Développement de cellules souches dérivées de cellules T régulatrices spécifiques de l'antigène contre Autoimmunité

Immunology and Infection

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Haque, M., Fino, K., Sandhu, P., Song, J. Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity. J. Vis. Exp. (117), e54720, doi:10.3791/54720 (2016).

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Abstract

Maladies auto-immunes surviennent en raison de la perte de l'auto-tolérance immunologique. Les lymphocytes T régulateurs (Treg) sont des médiateurs importants de l'auto-tolérance immunologique. Treg représentent environ 5 - 10% de la sous - population de lymphocytes T CD4 + matures chez les souris et les humains, avec environ 1 - 2% de ces Treg circulant dans le sang périphérique. Les cellules souches pluripotentes induites (CISP) peuvent être différenciées en Tregs fonctionnelle, qui ont un potentiel d'être utilisé pour les thérapies à base de cellules de maladies auto-immunes. Ici, nous présentons une méthode pour développer l' antigène (Ag) Tregs de CSPi spécifique de (c. -à- iPSC-Treg). La méthode est basée sur l'intégration du facteur de transcription FoxP3 et un récepteur Ag-spécifique des cellules T (TCR) en CSPi puis différenciation sur les cellules OP9 stromales exprimant Notch ligands delta-like (DL) 1 et DL4. Après la différenciation in vitro, les iPSC-Tregs expriment CD4, CD8, CD3, CD25, FoxP3 et Ag-TCR spécifique et sont capables de répondre à Ag stimulation.Cette méthode a été appliquée avec succès à la thérapie à base de cellules de l'arthrite auto-immune chez un modèle murin. Le transfert adoptif de ces Ag spécifique iPSC-Tregs dans l'arthrite Ag-induite (AIA) souris -bearing a la capacité de réduire l'inflammation des articulations et de l'enflure et de prévenir la perte osseuse.

Protocol

Toutes les expériences sur les animaux sont approuvés par le University College Pennsylvania State Animal Care Committee Médecine de (IACUC protocole n 45470) et sont menées en conformité avec les directives de l'Association pour l'évaluation et l'accréditation des laboratoires de protection des animaux.

1. Stem Cell Culture

  1. Incuber un plat de 10 cm avec 10 ml de gélatine à 0,1% pendant au moins 30 min à 37 ° C (incubateur) pour revêtir la plaque.
  2. Retirer la gélatine de l'antenne et la plaque 3 x 10 6 irradiée SNL76 / 7 cellules et incuber pendant une journée à 37 ° C (incubateur) en utilisant 10% de milieu DMEM (10% de FBS et 1% de pénicilline streptomycine).
  3. Retirez le support de la plaque et la culture décongelé CSPi sur / 7 couche d'alimentation de cellules SNL76 utilisant iPSC médias (milieu DMEM contenant 15% de sérum de veau foetal, 0,1 mmol / L des acides aminés non essentiels, 1 mmol / L de L-glutamine, et 0,1 mmol / L de β-mercaptoéthanol) 9. Le li cellulaire souris iPS-MEF-Ng-20D-17ne, qui a été induite à partir de souris fibroblastes embryonnaires par transfection virale rétro de Oct3 / 4, Sox2, Klf4, et c-Myc, a été obtenu auprès du Dr. Shinya Yamanaka (Institut des Sciences médicales de l'Université de Kyoto, Kyoto, Japon).
  4. Changer les médias le jour 3 avec un milieu frais et observer les colonies iPSC sous le microscope.
    NOTE: Ces colonies sont petites grappes brillantes ou des cellules rondes avec une démarcation claire montrant l'expression de la GFP sous un microscope à fluorescence.

