Otoimmünite karşı Kök Hücre türetilmiş antijen-özgü düzenleyici T hücrelerinin gelişimini

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Haque, M., Fino, K., Sandhu, P., Song, J. Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity. J. Vis. Exp. (117), e54720, doi:10.3791/54720 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Otoimmün hastalıklar nedeniyle immünolojik kendine karşı direncini kaybı ortaya çıkar. Düzenleme T hücreleri (Tregs) immünolojik kendine karşı direncini önemli aracılarıdır. Periferik kanda dolaşan Tregs% 2 - yaklaşık 1 ile farelerde ve insanlarda olgun CD4 + T hücre alt-popülasyonu% 10 - Tregs yaklaşık 5 temsil etmektedir. Uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs) potansiyel oto-bağışıklık hastalıkları, hücre bazlı terapiler için kullanılacak sahip fonksiyonel Tregs içine ayırt edilebilir. Burada, iPSCs gelen antijen (Ag) 'e özgü Tregs (yani, iPSC-Treg'ler) geliştirmek için bir yöntem mevcut. yöntem iPSCs olarak transkripsiyon faktörü Foxp3 ve Ag-spesifik T hücresi reseptörü (TCR) içeren ve Çentik ifade OP9 stromal hücreleri üzerinde farklılaşan göre delta-benzeri (DL) 1 ve DL4 ligandları. In vitro farklılaştırma ardından, iPSC-Treg'ler CD4, CD8, CD3, CD25, Foxp3 ve Ag-spesifik TCR ifade Ag uyarısına cevap verebilmektedir.Bu yöntem, başarılı bir murin modelinde otoimmün artrit, hücre bazlı tedavi uygulanmıştır. Ag-teşvikli artrit (AIA) tohumlu zeytin farelere bu Ag-spesifik iPSC-Tregs adoptif nakli eklem iltihabı azaltmak ve şişme ve kemik kaybını önlemek için yeteneğine sahiptir.

Protocol

Tüm hayvan deneyleri Tıp Hayvan Bakım Komitesi Pennsylvania State Üniversitesi (IACUC protokolü # 45470) tarafından onaylanır ve Laboratuar Hayvan Bakımı Değerlendirme ve Akreditasyon Derneği kurallarına uygun olarak yapılmaktadır.

1. Kök Hücre Kültürü

  1. kaplamak için 37 ° C (kuluçka) en az 30 dakika boyunca% 0.1 jelatin, 10 ml plakası olan bir 10 cm tabak inkübe edin.
  2. Çanak ve levha 3 x 10 6 jelatinin çıkarın SNL76 / 7 hücreleri ışımaya tutulmuş ve% 10 DMEM ortamı (% 10 FBS ve% 1 penisilin streptomisin) kullanılarak, 37 ° C'de (kuluçka) bir gün boyunca inkübe edilir.
  3. iPSC ortam kullanılarak SNL76 / 7 hücre besleyici tabakası üzerine levha ve Kültür çözülmüş iPSCs ortamı çıkarın (% 15 fetal buzağı serumu, 0.1 mmol / L esansiyel olmayan amino asitler, 1 mmol / L L-glutamin içeren DMEM ortamı ve 0.1 mg / L β-merkaptoetanol) 9. Fare iPS-MEF-Ng-20D-17 hücre liOct3 / 4, Sox2 Klf4 ve c-Myc retro virüs transfeksiyonu fare embriyonik fibroblastlar indüklenen edildi, NE Dr. Shinya Yamanaka (Frontier Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Kyoto Üniversitesi, Kyoto, Japonya) elde edildi.
  4. Taze medya ile günde 3 ortamı değiştirmek ve mikroskop altında iPSC koloniler gözlemlemek.
    NOT: Bu koloniler az parlak küme veya bir floresan mikroskobu altında GFP ekspresyonu gösteren açık bir sınır yuvarlak hücrelerdir.

Ag-spesifik iPSC-Tregs Vitro Farklılaşma 2.

