Desenvolvimento de Células-Tronco de derivados de células T regulatórias antígeno específico da Contra Auto-imunidade

Immunology and Infection

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Haque, M., Fino, K., Sandhu, P., Song, J. Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity. J. Vis. Exp. (117), e54720, doi:10.3791/54720 (2016).

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Abstract

As doenças autoimunes surgem devido à perda da auto-tolerância imunológica. As células T reguladoras (Tregs) são importantes mediadores da auto-tolerância imunológica. Tregs representam cerca de 5 - 10% da subpopulação maduro de células T CD4 + em ratinhos e humanos, com cerca de 1 - 2% dos Tregs que circulam no sangue periférico. Induzidas células estaminais pluripotentes (IPSCs) podem ser diferenciados em Tregs funcional, que tem um potencial para ser utilizados para terapias baseadas em células de doenças auto-imunes. Aqui, apresentamos um método para desenvolver antigénio (Ag) Tregs espec�icos de iPSCs (ou seja, IPSC-Tregs). O método baseia-se na incorporação do factor de transcrição Foxp3 e um receptor de células T específico de Ag-(TCR) em iPSCs e, em seguida, a diferenciação em células do estroma expressando Notch OP9 ligandos semelhante a delta (DL) e uma DL4. Seguindo diferenciação in vitro, o CPSP-Tregs expressam CD4, CD8, CD3, CD25, FoxP3, e Ag-TCR específico e são capazes de responder à estimulação Ag.Este método tem sido aplicado com sucesso para a terapia à base de células de artrite auto-imune num modelo murino. A transferência adoptiva destes específica iPSC-Ag-Tregs em artrite induzida por Ag (AIA) -bearing ratinhos tem a capacidade para reduzir a inflamação das articulações e inchaço e para prevenir a perda óssea.

Protocol

Todos os experimentos com animais são aprovados pelo Colégio Universitário Estadual da Pensilvânia do Comitê Animal Care Medicine (IACUC protocolo # 45470) e são desenvolvidas em conformidade com as diretrizes da Associação para a Avaliação e Acreditação do Laboratório Animal Care.

Cultura de Células 1. Stem

  1. Incubar a placa de 10 cm com 10 ml de gelatina a 0,1% durante pelo menos 30 min a 37 ° C (incubadora) de modo a revestir a placa.
  2. Remover gelatina do prato e a placa 3 x 10 6 irradiados SNL76 / 7 células e incuba-se durante um dia a 37 ° C (incubadora) usando 10% de meio DMEM (10% de FBS e 1% de penicilina estreptomicina).
  3. Remova a mídia da placa e cultura descongelada iPSCs sobre o / 7 camada de alimentação de células SNL76 usando a mídia iPSC (meio DMEM contendo 15% de soro fetal bovino, 0,1 mmol / L aminoácidos não essenciais, 1 mmol / L de L-glutamina, e 0,1 mmol / L β-mercaptoetanol) 9. O li célula do rato iPS-MEF-Ng-20D-17NE, que foi induzida a partir de fibroblastos de rato embrionários por transfecção retroviral de OCT3 / 4, Sox2, KLF4, e c-Myc, foi obtido do Dr. Shinya Yamanaka (Instituto de Frontier Ciências Médicas, Universidade de Kyoto, Quioto, Japão).
  4. Troque a mídia no dia 3 com meios frescos e observar colónias IPSC sob o microscópio.
    NOTA: Estas colónias são, clusters brilhantes pequenos ou células redondas com uma demarcação clara que mostra a expressão GFP sob um microscópio fluorescente.

2. In Vitro A diferenciação de específicos-Ag IPSC-Tregs

  1. Gerar as construções para ser usada na transdução retroviral por sub-clonagem dos genes OT-II e TCR FoxP3 no plasmídeo Midr 10 ligada com 2A péptido de auto-clivagem para fazer o construto-Midr-TCRα-2A-2A-TCRβ FoxP3.
  2. Execute transdução retroviral 9 de iPSCs usando células Plat E como a linha celular de empacotamento.
  3. No dia 0, sementes OP9-DL1-DL4-IA células B deta densidade mínima de 10 4 células / cm 2, usando meios de OP-9 meios (α-MEM contendo FCS a 20% e 1 x 10 6 culas por placa de 10 cm 2,2 g / L de bicarbonato de sódio. Prato.
  4. No dia 3, quando as células B OP9-DL1-DL4-ia tornado 80-90% confluentes, remova a mídia e sementes de 0,5 - 1 x 10 5 iPSCs sobre OP9-DL1-DL4 - células IA b na OP-9 mídia.
    NOTA: Este estabelece a co-cultura de iPSCs em células B OP9-DL1-DL4-IA e é considerado como o dia 0 de diferenciação 9.
  5. No dia 5, remova a mídia a partir da placa de 10 cm por aspiração, lavar as células com 10 ml de 1x PBS, e aspirar o PBS. Adicionar 4 ml de 0,25% de tripsina e incubar a 37 ° C durante 10 min. Adicionar mais 8 mL de meio iPSC às células, re-suspender-los, e centrifugar a 400 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
    1. Aspirar o sobrenadante e re-suspender as células em 10 ml de meio da IPSC. Incubar as células re-suspensas numa placa de 10 cm frescoe voltar para a incubadora durante 30 min.
      NOTA: Remover as células alimentadoras b OP9-DL1-DL4-IA e manter as iPSCs diferenciadoras flutuantes na mídia. Manter as células B OP9-DL1-DL4-IA continuamente para atingir 80-90% de confluência para uma maior co-cultura.
    2. Depois de 30 minutos, recolher as células flutuantes, filtrá-los através de um filtro celular de 70 uM, e contar as células com um hemocitómetro.
  6. Semente de 5 x 10 5 de iPSCs para um novo 80 - 90% confluentes de células B OP9-DL1-DL4-IA em meios OP9. Suplementar o meio com mFlt-3L, a uma concentração final de 5 ng / ml.
  7. No dia 8, recolher iPSCs parcialmente diferenciadas por lavagem da placa com a mídia do prato em si, utilizando uma pipeta de 10 ml. Use mais 5 ml de OP-9 mídia no prato para lavar suavemente as células semi-aderentes por pipetagem cuidadosa, forte, de modo a não quebrar a monocamada OP9 na parte inferior do prato. Repetir a lavagem com 10 ml de PBS para colher todos os semi-adherent diferenciação de células.
    1. Combinar as duas lavagens, centrifugar a 400 xg durante 5 min à temperatura ambiente, re-suspensão em 10 ml de meio OP9 contendo mFlt-3L (5 ng / ml) e mIL-7 (1 ng / ml), e filtrar através de um 70 coador de células uM.
  8. Transferir as células em uma placa de cultura de 6 poços contendo 80 - 90% confluentes OP9-DL1-DL4-IA b células, tal como no passo 1.1. Transferência de células colhidas a partir de uma placa de 10 cm para um poço da placa de 6 poços.
  9. No dia 10, a mudança de metade dos meios de comunicação a partir de células para a mídia OP9 fresco suplementado com mFlt-3L (5 ng / ml) e MIL-7 (1 ng / ml). Repita este passo a cada dois dias.
  10. A cada 4-6 dias, dependendo do crescimento, as sementes re-diferenciação iPSCs em placas com uma camada fresca de células B OP9-DL1-DL4-AI, tal como descrito na etapa 1.1.