2. In Vitro Différenciation des iPSC-Tregs Ag-spécifiques

  1. Générer les produits d' assemblage à utiliser dans transduction rétrovirale par sous-clonage des gènes OT-II et de TCR FoxP3 dans le plasmide Midr 10 lié à l' auto-clivage de peptide 2A pour rendre la construction Midr-TCRa-2A-2A TCRβ-FoxP3.
  2. Effectuer transduction rétrovirale 9 de CSPi en utilisant des cellules Plat E que la lignée cellulaire d'emballage.
  3. Le jour 0, les graines OP9-DL1-DL4-IA cellules B Adensité minimale ta 10 4 cellules / cm 2 en utilisant le support OP-9 média (α-MEM contenant 20% de FCS et 2,2 g / L de bicarbonate de sodium. La plaque 1 x 10 6 cellules par boîte de 10 cm.
  4. Le jour 3, lorsque les cellules b OP9-DL1-DL4-IA deviennent 80-90% confluentes, retirez le support et de semences 0,5 - 1 x 10 5 CSPi sur OP9-DL1-DL4 - cellules IA b dans OP-9 médias.
    NOTE: Ceci établit la co-culture de cellules CSPi sur b OP9-DL1-DL4-IA et est considéré comme le jour 0 de la différenciation 9.
  5. Le jour 5, retirez le support de la boîte de 10 cm par aspiration, laver les cellules avec 10 ml de PBS 1x et aspirer le PBS. Ajouter 4 ml de trypsine à 0,25% et on incube à 37 ° C pendant 10 min. Ajouter un autre 8 ml de iPSC médias pour les cellules, remettre en suspension, et centrifuger à 400 g pendant 5 min à température ambiante.
    1. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 10 ml de COPSi support. Incuber ces cellules remises en suspension sur une nouvelle boîte de 10 cmet revenir à l'incubateur pendant 30 minutes.
      REMARQUE: Retirez les cellules b nourricières OP9-DL1-DL4-IA et de garder les CSPi différenciateurs flottant dans les médias. Maintenir OP9-DL1-DL4-IA des cellules B en continu pour atteindre 80 - 90% de confluence pour plus de co-culture.
    2. Au bout de 30 min, recueillir les cellules flottantes, les filtrer à travers un tamis cellulaire de 70 pm, et compter les cellules avec un hémocytomètre.
  6. Seed 5 x 10 5 de CSPi à un nouveau 80 - 90% confluentes de cellules b OP9-DL1-DL4-IA dans les médias de OP9. Supplément aux médias mFlt-3L à une concentration finale de 5 ng / ml.
  7. Le jour 8, recueillir des CSPi partiellement différenciés par lavage de la plaque avec les médias de l'antenne elle-même en utilisant une pipette de 10 ml. Utilisez encore 5 ml d'OP-9 médias dans le plat pour laver délicatement les cellules semi-adhérentes par attention, pipetage force afin de ne pas briser la monocouche OP9 au fond du plat. Répétez le lavage avec 10 ml de PBS pour récolter tous les semi-annoncedifférenciation herent cellules.
    1. Combiner les deux lavages, centrifuger à 400 g pendant 5 min à température ambiante, de remettre en suspension dans 10 ml de milieu de OP9 contenant mFlt-3L (5 ng / ml) et mlL-7 (1 ng / ml) et filtrer à travers un 70 um tamis cellulaire.
  8. Transférer les cellules dans une plaque de culture à 6 puits contenant 80 - 90% confluentes OP9-DL1-DL4-IA b cellules, comme dans l' étape 1.1. Transfert des cellules récoltées à partir d'un plat de 10 cm dans un puits de la plaque de 6 puits.
  9. Au jour 10, le changement de la moitié du milieu par les cellules dans les milieux OP9 frais supplémenté avec mFlt-3L (5 ng / ml) et mlL-7 (1 ng / ml). Répétez cette étape tous les deux jours.
  10. Tous les 4-6 jours, en fonction de la croissance, réensemencer les CSPi de différenciation sur des plaques avec une nouvelle couche de cellules b OP9-DL1-DL4-IA, comme décrit dans l' étape 1.1.

3. Évaluation de In Vitro Treg Différenciation et Maturation

  1. Les modifications morphologiques des CSPi différenciateurs.
    1. Monitor la co-culture de cellules CSPi avec b OP9-DL1-DL4-IA quotidienne en observant les cellules vivantes sous un microscope à fond clair classique (20X). Le jour 5, observer les colonies avec des caractéristiques de mésoderme similaires, telles que les cellules aplaties. Le jour 8, observer de petites grappes rondes de cellules, qui représentent des cellules de différenciation.
    2. Utiliser la méthode d'exclusion au bleu Trypan pour compter les cellules pour détecter le nombre et le pourcentage de cellules vivantes. Calculer la viabilité cellulaire comme le nombre de cellules viables, divisé par le nombre total de cellules dans les quatre grilles sur l'hémocytomètre. Si les cellules prennent bleu trypan, pensez à les morts ou non viables. Notez le nombre de cellules vivantes récoltées à partir de la culture.
  2. Cytométrie de flux analyse de différenciation CSPi.
    1. Les jours 5, 7, 11, 15, 19, 21, et 28 de co-culture, éliminer les cellules avec 0,25% de trypsine comme à l'étape 25.
    2. Avant la coloration de la surface avec différents anticorps conjugués au fluorochrome, Incubate 1 x 10 6 cellules avec 100 ul de Fc 2.4G2 bloquant dilué dans du PBS (concentration finale de 10 pg / ml) à 4 ° C pendant 20 minutes pour empêcher la liaison de l' anticorps au récepteur Fc sur la surface cellulaire.
    3. Aux jours 5, 7, 11, 15, 19, 21 et 28, en utilisant 1 x 10 6 cellules par cytométrie en flux avec différents anticorps conjugués au fluorochrome pour détecter les marqueurs de la surface cellulaire, y compris CD3, TCRβ, CD4, CD8, CD25, et CTLA4.
    4. Après bloc Fc, laver les cellules avec 10 ml de PBS et tache avec différents anticorps conjugués au fluorochrome pendant 20 min à 4 ° C, puis effectuer l'analyse de cytométrie de flux avec la couleur 15 cytomètre de flux. Utiliser 0,200 ug d'anticorps par 10 6 cellules diluées dans 100 ul de PBS.
    5. Au jour 28, analyser les cellules par cytométrie en flux 11 et grille sur CD4 + CD8 + en utilisant CD4 et CD8 conjugué à un fluorochrome coloration; analyser l'expression de TCRVα2, TCRVβ5, CD25, CTLA-4 Et FoxP3 (figure 1). Pour FoxP3 coloration, fixer les cellules et les permealize puis effectuer la coloration des anticorps 11.
  3. Dans la stimulation antigénique in vitro de CSPi.
    1. Le jour 28 de co-culture, la récolte iPSC-Tregs à partir de cultures en recueillant les cellules flottantes. Trypsiniser le reste des cellules avec 0,25% de trypsine (comme à l'étape 2.5) et remettre en suspension les cellules dans 8 ml de milieux COPSi. Centrifugeuse pendant 5 min à 400 xg à la température ambiante, aspirer les médias, et encore re-suspendre les cellules dans 10 ml de milieu.
      1. Incuber les cellules remises en suspension dans une nouvelle boîte de 10 cm à 37 ° C pendant 30 min et recueillir les cellules flottantes. Laver les cellules avec du PBS froid.
    2. Incuber 3 x 10 6 splénocytes à partir de rates de souris C57BL / 6 Rag1 - / - souris avec 5 pM de peptide d' ovalbumine dans 200 pl de milieu (OVA 323-339) à 4 ° C pendant 30 minutes dans une plaque à 96 puits 11.
    3. Mélanger Tregs avec OVA 323-339 splénocytes dans un rapport 1: 4 (utilisation 0,75 x 10 6 Treg). Incuber à 37 ° C dans un incubateur à CO2 pendant 40 heures. Dans les dernières 4 heures, ajouter 4 pi de dilution Brefeldin A dans la culture (1,000x de concentration réelle, diluée dans un milieu de culture 1x).
    4. Les cellules de récolte avec 0,25% de trypsine (comme à l' étape 2.5), laver avec 10% de NaN3 et d'une solution 0,5 M d'EDTA (tampon FACS), le bloc avec 100 ul de dilution (concentration finale de 10 pg / ml) Fc bloqueur 2.4G2 et tache pour les marqueurs de surface, CD4, CD8, TCRVα2 et TCRVβ5 comme dans les étapes 3.2.3-3.2.4.
    5. Fixer les cellules avec une solution de paraformaldehyde à 4% dans du PBS et on perméabilise avec 100 ul de tampon de perméabilisation 1x après coloration de la surface cellulaire. Attention! Paraformaldéhyde est allergénique, cancérigène et toxique.
    6. Colorer les cellules avec un fluorochrome conjugué TGF-β et l'IL-10 pendant 20 min dans l'obscurité. Utiliser 0,200 ug d'anticorps / 10 6 cellules diluted dans 100 ul de PBS. Détecter la production intracellulaire du TGF-β et l' IL-10 avec la couleur 15 cytomètre en flux (Figure 2).
    7. Laver les cellules trois fois avec du tampon FACS à froid avant l'analyse cytométrique d'écoulement 11.
  4. Dans la persistance in vivo de Ag spécifique iPSC-Tregs.
    1. Après 8 jours de co-culture sur cellules b OP9-DL1-DL4-IA, transfert iPSC dérivé pré-Tregs (Thy1.2) comme dans l' étape (ancienne 4-6 semaines) 3.3.1 dans Tes 1.1 souris congéniques via un injection dans la veine de la queue sans anesthésie. Avant d'effectuer l'injection dans la veine de la queue, dilater la veine caudale en utilisant une lampe infrarouge pendant 5 min. Après veine de la queue de dilatation, placer la souris dans un restrainer et adoptivement transfert 3 x 10 6 cellules remises en suspension dans 200 pi de PBS en injectant à travers la veine de la queue.
    2. Six semaines après le transfert Treg, euthanasier les souris par asphyxie au CO2 suivie par dislocation cervicale. Assurez-vous que le miCE ne sont pas respirer. Ouvrez la cavité péritonéale en coupant la peau extérieure du péritoine avec des ciseaux et des pinces et en tirant doucement en arrière pour exposer la peau intérieure tapisse la cavité péritonéale. Isoler la rate et les ganglions lymphatiques périphériques de Thy 1.1 souris congéniques injectées.
    3. Recueillir les cellules de la rate et des ganglions lymphatiques à l'aide de la rupture mécanique pour obtenir une suspension cellulaire unique. Incuber les cellules avec 5 ml de tampon de lyse ACK pendant 5 min à température ambiante pour lyser les globules rouges. Collecter et laver splénocytes ou lymphocytes restants avec 10 ml de tampon FACS froid.
    4. Après le lavage, le traitement des cellules avec le bloqueur Fc 2.4G2 à 4 ° C pendant 20 minutes comme dans l'étape 3.2.2 et aux taches avec 100 ul de dilué anti-Thy 1.2 des anticorps conjugués au fluorochrome.
    5. Laver les cellules avec 10 ml de tampon FACS et procéder à l' écoulement analyse cytométrique 11.

4. In Vivo Maturation et la répression de l' arthrite auto - immune

  • Générer les constructions comme dans l'étape 2.1.
  • Effectuer transduction rétrovirale 9 comme dans l' étape 2.2.
  • La différenciation in vivo l' induction et l' arthrite chez les souris.
    1. Différencier OT-II TCR / FoxP3 transduites CSPi (OT-II-FoxP3 / CISP), CSPi de FoxP3 transduites et DsRed CSPi transduites sur les cellules b stromales OP9-DL1-DL4-IA en présence de cytokines mFlt-3L et mIL-7 pendant 8 jours, comme décrit dans les étapes 2.1 - 2.6.
    2. Trypisinize les trois types de cellules provenant de la plaque de 10 cm et remettre en suspension les cellules de chaque plaque de 10 cm dans 10 ml de milieu frais. Ajouter les cellules à 10 cm plaque fraîche et revenir à l'incubateur pendant 30 min. Après 30 min, recueillir les cellules flottantes.
    3. Passez les cellules à travers un tamis cellulaire de 70 um pour éliminer les amas de cellules et compter en utilisant un hémocytomètre. Ajuster les cellules à une concentration de 1,5 x 10 7 cellules / ml dans du PBS froid et filtrer à nouveau si nécessaire. Gardez les cellules sur la glace jusqu'à ce que le transfert des cellules dans des souris adoptive. Injecter 200 ul de la suspension cellulaire (3 x 10 6 cellules) en trois groupes de quatre à six semaines d'âge C57BL / 6 femelles de souris par la veine de la queue comme décrit dans 3.4.1
    4. Au jour 10 après le transfert des cellules, l'injection des souris avec 100 ug de MBSA émulsionnée dans un adjuvant complet de Freund à la base de la queue en utilisant une seringue de 1 ml.
    5. Le jour 17, anesthésier la souris en utilisant un vaporisateur isoflurane (selon les directives du IACUC). Utiliser 4-5% d'isoflurane pour l'induction et 1 - 2% pour l'entretien. Induire l'arthrite par injection intra-articulaire de 20 ug mBSA dans 10 ul de PBS dans le genou gauche articulaire et de 20 ug mBSA et 100 pg d'OVA dans son ensemble 10 ul de PBS dans l'articulation du genou droit. Aliments et un Gelpack peuvent être placés sur le plancher de la litière après l'arthrite a mis au point. Les souris seront euthanasiés: Body Condition Score (BCS) de 2/5 ou moribonds, la cachexie sévère et / ou persistante décubitus (une période de 24 heures), et la gravité de partition 4. Le score4, un érythème et un gonflement sévère englobent la cheville, le pied et les chiffres, ou ankyloses du membre.
  • Caractérisation des CSPi OT-II TCR / FoxP3-transduction.
    1. Utilisez un microscope à fluorescence (20X) pour visualiser les cellules vivantes non fixées DsRed + GFP +.
    2. Examiner l' intégration et l' expression génique à la fois par Western blot et cytométrie de flux 11.
  • le développement et la maturation Treg.
    1. Aux semaines 2, 4 et 6 après le transfert cellulaire, l'euthanasie des souris. Pour l' euthanasie, dans chaque cage utiliser 1 - 2 L de CO 2 dans la première phase. Une fois que l'animal a perdu conscience, augmenter le taux de CO 2 de débit à 4 - 5 L / min. Euthanasier souris par inhalation de CO 2. Isoler la rate et drainer les ganglions lymphatiques en coupant la peau extérieure du péritoine avec des ciseaux et des pinces et en tirant doucement en arrière pour exposer la peau intérieure tapisse la cavité péritonéale.
    2. Recueillir la suspension cellulaire unique from la rate et les ganglions lymphatiques par ventilation mécanique à l'aide d'un filtre cellulaire et une seringue de 1 ml dans 1% des médias iPSC. Centrifuger le tube conique contenant le support à 400 g pendant 5 min. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 5 ml de tampon de lyse ACK pour lyser les globules rouges. Re-centrifugeuse à 1000 rpm pendant 5 min. Re-suspendre le culot cellulaire et laver les splénocytes ou lymphocytes restants avec un tampon FACS froid. Suivez les étapes 3.4.4 - 3.4.5 et procéder à l'écoulement analyse cytométrique.
  • coloration intracellulaire.
    1. Le jour 50 post-défi, isoler la rate et drainer les ganglions lymphatiques de la souris (comme à l' étape 4.5.1) après l' euthanasie par inhalation de CO 2 suivie par dislocation cervicale.
    2. Recueillir la suspension cellulaire unique à partir de la rate et des ganglions lymphatiques par ventilation mécanique à l'aide d'un filtre cellulaire et une seringue de 1 ml. Incuber les splénocytes à la température ambiante pendant 5 min avec 5 ml de tampon de lyse ACK pour lyser les globules rouges. Collecter et laver les s restantsplenocytes ou lymphocytes avec un tampon FACS à froid. Suivez les étapes 3.2.3 - 3.2.4, mais la tache avec des marqueurs de surface CD4, CD8, CD25 et TCRVβ5.
    3. Passez à fixer les cellules pour la coloration intracellulaire comme décrit dans 3.3.5 - 3.3.7 et analyser la production intracellulaire de cytokines (TGF-β et l' IL-10) de Tregs iPSC dérivées et porte sur des cellules vivantes CD4 + CD25 +.
  • Infiltration de Tregs Ag-spécifiques dans les genoux et la suppression de l'arthrite.
    1. Après les étapes (4.3 - 4.3.6) aux jours 7-14 post-arthrite induction, euthanasier les souris par inhalation de CO 2 suivie par dislocation cervicale (selon les directives du IACUC). Enlever les poils à partir des genoux avec une tondeuse électrique et exciser les genoux par intervention chirurgicale.
    2. Retirer la peau des jambes en faisant une incision dans la patte arrière avec des ciseaux émoussée-end et couper la peau à travers la cuisse et en bas à la cheville. Peler délicatement la peau sur la jambe et du pied pour exposer le muscle. Retirerle muscle de la jambe soigneusement sans endommager l'articulation du genou.
      1. Couper la patte arrière juste au-dessus de l'articulation pelvienne / hanche et couper le tibia en utilisant des ciseaux de dissection pointus.
    3. Fixer les genoux à 4% de formol pendant 48 heures. Détartrer les genoux à l'aide d'acide formique 2,5 M; rincer trois fois dans le xylène pendant 3 minutes, rincer deux fois dans 100% d'éthanol, rincer deux fois dans 95% d'éthanol, rincer deux fois dans de l'eau déminéralisée pendant 2 min, et détartrer en 1 mM EDTA. Traiter à une température sous-ébullition (90 ° C) pendant 20 min.
    4. Refroidir le tissu fixé pendant 30 minutes. Rincer avec 1x PBS pendant 4 minutes et l'intégrer dans de la paraffine. Déshydrater les tissus par une série de bains d'éthanol pour déplacer l'eau, puis on les infiltrer avec de la cire. Puis incorporer les tissus infiltrés dans des blocs de cire. Effectuer deux tronçonnage vertical et horizontal pour la coloration. Préparer 4 um sections avec un microtome coulissant.
    5. Effectuer immunofluorescence sur les sections après les procédures standard de deparaffinisation et la réhydratation en utilisant du xylène et de l' éthanol 12.
    6. Bloquer l'activité de peroxydase endogène en plongeant la lame dans une quantité suffisante de solution de peroxyde d'hydrogène à 3% pendant 3 min après la récupération de Ag. des lames de bloc pour la liaison non spécifique dans 3% de BSA dans du PBS à température ambiante dans une chambre humidifiée pendant 60 minutes.
    7. des sections de tache avec 200 pi d'anticorps conjugué à un fluorochrome TCRVβ5 dilué 1: 100 dans la solution de blocage. Incuber pendant 2 heures à la température ambiante dans un 75 - chambre humidifiée à 100%, et laver 5 fois 1x PBS pendant 5 min.
    8. Counterstain les diapositives de coloration nucléaire avec un réactif antifade contenant DAPI. Ajouter environ 300 ul de la solution de coloration DAPI dilué (300 nM dans du PBS 1X) à la lamelle couvre-objet, assurant que toute la lamelle couvre-objet est couvert. Stocker les diapositives dans l'obscurité à 4 ° C jusqu'à l' analyse au microscope à fluorescence (Figure 3).
  • test de suppression de l'arthrite
    1. Mesurer le gonflement des deux genoux de la souris avant l'arthrite induction en utilisant un pied à coulisse cadran calibre pour établir une base de référence.
    2. Suivez les étapes (4.3 - 4.3.6) pour l'arthrite induction et le transfert Treg. Mesurer les genoux de la souris avec un cadran de calibre transfert étrier post-Treg.
    3. Calculer l'augmentation du diamètre pour cent du genou: Augmentation en pourcentage = (diamètre du genou au jour 1 - Diamètre du genou au jour 0) / diamètre du genou au jour 0.
  • La mesure de la destruction des articulations et de l' infiltration de cellules inflammatoires au niveau des genoux par histologie (figure 4).
    1. Le jour 7 post-arthrite induction, euthanasier les souris comme décrit précédemment et exciser les genoux par intervention chirurgicale. Voir l'étape 4.7.1 - 4.7.2.
    2. Fixer les genoux dans 4% de formaline, détartrer dans de l'EDTA, et d'intégrer dans de la paraffine. Voir l'étape 4.7.3
    3. Retirer les deux genoux, fixer dans 10% de formaline, et se calcifier dans Formical-4. Incluez les tissus en paraffine, section à 4 pm, et tache avec hematoxylet éosine (H & E) ou safranine O coloration (comme dans l'étape 4.7.7) et d'observer au microscope.
    4. Utilisez coloration H & E pour évaluer l'érosion des os avec un système de notation semi-quantitative (0: aucun érosions; 4: érosions étendues et la destruction de l'os). Utilisez safranine O coloration pour évaluer la perte de protéoglycanes et le score avec un système semi-quantitative notation (0: pas de perte de protéoglycanes; 3: perte totale de coloration pour les protéoglycanes).
      1. Utilisez un système de notation semi-quantitative pour marquer l'infiltration de cellules inflammatoires sur des lames H & E tachés (0: aucune infiltration cellulaire; 4: abondaient infiltration de cellules). Évaluer les scores en examinant les deux genoux en aveugle.
  • 5. Mesure de la perte osseuse dans les Knees avec le système de tomographie à haute résolution Micro-ordinateur (micro-CT)

    1. Le jour 10 post-arthrite induction, anesthésier les souris avec 2% d'isoflurane et de se préparer pour l'imagerie.
    2. Position microe avec les genoux tournés vers le haut dans la chambre.
    3. Utiliser un système de micro-CT à haute résolution pour acquérir l'imagerie in vivo de l'architecture de l' os autour des genoux des souris.
    4. Effectuer des micro-tomodensitométrie avec une longueur de 2,2 mm, y compris les articulations du genou de la souris avec les paramètres suivants: 10,5 taille um voxel à 55 kv, 145 uA 200 de temps d'intégration msec, 211 images.
    5. Importer des images micro-CT et images capture frontale d'avion après un traitement ultérieur de l' image ( le rendu de volume et de transformation) (Figure 5).

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    Representative Results

    Comme le montre ici, le jour 28, Tregs Ag spécifique exprimé sensiblement CD3 et Ag-TCR spécifique, deux marqueurs de cellules T. La population CD3 + TCRVβ5 + exprimé CD4. La plupart des cellules CD4 + TCRVβ5 + CD3 + ont également exprimé CD25, CD127, et CTLA-4, qui sont généralement exprimés à des niveaux élevés dans regs (T) de nTregs d' origine naturelle et dans les cellules T exprimant de manière ectopique FoxP3. L' expression de Foxp3 dans des cellules dérivées COPSi a persisté même après une longue stimulation in vitro avec le ligand Notch, comme détecté par coloration intracellulaire analysées par cytométrie de flux (figure 1). En outre, l'Ag-spécifique COPSi-Treg produit des cytokines suppressives, tels que le TGF-β et l' IL-10, lorsqu'elles sont stimulées in vitro avec des splénocytes Ag pulsé (figure 2), ce qui indique la COPSi-Treg avait des activités suppressives potentiels. La microscopie à fluorescence a révélé qu'un plus grand nombre FoxP3 + cellules étaient présentes dans la OVA traitées que les genoux du PBS-traitées; il n'y avait pas FoxP3 + cellules existantes dans les genoux chez les souris recevant les CSPi vecteur transduites DsRed +. Beaucoup d' autres cellules CD4 + FoxP3 + + TCRVβ5 cellules présentées dans les genoux de souris recevant iPSCs transduits avec le TCR-Midr FoxP3 que le Midr-FoxP3 (figure 3). Ces observations suggèrent que iPSC Treg Ag-spécifiques migrent vers le genou AIA après le transfert adoptif dans des souris receveuses. Les cellules iPSC dérivées transférées sensiblement diminué du genou inflammatoire gonflement quand OVA était présent, mais n'a eu aucun effet sur le genou de contrôle qui a été seulement injecté avec mBSA dans le modèle murin (figure 4); réduction de la perte osseuse au niveau du genou de transfert de cellule visualisée par le système de micro-CT à haute résolution (figure 5).

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    Figure 1:. Différenciation de Ag spécifique iPSC-Tregs murin CSPi ont été transduites avec une construction: MIDR-TCRa-2A-TCRβ-2A-FoxP3 contenant des gènes de TCR spécifiques de l' OVA et FoxP3. Les cellules génétiquement transduite (DsRed +) ont été co-cultivées sur OP9-DL1-DL4-IA des cellules B en présence de mFlt3L et mlL-7 (A) . Morphology of T regs la différenciation des cellules au jour 0, 7, 14 et 22. (B) débit d' analyse cytométrique pour l'expression de protéines de cellules iPSC dérivées au jour 28. CD3 + TCRVβ5 + cellules ont été bloquées comme indiqué (R1) et analysés pour l'expression de CD4 et CD8, avec CD25, CD127, CTLA 4 et FoxP3 montré pour les cellules gated comme CD4 + CD8 - cellules (R2). (lignes sombres, les zones ombragées indiquent les contrôles isotypiques) S'il vous plaît cliquer ici pour voir un largversion er de ce chiffre.

    Figure 2
    Figure 2: analyses fonctionnelles de I n Tregs Vitro Differentiated Ag spécifique murins iPSC-Tregs ont été stimulées par les splénocytes. (TTB; T regs / TTB = 1: 4) et pulsées avec peptide OVA 323-339. La production de cytokines intracellulaires (TGF-β et l' IL-10) ont été analysées par cytométrie en flux après fenêtrage direct CD4 + CD25 +. (Lignes sombres, les zones ombragées indiquent les contrôles isotypiques) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

    Figure 3
    Figure 3:iPSC-Tregs Infiltration dans les articulations du genou spécifiques g. iPSC-Tregs Ag-spécifiques ont été transférés dans adoptivement C57BL / 6. Peu de temps après l'arthrite induction (jours 7 - 14), les genoux ont été enlevés et colorées pour immunohistologiques (barres d'échelle: 20 um). Les souris recevant OVA-spécifiques iPSC-Tregs ont un grand nombre de TCRVβ5 + cellules dans les genoux. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

    Figure 4
    Figure 4: Transfert adoptif de Ag spécifique iPSC-Tregs améliore AIA chez la souris CSPi murins ont été transduites avec la construction rétrovirale MIDR, MIDR-FoxP3 ou MIDR-TCR-FoxP3 et ont été co-cultivées sur le OP9-DL1 / DL4 /. IA cellules b. Au jour 7, les cellules à gène transduit (3 × 10 6 / souris) ont undoptively transféré dans C57BL / 6 femelles de souris qui ont été induites avec de l'AIA deux semaines après le transfert cellulaire. Le jour suivant l' induction d' arthrite, de la gravité de l' arthrite a été surveillée par la mesure du diamètre du genou. (AC) Pourcentage d'augmentation du diamètre du genou. Augmentation du diamètre du genou a été calculé en fonction du diamètre du genou de préinjection pour chaque souris avant injection au jour 0. Le score de l'arthrite a été évaluée en examinant les deux genoux d'une manière aveugle; chaque genou a été attribué un score (0: pas de gonflement visible ou une décoloration; 1: visible gonflement avec ou sans décoloration; 2: modérée gonflement avec la décoloration; 3: gonflement sévère avec la décoloration). Dans chaque groupe, cinq souris ont été utilisées, et les données sont représentatives de trois expériences indépendantes. Les données sont représentés comme la moyenne ± écart - type. (D) La moyenne marquant le jour 7 pour les deux genoux de cinq souris. Les données sont représentées par la moyenne ± écart - type de trois expériences indépendantes (** p <0,01, *** p <0,001, ANOVA à deux voies). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

    Figure 5
    Figure 5:. Ag spécifique iPSC-Tregs Migrate à l'OVA Injecté genou et de réduire la perte osseuse iPSC-Tregs ont été adoptivement transféré dans C57BL / 6. Dans les 21 jours post-arthrite induction, les souris ont été anesthésiés et l'architecture de l'os autour des genoux de la souris a été imagées par le système de micro-CT. Les souris recevant OT-II TCR / FoxP3 gène transduites murin iPSC-Tregs présentent une réduction significative de la perte osseuse par rapport aux souris témoins recevant CSPi vecteur transduites. (A) Les analyses ont été réalisées avec une longueur de 2,2 mm, et les images ont été capturées après traitement ultérieur de l'image (le rendu de volume et de transformation;barres d'échelle:. 1 mm) (B) le volume osseux autour de l' articulation du genou a été évaluée en utilisant la reconstruction tridimensionnelle des images micro-CT, et le volume d'os à l' intérieur du volume d'intérêt a été calculé (barres d'échelle:. 1 mm) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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    Discussion

    Dans ce protocole, une étape critique est la différenciation in vitro de TCR / FoxP3 CSPi géniques-transduction. In vitro signalisation Notch induit le développement vers la lignée cellulaire T. Pour différencier CSPi en CD4 + Foxp3 + Tregs, nous avons utilisé les cellules b OP9-DL1 / DL4 / IA, qui expriment des molécules hautement CMH II (IA) b. La plupart des CSPi se différencient en cellules CD4 +. Cependant, après l'expression du TCR de surface, de nombreuses cellules pré-T différenciées perdent la capacité à se différencier et finissent par mourir. En conséquence, le nombre de cellules Treg des fonctions dérivées COPSi réduit considérablement après quatre semaines de différenciation in vitro. Pour éviter cela, l'addition de IL-2 peut améliorer la survie des cellules à ces points de temps. Une autre méthode consiste à conduire la maturation et la survie des pré-lymphocytes T régulateurs spécifiques d' Ag est de transférer les pré-Treg qui se sont différenciés in vitro pendant une semaine à des souris. Ces pré-Tregs peut continue différenciation et la maturation in vivo pour trois semaines. En utilisant cette méthode, une population Treg Ag-fonctionnel spécifique peut être généré à partir iPSCs, qui sont nTregs-like et qui ont la capacité de supprimer l'arthrite auto-immune dans le modèle murin.

    Pour améliorer l'efficacité du développement in vivo de Ag spécifique iPSC-Tregs, composés différents (par exemple, l' acide rétinoïque, gelectin) 13,14 ou suppressives cytokines (par exemple, le TGF-β, IL-10) peuvent être utilisés après le transfert adoptif de la pré-Treg. En plus d'augmenter la survie des cellules, cette approche combinée peut maintenir l' expression de FoxP3 14,15 et améliorer la qualité de l'Ag spécifique iPSC-Tregs.

    Un problème potentiel qui pourrait survenir pour le développement in vivo Treg est immunosuppression globale, ce qui entraîne des complications pendant les infections ou la perte de poids subséquente. Un grand nombre de Ag spécifique Tregs en développement vivo peut aggraver les infections. Dans ce cas, un gène suicide, la caspase inductible 9 (ICasp9) 15,16, peut être incorporé dans le vecteur TCR / FoxP3. Cette approche permet l'élimination des Tregs cellules souches dérivées par l'injection d'une petite molécule bioinerte dimérisation Agent (AP1903) pour "couper" la génération de Tregs cellules souches dérivées, ce qui permettra de surmonter ce problème potentiel.

    Une auto-Ag est une protéine typique reconnu par le système immunitaire des hôtes souffrant d'une maladie auto-immune individuelle. Cette auto-Ag est la cible du système immunitaire et les cellules T corrélées ne sont pas supprimées. Pour générer l'auto-Ag Tregs spécifiques, l'utilisation de TCR transduction est un bon choix. Une auto-Ag (par exemple, la protéine de choc thermique) TCR spécifique peut être transduit dans CD4 + CD25 + matures Tregs de cellules mononucléaires du sang (CMSP), et cette approche a été utilisée dans les essais cliniques. En variante, comme described dans ce protocole, en utilisant la transduction du gène de l'auto-Ag TCR spécifique avec FoxP3 et la stimulation avec la signalisation Notch, souches dérivées de cellules Tregs-peut être auto-Ag spécifique Tregs.

    Thérapies à base de cellules pour les maladies auto - immunes en utilisant Tregs ingénierie peuvent être utiles 17. Bien que TCR transduction dans les cellules T a prouvé pour être sûr, réalisable et applicable dans les essais cliniques, il existe encore des problèmes de sécurité en raison de l'auto - immunité provoquée par la réactivité croisée avec les tissus sains 18. En outre, en utilisant les méthodes actuelles, Tregs génétiquement modifiés ont généralement une persistance à court terme in vivo 19. Alternativement, une source prometteuse pour développer un grand nombre de monoclonaux Ag-spécifiques Tregs est des cellules souches. Les cellules souches embryonnaires (CSE) ont la meilleure pluripotence et l'auto-renouvellement, mais il est impossible de les obtenir auprès de patients. Bien que facilement isolé à partir du sang périphérique, des cellules souches hématopoïétiques (CSH) sont multi-Les cellules souches puissants et peuvent être développées dans une culture cellulaire de manière similaire à 20 CES. la technologie iPSC actuelle a progressé à une génération plus efficace de PSC à partir de cellules somatiques de patients par transduction de différents facteurs de transcription. Un certain nombre d'améliorations méthodologiques ont été développés ces dernières années pour générer des CSPi en réduisant au maximum les risques potentiels tels que l'immunogénicité et la tumorigénicité. Par rapport à CES, CSPi ont pluripotence identiques et auto-renouvellement. En conséquence, la technologie iPSC peut fournir un avantage dans le développement PSCs patient et / ou spécifiques à une maladie. L'utilisation de CSPi pour développer Ag spécifique Tregs peut avancer le domaine des thérapies à base de cellules pour les maladies auto - immunes 10,11.

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    Acknowledgments

    Ce projet a été financé, en partie, au titre des subventions des Instituts nationaux de la santé (R01AI121180, R21AI109239 et K18CA151798), l'American Diabetes Association (1-16-IBS-281), et le ministère de la Santé en Pennsylvanie (Fonds de règlement du tabac) à JS

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    C57BL/6j mice Jackson Laboratory 664
    B6.129S7 Rag1tm1Mom/J Jackson Laboratory 2216
    Anti-CD3 (2C11) antibody BD Pharmingen 553058
    Anti-CD28 (37.51) antibody BD Pharmingen 553295
    Anti-CD4 (GK1.5) antibody Biolegend 100417
    Anti-CD8 (53–6.7) antibody Biolegend 100714
    Anti-CD25 (3C7) antibody Biolegend 101912
    Anti-TCR-β (H57597) antibody Biolegend 109220
    Anti-IL10 Biolegend 505010
    Anti-TGFβ Biolegend 141402
    DMEM Invitrogen ABCD1234
    α-MEM Invitrogen A10490-01
    FBS Hyclone SH3007.01
    Brefeldin A Sigma B7651
    Polybrene Sigma 107689
    Genejammer Integrated science 204130
    ACK Lysis buffer Lonza 10-548E
    mFlt-3L peprotech 250-31L
    mIL-7 peprotech 217-17
    Gelatin Sigma G9391
    Paraformaldehyde Sigma P6148-500G Caution: Allergenic, Carcenogenic, Toxic
    Permeabilization buffer Biolegend 421002
    mBSA Sigma A7906
    Ova albumin Avantor 0440-01
    CFA Difco 2017014
    Tailveiner restrainer Braintree scientific RTV 150-STD

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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