  1. Yapıları oluşturmak MIDR-TCRα-2A-TCRβ-2A-FoxP3 bir yapı oluşturmak için kendi kendine-yaran peptid 2A bağlantılı MIDR plazmid 10'a alt klonlama OT-II TCR genlerinin ve Foxp3 tarafından Retroviral transdüksiyonun kullanılmak üzere.
  2. Paketleme hücre hattı olarak Plat E hücreleri kullanılarak iPSCs retroviral transdüksiyonunu 9 gerçekleştirin.
  3. 0. günde, tohum PÇ9-DL1-DL4-IA B hücreleri% 20 FCS ve 2.2 g / L sodyum bikarbonat kompozisyonuna sahiptir. Levha 10 cm tabak başına 1 x 10 6 hücre ihtiva eden OP-9 ortam (α-MEM ortamı kullanılarak 10 4 hücre / cm2 ta asgari yoğunluk.
  4. OP9-DL1-DL4-IA b hücreleri% 80-90 konfluent olunca günde 3, medyayı çıkarın ve 0,5 tohum - OP9-DL1-DL4 üzerinde 1 x 10 5 iPSCs - IA b hücreleri PÇ-9 medyada.
    NOT: Bu PÇ9-DL1-DL4-IA B hücreleri üzerindeki iPSCs ko-kültür kurar ve farklılaşma 9 gün 0 olarak kabul edilir.
  5. günde 5 günü, aspirasyon ile 10 cm çanak ortamı çıkarın 1x 10 ml PBS ile hücreleri yıkayın ve PBS aspire. % 0.25 tripsin 4 ml ilave edilir ve 10 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g'de, hücrelere iPSC başka bir medya 8 ml ilave bunları yeniden askıya ve santrifüjlenir.
    1. Aspire süpernatan ve iPSC ortam, 10 ml hücrelerin yeniden askıya. taze bir 10 cm çanak bu yeniden askıya hücreleri inkübeve 30 dakika boyunca inkübatör dönmek.
      NOT: OP9-DL1-DL4-IA b besleyici hücreler çıkarın ve medya yüzen ayırt iPSCs tutun. Daha fazla ko-kültür için% 90 confluency - Bakım OP9-DL1-DL4-IA b hücreleri sürekli 80 elde etmek.
    2. 30 dakika sonra, yüzen hücreleri toplamak 70 mikron hücre süzgecinden bunları filtre ve bir hemasitometre hücreleri saymak.
  6. OP9 medya PÇ9-DL1-DL4-IA B hücreleri% 90 konfluent - yeni bir 80 Tohum iPSCs 5 x 10 5. 5 ng / ml 'lik bir nihai konsantrasyonda mFlt-3L ile ortam ilavesi.
  7. 8. günde, 10 ml pipet kullanarak çanak kendisinden ortam ile plakayı yıkayarak kısmen farklılaşmış iPSCs toplar. çanak alt OP9 tek tabaka kırmak için değil böylece nazikçe dikkatli, güçlü pipetleme yarı yapışık hücrelere yıkayın çanak PÇ-9 medya başka bir 5 ml kullanın. tüm yarı reklam hasat 10 ml PBS ile tekrar kullanınherent hücreleri farklılaştırarak.
    1. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g'de iki yıkama, santrifüj birleştirin, mFlt-3L (5 ng / ml) ve mlL-7 (1 ng / ml) ihtiva eden OP9, 10 mL ortam içerisinde yeniden askıya ve 70 vasıtasıyla filtre edin mikron hücre süzgeç.
  8. Aşama 1.1'de olduğu gibi, B hücreleri% 90 konfluent PÇ9-DL1-DL4-Ia - 80 ihtiva eden bir 6-yuvalı kültür plakasına hücreleri aktarın. Aktarım hücreler 6 oyuklu plakanın bir oyuk içine bir 10 cm tabak hasat.
  9. 10. günde, mFlt-3L (5 ng / ml) ve mlL-7 (1 ng / ml) ile desteklenmiş taze OP9 ortamına hücrelerden ortam değişikliği yarısı. iki günde bu adımı yineleyin.
  10. 4-6 gün büyümeye bağlı olarak, yeniden ekim adım 1.1 de tarif edildiği gibi PÇ9-DL1-DL4-IA B hücrelerinin yeni bir katman ile plakalar üzerine ayırt iPSCs.

