскрипции. Ряд методологических улучшений были разработаны в последние годы для создания иПСК, максимально уменьшая потенциальные опасности, такие как иммуногенность и туморогенности. По сравнению с ЭСК, иПСК имеют одинаковую плюрипотентности и самообновления. В результате, технология Ipsc может обеспечить преимущество в разработке пациенто и / или в отношении конкретных заболеваний ЧОК. Использование ИПСК для разработки Ag конкретных Tregs может заранее области клеточной терапии для аутоиммунных заболеваний 10,11.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Acknowledgments

    Этот проект был профинансирован, в частности, в рамках грантов от Национального института здоровья (R01AI121180, R21AI109239 и K18CA151798), Американской ассоциации диабета (1-16-IBS-281) и Пенсильвании Департамент здравоохранения (Табак Расчетно фонды) в JS

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    C57BL/6j mice Jackson Laboratory 664
    B6.129S7 Rag1tm1Mom/J Jackson Laboratory 2216
    Anti-CD3 (2C11) antibody BD Pharmingen 553058
    Anti-CD28 (37.51) antibody BD Pharmingen 553295
    Anti-CD4 (GK1.5) antibody Biolegend 100417
    Anti-CD8 (53–6.7) antibody Biolegend 100714
    Anti-CD25 (3C7) antibody Biolegend 101912
    Anti-TCR-β (H57597) antibody Biolegend 109220
    Anti-IL10 Biolegend 505010
    Anti-TGFβ Biolegend 141402
    DMEM Invitrogen ABCD1234
    α-MEM Invitrogen A10490-01
    FBS Hyclone SH3007.01
    Brefeldin A Sigma B7651
    Polybrene Sigma 107689
    Genejammer Integrated science 204130
    ACK Lysis buffer Lonza 10-548E
    mFlt-3L peprotech 250-31L
    mIL-7 peprotech 217-17
    Gelatin Sigma G9391
    Paraformaldehyde Sigma P6148-500G Caution: Allergenic, Carcenogenic, Toxic
    Permeabilization buffer Biolegend 421002
    mBSA Sigma A7906
    Ova albumin Avantor 0440-01
    CFA Difco 2017014
    Tailveiner restrainer Braintree scientific RTV 150-STD

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Firestein, G. S. Evolving concepts of rheumatoid arthritis. Nature. 423, 356-361 (2003).
    2. Ferraro, A., et al. Interindividual variation in human T regulatory cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, E1111-E1120 (2014).
    3. Tang, Q., et al. In vitro-expanded antigen-specific regulatory T cells suppress autoimmune diabetes. J Exp Med. 199, 1455-1465 (2004).
    4. van Herwijnen, M. J., et al. Regulatory T cells that recognize a ubiquitous stress-inducible self-antigen are long-lived suppressors of autoimmune arthritis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 14134-14139 (2012).
    5. Wright, G. P., et al. Adoptive therapy with redirected primary regulatory T cells results in antigen-specific suppression of arthritis. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 19078-19083 (2009).
    6. Schmitt, T. M., et al. Induction of T cell development and establishment of T cell competence from embryonic stem cells differentiated in vitro. Nat Immunol. 5, 410-417 (2004).
    7. La Motte-Mohs, R. N., Herer, E., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T-cell development from human cord blood hematopoietic stem cells by Delta-like 1 in vitro. Blood. 105, 1431-1439 (2005).
    8. Lei, F., Haque, R., Weiler, L., Vrana, K. E., Song, J. T lineage differentiation from induced pluripotent stem cells. Cell Immunol. 260, 1-5 (2009).
    9. Lei, F., Haque, R., Xiong, X., Song, J. Directed differentiation of induced pluripotent stem cells towards T lymphocytes. J Vis Exp. e3986 (2012).
    10. Lei, F., et al. In vivo programming of tumor antigen-specific T lymphocytes from pluripotent stem cells to promote cancer immunosurveillance. Cancer Res. 71, 4742-4747 (2011).
    11. Haque, R., et al. Programming of regulatory T cells from pluripotent stem cells and prevention of autoimmunity. J Immunol. 189, 1228-1236 (2012).
    12. Chi, V., Chandy, K. G. Immunohistochemistry: paraffin sections using the Vectastain ABC kit from vector labs. J Vis Exp. (2007).
    13. Lu, L., et al. Critical role of all-trans retinoic acid in stabilizing human natural regulatory T cells under inflammatory conditions. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, E3432-E3440 (2014).
    14. Wu, C., et al. Galectin-9-CD44 interaction enhances stability and function of adaptive regulatory T cells. Immunity. 41, 270-282 (2014).
    15. Di Stasi, A., et al. Inducible apoptosis as a safety switch for adoptive cell therapy. N Engl J Med. 365, 1673-1683 (2011).
    16. Ramos, C. A., et al. An inducible caspase 9 suicide gene to improve the safety of mesenchymal stromal cell therapies. Stem Cells. 28, 1107-1115 (2010).
    17. Haque, R., Lei, F., Xiong, X., Wu, Y., Song, J. FoxP3 and Bcl-xL cooperatively promote regulatory T cell persistence and prevention of arthritis development. Arthritis Res Ther. 12, R66 (2010).
    18. van Loenen, M. M., et al. Mixed T cell receptor dimers harbor potentially harmful neoreactivity. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 10972-10977 (2010).
    19. Kim, Y. C., et al. Engineered antigen-specific human regulatory T cells: immunosuppression of FVIII-specific T- and B-cell responses. Blood. 125, 1107-1115 (2015).
    20. Himburg, H. A., et al. Pleiotrophin regulates the expansion and regeneration of hematopoietic stem cells. Nat Med. 16, 475-482 (2010).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics