Lo sviluppo di cellule staminali derivate antigene-specifiche cellule T regolatorie contro autoimmunità

Immunology and Infection

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Haque, M., Fino, K., Sandhu, P., Song, J. Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity. J. Vis. Exp. (117), e54720, doi:10.3791/54720 (2016).

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Abstract

Malattie autoimmuni insorgono a causa della perdita di immunologica auto-tolleranza. cellule T regolatorie (Tregs) sono importanti mediatori di immunologica auto-tolleranza. Tregs rappresentano circa il 5 - 10% del maturo sottopopolazione di cellule T CD4 + in topi e nell'uomo, con circa 1 - 2% di tali Tregs circolanti nel sangue periferico. Le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) possono essere differenziati in Tregs funzionale, che hanno un potenziale da utilizzare per le terapie a base di cellule di malattie autoimmuni. Qui, vi presentiamo un metodo per sviluppare antigene (Ag) Treg specifico d'da iPSCs (vale a dire, IPSC-Tregs). Il metodo si basa sulla incorpora il fattore di trascrizione FoxP3 e un recettore delle cellule T Ag-specifica (TCR) in iPSCs e differenziazione di cellule stromali OP9 esprimenti Notch ligandi delta-simili (DL) 1 e DL4. A seguito di differenziazione in vitro, l'IPSC-Treg esprimono CD4, CD8, CD3, CD25, FoxP3, e Ag-specifici TCR e sono in grado di rispondere alla stimolazione Ag.Questo metodo è stato applicato con successo a terapia cellulare di artrite autoimmune in un modello murino. trasferimento adottivo di questi Ag-specifici iPSC-Tregs in artrite Ag-indotta (AIA) topi -bearing ha la capacità di ridurre l'infiammazione articolare e gonfiore e per prevenire la perdita ossea.

Protocol

Tutti gli esperimenti sugli animali sono approvati dalla Pennsylvania State University College of Comitato Animal Care Medicine (IACUC protocollo # 45470) e sono condotte in conformità con le linee guida dell'Associazione per la valutazione e l'accreditamento del laboratorio Animal Care.

1. Stem Cell Culture

  1. Incubare un piatto 10 centimetri con 10 ml di 0,1% di gelatina per almeno 30 min a 37 ° C (incubatore) al fine di rivestire la piastra.
  2. Rimuovere la gelatina dal piatto e la piastra 3 x 10 6 irradiato SNL76 / 7 cellule e incubare per un giorno a 37 ° C (incubatore) utilizzando 10% DMEM supporti (10% FBS e 1% di penicillina streptomicina).
  3. Rimuovere il supporto dalla piastra e cultura scongelato iPSCs il / 7 strato di alimentatore di cellule SNL76 usando iPSC supporti (supporto DMEM contenente il 15% di siero fetale bovino, 0,1 mmol / L aminoacidi non essenziali, 1 mmol / L di L-glutammina, e 0,1 mmol / L β-mercaptoetanolo) 9. Il li cellule di topo iPS-MEF-Ng-20D-17ne, che è stato indotto da fibroblasti embrionali di topo di retrò trasfezione virale di Oct3 / 4, Sox2, Klf4, e c-Myc, è stato ottenuto dal Dr. Shinya Yamanaka (Institute for Frontier Medical Sciences, Università di Kyoto, Kyoto, Giappone).
  4. Modificare i media il giorno 3 con mezzi freschi e osservare colonie IPSC al microscopio.
    NOTA: Queste colonie sono piccoli, cluster lucide o cellule rotonde con una demarcazione chiara che mostra l'espressione della GFP sotto un microscopio a fluorescenza.

2. La differenziazione in vitro di Ag-specifici IPSC-Tregs

  1. Generare i costrutti da utilizzare nella trasduzione retrovirale da sub-clonazione dei geni OT-II TCR e FoxP3 nel plasmide MIDR 10 collegato con l'auto-scissione peptide 2A per fare il costrutto MIDR-TCRα-2A-TCRβ-2A-FoxP3.
  2. Eseguire trasduzione retrovirale 9 di iPSCs utilizzando cellule Plat E come la linea cellulare di confezionamento.
  3. Al giorno 0, seme OP9-DL1-DL4-IA b celle ata densità minima di 10 4 cellule / cm 2 utilizzando OP-9 supporti (α-MEM supporto contenente il 20% di FCS e 2,2 g / l di sodio bicarbonato. Piastra 1 x 10 6 cellule per 10 centimetri piatto.
  4. Il giorno 3, quando le cellule B OP9-DL1-DL4-IA diventano 80-90% confluenti, rimuovere il supporto e seminare 0.5 - 1 x 10 5 iPSCs sopra OP9-DL1-DL4 - cellule IA b in OP-9 dei media.
    NOTA: Questo stabilisce la co-coltura di iPSCs sulle cellule B OP9-DL1-DL4-IA ed è considerato come giorno 0 di differenziazione 9.
  5. Il giorno 5, rimuovere il supporto dal 10 centimetri piatto per aspirazione, lavare le cellule con 10 ml di PBS 1x, e aspirare il PBS. Aggiungere 4 ml di 0,25% tripsina e incubare a 37 ° C per 10 min. Aggiungere altri 8 ml di COPSI media per le cellule, risospendere e centrifugare a 400 xg per 5 min a temperatura ambiente.
    1. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 10 ml di IPSC media. Incubare queste cellule ri-sospeso su un fresco piatto di 10 centimetrie tornare alla incubatore per 30 min.
      NOTA: rimuovere le cellule B di alimentazione OP9-DL1-DL4-IA e mantenere i iPSCs differenzianti che galleggiano nei media. Mantenere le cellule B OP9-DL1-DL4-IA continuamente per raggiungere 80-90% di confluenza per un ulteriore co-coltura.
    2. Dopo 30 minuti, raccogliere le cellule galleggianti, filtrarli attraverso un colino cella di 70 micron, e contare le cellule con un emocitometro.
  6. Seme di 5 x 10 5 di iPSCs ad un fresco 80-90% confluenti di cellule B OP9-DL1-DL4-IA nei media OP9. Supplemento media con mFlt-3L ad una concentrazione finale di 5 ng / ml.
  7. Il giorno 8, raccogliere iPSCs parzialmente dissociati lavando il piatto con il supporto dal piatto stesso con una pipetta 10 ml. Utilizzare altri 5 ml di OP-9 supporti nel piatto per lavare delicatamente le cellule semi-aderenti mediante attenta, pipettando forza in modo da non rompere il monostrato OP9 sul fondo del piatto. Ripetere il lavaggio con 10 ml di PBS per raccogliere tutti i semi-annuncioherent differenziazione delle cellule.
    1. Combinare due lavaggi, centrifugare a 400 xg per 5 min a temperatura ambiente, risospendere in 10 ml di mezzi OP9 contenente mFlt-3L (5 ng / ml) e MIL-7 (1 ng / ml), e filtrare 70 colino cellule micron.
  8. Trasferire le cellule in una piastra di coltura 6-pozzetti contenenti 80-90% confluenti OP9-DL1-DL4-IA b cellule, come al punto 1.1. Trasferire le cellule raccolte da un piatto 10 centimetri in un pozzetto della piastra da 6 pozzetti.
  9. Il giorno 10, modifica la metà dei mezzi da cellule ai media OP9 fresco supplementato con mFlt-3L (5 ng / ml) e MIL-7 (1 ng / ml). Ripetere questa operazione ogni due giorni.
  10. Ogni 4-6 giorni, a seconda della crescita, ri-seme le iPSCs differenziazione su piastre con un nuovo strato di cellule B OP9-DL1-DL4-IA, come descritto al punto 1.1.

3. Valutazione delle Treg in vitro differenziazione e maturazione

  1. cambiamenti morfologici del iPSCs di differenziazione.
    1. momentoNitor la co-coltura di iPSCs con cellule B OP9-DL1-DL4-IA di tutti i giorni, osservando le cellule vive sotto un microscopio campo chiaro convenzionale (20X). Di giorno 5, osservare le colonie con caratteristiche simili a mesoderma, come le cellule appiattite. Di giorno 8, osservare piccoli ammassi di cellule rotonde, che rappresentano le cellule differenzianti.
    2. Utilizzare l'esclusione Metodo Trypan Blue per contare le cellule per rilevare il numero e la percentuale di cellule vive. Calcolare la vitalità cellulare come il numero di cellule vitali diviso per il numero totale di cellule nei quattro griglie sul emocitometro. Se le cellule prendono trypan blu, li considerano morti o non vitali. Registrare il numero di cellule vive raccolte dalla cultura.
  2. Citometria a flusso analisi della differenziazione iPSCs.
    1. Nei giorni 5, 7, 11, 15, 19, 21, e 28 di co-coltura, rimuovere le cellule con 0,25% tripsina come nella fase 25.
    2. Prima della colorazione della superficie con diversi anticorpi coniugati a fluorocromi, incubate 1 x 10 6 cellule con 100 ml di Fc blocker 2.4G2 diluito in PBS (concentrazione finale 10 ug / ml) a 4 ° C per 20 min per impedire il legame dell'anticorpo al recettore Fc sulla superficie cellulare.
    3. Nei giorni 5, 7, 11, 15, 19, 21, e 28, usare 1 x 10 6 cellule per la citometria a flusso con diversi anticorpi coniugati a fluorocromi per rilevare i marcatori di superficie delle cellule, tra cui CD3, TCRβ, CD4, CD8, CD25, e CTLA4.
    4. A seguito di blocco Fc, lavare le cellule con 10 ml di PBS e macchia con diversi anticorpi coniugati a fluorocromi per 20 minuti a 4 ° C, e quindi eseguire l'analisi di citometria di flusso con il 15-colore citofluorimetro. Utilizzare 0,200 mg di anticorpo per 10 6 cellule diluite in 100 ml di PBS.
    5. Il giorno 28, analizzare le cellule mediante citometria di flusso 11 e la porta su CD8 + cellule CD4 + che utilizzano CD4 e CD8 coniugato a un fluorocromo colorazione; analizzare per l'espressione di TCRVα2, TCRVβ5, CD25, CTLA-4, E FoxP3 (Figura 1). Per FoxP3 colorazione, fissare le cellule e li permealize e quindi eseguire colorazione anticorpale 11.
  3. In stimolazione antigenica in vitro di iPSCs.
    1. Il giorno 28 di co-coltura, raccolto iPSC-Tregs da culture attraverso la raccolta delle cellule galleggianti. Trypsinize il resto delle cellule con tripsina 0,25% (come nel passaggio 2,5) e risospendere le cellule in 8 ml di COPSI media. Centrifugare per 5 minuti a 400 xg a temperatura ambiente, aspirare i mezzi di comunicazione, e di nuovo risospendere le cellule in 10 ml di media.
      1. Incubare le cellule risospese in un nuovo 10 centimetri piatto a 37 ° C per 30 minuti e raccogliere le cellule galleggianti. Lavare le cellule con PBS freddo.
    2. Incubare 3 x 10 6 splenociti da milze di topi C57BL / 6 Rag1 - / - topi con 5 mM ovalbumina peptide in 200 ml di mezzi (OVA 323-339) a 4 ° C per 30 minuti in un pozzo piastra 11 96.
    3. Mescolare Tregs con OVA 323-339 splenociti in un rapporto 1: 4 (usa 0,75 x 10 6 Tregs). Incubare a 37 ° C in un incubatore CO 2 per 40 ore. Negli ultimi 4 ore, aggiungere 4 ml di diluito brefeldina a nella cultura (1,000x effettiva concentrazione, diluita in mezzi di coltura 1x).
    4. Celle di raccolta con 0,25% tripsina (come al punto 2.5), lavare con 10% NaN 3 e 0,5 M soluzione di EDTA (tampone FACS), blocco con 100 ml di diluito (concentrazione finale 10 mg / ml) Fc bloccante 2.4G2, e macchia per i marcatori di superficie, CD4, CD8, TCRVα2, e TCRVβ5 come nei passaggi 3.2.3-3.2.4.
    5. Fissare le cellule con una soluzione di paraformaldeide al 4% in PBS e permeabilize con 100 ml di buffer di permeabilizzazione 1x dopo la colorazione della superficie cellulare. Attenzione! Paraformaldeide è allergenico, cancerogeno e tossico.
    6. Macchiare le cellule con fluorocromo coniugato TGF-β e IL-10 per 20 minuti al buio. Utilizzare 0,200 mg di anticorpo / 10 6 cellule dilutEd in 100 ml di PBS. Rilevare la produzione intracellulare di TGF-β e IL-10 con la 15-colore citofluorimetro (Figura 2).
    7. Lavare le cellule tre volte con freddo tampone FACS prima della citometria di flusso 11.
  4. In persistenza vivo di Ag-specifici iPSC-Tregs.
    1. Dopo 8 giorni di co-coltura di cellule B OP9-DL1-DL4-IA, trasferire IPSC di derivazione pre-Tregs (Thy1.2) come al punto 3.3.1 nelle tue 1.1 topi congenic (4-6 settimane), tramite un coda vena iniezione senza anestesia. Prima di eseguire la coda iniezione vena dilatare la vena della coda usando una lampada a infrarossi per 5 min. Dopo vena della coda dilatazione, posizionare il mouse in un dispositivo di immobilizzazione e adoptively trasferimento 3 x 10 6 cellule risospese in 200 ml di PBS iniettando attraverso la vena della coda.
    2. Sei settimane dopo il trasferimento Treg, eutanasia topi da CO 2 asfissia seguita da dislocazione cervicale. Assicurarsi che la mice non sono la respirazione. Aprire la cavità peritoneale, tagliando la pelle esterna del peritoneo con le forbici e pinze e delicatamente tirando indietro per esporre la pelle interna che riveste la cavità peritoneale. Isolare la milza e linfonodi periferici di iniettati Thy 1.1 topi congenic.
    3. Raccogliere le cellule dal milza e nei linfonodi utilizzando rottura meccanica per ottenere una sospensione di cellule singole. Incubare le cellule con 5 ml di tampone di lisi ACK per 5 min a temperatura ambiente per lisare i globuli rossi. Raccogliere e lavare splenociti o linfociti rimanenti con 10 ml di tampone FACS freddo.
    4. Dopo il lavaggio, il trattamento di cellule con il blocco 2.4G2 Fc a 4 ° C per 20 min come al punto 3.2.2 e macchia con 100 ml di diluito anti-Thy 1.2 anticorpi coniugati a fluorocromi.
    5. Lavare le cellule con 10 ml di tampone FACS e procedere a scorrere citometria 11.

4. In Vivo Maturazione e soppressione di artrite autoimmune

  • Generare i costrutti come al punto 2.1.
  • Eseguire trasduzione retrovirale 9 come al punto 2.2.
  • In differenziazione vivo e induzione artrite nei topi.
    1. Differenziare OT-II TCR / iPSCs FOXP3-trasdotte (OT-II-FOXP3 / iPSCs), iPSCs FOXP3-trasdotte, e DsRed iPSCs trasdotte sulle cellule B stromali OP9-DL1-DL4-IA in presenza di citochine mFlt-3L e mIL-7 per 8 giorni come descritto nei punti 2.1 - 2.6.
    2. Trypisinize tutti e tre i tipi di cellule dalla piastra 10 centimetri e risospendere le cellule da ciascuna piastra 10 cm di 10 ml di mezzi freschi. Aggiungere le cellule a 10 cm Piatto fresco e tornare a incubatore per 30 min. Dopo 30 minuti, raccogliere le cellule galleggiante.
    3. Passare le cellule attraverso un colino cella di 70 micron per rimuovere gruppi di cellule e contare con un emocitometro. Regolare le cellule ad una concentrazione di 1,5 x 10 7 cellule / ml in PBS freddo e filtrare nuovamente se necessario. Mantenere le cellule in ghiaccio fino al trasferimento delle cellule adottivo in topi. Iniettare 200 ml di sospensione cellulare (3 x 10 6 cellule) in tre diversi gruppi di 4 - 6 settimane di età C57BL / 6 topi femmina attraverso la vena della coda come descritto in 3.4.1
    4. Il giorno 10 dopo il trasferimento di cellule, iniettare topi con 100 mg di MBSA emulsionato in adiuvante completo di Freund alla base della coda utilizzando una siringa da 1 ml.
    5. Il giorno 17, anestetizzare topo, utilizzando un vaporizzatore isoflurano (secondo le linee guida IACUC). Utilizzare 4 - 5% isoflurano per l'induzione e 1 - 2% per la manutenzione. Indurre l'artrite per iniezione intra-articolare di 20 mcg MBSA in 10 microlitri di PBS nel ginocchio sinistro comune e di 20 mg MBSA e 100 mcg intero OVA in 10 microlitri di PBS nell'articolazione del ginocchio destro. Cibo e un Gelpack possono essere collocati sul pavimento assestamento dopo l'artrite si è sviluppata. I topi saranno sacrificati: Body Condition Score (BCS) di 2/5 o moribondi, grave cachessia e / o decubito permanente (un periodo di 24 ore), e la gravità punteggio 4. Nel punteggio4, eritema e gonfiore grave comprendono la caviglia, piede e le cifre, o anchilosi dell'arto.
  • Caratterizzazione dei iPSCs OT-II TCR / Foxp3-trasdotte.
    1. Utilizzare un microscopio a fluorescenza (20X) per visualizzare in tempo reale non fissati cellule DsRed + GFP +.
    2. Esaminare l'integrazione e l'espressione genica sia da Western Blot e citometria a flusso 11.
  • lo sviluppo e la maturazione Treg.
    1. Alle settimane 2, 4, e 6 dopo il trasferimento delle cellule, eutanasia i topi. Per l'eutanasia, in ogni gabbia utilizzare 1 - 2 L di CO 2 nel primo stadio. Una volta che l'animale è perso conoscenza, aumentare il flusso di CO 2 a 4 - 5 L / min. Euthanize topi da CO 2 inalazione. Isolare la milza e drenare i linfonodi, tagliando la pelle esterna del peritoneo con le forbici e pinze e delicatamente tirando indietro per esporre la pelle interna che riveste la cavità peritoneale.
    2. Raccogliere la sospensione singola cella from della milza e linfonodi di guasto meccanico utilizzando un colino cellulare e una siringa da 1 ml a 1% Mezzi di IPSC. Centrifugare il tubo conico contenente il supporto a 400 g per 5 minuti. Risospendere il pellet di cellule in 5 ml di tampone di lisi ACK per lisare i globuli rossi. Re-centrifugare a 1000 rpm per 5 min. Risospendere il pellet di cellule e lavare i restanti splenociti o linfociti con tampone FACS freddo. Seguire i punti 3.4.4 - 3.4.5 e procedere a scorrere citometria.
  • colorazione intracellulare.
    1. Il giorno 50 post-sfida, isolare la milza e drenare i linfonodi dei topi (come al punto 4.5.1) dopo euthanization da CO 2 inalazione seguita da dislocazione cervicale.
    2. Raccogliere la sospensione singola cella dalla milza e linfonodi di guasto meccanico utilizzando un colino cellulare e una siringa da 1 ml. Incubare le splenociti a temperatura ambiente per 5 minuti con 5 ml di tampone di lisi ACK per lisare i globuli rossi. Raccogliere e lavare i restanti splenocytes o linfociti con tampone FACS freddo. Seguire i punti 3.2.3 - 3.2.4, ma macchia con marcatori di superficie CD4, CD8, CD25, e TCRVβ5.
    3. Procedere a fissare le cellule per la colorazione intracellulare come descritto in 3.3.5 - 3.3.7 e analizzare la produzione intracellulare di citochine (TGF-β e IL-10) di iPSC-derivato Tregs e la porta su cellule in diretta CD4 + CD25 +.
  • Infiltrazione di Ag-specifici Treg nelle ginocchia e la soppressione di artrite.
    1. A seguito di passaggi (4.3 - 4.3.6) nei giorni 7-14 di induzione post-artrite, eutanasia topi da CO 2 inalazione seguita da dislocazione cervicale (secondo le linee guida IACUC). Eliminare i peli dalle ginocchia con un tagliatore elettrico e accise le ginocchia dalla procedura chirurgica.
    2. Rimuovere la pelle dalle gambe facendo un'incisione nella zampa posteriore con le forbici smussato-end e tagliare la pelle attraverso la coscia e fino alla caviglia. buccia delicatamente la pelle sopra la gamba e del piede per esporre il muscolo. Rimuovereil muscolo dalla gamba accuratamente senza danneggiare l'articolazione del ginocchio.
      1. Tagliare la zampa posteriore appena sopra l'articolazione del bacino / anca e tagliare la tibia con le forbici dissezione affilate.
    3. Fissare le ginocchia in formalina 4% per 48 ore. Disincrostare il ginocchio usando 2.5 M acido formico; lavare tre volte in xilene per 3 min, lavare due volte in 100% di etanolo, lavare due volte in 95% di etanolo, lavare due volte in acqua deionizzata per 2 min, e decalcificazione in 1 mM EDTA. Trattare ad una temperatura sub-ebollizione (90 ° C) per 20 min.
    4. Raffreddare il tessuto fissato per 30 min. Risciacquare con PBS 1x per 4 min e incorporarlo in paraffina. Disidratare i tessuti attraverso una serie di bagni di etanolo per spostare l'acqua, e poi infiltrarsi con cera. Poi incorporare i tessuti infiltrati in blocchi di cera. Eseguire sia sezionamento verticale e orizzontale per la colorazione. Preparare 4 sezioni micron con un microtomo scorrevole.
    5. Eseguire immunofluorescenza colorazione sulle sezioni dopo le procedure standard di deparaffinizzazione e reidratazione con xilene ed etanolo 12.
    6. Bloccare perossidasi endogena immergendo il vetrino in una quantità sufficiente di soluzione di perossido di idrogeno al 3% per 3 minuti dopo Ag recupero. scivoli blocco per rilegatura in 3% BSA in PBS a temperatura ambiente in una camera umidificata per 60 minuti non specifico.
    7. sezioni macchia con 200 ml di anticorpi TCRVβ5 fluorocromo coniugato diluito 1: 100 in soluzione di saturazione. Incubare per 2 ore a temperatura ambiente in 75 - camera umidificata 100%, e lavare 5 volte in 1x PBS per 5 min.
    8. Controcolorare le diapositive per la colorazione nucleare con un reagente antifade contenente DAPI. Aggiungere circa 300 ml di soluzione colorante DAPI diluita (300 Nm in 1x PBS) per vetrino, assicurandosi che tutto il vetrino è coperto. Conservare i vetrini al buio a 4 ° C fino all'analisi al microscopio a fluorescenza (Figura 3).
  • test di soppressione Artrite
    1. Misurare il gonfiore di entrambe le ginocchia dei topi prima dell'induzione artrite utilizzando una pinza quadrante calibro per stabilire una linea di base.
    2. Seguire i passaggi (4,3 - 4.3.6) per l'induzione l'artrite e il trasferimento Treg. Misurare le ginocchia del mouse con un quadrante calibro trasferimento pinza post-Treg.
    3. Calcolare l'incremento percentuale del diametro del ginocchio: Incremento percentuale = (diametro ginocchio il giorno 1 - diametro ginocchio al giorno 0) / diametro del ginocchio al giorno 0.
  • Misurazione della distruzione articolare e infiltrazione di cellule infiammatorie nelle ginocchia istologicamente (Figura 4).
    1. Il giorno 7 post-artrite induzione, eutanasia i topi come descritto in precedenza e le accise le ginocchia dalla procedura chirurgica. Vedere il punto 4.7.1 - 4.7.2.
    2. Fissare le ginocchia in formalina 4%, decalcificazione in EDTA, e incorporare in paraffina. Vedere il punto 4.7.3
    3. Rimuovere entrambe le ginocchia, fissare in formalina al 10%, e in calcify Formical-4. Incorporare i tessuti in paraffina, sezione a 4 micron, e macchia con hematoxyle eosina (H & E) o safranina O colorazione (come al punto 4.7.7) ed osservare al microscopio.
    4. Utilizzare colorazione H & E per valutare l'erosione ossea con un sistema semi-quantitativa di punteggio (0: nessun erosioni; 4: erosioni estese e la distruzione del tessuto osseo). Utilizzare safranina O colorazione per valutare la perdita di proteoglicani e segnare con un sistema semi-quantitativa scoring (0: nessuna perdita di proteoglicani; 3: perdita completa di colorazione per proteoglicani).
      1. Utilizzare un sistema di punteggio semi-quantitativa di segnare infiltrazione infiammatoria delle cellule su vetrini H & E macchiati (0: nessuna infiltrazione di cellule; 4: abbondato infiltrazione di cellule). Valutare i punteggi esaminando entrambe le ginocchia in modo cieco.
  • 5. Misurazione della perdita ossea nelle ginocchia con il sistema ad alta risoluzione micro-tomografia computerizzata (micro-CT)

    1. Il giorno 10 di induzione post-artrite, anestetizzare i topi con 2% isoflurano e prepararsi per l'imaging.
    2. posizione MICe con le ginocchia rivolte verso l'alto nella camera.
    3. Utilizzare un sistema di micro-CT ad alta risoluzione per acquisire imaging in vivo dell'architettura ossea intorno alle ginocchia dei topi.
    4. Eseguire micro-TC con una lunghezza 2,2 millimetri, tra cui le articolazioni del ginocchio del mouse con i seguenti parametri: 10,5 micron di dimensione voxel a 55 kV, 145 μA 200 msec tempo di integrazione, 211 immagini.
    5. Immagini Importa micro-CT e immagini piane cattura frontale dopo un'ulteriore elaborazione dell'immagine (volume rendering e trasformazione) (Figura 5).

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    Representative Results

    Come mostrato qui, il giorno 28, Ag-specifica Treg espresso sostanzialmente CD3 e Ag-specifica TCR, due marcatori di cellule T. La popolazione CD3 + TCRVβ5 + CD4 espresso. La maggior parte delle cellule CD3 + TCRVβ5 + CD4 + CD25 espresse anche, CD127, e CTLA-4, che sono tipicamente espressi a livelli elevati nel naturale REGS T (nTregs) e nelle cellule T che esprimono FoxP3 ectopica. Espressione FoxP3 nelle cellule iPSC-derivate persisteva anche dopo lungo periodo di stimolazione in vitro con il ligando Notch, come rilevato dalla colorazione intracellulare analizzata mediante citometria di flusso (Figura 1). Inoltre, l'Ag-specifica COPSI-Tregs prodotta citochine soppressive, quali TGF-β e IL-10, quando stimolate in vitro con splenociti Ag-pulsata (Figura 2), che indica l'IPSC-Tregs aveva potenziali attività soppressiva. Microscopia a fluorescenza rivelato che più Foxp3 + cellule erano presenti nel OVA trattati con rispetto le ginocchia PBS trattati; non ci sono stati + cellule FOXP3 esistenti nelle ginocchia nei topi trattati con i iPSCs vettore-trasdotte DsRed +. Molti di più CD4 + + + TCRVβ5 cellule FOXP3 presentati nelle ginocchia di topi trattati con iPSCs trasdotte con il MIDR-TCR-FoxP3 rispetto al MIDR-FoxP3 (Figura 3). Queste osservazioni suggeriscono che Ag-specifici IPSC-Tregs migrano al ginocchio AIA dopo il trasferimento adottivo in topi riceventi. Le cellule derivate COPSI trasferiti sostanzialmente diminuiti ginocchio infiammatori gonfiore quando OVA era presente, ma non ha avuto effetto sul ginocchio controllo che è stato iniettato solo con MBSA nel modello murino (figura 4); perdita ossea ridotta in ginocchio trasferimento di cellule visualizzata dal sistema micro-CT ad alta risoluzione (Figura 5).

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    Figura 1:. Differenziazione di Ag-specifici iPSC-Tregs murino iPSCs sono state trasdotte con un costrutto: MIDR-TCRα-2A-TCRβ-2A-FoxP3 contenenti geni di OVA-specifici TCR e FoxP3. Le cellule gene-trasdotte (DsRed +) sono stati co-coltivati su OP9-DL1-DL4-IA cellule B in presenza di mFlt3L e MIL-7. (A) Morfologia di T REGS differenziazione delle cellule al giorno 0, 7, 14 e 22. citometria (B) di flusso per l'espressione della proteina delle cellule iPSC-derivati al giorno 28. CD3 + TCRVβ5 + cellule sono state gated come indicato (R1) e analizzati per l'espressione di CD4 e CD8, con CD25, CD127, CTLA- 4, e FoxP3 dimostrato per le cellule gated come CD4 + CD8 - cellule (R2). (linee scure; aree ombreggiate indicano controlli isotipo) clicca qui per visualizzare un largversione er di questa figura.

    figura 2
    Figura 2: Analisi funzionale di I n Vitro differenziata Ag-specifica Tregs murini IPSC-Treg sono state stimolate da splenociti.;: E pulsata con OVA 323-339 peptide (APC REGS T / APC = 1 4). La produzione di citochine intracellulari (TGF-β e IL-10) è stato analizzato in citometria a flusso dopo gating sulle cellule dal vivo CD4 + CD25 +. (Linee scure; aree ombreggiate indicano controlli isotipo) Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

    Figura 3
    Figura 3: AiPSC-Tregs infiltrarsi articolazioni del ginocchio specifici g. Ag-specifici IPSC-Treg sono stati adoptively trasferiti in topi C57BL / 6. Poco dopo l'artrite induzione (giorni 7 - 14), le ginocchia sono stati rimossi e colorate per Immunoistologia (barre di scala: 20 micron). I topi trattati con OVA-specifici iPSC-Tregs hanno un gran numero di cellule + TCRVβ5 alle ginocchia. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

    Figura 4
    Figura 4: trasferimento adottivo di Ag-specifici iPSC-Tregs migliora AIA nei topi iPSCs murini sono state trasdotte con il costrutto retrovirale MIDR, MIDR-FoxP3, o MIDR-TCR-FoxP3 e sono stati co-coltura sul OP9-DL1 / DL4 /. cellule B IA. Il giorno 7, le cellule gene-trasdotte (3 x 10 6 / topo) è undoptively trasferiti in femmine C57BL / 6 topi che sono stati indotti con AIA due settimane dopo il trasferimento delle cellule. Il giorno dopo l'induzione artrite, artrite gravità è stata monitorata mediante misurazione del diametro ginocchio. (AC) aumento percentuale del diametro del ginocchio. Aumento del diametro del ginocchio è stato calcolato sulla base di pre-iniezione del diametro ginocchio per ogni mouse prima dell'iniezione al giorno 0. punteggio artrite è stata valutata esaminando entrambe le ginocchia in modo cieco; ogni ginocchio è stato assegnato un punteggio (0: nessun gonfiore visibile o decolorazione; 1: visibile gonfiore con o senza decolorazione; 2: moderata gonfiore con decolorazione; 3: grave gonfiore con scolorimento). In ciascun gruppo, cinque topi sono stati utilizzati, ei dati sono rappresentativi di tre esperimenti indipendenti. I dati sono rappresentati come media ± SD. (D) La media aver eseguito il giorno 7 per entrambe le ginocchia di cinque topi. I dati sono rappresentati come media ± SD di tre esperimenti indipendenti (** p <0,01, *** p <0,001, ANOVA a due vie). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

    Figura 5
    Figura 5:. Ag-specifici iPSC-Tregs migrare al OVA iniettato ginocchio e ridurre la perdita ossea IPSC-Treg sono stati adoptively trasferito in topi C57BL / 6. Entro 21 giorni post-induzione artrite, i topi sono stati anestetizzati e l'architettura osso intorno alle ginocchia mouse è stato ripreso dal sistema di micro-CT. I topi trattati con OT-II TCR / FoxP3 gene-trasdotte murino IPSC-Tregs presentare una significativa riduzione della perdita ossea, rispetto ai topi di controllo che ricevono iPSCs vettori trasdotte. (A) Le scansioni sono state eseguite con una lunghezza 2,2 millimetri, e le immagini sono state catturate dopo un'ulteriore elaborazione delle immagini (rendering volumetrico e trasformazione;barre di scala:. 1 mm) (B) volume osseo intorno ginocchio è stata valutata utilizzando la ricostruzione tridimensionale di immagini micro-CT, e il volume delle ossa all'interno del volume di interesse è stato fissato (barre di scala:. 1 mm) Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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    Discussion

    In questo protocollo, un passaggio fondamentale è la differenziazione in vitro di TCR / FOXP3 iPSCs gene-trasdotte. In vitro Notch induce lo sviluppo verso la linea cellulare T. Per differenziare iPSCs in CD4 + FoxP3 + Tregs, abbiamo utilizzato le cellule B OP9-DL1 / DL4 / Ia, altamente espressa molecole MHC II (IA b). La maggior parte dei iPSCs differenziano in cellule CD4 +. Tuttavia, dopo l'espressione del TCR di superficie, molte cellule pre-T differenziati perdono la capacità di differenziare e alla fine muoiono. Come risultato, il numero di cellule dei Tregs funzionali COPSI-derivati riduce drasticamente dopo quattro settimane di differenziazione in vitro. Per evitare questo, l'aggiunta di IL-2 può migliorare la sopravvivenza cellulare in quei punti temporali. Un metodo alternativo per guidare la maturazione e la sopravvivenza di Ag-specifici pre-Tregs è di trasferire i pre-Tregs che sono differenziate in vitro per una settimana in topi. Questi pre-Tregs può continue differenziazione e maturazione in vivo per altre tre settimane. Utilizzando questo metodo, una popolazione Treg Ag-specifica funzionale può essere generata da iPSCs, che sono nTregs-come e hanno la capacità di sopprimere l'artrite autoimmune nel modello murino.

    Per migliorare l'efficacia della vivo sviluppo di Ag-specifici iPSC-Tregs, composti diversi (ad esempio, l'acido retinoico, gelectin) 13,14 o soppressiva citochine (ad esempio, TGF-β, IL-10) possono essere utilizzati dopo il trasferimento adottivo del pre-Tregs. Oltre ad aumentare la sopravvivenza cellulare, questo approccio combinato può mantenere espressione FoxP3 14,15 e migliorare la qualità del Ag-specifica COPSI-Tregs.

    Un potenziale problema che potrebbe sorgere per lo sviluppo in vivo Treg è immunosoppressione globale, con conseguente complicazioni durante infezioni o conseguente perdita di peso. Un gran numero di Ag-specifica Tregs in via di sviluppo nel VIvo può peggiorare le infezioni. In questo caso, un gene suicida, la caspasi 9 inducibile (ICasp9) 15,16, può essere incorporato nel vettore TCR / FoxP3. Questo approccio permette la rimozione dei Tregs cellule staminali derivate dalla iniezione di una piccola molecola bioinerti dimerizing agente (AP1903) per "spegnere" la generazione di cellule staminali derivate da Tregs, che permette di superare questo potenziale problema.

    Un self-Ag è una proteina tipica riconosciuta dal sistema immunitario di ospiti che soffrono di una malattia autoimmune individuale. Questa auto-Ag è l'obiettivo del sistema immunitario, e le cellule T correlate non vengono eliminati. Per generare auto-Ag Tregs specifici, l'uso di TCR trasduzione è una buona scelta. Un auto-Ag (ad esempio, la proteina heat shock) specifica TCR può essere trasduzione in maturi CD4 + CD25 + Treg dalle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC), e questo approccio è stato utilizzato in studi clinici. In alternativa, come described in questo protocollo, utilizzando la trasduzione genica di auto-Ag TCR specifico con FoxP3 e la stimolazione con segnalazione Notch, staminali Tregs derivati ​​dalle cellule può essere auto-Ag specifica Tregs.

    Terapie a base di cellule per le malattie autoimmuni che utilizzano Tregs ingegnerizzati possono essere utili 17. Anche se TCR trasduzione nelle cellule T ha dimostrato di essere al sicuro, fattibile, e applicabile negli studi clinici, ci sono ancora notevoli problemi di sicurezza a causa della autoimmunità causata da cross-reattività con i tessuti sani 18. Inoltre, usando i metodi attuali, geneticamente modificato Tregs solito hanno una persistenza breve termine in vivo 19. In alternativa, una fonte promettente per lo sviluppo di un gran numero di monoclonali Ag-specifici Tregs è cellule staminali. Le cellule staminali embrionali (ESC) hanno la migliore pluripotenza e di auto-rinnovamento, ma non è possibile ottenere loro di pazienti. Anche se facilmente isolati dal sangue periferico, le cellule staminali ematopoietiche (CSE) sono multi-Le cellule staminali potenti e possono essere espanse in coltura cellulare in modo simile a CES 20. La tecnologia attuale COPSI è avanzata ad una generazione più efficace di PSC da cellule somatiche dei pazienti da trasduzione di diversi fattori di trascrizione. Un certo numero di miglioramenti metodologici sono stati sviluppati negli ultimi anni per generare iPSCs riducendo al massimo i rischi potenziali, come immunogenicità e tumorigenicità. Rispetto al CES, iPSCs hanno pluripotenza identici e auto-rinnovamento. Come risultato, la tecnologia COPSI può fornire un vantaggio nello sviluppo PSC-paziente e / o malattie specifiche. L'uso di iPSCs per sviluppare Ag-specifica Tregs può avanzare il campo delle terapie a base di cellule per le malattie autoimmuni 10,11.

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    Acknowledgments

    Questo progetto è stato finanziato, in parte, sotto sovvenzioni dal National Institutes of Health (R01AI121180, R21AI109239 e K18CA151798), l'American Diabetes Association (1-16-IBS-281), e il Dipartimento della Salute della Pennsylvania (tabacco Settlement Funds) a JS

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    C57BL/6j mice Jackson Laboratory 664
    B6.129S7 Rag1tm1Mom/J Jackson Laboratory 2216
    Anti-CD3 (2C11) antibody BD Pharmingen 553058
    Anti-CD28 (37.51) antibody BD Pharmingen 553295
    Anti-CD4 (GK1.5) antibody Biolegend 100417
    Anti-CD8 (53–6.7) antibody Biolegend 100714
    Anti-CD25 (3C7) antibody Biolegend 101912
    Anti-TCR-β (H57597) antibody Biolegend 109220
    Anti-IL10 Biolegend 505010
    Anti-TGFβ Biolegend 141402
    DMEM Invitrogen ABCD1234
    α-MEM Invitrogen A10490-01
    FBS Hyclone SH3007.01
    Brefeldin A Sigma B7651
    Polybrene Sigma 107689
    Genejammer Integrated science 204130
    ACK Lysis buffer Lonza 10-548E
    mFlt-3L peprotech 250-31L
    mIL-7 peprotech 217-17
    Gelatin Sigma G9391
    Paraformaldehyde Sigma P6148-500G Caution: Allergenic, Carcenogenic, Toxic
    Permeabilization buffer Biolegend 421002
    mBSA Sigma A7906
    Ova albumin Avantor 0440-01
    CFA Difco 2017014
    Tailveiner restrainer Braintree scientific RTV 150-STD

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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