İn Vitro Treg farklılaşması ve olgunlaşmasının 3. Değerlendirme

  1. ayırt iPSCs morfolojik değişiklikler.
    1. MoNITOR gün geleneksel bir aydınlık mikroskobu (20X) kapsamında, canlı hücreleri gözlemleyerek PÇ9-DL1-DL4-IA B hücreleri ile iPSCs ko-kültür. 5. günde, bu düzleştirilmiş hücreleri gibi mezoderm benzeri özelliklere sahip, kolonilerin. günde 8 ile, ayırt hücreleri temsil hücrelerin küçük, yuvarlak kümeleri, gözlemlemek.
    2. Canlı hücrelerin sayısını ve yüzdesini saptamak üzere hücreleri saymak için Tripan Mavisi Dışlama yöntemi kullanın. hemasitometre dört ızgaraları içindeki hücrelerin sayısına bölünmesiyle canlı hücre sayısı hücre sağ kalabilirliğinin hesaplanması. Hücreler tripan mavisi kadar alırsak, onları ölü ya da cansız düşünün. kültürden hasat canlı hücre sayısı kaydedilir.
  2. iPSCs ayırt Flow sitometri analizi.
    1. gün 5, 7, 11, 15, 19, 21 ve eş-kültür, 28, adım 25'te,% 0.25 tripsin ile hücreleri çıkarmak.
    2. Farklı florokrom-eşlenik antikorlar yüzey boyama öncesinde, incubatE 20 dakika boyunca 4 ° C'de PBS (nihai konsantrasyon 10 ug / mL) içinde seyreltilmiş Fc bloke edici 2.4G2 100 ul 1 x 10 6 hücre, hücre yüzeyi üzerinde Fc reseptörüne antikorun önler.
    3. Gün 5, 7, 11, 15, 19, 21, ve 28, CD3, TCRβ, CD4, CD8, CD25 dahil olmak üzere hücre yüzeyi işaretçileri, tespit etmek için farklı bir florokrom-eşlenik antikorlar ile akış sitometrisi için 1 x 10 6 hücre kullanın ve CTLA4.
    4. Fc Block sonra, 4 ° C'de 20 dakika süreyle, farklı florokrom-eşlenik antikorlar ile 10 ml PBS ve leke hücreleri yıkayın ve daha sonra akış sitometresi 15 renk akış sitometrik analizi gerçekleştirmek. 100 ul PBS içinde seyreltilmiş 10 6 hücre başına antikor 0.200 ug kullanın.
    5. 28 günde, CD4 ve CD8 florokrom-eşlenik lekeleme kullanılarak CD4 +, CD8 + hücreleri üzerinde 11 akış sitometrisi ve kapının hücreleri analiz; TCRVα2, TCRVβ5, CD25, CTLA ifadesi için analiz-4 Ve FoxP3 (Şekil 1). FoxP3 boyama, hücrelerin düzeltmek ve onları permealize ve sonra antikor boyama 11 gerçekleştirin.
  3. IPSCs in vitro antijen ile uyarılması.
    1. yüzen hücreleri toplayarak kültürlerden ko-kültür, hasat iPSC-Treg'ler gününde 28. (Adım 2.5 gibi),% 0.25 tripsin ile hücrelerin geri kalanı tripsinize ve iPSC ortam 8 ml hücrelerin yeniden askıya. Oda sıcaklığında 400 x g'de 5 dakika boyunca santrifüje, ortam, 10 ml hücreleri askıya tekrar tekrar ortamı aspire ve.
      1. 30 dakika boyunca 37 ° C 'de, yeni bir 10 cm'lik bir tabakta yeniden süspansiyon haline hücreleri inkübe ve kayan hücreleri toplamak. soğuk PBS ile hücreleri yıkayın.
    2. 96 oyuklu bir plaka 11, 30 dakika boyunca 4 ° C 'de ortam 200 ul 5 uM ovalbümin peptidi ile farelerin (OVA 323-339) - / - C57BL / 6 Rag1 dalaklarından 3 x 10 6 splenositlerin inkübe edin.
    3. OVA 323-339 ile Tregs Mix 1 at splenositler: 4 oranında (0.75 x 10 6 Tregs kullanın). 40 saat bir CO2 inkübatörde 37 ° C'de inkübe edilir. Son 4 saat içinde, kültür (1 x kültür ortamı içinde seyreltilmiş, gerçek konsantrasyon 1,000x) seyreltilir Brefeldin A 4 ul ekle.
    4. (Adım 2.5 gibi),% 0.25 tripsin ile hasat hücreleri seyreltildi (nihai konsantrasyon 10 ug / ml) Fc engelleyici 2.4G2 ve leke, 100 ul% 10 NaN3 ve 0.5 M EDTA çözeltisi (FACS tamponu), blok ile yıkayın adımda 3.2.3-3.2.4 gibi yüzey belirteçleri, CD4, CD8, TCRVα2 ve TCRVβ5 için.
    5. PBS içinde% 4 paraformaldehit çözeltisi hücreleri saptamak ve hücre yüzeyi boyama sonrası 1x permeabilizasyon tamponu 100 ul geçirgenliği. Dikkat! Paraformaldehit alerjik karsinojenik ve toksik değildir.
    6. florokrom-eşlenik TGF-p ve IL-10, karanlıkta 20 dakika için hücrelerin lekelenmesi. Antikor 0.200 ug / 10 6 hücre kullan olduğu zaman dilüe olabilme100 ul PBS ed. 15-renkli akım sitometresi (Şekil 2), TGF-p ve IL-10 nin intraselüler üretimini algılar.
    7. Akım sitometri analizi 11 öncesinde soğuk FACS tamponu ile hücreler üç kez yıkayın.
  4. Ag-spesifik iPSC-Tregs in vivo ısrarında bir.
    1. PÇ9-DL1-DL4-IA B hücreleri üzerinde eş-kültür 8 gün sonra transfer iPSC türevi ön-Tregs VIA adım Thy 1.1 konjenik farelere 3.3.1 (4-6 haftalık) 'de (Thy1.2) anestezi olmadan kuyruk ven enjeksiyon. kuyruk damarından gerçekleştirmeden önce, 5 dakika boyunca bir kızıl ötesi lamba kullanılarak kuyruk damarının dilate. Kuyruk veni dilatasyon sonra, süzgeç fare ve adoptif dip damar yoluyla enjekte edilerek 200 ul PBS içinde yeniden süspansiyona alınmış, 3 x 10 6 hücre yerleştirin.
    2. Altı hafta Treg transferi sonrasında, servikal dislokasyon tarafından takip CO 2 boğulma tarafından fareler euthanize. mil emin olunce nefes değildir. periton boşluğunu çevreleyen iç cildi açığa çıkarmak için geri çekerek hafifçe makas ve forseps kullanarak periton dış kabuğunu kesip tarafından periton boşluğuna açın. dalak ve enjekte Thy 1.1 congenic farelerin periferal lenf düğümleri izole edin.
    3. tek bir hücre süspansiyonu elde etmek üzere mekanik olarak parçalanması ile dalak ve lenf düğümleri hücreleri toplamak. Kırmızı kan hücreleri lize etmek için oda sıcaklığında 5 dakika boyunca ACK lisiz tamponu, 5 ml kuluçkaya bırakılır. Toplamak ve soğuk FACS tamponu, 10 ml kalan splenositlerin veya lenfositlerle yıkayın.
    4. Yıkamanın ardından, seyreltilmiş florokrom-eşlenik anti-Thy 1.2 antikor 100 ul ile adım 3.2.2 ve leke olarak 20 dakika süre ile 4 ° C 'de Fc bloke edici 2.4G2 hücreleri tedavi.
    5. FACS tampon 10 ml hücreleri yıkayın ve sitometrik analizi 11 akmaya devam edin.