3. Avaliação da In Vitro Treg diferenciação e maturação

  1. As alterações morfológicas de iPSCs diferenciador.
    1. Monitor a co-cultura de iPSCs com as células B OP9-DL1-DL4-ia todos os dias através da observação de células vivas sob um microscópio de campo claro convencional (20X). De dia 5, observar as colônias com características mesoderme-like, tais como células achatadas. De dia 8, observar pequenos grupos, redondo de células, que representam células de diferenciação.
    2. Use o método de exclusão Trypan Blue para contar as células para detectar o número ea porcentagem de células vivas. Calcular a viabilidade celular como o número de células viáveis, dividido pelo número total de células dentro das quatro grades na hemocitómetro. Se as células ocupam azul de tripano, considerá-los mortos ou não viáveis. Registe o número de células vivas colhidas a partir da cultura.
  2. A análise de citometria de fluxo de diferenciar iPSCs.
    1. Nos dias 5, 7, 11, 15, 19, 21, e 28 do co-cultura, remover as células com 0,25% de tripsina como na etapa 25.
    2. Antes da coloração de superfície com anticorpos fluorocromo-conjugados diferentes, incubate 1 X 10 6 células com 100 ul de Fc 2.4G2 bloqueador diluída em PBS (concentração final 10 ug / ml) a 4 ° C durante 20 minutos para evitar a ligação do anticorpo para o receptor Fc na superfície da célula.
    3. Nos dias 5, 7, 11, 15, 19, 21, e 28, usar 1 x 10 6 células por citometria de fluxo com anticorpos fluorocromo-conjugados diferentes para detectar os marcadores de superfície celular, incluindo CD3, TCRβ, CD4, CD8, CD25, e CTLA4.
    4. Seguinte bloco Fc, lavar as células com 10 ml de PBS e mancha com anticorpos fluorocromo-conjugados com diferentes durante 20 min a 4 ° C, e, em seguida, executar a análise por citometria de fluxo com os 15 cor-de fluxo FACSCalibur. Use 0,200 ug de anticorpo por 10 6 células diluído em 100 ul de PBS.
    5. No dia 28, analisar as células por citometria de fluxo 11 e a porta em células CD4 + CD8 + utilizando CD4 e CD8 conjugados com fluorocromo coloração; análise para a expressão de TCRVα2, TCRVβ5, CD25, CTLA-4, E FoxP3 (Figura 1). Para a coloração FoxP3, fixar as células e permealize-los e, em seguida, executar coloração de anticorpos 11.
  3. Na estimulação com antigénio in vitro de iPSCs.
    1. No dia 28 de co-cultura, colheita iPSC-Tregs a partir de culturas através da recolha das células flutuantes. Tripsinizar o resto das células com tripsina a 0,25% (como no passo 2.5) e re-suspender as células em 8 ml de meio da IPSC. Centrifugar durante 5 minutos a 400 xg, à temperatura ambiente, aspirar os meios de comunicação, e de novo re-suspender as células em 10 ml de meio.
      1. Incubar as células ressuspensas em uma nova placa de 10 cm a 37 ° C durante 30 minutos e recolher as células flutuantes. Lavam-se as células com PBS frio.
    2. Incubar 3 x 10 6 esplenócitos de baços de C57BL / 6 RAG1 - / - ratos com o péptido de ovalbumina 5 uM em 200 ul de meios de comunicação (OVA 323-339) a 4 ° C durante 30 minutos numa placa de 96 poços 11.
    3. Misturar com OVA 323-339 Tregs esplenócitos em uma proporção de 1: 4 (use 0,75 x 10 6 Tregs). Incubar a 37 ° C numa incubadora de CO2 durante 40 hr. No último 4 horas, adicionar 4 mL de diluída Brefeldina A na cultura (1.000x concentração real, diluída em meio de cultura 1x).
    4. Células da colheita com tripsina a 0,25% (como no passo 2.5), lava-se com 10% de NaN3 e uma solução 0,5 M de EDTA (tampão FACS), bloco com 100 ul de diluído (concentração final 10 ug / ml) Fc bloqueador 2.4G2, e mancha para os marcadores de superfície, CD4, CD8, TCRVα2, e TCRVβ5 tal como nos passos 3.2.3-3.2.4.
    5. Fixar as células com uma solução de paraformaldeído a 4% em PBS e permeabilizar com 100 ul de tampão de permeabilização 1x após coloração da superfície celular. Cuidado! O paraformaldeído é alergénico, carcinogénico e tóxico.
    6. Corar as células com fluorocromo-conjugados de TGF-β e IL-10 durante 20 min no escuro. Use 0,200 ug de anticorpo / 10 6 células diluted em 100 ul de PBS. Detectar a produção intracelular de TGF-β e IL-10 com a 15-cor citómetro de fluxo (Figura 2).
    7. Lavam-se as células três vezes com tampão FACS frio antes da análise por citometria de fluxo 11.
  4. Em persistência in vivo de Ag-specific iPSC-Tregs.
    1. Após 8 dias de co-cultura em células B OP9-DL1-DL4-IA, transferir-iPSC derivado pré-Tregs (Thy1.2) como no passo 3.3.1 em Tuas ratinhos congénicos 1,1 (4-6 semanas de idade) por meio de um injecção na veia da cauda sem anestesia. Antes de realizar a injecção na veia da cauda, ​​dilatar veia da cauda usando uma lâmpada de infravermelhos durante 5 minutos. Após a dilatação da veia da cauda, colocar o rato em uma limitador e transferência adoptiva de 3 x 10 6 células ressuspensas em 200 ul de PBS por injecção através da veia da cauda.
    2. Seis semanas após a transferência de Treg, sacrificar os ratinhos por asfixia com CO 2, seguida por deslocação cervical. Certifique-se de que a mice não está respirando. Abrir a cavidade peritoneal, cortando a película exterior do peritoneu utilizando tesouras e pinças e puxando-o para trás para expor a pele que reveste o interior da cavidade peritoneal. Isolar o baço e gânglios linfáticos periféricos de ratos cong�icas Thy 1.1 injetados.
    3. Recolher as células de baço e nos nódulos linfáticos, utilizando quebra mecânica para produzir uma suspensão de célula única. Incubam-se as células com 5 ml de tampão de lise ACK durante 5 min à temperatura ambiente para lisar os glóbulos vermelhos. Recolher e lavar os esplenócitos ou linfócitos remanescentes com 10 ml de tampão FACS frio.
    4. Após a lavagem, o tratamento de células com o 2.4G2 bloqueador de Fc, a 4 ° C durante 20 minutos como no passo 3.2.2 e mancha com 100 ul de anticorpos fluorocromo-conjugados com anti-Thy 1,2 diluído.
    5. Lavar as células com 10 ml de tampão de FACS e proceder à análise citométrica de fluxo 11.

4. In Vivo Maturação e Repressão da artrite auto-imune

  • Gerar as construções como no passo 2.1.
  • Realizar a transdução retroviral 9 como no passo 2.2.
  • Na diferenciação in vivo e indução de artrite em ratos.
    1. Diferenciar OT-II TCR / transduzidas-FoxP3 iPSCs (AT-II-FoxP3 / IPSCs), iPSCs transduzidas-FoxP3, e DsRed iPSCs transduzidas sobre as células b estromais OP9-DL1-DL4-IA na presença de citocinas mFlt-3L e mIL-7 para 8 dias tal como descrito nos passos 2.1 - 2.6.
    2. Trypisinize todos os três tipos de células a partir da placa de 10 cm, e as células de cada placa de 10 centímetros de re-suspensão em 10 ml de meio fresco. Adicionar as células para uma placa fresca a 10 cm, e voltar a incubadora durante 30 min. Após 30 min, coletar células flutuante.
    3. Passe as células através de um filtro de células 70 mm para remover grupos de células e contar com um hemocitômetro. Ajustar as células a uma concentração de 1,5 x 10 7 células / ml em PBS frio e filtra-se novamente, se necessário. Manter as células no gelo até a transferência celular adotiva em ratinhos. Injectar 200 ul da suspensão de células (3 x 10 6 células) em três grupos diferentes de 4 - 6 semanas de idade, fêmeas C57BL / 6 murganhos através da veia da cauda, tal como descrito em 3.4.1
    4. No dia 10 após a transferência de células, injectar ratinhos com 100 ug de mBSA emulsionado em adjuvante completo de Freund na base da cauda, ​​utilizando uma seringa de 1 ml.
    5. No dia 17, anestesiar ratos utilizando um vaporizador de isoflurano (de acordo com as orientações IACUC). Utilizar 4-5% de isoflurano para a indução e 1 - 2% para manutenção. Induzir a artrite por injecção intra-articular de 20 ug mBSA em 10 ul de PBS no joelho esquerdo conjunta e de 20 ug e 100 ug mBSA inteiro de OVA em 10 ul de PBS na articulação do joelho direito. Comida e um gelpack pode ser colocado no chão da cama depois desenvolveu artrite. Camundongos serão sacrificados: escore de condição corporal (ECC) de 2/5 ou moribundas, caquexia grave e / ou decúbito persistente (um período de 24 horas), e da gravidade marcar 4. Na pontuação4, eritema e inchaço grave abranger o tornozelo, pé e dígitos, ou anquiloses do membro.
  • Caracterização dos iPSCs OT-II TCR / transduzidas-FoxP3.
    1. Use um microscópio de fluorescência (20X) para visualizar as células DsRed + GFP + ao vivo não corrigidos.
    2. Examine a integração e expressão de genes por ambos Western blot e citometria de fluxo 11.
  • Treg desenvolvimento e maturação.
    1. Nas semanas 2, 4 e 6 após a transferência de células, eutanásia os ratos. Por eutanásia, em cada gaiola usar 1-2 L de CO 2 na primeira fase. Uma vez que o animal perde a consciência, aumentar a taxa de fluxo de CO2 para 4-5 l / min. Euthanize ratos por inalação de CO 2. Isolar o baço e os gânglios linfáticos drenar cortando a pele exterior do peritoneu utilizando tesouras e pinças e puxando-o para trás para expor a pele que reveste o interior da cavidade peritoneal.
    2. Recolher o único suspensão de células from os baço e linfonodos por avaria mecânica, utilizando um filtro de células e uma seringa de 1 ml em 1% de mídia da IPSC. Centrifugar o tubo cônico que contém a mídia a 400 g durante 5 min. Re-suspender o sedimento de células em 5 ml de tampão de lise ACK para lisar as células vermelhas do sangue. Re-centrifugar a 1000 rpm durante 5 min. Re-suspender o sedimento de células e lava-se os esplenócitos ou linfócitos restantes com tampão FACS frio. Siga os passos 3.4.4 - 3.4.5 e proceder à análise de fluxo de citometria.
  • coloração intracelular.
    1. No dia 50 pós-desafio, isolar o baço e os gânglios linfáticos drenar dos murganhos (como no passo 4.5.1) Após a eutanásia por inalação de CO 2, seguida por deslocação cervical.
    2. Recolher o suspensão de células individuais do baço e linfonodos por avaria mecânica, utilizando um filtro de células e uma seringa de 1 ml. Incubar os esplenócitos à temperatura ambiente durante 5 min com 5 ml de tampão de lise ACK para lisar as células vermelhas do sangue. Recolher e lavar as s restantesplenocytes ou linfócitos com tampão FACS frio. Siga os passos 3.2.3 - 3.2.4, mas mancha com marcadores de superfície CD4, CD8, CD25, e TCRVβ5.
    3. Avance para fixar as células para a coloração intracelular, tal como descrito em 3.3.5 - 3.3.7 e a análise da produção de citoquina intracelular (TGF-β e IL-10) de Tregs iPSC-derivado e porta em células vivo CD4 + CD25 +.
  • Infiltração de Tregs específicas-Ag nos joelhos e supressão de artrite.
    1. Seguindo os passos (4.3 - 4.3.6) nos dias 7-14 de indução de pós-artrite, eutanásia ratos por inalação de CO 2 seguido por deslocamento cervical (de acordo com as diretrizes IACUC). Remover os pêlos dos joelhos com um clipper elétrico e extirpar os joelhos por procedimento cirúrgico.
    2. Remover a pele dos pés, fazendo uma incisão na pata traseira com uma tesoura de extremidade romba e cortar a pele através da coxa e para baixo para o tornozelo. Suavemente descascar a pele ao longo da perna e do pé para expor o músculo. Removero músculo da perna cuidadosamente sem danificar a articulação do joelho.
      1. Cortar a perna logo acima do pélvica joint / quadril e cortar a tíbia usando tesouras de dissecação afiadas.
    3. Corrigir os joelhos em formalina a 4% durante 48 horas. Descalcificar os joelhos usando ácido fórmico a 2,5; lavar três vezes em xilol durante 3 minutos, lavar duas vezes em etanol a 100%, lavar duas vezes em etanol a 95%, lavar duas vezes em água desionizada durante 2 minutos, e descalcificar em EDTA 1 mM. Tratar a uma temperatura sub-ebulição (90 ° C) durante 20 min.
    4. Arrefece-se a tecido fixado em 30 min. Lavar com 1x PBS durante 4 minutos e incorporá-lo em parafina. Desidratar os tecidos por meio de uma série de banhos de etanol para deslocar a água, e, em seguida, infiltrando-as com cera. Em seguida, incorporar os tecidos infiltrados em blocos de cera. Executar tanto de corte vertical e horizontal para a coloração. Prepare 4 mm seções com um micrótomo deslizante.
    5. Realização da coloração imunofluorescente nas secções após procedimentos padrão de deparaffinização e a reidratação utilizando xileno e etanol 12.
    6. Bloquear a actividade da peroxidase endógena por imersão da corrediça em uma quantidade suficiente de solução de peróxido de hidrogénio a 3% durante 3 min após a recuperação Ag. bloco desliza para ligação não específica em 3% de BSA em PBS, à temperatura ambiente numa câmara humidificada, durante 60 min.
    7. secções mancha com 200 ul de anticorpo conjugado com fluorocromo TCRVβ5 diluído 1: 100 em solução de bloqueio. Incubar durante 2 horas à temperatura ambiente num 75 - câmara humidificada a 100%, e lava-se 5 vezes em 1X PBS durante 5 min.
    8. Contracoloração das lâminas para coloração nuclear com um reagente Antifade contendo DAPI. Adicionar cerca de 300 ul da solução de coloração DAPI diluídas (300 nM em PBS 1x) para a lamela, assegurando que toda a lamela é coberto. Armazenar as lâminas no escuro a 4 ° C até à análise ao microscópio de fluorescência (Figura 3).
  • ensaio de supressão da artrite
    1. Medir o inchaço de ambos os joelhos dos camundongos antes da indução de artrite usando uma pinça de calibre de marcação para estabelecer uma linha de base.
    2. Siga os passos (4.3 - 4.3.6) para indução de artrite e transferência Treg. Meça joelhos rato com um calibre de marcação transferência caliper pós-Treg.
    3. Calcular a percentagem de aumento no diâmetro do joelho: por cento de aumento = (diâmetro do joelho no dia 1 - diâmetro do joelho no dia 0) / diâmetro do joelho no dia 0.
  • Medição da destruição da articulação e a infiltração de células inflamatórias nos joelhos por histologia (Figura 4).
    1. No dia 7 de indução de pós-artrite, eutanásia os ratos, tal como descrito anteriormente, e extirpar os joelhos por procedimento cirúrgico. Veja o passo 4.7.1 - 4.7.2.
    2. Corrigir os joelhos em 4% de formalina, descalcificação em EDTA e incorporar em parafina. Veja o passo 4.7.3
    3. Remova ambos os joelhos, corrigir em formol 10%, e calcificar em Formical-4. Incorporar os tecidos em parafina, seção de 4 mm, e mancha com hematoxyle eosina (H & E) ou coloração com safranina O (como no passo 4.7.7) e observa ao microscópio.
    4. Use coloração H & E para avaliar a erosão óssea com um sistema de pontuação semi-quantitativa (0: não há erosões; 4: erosões estendidos e destruição do osso). Use safranina O coloração para avaliar a perda de proteoglicanos e marcar com um sistema de pontuação semi-quantitativo (0: nenhuma perda de proteoglicanos; 3: perda completa de coloração para proteoglicanos).
      1. Use um sistema de pontuação semi-quantitativa para marcar a infiltração de células inflamatórias em lâminas H & E manchados (0: sem infiltração de células; 4: abundavam infiltração de células). Avaliar a pontuação examinando ambos os joelhos de forma cega.
  • 5. Medição de perda óssea nos joelhos com o Sistema de alta resolução Micro-tomografia computadorizada (micro-CT)

    1. No dia 10 de indução de pós-artrite, anestesiar ratos com isoflurano a 2% e se preparar para a imagem latente.
    2. mic posiçãoe com os joelhos virados para cima na câmara.
    3. Use um sistema de micro-CT de alta resolução para adquirir in vivo de imagens da arquitetura óssea ao redor dos joelhos de ratos.
    4. Executar verificações micro-CT com um comprimento de 2,2 mm, incluindo as articulações do joelho do rato com os seguintes parâmetros: 10,5 uM de tamanho de voxel a 55 kV, 145 mA 200 ms de tempo de integração, 211 imagens.
    5. Import micro-CT imagens e imagens de plano de captura frontal após o processamento de imagem (renderização de volume e de transformação) (Figura 5).

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    Representative Results

    Como mostrado aqui, no dia 28, específico do Ag Tregs expressa substancialmente CD3 e TCR específico do Ag, dois marcadores de células T. A população de células CD3 + + TCRVβ5 expressa CD4. A maioria das células CD3 +, CD4 + TCRVβ5 + também expressa CD25, CD127, e CTLA-4, que são normalmente expressas em níveis elevados em que ocorre naturalmente (regs T nTregs) e em células T que expressam ectopicamente FoxP3. FoxP3 expressão em células-derivadas iPSC persistiu mesmo depois de longo prazo na estimulação in vitro com o ligando do entalhe, tal como detectado por coloração intracelular analisadas por citometria de fluxo (Figura 1). Além disso, a Ag-specific iPSC-Tregs produzido citoquinas supressoras, tais como TGF-β e IL-10, quando estimulada in vitro com esplenócitos Ag-pulsados (Figura 2), indicando a iPSC-Tregs tinham potenciais actividades supressivas. A microscopia de fluorescência revelou que mais células FoxP3 + estavam presentes na que os joelhos tratados com PBS-OVA tratadas; não havia células FoxP3 + existentes nos joelhos em camundongos que receberam as iPSCs transduzidas por vetores DsRed +. Muitos mais células CD4 + FoxP3 + + TCRVβ5 células apresentados nos joelhos de ratos que receberam iPSCs transduzidas com o TCR-Midr-Foxp3 que o Midr-FoxP3 (Figura 3). Estas observações sugerem que específicas IPSC-Ag-Tregs migrar para o joelho AIA após a transferência adoptiva para ratinhos receptores. As células-derivadas iPSC transferidos diminuiu substancialmente o joelho inchaço inflamatório quando OVA estava presente, mas não teve nenhum efeito sobre o controlo do joelho que apenas foi injectada com mBSA no modelo de murino (Figura 4); reduziu a perda óssea no joelho transferência de células visualizados pelo sistema de micro-TC de alta resolução (Figura 5).

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    Figura 1:. Diferenciação de Ag-specific iPSC-Tregs Murino iPSCs foram transduzidas com um constructo: Midr-TCRα-2A-2A-TCRβ-FoxP3 contendo genes de OVA-específica de TCR e FoxP3. As células transduzidas com genes (DsRed +) foram co-cultivados em células B OP9-DL1-DL4-IA na presença de mFlt3L e mIL-7. (A) Morfologia de T regs diferenciação de células no dia 0, 7, 14 e 22. análise por citometria de (B) de fluxo para a expressão da proteína das células-derivadas iPSC no dia 28. CD3 + + TCRVβ5 células foram bloqueadas conforme indicado (R1) e analisados para a expressão de CD4 e CD8, com CD25, CD127, CTLA- 4 e FoxP3 mostrado para células fechadas como CD4 + CD8 - células (R2). (linhas escuras; áreas sombreadas indicam controlos isotípicos) por favor clique aqui para ver uma largversão er desta figura.

    Figura 2
    Figura 2: As análises funcionais de I n Tregs Vitro Diferenciada Ag específicos de murino IPSC-Tregs foram estimuladas por esplenócitos.;: E pulsadas com OVA 323-339 peptídeo (APCs regs T / APC = 1 4). Produção de citocinas intracelular (TGF-β e IL-10) foi analisada por citometria de fluxo após gating em directo de CD4 + CD25 +. (Linhas escuras; áreas sombreadas indicam controlos isotípicos) Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    Figura 3
    Figura 3: UmiPSC-Tregs infiltrar-se as articulações do joelho específico do g. Ag-específicos IPSC-Tregs foram transferidos adoptivamente para ratinhos C57BL / 6. Pouco tempo após a indução da artrite (dias 7 - 14), os joelhos foram removidas e coradas para a imuno-histologia (barras de escala: 20 mm). Os ratinhos que receberam OVA específica do iPSC-Tregs têm um grande número de células TCRVβ5 + nos joelhos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    Figura 4
    Figura 4: Transferência adoptiva de específicas de Ag iPSC-Tregs melhora AIA em Ratos iPSCs de ratinho foram transduzidas com a construção retroviral Midr, Midr-FoxP3, ou Midr-TCR-Foxp3 e foram co-cultivados sobre o OP9-DL1 / DL4 /. As células B IA. No dia 7, as células transduzidas com o gene (3 x 10 6 / rato) foram umdoptively transferidos para fêmeas C57BL / 6 ratos que foram induzidos com AIA duas semanas após a transferência de células. No dia seguinte a indução da artrite, a gravidade da artrite foi monitorizada por medição do diâmetro do joelho. (AC) por cento de aumento no diâmetro do joelho. Aumento do diâmetro do joelho foi calculada com base no diâmetro de pré-injecção do joelho para cada rato antes da injecção no dia 0. A pontuação de artrite foi avaliada por análise de ambos os joelhos de uma maneira cega; cada joelho foi atribuída uma pontuação (0: nenhum inchaço visível ou descoloração; 1: visível inchaço com ou sem manchas; 2: moderada inchaço com descoloração; 3: inchaço grave com descoloração). Em cada grupo foram utilizados cinco ratos, e os dados são representativos de três experiências independentes. Os dados estão representados como a média ± DP. (D) A média marcando no dia 7 para ambos os joelhos a partir de cinco murganhos. Os dados estão representados como a média ± DP de três experiências independentes (** p <0,01, *** p <0,001, two-way ANOVA). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    Figura 5
    Figura 5: Ag. Específica iPSC-Tregs migrar para o OVA injetado no joelho e reduzir a perda óssea IPSC-Tregs foram adoptively transferidos para camundongos C57BL / 6. Dentro de 21 dias de indução de pós-artrite, os ratos foram anestesiados e a arquitetura óssea ao redor dos joelhos rato foi fotografada pelo sistema de micro-CT. Os ratinhos que receberam OT-II TCR / FoxP3 gene transduzido murino IPSC-Tregs exibem redução significativa da perda óssea, em comparação com ratinhos de controlo que receberam iPSCs transduzidas por vectores. (A) Os exames foram realizados com um comprimento de 2,2 mm, e as imagens foram capturadas depois posterior processamento de imagem (renderização de volume e de transformação;barras de escala:. 1 mm) (B) de volume ósseo ao redor da articulação do joelho foi avaliada usando reconstrução tridimensional de imagens micro-CT, e foi calculado o volume ósseo no interior do volume de juros (barras de escala:. 1 mm) Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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    Discussion

    Neste protocolo, um passo crítico é a diferenciação in vitro de iPSCs transduzidas com genes / FoxP3 TCR. In vitro sinalização Notch induz o desenvolvimento para a linhagem de células T. Para diferenciar iPSCs em células CD4 + Foxp3 + Tregs, foram utilizadas as células B OP9-DL1 / DL4 / IA, que moléculas altamente expressa MHC II (IA b). A maioria dos iPSCs diferenciar-se em células T CD4 +. No entanto, após a expressão de TCR da superfície, muitas células pré-T diferenciadas perdem a capacidade de diferenciar e eventualmente morrem. Como resultado, o número de células das Tregs funcionais iPSC derivados reduz dramaticamente após quatro semanas de diferenciação in vitro. Para o evitar, a adição de IL-2 pode melhorar a sobrevivência de células nos pontos de tempo. Um método alternativo de conduzir a maturação e sobrevivência de Ag-específicas pré-Tregs é para transferir os pré-Tregs que diferenciadas in vitro durante uma semana em ratinhos. Estes pré-Tregs podem continue diferenciação e maturação in vivo por mais três semanas. Usando este método, uma população específica Treg Ag-funcional pode ser gerada a partir de iPSCs, que são nTregs-like e têm a capacidade de suprimir a artrite auto-imune no modelo murino.

    Para melhorar a eficácia de no desenvolvimento in vivo de Ag-specific iPSC-Tregs, compostos diferentes (por exemplo, ácido retinóico, 13,14 gelectin) ou supressores de citocinas (por exemplo, TGF-β, IL-10) pode ser usado após a transferência adoptiva do pré-Tregs. Além de aumentar a sobrevivência de células, esta abordagem combinada pode manter a expressão FoxP3 14,15 e melhorar a qualidade do específico do Ag iPSC-Tregs.

    Um problema potencial que pode surgir para o desenvolvimento in vivo Treg é geral imunossupressão, resultando em complicações durante infecções ou subsequente perda de peso. Um grande número de Ag-específica Tregs em desenvolvimento VIvo pode piorar infecções. Neste caso, um gene suicida, a caspase 9 indutível (ICasp9) 15,16, podem ser incorporadas no vector de TCR / FoxP3. Esta abordagem permite a remoção das Tregs derivadas de células estaminais através da injecção de uma pequena molécula bio-inerte dimerização agente (AP1903) para "desligar" a geração de Tregs derivadas de células estaminais, a qual irá ultrapassar este problema potencial.

    Um auto-Ag é uma proteína típica reconhecido pelo sistema imune de hospedeiros que sofrem de uma desordem auto-imune indivíduo. Esta auto-Ag é o objectivo do sistema imunitário, e as células T não são eliminadas correlacionados. Para gerar a auto-Ag Tregs específicos, a utilização de transdução de TCR é uma boa escolha. Um auto-Ag (por exemplo, proteína de choque térmico) de TCR específica pode ser transduzido para madura CD4 + CD25 + a partir de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs), e esta abordagem tem sido utilizada em ensaios clínicos. Em alternativa, como descrita neste protocolo, utilizando a transdução de genes de auto-Ag TCR específico com FoxP3 e estimulação com a sinalização Notch,-tronco derivadas de células Tregs pode ser auto-Ag Tregs específico.

    Terapias à base de células para doenças auto-imunes que utilizam Tregs manipuladas podem ser úteis 17. Embora TCR transdução em células T provou ser seguro, viável e aplicável em ensaios clínicos, ainda há grandes preocupações de segurança, devido à auto-imunidade causada por reação cruzada com os tecidos saudáveis 18. Além disso, usando os métodos atuais, geneticamente modificado Tregs geralmente têm uma persistência de curto prazo in vivo 19. Em alternativa, uma fonte promissora para o desenvolvimento de um grande número de anticorpos monoclonais específicos de Ag-Tregs é células estaminais. As células estaminais embrionárias (CES) tem o melhor pluripotência e auto-renovação, mas não é possível obter-los a partir de pacientes. Embora facilmente isolados a partir do sangue periférico, células estaminais hematopoiéticas (HSCs) são multi-As células estaminais e potentes podem ser expandidas em cultura de células de forma semelhante à CES 20. tecnologia iPSC presente avançou a uma geração mais eficiente de CPS a partir de células somáticas de doentes por transdução de diferentes factores de transcrição. Um certo número de aperfeiçoamentos metodológicos têm sido desenvolvidos nos últimos anos para gerar iPSCs reduzindo ao máximo os riscos potenciais, tais como a imunogenicidade e a tumorigenicidade. Em comparação com os CES, iPSCs possuem pluripotência idênticos e auto-renovação. Como resultado, a tecnologia iPSC pode proporcionar uma vantagem no desenvolvimento de pacientes-unidades e / ou de doenças específicas. O uso de iPSCs para desenvolver Ag-específica Tregs podem avançar no campo de terapias à base de células para doenças auto-imunes 10,11.

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    Acknowledgments

    Este projecto foi financiado, em parte, sob bolsas de Institutos Nacionais de Saúde (R01AI121180, R21AI109239 e K18CA151798), a American Diabetes Association (1-16-IBS-281), e do Departamento de Pensilvânia da Saúde (tabaco fundos de liquidação) para JS

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    C57BL/6j mice Jackson Laboratory 664
    B6.129S7 Rag1tm1Mom/J Jackson Laboratory 2216
    Anti-CD3 (2C11) antibody BD Pharmingen 553058
    Anti-CD28 (37.51) antibody BD Pharmingen 553295
    Anti-CD4 (GK1.5) antibody Biolegend 100417
    Anti-CD8 (53–6.7) antibody Biolegend 100714
    Anti-CD25 (3C7) antibody Biolegend 101912
    Anti-TCR-β (H57597) antibody Biolegend 109220
    Anti-IL10 Biolegend 505010
    Anti-TGFβ Biolegend 141402
    DMEM Invitrogen ABCD1234
    α-MEM Invitrogen A10490-01
    FBS Hyclone SH3007.01
    Brefeldin A Sigma B7651
    Polybrene Sigma 107689
    Genejammer Integrated science 204130
    ACK Lysis buffer Lonza 10-548E
    mFlt-3L peprotech 250-31L
    mIL-7 peprotech 217-17
    Gelatin Sigma G9391
    Paraformaldehyde Sigma P6148-500G Caution: Allergenic, Carcenogenic, Toxic
    Permeabilization buffer Biolegend 421002
    mBSA Sigma A7906
    Ova albumin Avantor 0440-01
    CFA Difco 2017014
    Tailveiner restrainer Braintree scientific RTV 150-STD

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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