Otoimmün Artrit Vivo Olgunlaşma 4. ve Bastırma

  • Adım 2.1 gibi yapıları oluşturmak.
  • Adım 2.2 olarak retroviral transdüksiyon 9 gerçekleştirin.
  • In vivo farklılaşması ve farelerde artirit indüksiyonu in.
    1. OT-II TCR / FoxP3 transduced iPSCs (OT-II-FoxP3 / iPSCs) ayırt sitokinler mFlt-3L varlığında OP9-DL1-DL4-IA b stromal hücreleri üzerinde FoxP3 transduced iPSCs ve DsRed transduced iPSCs ve 2.6 - mIL-7 8 gün boyunca adımlarda 2.1 açıklandığı gibi.
    2. Trypisinize 10 cm plaka ve hücreleri üç çeşit taze ortam 10 ml her biri 10 cm plaka hücrelerin yeniden askıya. taze 10 cm plaka hücreleri ekleyin ve 30 dakika için inkübatöre geri döner. 30 dakika sonra, hücrelerin yüzer toplayın.
    3. hücre kümeleri kaldırmak ve hemasitometre kullanarak saymak için 70 mikron hücre süzgecinden hücreleri geçmektedir. Soğuk PBS 1.5 x 10 7 hücre / ml 'lik bir konsantrasyona kadar hücrelere ayarlamak ve gerektiğinde tekrar filtre. farelere evlatlık hücre transferi kadar buz üzerinde hücreleri tutun. 3.4.1 de tarif edildiği gibi bir kuyruk damarı yoluyla 6 haftalık dişi C57BL / 6 fareleri - 4, üç farklı grup hücre süspansiyonu 200 ul (3 x 10 6 hücre) enjekte
    4. hücre transferi 10 gün sonra, MBSA'ın ug 1 ml şırınga ile kuyruk tabanında Freund tam adjuvanı içinde emülsiyon haline getirilmiş 100 ile fareler enjekte edilir.
    5. 17. günde bir izofluran buharlaştırıcı (IACUC kurallarına göre) kullanarak fareler uyutmak. indüksiyonu için% 5 izofluran ve 1 - - bakım için% 2 4 kullanmaktadır. Sağ diz ekleminde 10 ul PBS içinde 20 ug MBSA ve 100 ug tam OVA ortak sol dizinde ve 10 ul PBS içinde 20 ug MBSA'ın intraartiküler enjeksiyon ile arteritin uyarılması. artrit geliştirmiştir sonra gıda ve gelpack yatak zemin üzerine yerleştirilebilir. 2/5 veya can çekişen, şiddetli kaşeksi ve / veya kalıcı yatma (24 saatlik süresi) Kondüsyon Skoru (BCS), ve şiddet skoru ise 4. skor: Fareler ötenazi edilecek4, eritem ve şiddetli şişme ayak bileği, ayak ve rakam ya da ekstremite ankyloses kapsamaktadır.
  • OT-II TCR / FoxP3 transduced iPSCs karakterizasyonu.
    1. Sabitlenmemiş canlı DsRed + GFP + hücreleri görselleştirmek için bir floresan mikroskop (20X) kullanın.
    2. Her iki Western Blot ile gen entegrasyonu ve ifadesini incelemek ve 11 akım sitometri.
  • Treg gelişimi ve olgunlaşma.
    1. 2, 4, ve 6 hücre transferinden sonra, farelere ötenazi. İlk aşamada CO 2 2 l - ötenazi için, her bir kafeste 1 kullanın. / Dk 5 L - hayvan bilincini kaybetti sonra, 4 CO 2 akış hızını artırır. CO 2 inhalasyon yoluyla fareler Euthanize. dalak izole edin ve periton boşluğunu çevreleyen iç cildi açığa çıkarmak için geri çekerek hafifçe makas ve forseps kullanarak periton dış kabuğunu kesme ve lenf düğümleri boşaltın.
    2. tek bir hücre süspansiyonu f toplayınROM hücre süzgecinden ve% 1 iPSC ortam içinde 1 ml hava ile mekanik arıza ile dalak ve lenf düğümleri. 5 dakika boyunca 400 g'de ortamı ihtiva eden konik tüp santrifüjleyin. kırmızı kan hücrelerinin lize ACK lisiz tamponu, 5 ml hücre pelletini yeniden askıya. Yeniden santrifüj 5 dakika için 1000 rpm'de. Hücre pelet yeniden askıya ve soğuk FACS tamponu ile kalan splenositlerin veya lenfositler yıkayın. adımları 3.4.4 izleyin - 3.4.5 ve flow sitometri yöntemi geçin.
  • Hücre içi boyama.
    1. Gün 50 sonrası meydan, dalak izole ve CO euthanization sonra (adım 4.5.1 gibi) servikal dislokasyon ardından 2 inhalasyon farelerin lenf düğümleri boşaltın.
    2. bir hücre süzgeç ve 1 ml hava ile mekanik arıza ile dalak ve lenf düğümleri tek bir hücre süspansiyonu toplanır. kırmızı kan hücrelerinin lize ACK lisiz tamponu, 5 ml, 5 dakika boyunca oda sıcaklığında splenositlerin inkübe edin. Toplamak ve kalan s yıkayınsoğuk FACS tamponu ile plenocytes veya lenfositler. Yüzey belirteçleri CD4, CD8, CD25 ve TCRVβ5 ile 3.2.4, ama leke - adımlarını 3.2.3 izleyin.
    3. 3.3.7 canlı CD4 + CD25 + hücreleri üzerinde hücre içi sitokin üretimini (TGF-p ve IL-10) iPSC türetilmiş Tregs ve kapı analizi - 3.3.5 de tarif edildiği gibi hücre içi boyama hücreleri düzeltmek için devam edin.
  • dizlerde Ag-spesifik Tregs Sızma ve artrit bastırılması.
    1. 7 gün - adımlar (4.3.6 4.3) - Aşağıdaki 14 sonrası artrit indüksiyon, (IACUC kurallarına göre) CO servikal dislokasyon tarafından takip 2 inhalasyon fareler euthanize. elektrikli kesme makinesi ile diz saç çıkarın ve cerrahi prosedür ile dizlerini tüketim.
    2. künt uç makasla arka bacağında bir kesi yaparak bacak deri kaldırmak ve ayak bileği için uyluk boyunca ve aşağı deriyi kesti. Yavaşça kas maruz bacak ve ayak üstü cilt soyma. Kaldırdikkatle diz eklemini zarar vermeden bacak kas.
      1. sadece pelvik / kalça eklemi üzerinde arka bacak kesin ve keskin diseksiyon makas kullanarak tibia kesti.
    3. 48 saat süreyle% 4 formalin dizlerini sabitleyin. 2.5 M formik asit ile diz kirecini; % 95 etanol içerisinde iki kez yıkayın,% 100 etanol içinde iki kez yıkayın, 3 dakika boyunca ksilen içinde üç kez yıkayın 2 dakika boyunca iyonu giderilmiş suda iki kez yıkayın ve 1 mM EDTA içinde kirecini. 20 dakika boyunca bir alt kaynama sıcaklığı (90 ° C) tedavi edin.
    4. 30 dakika süre ile sabit bir doku soğutun. 4 dakika süreyle 1x PBS ile durulayın ve parafin gömün. su yerinden, ve sonra balmumu ile sızmak için etanol banyoları bir dizi dokuları dehydrate. Sonra mum bloklar halinde sızmış doku embed. boyama için dikey ve yatay bölümlendirilmeleri gerçekleştirin. bir kayar mikrotom ile 4 um kesitler hazırlamak.
    5. deparaffi standart prosedürlerinden sonra bölümlerde immunofluorescent boyama gerçekleştirinzasyon ve rehidrasyon ksilen ve etanol 12 kullanılmıştır.
    6. Ag alma sonra 3 dakika boyunca% 3 hidrojen peroksit çözeltisinin yeterli bir miktarı slayt daldırarak bir endojen peroksidaz etkinliğini bloke eder. 60 dakika boyunca nemlendirilmiş bir odada, oda sıcaklığında PBS içinde% 3 BSA içinde spesifik olmayan bağlanma için blok kayar.
    7. bloke çözeltisi içinde 1: 100 seyreltilmiş florokrom-eşlenik TCRVβ5 antikoru 200 ul Leke bölümleri. 75, oda sıcaklığında 2 saat boyunca inkübe -% 100 nemli bir bölmede, ve 5 dakika boyunca 1 x PBS içinde 5 kez yıkayın.
    8. DAPI içeren bir antifade bir reaktif ile nükleer boyama için slaytlar karşıt. Tüm lamel kaplı olduğunu belli hale lamel seyreltilmiş DAPI boyama çözeltisi (1x PBS içinde 300 nM) yaklaşık 300 ul ekleyin. Bir floresan mikroskobu (Şekil 3) altında analize kadar 4 ° C'de karanlıkta slaytlar saklayın.
  • Artrit bastırma tahlil
    1. bir temel kurmak için çevirmeli ayar kumpas kullanarak artrit indüksiyon öncesi farelerin iki diz şişmesi ölçün.
    2. artrit indüksiyon ve Treg transferi için - adımlar (4.3.6 4.3) izleyin. Çevirmeli ayar kumpas sonrası Treg transferi ile fare dizler ölçün.
    3. Diz çapı oranında artış hesaplayın: Yüzde Artış = (Diz çapı günde 1 - 0. günde Diz çapı) / 0. günde Diz çapı.
  • Histoloji dizlerde eklem harabiyeti ve inflamatuar hücre infiltrasyonu Ölçümü (Şekil 4).
    1. 7 gün sonra artrit indüklendikten, daha önce tarif edildiği gibi fare euthanize ve cerrahi prosedür ile diz tüketim. 4.7.2 - adımı 4.7.1 bakın.
    2. % 4 formalin dizlerini Fix EDTA kirecini ve parafin içine gömmek. adım 4.7.3 bakın
    3. % 10 formalin içinde düzeltmek, hem de dizlerini kaldırmak ve Formical-4 calcify. 4 mikron Parafin, bölüm dokuları gömmek ve hematoxyl ile lekeve eozin (H & E) ya da (aşama 4.7.7 gibi) Safranin O boyama ve bir mikroskop altında gözleyin.
    4. yarı kantitatif puanlama sistemi ile kemik erozyonu değerlendirmek için H & E boyama kullanın (0: hayır erozyonlar; 4: genişletilmiş erozyonlar ve kemik yıkımını). proteoglikan kaybı değerlendirmek ve yarı-kantitatif puanlama sistemi ile puan Safranin O boyama kullanın (0: proteoglikan kaybı; 3: proteoglikan için boyama tam kaybı).
      1. H & E lekeli slaytlar üzerinde inflamatuar hücre infiltrasyonu gol yarı kantitatif puanlama sistemini kullanın (: hayır hücre infiltrasyonu; 4: 0 hücre infiltrasyonu abounded). bir kör bir şekilde iki diz inceleyerek puanları değerlendirin.
  • Yüksek çözünürlüklü Mikro bilgisayarlı Tomografi (mikro-CT) Sistemi ile Dizler Kemik Kaybının 5. Ölçüm

    1. gün 10 sonrası artrit indüksiyon,% 2 izofluran ile Fareler uyuşturan ve görüntüleme için hazırlar.
    2. Pozisyon mikrofonodasında yukarı bakacak şekilde dizlerinin e.
    3. Farelerin dizlerinin çevresindeki kemik mimarisinin in vivo görüntüleme elde etmek için yüksek çözünürlüklü bir mikro-BT sistemini kullanın.
    4. 55 kv 10.5 mikron voksel boyutu, 145 uA 200 msn entegrasyon süresi, 211 resim: aşağıdaki parametrelerle fare diz eklemleri de dahil olmak üzere bir 2.2 mm uzunluğunda olan mikro-BT taramaları, gerçekleştirin.
    5. Daha fazla görüntü işleme (volume rendering ve transformasyon) (Şekil 5) sonra ithalat mikro-BT görüntüleri ve yakalama frontal düzlem görüntüler.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    28. günde, burada gösterildiği gibi, Ag-spesifik Tregs esas CD3 ve Ag-spesifik TCR iki T hücre işaretçileri olarak ifade edilmiştir. CD3 + TCRVβ5 + popülasyonu CD4 ifade edilmiştir. Tipik olarak, doğal olarak T regs (nTregs üretme) meydana gelen ve ektopik Foxp3 T hücrelerinde yüksek seviyelerde ifade edilmiştir, aynı zamanda CD25, CD127, ve CTLA-4 olarak ifade CD3 + TCRVβ5 + CD4 + hücrelerinin, çoğu. Akış sitometrisi (Şekil 1) ile analiz, hücre içi boyama ile saptandığı gibi iPSC türetilmiş hücrelerde FoxP3 ifadesi Çentik ligand ile in vitro uyarılması sonra bile uzun süreli devam etti. IPSC-Tregs potansiyeli bastırıcı faaliyetleri vardı gösteren Ag-darbeli splenositler (Şekil 2) ile in vitro olarak uyarıldı Buna ek olarak, Ag-spesifik iPSC-Tregs, TGF-p ve IL-10 olarak bastırıcı sitokinlerin üretti. Floresan mikroskopi ortaya Daha fazla FoxP3 + hücrelerinde mevcut olduğunu OVA ile muamele edilmiş, PBS ile tedavi edilen diz daha; DsRed + vektör transduced iPSCs alan farelerde diz mevcut hiçbir FoxP3 + hücreleri vardı. Çok daha fazla CD4 + MIDR-Foxp3 daha MIDR-TCR-Foxp3 ile transduse iPSCs alan farelerin diz sunulan FoxP3 + TCRVβ5 + hücreleri (Şekil 3). Bu gözlemler Ag-spesifik iPSC-Treg'ler alıcı farelere evlatlık transferinden sonra AIA diz göç olduğunu göstermektedir. Transfer iPSC türetilmiş hücreler hemen hemen OVA mevcut olduğunda şişmesi enflamatuar diz azalmış ancak murin modelde MBSA enjekte edildi kontrol diz (Şekil 4) üzerinde herhangi bir etki; yüksek çözünürlüklü mikro BT sistemi (Şekil 5) ile görselleştirildi hücre transferi diz düşük kemik kaybı.

    tp_upload / 54720 / 54720fig1.jpg "/>
    Şekil 1:. Ag-spesifik IPSC-Tregs farklılaşması Murin iPSCs bir yapı ile transduse edilmiştir: MIDR-TCRα-2A-TCRβ-2A-FoxP3 OVA'ya özel TCR ve Foxp3 genlerini ihtiva etmektedir. Gen transdüksiyona uğramış hücreler (DsRed +) mFlt3L ve mIL-7 varlığında PÇ9-DL1-DL4-IA B hücreleri üzerinde birlikte kültürlenmiştir. (A) T-morfolojisi 0, 7, 14 ve hücre farklılaşmasını gruplar gruplar 28. günde, CD3'e iPSC türetilmiş hücrelerinin protein ifadesi için 22 (B), akış sitometrik analizi + TCRVβ5 + tuşu (R1) halinde işlenir ve CD4 ve CD8 ekspresyonu için analiz, CD25, CD127, CTLA-ile olan hücreler CD4 + CD8 olarak kapılı hücreler için gösterilen 4, ve FoxP3 - hücrelerinden (R2). (koyu çizgiler; gölgeli alanlar izotip kontrolleri belirtiniz) bir larg görmek için buraya tıklayınızBu rakamın er sürümü.

    şekil 2
    Şekil 2: I in Vitro Farklılaşmış Ag-spesifik Tregs Fonksiyonel Analizi Murine iPSC-Tregs splenositler tarafından uyarıldı. (APC'ler T gruplar gruplar / APC '= 1: 4) ve OVA 323-339 peptidi ile bombardıman edilmiş. Hücre içi sitokin üretimi (TGF-β ve IL-10) sitometri canlı CD4 + CD25 + hücreler üzerinde yolluk sonra akış ile analiz edilmiştir. (Koyu çizgiler; gölgeli alanlar izotip kontrolleri belirtiniz) bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

    Şekil 3,
    Şekil 3:g spesifik diz eklemlerine iPSC-Tregs sızmak. Ag-spesifik iPSC-Tregs adoptif C57BL / 6 farelerine transfer edilmiştir. Kısa bir süre artrit indüksiyon (gün 7-14) sonra, dizler çıkarıldı ve immünohistolojisi lekeli (ölçek çubukları: 20 mikron). OVA-spesifik iPSC-Tregs alan fareler dizlerde TCRVβ5 + hücreler çok sayıda var. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

    Şekil 4,
    Şekil 4: Ag-spesifik iPSC-Tregs Kabul edilmiş Transferi Farelerde AIA ameliorates Fare iPSCs retroviral yapı MIDR, MIDR-FoxP3 veya MIDR-TCR-FoxP3 ve vardı OP9-DL1 üzerinde ko-kültür / DL4 / transduced. IA b hücreleri. 7. günde, gen transdüksiyona uğramış hücreler (3 x 10 6 / fare) olduğu birdoptively iki hafta hücre transferinden sonra AIA ile indüklenmiştir dişi C57BL / 6 farelerine aktarılır. Günde, aşağıdaki artrit indüklendikten üzerinde, artrit şiddeti. Diz çapının ölçümü ile gözlenmiş diz çapı (AC) Yüzde artış. Diz çapındaki artış bir kör bir şekilde iki diz incelenerek değerlendirilmiştir gün 0. Artrit puanı enjeksiyon önce her fare için enjeksiyon öncesi diz çapına göre hesaplanmıştır; Her diz puan atandı (0: hiçbir görünür şişlik veya renk değişikliği; 1: veya renk olmadan şişme görülebilir; 2: renk ile şişme orta; 3: Şiddetli renk ile şişmesi). Her grupta beş farenin kullanıldı ve Veriler, üç bağımsız deneyi temsil etmektedir. Veriler ortalama ± SD olarak temsil edilir. (D) ortalama beş fareden iki diz için günde 7 gol. Veriler, üç bağımsız deneyin göre (± SD ortalaması olarak ifade edilmiştir ** p <0.01, *** p <0.001, iki yönlü ANOVA). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

    Şekil 5,
    Şekil 5:. OVA enjekte edilen dizin için iPSC-Tregs geçirme Ag-spesifik ve kemik erimesini azaltmak iPSC-Tregs adoptif C57BL / 6 farelerine transfer edilmiştir. 21 gün sonrası artrit indüksiyon içinde, fareler anestezi ve fare dizlerinin çevresindeki kemik mimarisi mikro-BT sistemi tarafından görüntülendi. Verilen farelerde OT-II TCR / FoxP3 gen transdüse vektör kalıt iPSCs alan, kontrol fareleri ile karşılaştırıldığında iPSC-Tregs kemik kaybının belirgin bir azalma sergileyen, murin. (A) taramaları, 2.2 mm uzunluğunda ile yapıldı ve görüntüler sonra ele geçirildi daha fazla görüntü işleme (volume rendering ve dönüşümü;Ölçek çubukları:. (ölçek çubukları 1 mm) (B) diz eklemi çevresinde kemik hacmi mikro-BT görüntüleri üç boyutlu rekonstrüksiyon kullanarak değerlendirildi ve ilgi hacmi içindeki kemik hacmi hesaplanmıştır. 1 mm) için tıklayınız Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Bu protokol, kritik bir adımdır TCR / FoxP3 gen transduced iPSCs in vitro farklılaştırma olduğunu. In vitro Notch sinyal T hücre soyu doğru gelişimini uyarmaktadır. CD4 + FoxP3 + Tregs içine iPSCs ayırt etmek, biz OP9-DL1 / DL4 / IA b hücreleri, son derece hızlı MHC II (IA b) molekülleri kullanılır. IPSCs çoğu CD4 + hücreleri içinde farklılık gösterir. Ancak, yüzey TCR ifade sonrasında, pek çok farklı ön T hücreleri ayırt etmek ve en sonunda ölmek yeteneğini kaybeder. Bunun bir sonucu olarak, iPSC türetilmiş fonksiyonel Tregs hücre sayısı önemli ölçüde, in vitro farklılaşma dört hafta sonra azaltır. Bunu önlemek için, IL-2 ilave o zaman noktalarında hücre sağkalım artırabilir. Alternatif bir yöntem, farelere, bir hafta süreyle in vitro farklılaşan adres önceden Tregs aktarmak için Ag-spesifik ön-Tregs olgunlaşmasını ve hayatta kalma olan sürücü. Bu ön-Treg'ler co yapabilirsinizntinue farklılaştırılması ve üç hafta için in vivo olgunlaşma. Bu yöntemi kullanarak, fonksiyonel bir Ag-spesifik regülatör T popülasyon nTregs üretme gibi olan ve murin modelinde otoimmün artrit bastırma kabiliyetine sahiptir iPSCs, elde edilebilir.

    Ag-spesifik iPSC-Tregs in vivo gelişimi etkinliğini artırmak için, farklı bileşikler (örneğin, retinoik asit, gelectin) 13,14 veya baskılayıcı sitokinler (örneğin, TGF-oc β, IL-10) adoptif transfer edildikten sonra kullanılabilir ön Tregs. Hücre yaşamını artan yanı sıra, bu kombine yaklaşım FoxP3 ifade 14,15 korumak ve Ag-spesifik iPSC-Tregs kalitesini artırabilirsiniz.

    In vivo Treg gelişimi için ortaya çıkabilecek potansiyel bir sorun enfeksiyonları veya sonradan kilo kaybı sırasında komplikasyonlara sebep genel immünsupresyon olduğunu. Vi gelişen Ag-spesifik Tregs çok sayıdavo enfeksiyonları kötüleştirebilir. Bu durumda, bir intihar geni, uyarılabilir kaspaz 9 (ICasp9) 15,16, TCR / FoxP3 vektörüne dahil edilebilir. Bu yaklaşım, bu olası sorunu aşacağız kök hücre kaynaklı Tregs nesil, "kapatmak" için ajan (AP1903) dimerize bir bioinert küçük molekülün enjeksiyonu ile kök hücre kaynaklı Tregs kaldırılmasını sağlar.

    Bir öz-antijen bağımsız bir otoimmün sistemindeki bir bozukluktan şikayetçi ana bağışıklık sistemi tarafından tanınan tipik bir proteindir. Bu kendi kendine Ag bağışıklık sisteminin hedefidir ve ilişkili T hücreleri silinmez. kendini Ag spesifik Tregs üretmek için, TCR iletimi kullanımı iyi bir seçimdir. Bir öz-antijen (örneğin, ısı şoku proteini) özel bir TCR periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC), olgun CD4 + CD25 + Tregs dönüştürülebilen olabilir ve bu yaklaşım, klinik denemelerde kullanılmıştır. Seçenek olarak ise, DES, Hücre kökenli Tregs kök Notch sinyalizasyon ile gen kendini Ag iletimini Foxp3 belirli TCR ve stimülasyon kullanarak bu protokolü açıklanan şekilde, kendini Ag özgü Treg'ler olabilir.

    Işlenmiş Tregs kullanılarak oto-bağışıklık hastalıklarında hücre bazlı terapiler 17 yararlı olabilir. T hücrelerinin TCR iletimi, güvenli, uygun ve klinik çalışmalarda kullanılabilir nitelikte olmasına rağmen, bağlı sağlıklı dokuların 18 ile çapraz reaktivitesi nedeniyle otoimmüniteye güvenlikle ilgili önemli hala vardır. Ayrıca, mevcut yöntemlerle, genetiği değiştirilmiş Treg'ler genellikle in vivo 19 kısa süreli kalıcılığı vardır. Seçenek olarak ise, monoklonal Ag-spesifik Tregs çok sayıda geliştirmek için gelecek vaat eden bir kaynak kök hücreler olduğunu. Embriyonik kök hücreler (EKH) en iyi pluripotensini ve kendini yenileme var, ama hastaların onları elde etmek mümkün değildir. Kolayca periferal kanından izole olmasına rağmen, hematopoietik kök hücreler (HSC), çok olangüçlü kök hücreleri ve EKH 20 benzer şekilde, hücre kültürü içinde genişletilebilir. Mevcut iPSC teknolojisi, farklı transkripsiyon faktörlerinin transdüksiyonu ile hastaların somatik hücrelerden PSC daha verimli bir kuşağa ilerlemiştir. metodolojik iyileştirmeler bir dizi maksimum böyle bağışıklayıcı ve tümorijenisite gibi potansiyel tehlikeleri azaltarak iPSCs üretmek için son yıllarda geliştirilmiştir. EKH ile karşılaştırıldığında, iPSCs aynı pluripotensini ve kendini yenileme vardır. Bunun bir sonucu olarak, iPSC teknolojisi hasta ve / veya hastalığa spesifik PSC'ler geliştirilmesinde avantaj sağlayabilir. IPSCs kullanımı Ag-spesifik Tregs otoimmün hastalıklar 10,11 için hücreye dayalı tedavilerin alan ilerleyebilir geliştirmektir.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Acknowledgments

    Bu proje Sağlık (R01AI121180, R21AI109239 ve K18CA151798), American Diabetes Association National Institutes hibe altında, kısmen, finanse edildi (1-16-IBS-281) ve Sağlık Pennsylvania Bölümü (Tütün Yerleşim FONLAR) JS

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    C57BL/6j mice Jackson Laboratory 664
    B6.129S7 Rag1tm1Mom/J Jackson Laboratory 2216
    Anti-CD3 (2C11) antibody BD Pharmingen 553058
    Anti-CD28 (37.51) antibody BD Pharmingen 553295
    Anti-CD4 (GK1.5) antibody Biolegend 100417
    Anti-CD8 (53–6.7) antibody Biolegend 100714
    Anti-CD25 (3C7) antibody Biolegend 101912
    Anti-TCR-β (H57597) antibody Biolegend 109220
    Anti-IL10 Biolegend 505010
    Anti-TGFβ Biolegend 141402
    DMEM Invitrogen ABCD1234
    α-MEM Invitrogen A10490-01
    FBS Hyclone SH3007.01
    Brefeldin A Sigma B7651
    Polybrene Sigma 107689
    Genejammer Integrated science 204130
    ACK Lysis buffer Lonza 10-548E
    mFlt-3L peprotech 250-31L
    mIL-7 peprotech 217-17
    Gelatin Sigma G9391
    Paraformaldehyde Sigma P6148-500G Caution: Allergenic, Carcenogenic, Toxic
    Permeabilization buffer Biolegend 421002
    mBSA Sigma A7906
    Ova albumin Avantor 0440-01
    CFA Difco 2017014
    Tailveiner restrainer Braintree scientific RTV 150-STD

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Firestein, G. S. Evolving concepts of rheumatoid arthritis. Nature. 423, 356-361 (2003).
    2. Ferraro, A., et al. Interindividual variation in human T regulatory cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, E1111-E1120 (2014).
    3. Tang, Q., et al. In vitro-expanded antigen-specific regulatory T cells suppress autoimmune diabetes. J Exp Med. 199, 1455-1465 (2004).
    4. van Herwijnen, M. J., et al. Regulatory T cells that recognize a ubiquitous stress-inducible self-antigen are long-lived suppressors of autoimmune arthritis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 14134-14139 (2012).
    5. Wright, G. P., et al. Adoptive therapy with redirected primary regulatory T cells results in antigen-specific suppression of arthritis. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 19078-19083 (2009).
    6. Schmitt, T. M., et al. Induction of T cell development and establishment of T cell competence from embryonic stem cells differentiated in vitro. Nat Immunol. 5, 410-417 (2004).
    7. La Motte-Mohs, R. N., Herer, E., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T-cell development from human cord blood hematopoietic stem cells by Delta-like 1 in vitro. Blood. 105, 1431-1439 (2005).
    8. Lei, F., Haque, R., Weiler, L., Vrana, K. E., Song, J. T lineage differentiation from induced pluripotent stem cells. Cell Immunol. 260, 1-5 (2009).
    9. Lei, F., Haque, R., Xiong, X., Song, J. Directed differentiation of induced pluripotent stem cells towards T lymphocytes. J Vis Exp. e3986 (2012).
    10. Lei, F., et al. In vivo programming of tumor antigen-specific T lymphocytes from pluripotent stem cells to promote cancer immunosurveillance. Cancer Res. 71, 4742-4747 (2011).
    11. Haque, R., et al. Programming of regulatory T cells from pluripotent stem cells and prevention of autoimmunity. J Immunol. 189, 1228-1236 (2012).
    12. Chi, V., Chandy, K. G. Immunohistochemistry: paraffin sections using the Vectastain ABC kit from vector labs. J Vis Exp. (2007).
    13. Lu, L., et al. Critical role of all-trans retinoic acid in stabilizing human natural regulatory T cells under inflammatory conditions. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, E3432-E3440 (2014).
    14. Wu, C., et al. Galectin-9-CD44 interaction enhances stability and function of adaptive regulatory T cells. Immunity. 41, 270-282 (2014).
    15. Di Stasi, A., et al. Inducible apoptosis as a safety switch for adoptive cell therapy. N Engl J Med. 365, 1673-1683 (2011).
    16. Ramos, C. A., et al. An inducible caspase 9 suicide gene to improve the safety of mesenchymal stromal cell therapies. Stem Cells. 28, 1107-1115 (2010).
    17. Haque, R., Lei, F., Xiong, X., Wu, Y., Song, J. FoxP3 and Bcl-xL cooperatively promote regulatory T cell persistence and prevention of arthritis development. Arthritis Res Ther. 12, R66 (2010).
    18. van Loenen, M. M., et al. Mixed T cell receptor dimers harbor potentially harmful neoreactivity. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 10972-10977 (2010).
    19. Kim, Y. C., et al. Engineered antigen-specific human regulatory T cells: immunosuppression of FVIII-specific T- and B-cell responses. Blood. 125, 1107-1115 (2015).
    20. Himburg, H. A., et al. Pleiotrophin regulates the expansion and regeneration of hematopoietic stem cells. Nat Med. 16, 475-482 (2010).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics