쥐 간 문부 클램프 모델을 사용하여 직접 분절 인트라 간 납품 방법

Medicine
 

Summary

고유 한 쥐의 간 문부 클램프 모델은 허혈 - 재관류 손상을 완화의 약물 분자의 영향을 연구하기 위해 개발되었다. 이 모델은 직접 간 전송을 허용, 포털 정맥의 지점을 통해 허혈성 간 세그먼트 포털 공급의 직접 삽관이 포함되어 있습니다.

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Beal, E. W., Dumond, C., Kim, J. L., Mumtaz, K., Hayes Jr., D., Washburn, K., Whitson, B. A., Black, S. M. Method of Direct Segmental Intra-hepatic Delivery Using a Rat Liver Hilar Clamp Model. J. Vis. Exp. (122), e54729, doi:10.3791/54729 (2017).

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Abstract

유입 폐색, 간 이식 주요 간 수술, 따뜻한 국소 빈혈의 기간 및 허혈 / 재관류 (I / R) 무수히 많은 부정적인 결과와 부상으로 이어지는 재관류의 기간을 필요로한다. 간 이식 향하는 한계 기관의 잠재적 인 I / R 손상은 감소 장기 가동률에 차 현재 기증자 부족에 기여한다. 중요한 필요가 이식에서 이식 기능에 미치는 영향을 중재하기 위해 간 I / R 부상을 탐험하기 위해 존재한다. 쥐의 간 문부 클램프 모델 간 I / R 손상에 다른 분자의 영향을 조사하기 위해 사용된다. 모델에 따라, 이들 분자는 주변 장간막 정맥 내로 흡입, 경막 외 주입, 복강 내 주사, 정맥 내 투여 또는 주사하여 전달 하였다. 쥐의 간 문부 클램프 모델은 I / R 손상을 완화의 약물 분자의 영향을 연구에 사용하기 위해 개발되었다. describ쥐 간 문부 클램프 용 ED 모델 직접 분절 간 전송을 허용 간문맥의 곁가지를 통해 허혈성 간장 세그먼트 포털 공급 직접 캐 뉼러를 포함한다. 우리의 접근 방식은 연구 대상 물질이 주입되는 시간 동안 60 분 동안 왼쪽 측면과 중앙 로브에 허혈을 유도하는 것입니다. 이 경우, 슈퍼 옥사이드 디스 뮤 타제 - 페 길화는 (PEG-SOD), 자유 라디칼 스 캐빈 저는, 허혈성 세그먼트에 직접 주입된다. 실험이 시리즈는 PEG-SOD의 주입이 간 I / R 손상에 대한 보호는 것을 보여줍니다. 이 방법의 이점은 전신 부작용의 감소 및 분포의 용적 감소와 그에 허혈성 세그먼트로 분자의 직접적인 주입을 포함한다.

Introduction

유입 폐색, 간 이식 주요 간 수술, 따뜻한 국소 빈혈의 기간 및 허혈 / 재관류 (I / R) 부상 1에 이르는 재관류의 기간을 필요로한다. 간에서 I / R 손상의 결과는 광범위하게 1, 2, 3 설명하고있다. I의 결과는 / 문헌에 상세히 R 부상을 포함한다 : 반응성 산소 종의 생성을, 호중구 활성화, 쿠퍼 세포, 내피 세포, 수신자와 같은 수용체의 헴 옥 시게나 제 시스템의 활성화 및 활성화 포함한 염증성 캐스케이드의 개시 엔도 텔린과 산화 질소, 핵 인자 κB의 활성화 및 전 염증성 사이토 카인 및 부착 분자의 합성 1, 2, 3 사이의 불균형의 촉진. 이 염증성 이벤트 리터 수도세포 사멸, 괴사, 장기 기능 장애 및 궁극적으로 장기 부전 3 EAD.

나는 / 간 이식 향하는 기관의 R 손상은 초기 이식 손실로 이어질과 한계 장기 부상 3에 더 취약으로 현재 기증자 부족에 기여 할 수 있습니다. 2015 5에서 수행 된 미국 4에서 간 이식 대기 목록에 15,226 잠재적 인 수신자 만 5950 간 이식은 현재이 있습니다. 때문에 장기 가용성이 극단적 인 제한으로 연구 간 I / R 손상이 이식 기능과 기관의 활용을 최적화하기 위해 필요한 탐구.

간 I / R 부상을 연구하는 데 사용 동물 모델 쥐 문부 클램프 모델과 쥐의 간 이식 모델을 포함한다. 현재 사용중인 쥐 문부 클램프 다양한 모델이있다. 가장 일반적인 하나 인 문맥, 간동맥 및 담즙 뒤CT 왼쪽 측면 및 중간 엽이 미세 수술 클립 6, 7, 8, 9, 10, 11, 60 분의 재관류 30 다음 최소 6, 7, 10, 13, 14 및 60 동안 12를 이용하여 고정되어 공급 H 7, 9, 10, 13 (24), (14)가 허용된다. 래트 간 왼쪽 측면 및 중간 엽이 간 실질 (9)의 약 70 %를 포함한다. 허혈 양상을 연구하기위한 일부 프로토콜은 문부 혈관의 간헐적 인 클램핑을 포함또는 폐문 용기 (9), (13)를 클램핑에 의해 유도 된 허혈성 장기간에 뒷다리 종래. 문헌에 기술 된 몇 가지 수정이있다. 첫 번째는 좌측 측면 및 중간 엽 공급 문맥과 간동맥 클램프 있지만 담관 (15)를 제외한다. 제 2 변형은 종래 디비전 16, 17, 18, 19, 20 간문맥, 간동맥 및 담관 클램핑하여 총 간 허혈을 유도하는 것이다. 제 3 변형은 30~60 분 8 오른쪽 로브의 폐문 혈관 클램프를 포함한다. 추가의 변형, 2113에 손상을 유도하기 위해 하나 개 뒷다리의 관다발 클램핑 포함 방법이도 1a-D에 도시되어있다.

쥐 간 문부 클램프 모델 간 I / R에 다른 분자 및 화합물의 효과를 연구하기 위해 사용되었다. 주연 장간막 정맥 (8)로 흡입 (11), 경막 외 주입 (12), 복강 내 주사 17, 18, 21, 22, 정맥 내 투여 10, 14, 15, 19, 23, 24 또는 주입을 사용하여 전달 된 이들 분자 모델에 사용 따라 .

이 보고서에 포함하여에 설명 된 쥐의 간 문부 클램프의 모델연구중인 약물 물질의 직접 분절 간 전송을 허용 문맥의 곁가지를 통해 허혈성 세그먼트 포털 공급 (도 2), 직접 삽관을 말이지. 우리의 방법은이 경우의 연구 대상 물질의 주입, 페 길화 슈퍼 옥사이드 디스 뮤타 아제, 자유 라디칼 스 캐빈 저 (25), 허혈성 세그먼트에 직접 주입하는 동안, 60 분 동안 왼쪽 측면 및 중간 엽에서 허혈을 유도하는 . 혈액 샘플은 허혈 유도 전에 및 120 분 후 재관류에서 촬영된다. 이 시점에서, 쥐가 희생되고 샘플은 왼쪽과 중간 엽에서 가져옵니다. 또한, 샘플은 내부 제어 역할을 오른쪽 로브에서 촬영된다.

이 방법에 많은 장점이 있습니다. 무엇보다도, 연구중인 약물 물질 직접 허혈성 부분에 주입 될 수있는 볼륨 OF 분포는 전신 순환에 주입 분배의 부피 또는 복강에 비해 상당히 낮다. 또한,이 방법은 감소, 전신 부작용의 가능성을 배제하지 않는다.

Protocol

모든 절차는 기관 동물 관리 및 동물 애호 실험실 동물의 관리 및 사용 (IACUC)의 국가 연구위원회 설명서의 지침에 따라 수행되었다 오하이오 주립 대학 IACUC위원회의 승인을 겪었다.

1. 초기 셋업

  1. 셋업 수술 현미경 및 운영 극장 (그림 3, 그림 4). 마취를 유지하고 생체 신호를 모니터링하는 등 모든 장비를 켭니다. 전기 수술 장치와 온난화 패드를 켭니다. 수술대 근처 주입 펌프를 배치합니다.
    1. 마취 주사기 흡입 (분자량 184.5)에 대해 액체 10 mL의 이소 플루 란을 작성하고, 마취 장치에 배치.
    2. 셋업 혈액 샘플이 처리 될 원심 근처 200 ㎖의 수술대에 가까운 액체 질소 용기 다른.
    3. 포스수술기구, 4-0 및 7-0 꼰 실크 봉합사 멸균 면봉, 4 × 4 부직포 스폰지, 5 ㎖ 주사기와 수술대 근처 27 게이지 인슐린 주사기 ition.
  2. 이소 플루 챔버를 준비 충분한 이소 플루 란 마취를 유도 전달 시스템에 주입되도록한다.

마취 2. 유도

  1. 다음과 같은 개인 보호 장비 (PPE)에 넣어 쥐를 취급하기 전에 : 수술 용 마스크, 수술 용 장갑, 일회용 가운.
  2. 쥐 무게와 무게를 기록한다.
    참고 : 스프 라그 돌리 쥐가 사용되어야한다.
  3. 마취 챔버에서 쥐를 놓고 이소 플루 란과 산소를 ​​켭니다. 이소 플루 챔버를 사용하여 마취를 유도한다.
  4. 청소기 노출 (그림 5)를 허용하는 전기 머리 깎기를 사용하여 동물의 복부 머리를 클립.
  5. additio의 이소 플루 란 챔버에서 동물 다시 배치최종 일분. 마취의 깊이를 확인하기 위해 발가락 핀치를 수행합니다.

3. 지원 절차

  1. 동물의 코 콘에서 코와 온난화 패드에 구속 또는 테이프로 고정 된 사지를 가진 쥐를 놓습니다.
  2. 이상 250g 무게 % 동물 200 내지 250g 무게 4의 동물에 대해 3.6 %로 마취로 마취 전달 시스템 노우즈 콘 및 이소 플루 란 마취를 이용하여 계속. 발가락 핀치와 피부 핀치를 수행하여 마취의 깊이를 확인합니다.
  3. 예리한 가위 (도 6)를 사용하여 피부를 통해 칼 모양하는 치골에서 중심선 복부 절개를.
  4. 칼 모양의 방광이나 장 손상되지 않도록 복부 돌보는를 입력 치골에서 원격 교육 알바를 따라 복막에 절개를합니다. 간은 또한 전방으로 칼 모양의 과정 가까운 복막에 스틱으로 이전이 아칸소에서 복벽을 절개에 릴리스되도록개.
  5. 피부를 통해 가로 절개와 간 우엽의 열등한 국경의 수준에서 복막을 확인합니다.
  6. 이상 250g 무게 동물을위한 200 % 사이 250g 2 무게 동물 1.6 %로 마취를 줄이십시오.
  7. 곡선 모기 클램프를 사용하여 칼 모양 후퇴 프로세스.
  8. 중심선으로부터 멀리 떨어져 가능한 리브 당기는 찾는 리브 견인기 (도 7). 횡격막 낫 모양, 그리고 위의 인대를 잘라. 적신 멸균 면봉을 사용하여 간을 올립니다.
  9. 간이에 접근하기 위해 추가 인대 필요 잘라. 식염수에 적신 거즈 (그림 7)과 내장 회전을 수행합니다.
  10. 날카 롭거나 무딘 절개를 사용하여 포털 폐문 위에 놓여 느슨한 결합 조직을 제거합니다. 포털 정맥의 길이를 덮는 느슨한 결합 조직을 제거합니다.
  11. 느슨한 결합 t을 밀어 집게를 사용하여창을 왼쪽 포털 정맥, 동맥 및 담즙 덕트에 문제 후방 및 4-0 포츠 봉합을 배치하지만 (그림 8) 아래 식은 죽 먹기가 없습니다.
  12. 우측 신장의 약 수준으로 제공 포털 정맥에 후방 분기를 덮는 느슨한 결합 조직을 취소합니다. 이 정맥 삽관에 사용됩니다.
  13. 인슐린 주사기 (도 9)과 대정맥 (IVC)에서 혈액 0.5ml를 그리기. 12 분 동안 135 XG에 작은 바이알 원심 혈액 0.5 mL로 놓는다. 혈청을 그리는 시도합니다.
    1. 135 × g으로 3 분 - 뚜렷한 선 적혈구 혈청 사이 알 수없는 경우, 추가로 2 원심 분리하려고. 알라닌 - 아미노 전이 효소 (ALT)에 대한 유리 병에서 혈청과 장소를 그립니다. 스냅 액체 질소에 직접 배치하여이 표본을 동결.
  14. 정맥에 사용됩니다 7-0 봉합과 정맥에 가까운 장소의 두 조각을 잘라기. 내측까지 가능한이 혈관 주변의 제 7-0 루프를 놓는다. 이 루프를 묶은 곡선 모기 클램프 (도 10)를 사용하여 후퇴 사용. 포털 정맥과의 교차점 근처에 삽관에 사용되는 하나 개의 넥타이를 배치됩니다 정맥에 두 번째 7-0 루프를 놓고, 그러나 아래 식은 죽 먹기가 없습니다.
  15. 시약 3 ㎖와 함께 5 ㎖ 주사기와 주입 펌프를 준비한다. 프라임 튜브.
  16. 미세 수술 클램프를 사용하여 말초 포털 정맥을 클램프.
    참고 : 정맥이 삽관을 위해 절개 할 때 출혈을 줄일 수 있습니다.
  17. 7-0 체류 봉합 작은 미세 수술 가위를 사용하여 문맥과의 교점 사이의 정맥에 0.5 mm 구멍을 잘라. 왼쪽 포털 정맥 시스템 (그림 11, 그림 12) cannulate에 27-0 카테터를 사용합니다. 왼쪽 및 오른쪽 포털 정맥의 분기점을지나 카테터를 삽입합니다.
  18. infus에 의해 정맥의 위치를 ​​확인생리 식염수 1 ㎖를 보내고 그리고 희게하는 간 왼쪽 측면 및 중간 엽위한 시계. 수동으로 카테터 오른쪽 포털 정맥의 이륙 과거는 아니지만 중간 엽를 공급 포털 정맥의 이륙을 넘어 확인합니다.
  19. 포츠 봉합 아래 식은 죽 먹기와 허혈 시간을 시작합니다. 정맥 주위에 7-0 봉합 제자리에 고정 및 말초 문맥에서 클램프를 제거 27-0 카테터를 조입니다.
  20. 주입 펌프를 사용하여 폴리에틸렌 글리콜 - 슈퍼 옥사이드 디스 뮤타 아제 (SOD-PEG, 0.00067 g / ㎖)의 투여를 시작한다. 허혈 시간의 시작에 가능한 한 가깝게 주입을 시작합니다.

4. 모니터링

  1. 주입에 걸쳐 동물의 생체 신호를 모니터링하기 위해 계속합니다. 0.9 % 생리 식염수 2 mL를 15 분에 걸쳐 0.9 % 생리 식염수에 용해 된 PEG-SOD 2 ㎖ (0.00067 g / ㎖)를 제공한다.

5. 재관류

  1. 한 시간의 I의 처음부터 통과 할 수 있도록 허용schemic 시간. 이 따뜻한 허혈 시간의 1 시간이다.
  2. 포츠 봉합사를 제거합니다. 27-0 카테터를 제거합니다. 정맥 주위에 7-0 봉합을 식은 죽 먹기. 시간을합니다. 이 재관류의 시간을 표시합니다.

6. 계속 샘플링

  1. 120 분 후 재관류에 IVC에서 혈액 0.5ml를 그리기. 적혈구 용혈 방지하기 위해 천천히 피를 그립니다. 천천히 유리 병에 피를 똑. 하대 정맥에서 출혈하는 것은 각각의 혈액 무승부 제어되어 있는지 확인합니다.
    1. 출혈이 계속되면 멸균 면봉이나 거즈에서 1cm 섹션 컷에 의해 작은 1cm로 부드러운 압력을 적용합니다.
  2. 12 분 동안 135 XG 원심 분리기. 135 × g으로 3 분 - 충분한 분리가 달성되지 않는 경우, 추가로 2 시도.
  3. ALT 뒷부분 처리 바이알에 혈청의 절반을 놓는다. 스냅 이러한 표본을 동결.

7. 안락사

  1. 쥐가 마취 여전히 동안 IVC와의 컷uperior 베나 카바 (SVC)과 혈액의 흐름, 호흡과 심장 박동을 중지 할 때까지 모니터링 할 수 있습니다.
  2. 다이어프램 절개 및 원형 조리개를 절개하여 복강에 남아 간 접속 부가 결합 조직을 절개하여 간단한 절제술을 수행한다. 복강으로부터 간을 제거한다.
  3. 간 우엽에서 간의 왼쪽과 중간 엽에서 4 개 개의 샘플과 4 개 개의 샘플을 가져 가라. 샘플은 가능한 한 커야과 크기 만 사용할 간 조직의 양에 의해 제한된다. 작은 레이블 유리 병에 이들을 배치하고 액체 질소에 동결 스냅. 조직 아데노신 삼인산 (ADP), 말론 디 알데히드 (MDA)과 글루타치온 (GSH) 나중에 처리를 위해 다음을 사용합니다.

8. 포스트 실험 분석

  1. 진단 키트를 사용하여 글루타치온 (GSH), 말론 디 알데히드 (MDA)와 알라닌 아미노 전이 효소 (ALT) 간 조직의 활동과 혈청 샘플을 확인제조업체의 지침에 따라.
  2. 용해 완충액으로 간 조직을 균질화하고, 브래드 포드 분석법을 이용하여 정량화. 벽개 capase -3- 액틴에 대한 항체를 사용 도데 실 황산나트륨 - 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 및 면역 블롯에 의하여 조직 용 해물을 분석한다. 공개 소프트웨어로 수행 웨스턴 블랏을 정량화.

Representative Results

이 실험은 2 개 군의 N = 3 마리씩을 수행 하였다. 세 쥐 간 15 분에 걸쳐 주입 펌프에 생리 식염수 2 ㎖ (NS) 주사 하였다. 세 쥐 간 15 분에 걸쳐 주입 펌프 페 길화 수퍼 옥사이드 디스 뮤타 아제 (SOD-PEG, 0.00067 g / mL)로 혼합 된 생리 식염수 2 ㎖ (NS) 주사 하였다. 상기 프로토콜에 기재된 바와 같이, 혈액 시료는 미리 폐문 클램프 및 120 분 후 재관류로 촬영 하였다. 재관류 네 간 조직 샘플의 120 분의 완료는 좌측 및 중간 엽 네 간 샘플로부터 찍은 후 또한 래트 간 오른쪽 엽에서 촬영 하였다.

혈청 알라닌 아미노 전이 효소 (ALT)의 사전 폐문 클램프 제어 120 분 후 재관류 (NS) 및 실험 (PEG-SOD) 동물에서 측정 하였다. 제어 ALT 수준 사이에는 유의 한 차이가 있었다 (NS)동물 사전 폐문 클램프 및 120 분 후 재관류시. ALT 제어 레벨 (NS) 및 실험 동물 (PEG-SOD) 120 분 (도 13a) 사이에 큰 차이가 있었다. 티슈 말론 알데히드 (MDA)의 제어부 (NS) 및 실험 (PEG-SOD) 간 좌우 돌출부 모두의 동물에 대해 측정 하였다. 제어 주입 (NS) 실험 주사 (PEG-SOD)와 오른쪽 로브 (비 폐문 클램프)에서 MDA 조직에는 큰 차이를 설명하지 않는다. 제어 분사 좌엽 (포스트 폐문 클램프 재관류) 조직 MDA (NS)의 오른쪽 로브 (비 폐문 클램프) p <0.001보다 상당히 다르다. 좌엽 (포스트 폐문 클램프 및 재관류) 실험 주사 (PEG-SOD) p <0.005 (도 13B)에 비해 제어 주입 (NS)와 조직 MDA 상당히 상이한 레벨을 갖는다. 티슈 글루타티온 (GSH)을 측정 및 제어 주입 (NS)을 가진 티슈 글루타티온 오른쪽 로브 (비 폐문 클램프)이었다ND 실험 주입 (PEG-SOD)는 큰 차이를 설명하지 않는다. 제어 분사 좌엽 (포스트 폐문 클램프 재관류) 조직 GSH (NS)는 제어 주입 (NS) p <0.05 오른쪽 로브 (비 폐문 클램프)보다 상당히 다르다. 좌엽 (포스트 폐문 클램프 및 재관류) 실험 주사 (PEG-SOD) p <0.005 (도 13C) 대 제어 주입 (NS)와 티슈 글루타티온 농도의 유의 한 차이가있다. 웨스턴 블롯은 대조군 동물의 우측 및 좌측 엽을 비교 수행 하였다 보여 증가 카스파 제 -3 폐문 클램프 및 재관류 (도 13D) 후 좌측 엽 절단. 두번째 웨스턴 블롯 제어 및 PEG-SOD (도 13E)로 처리 된 동물의 좌측 엽을 비교 하였다. 이 PEG-SOD로 치료 동물의 간 조직에서 쪼개진 카스파 제 -3 감소하는 방법을 보여줍니다. 농도계는 demonstra을 수행 하였다절단 된 카스파 제 -3 간 조직에서의 레벨이 상당히 대조 동물 (도 13F)의 바로 좌측 엽 비해 증가된다 팅. 생리 식염수 주입 페그 SOD 주입 실험 동물의 좌측 엽 간 조직 및 대조 동물의 좌측 엽 간 조직을 비교할 때, 농도계 동물에 비해 PEG-SOD 처리 동물에서 절단 된 카스파 제 -3을 크게 저하 보여 제어부 (도 13G)로 처리 하였다.

그림 1
그림 1 : 해부학 삽화. 쥐의 간 A. 해부학 그림. 쥐의 간 B. 해부학 그림. 간장의 왼쪽과 중간 엽에 포털 꽃자루가 고정된다. 왼쪽과 중간 엽은 허혈성 있습니다. C. 해부학쥐의 간의 그림입니다. 좌측 엽 포털 척추 경은 클램프된다. 왼쪽 엽은 허혈성입니다. 쥐의 간 D. 해부학 그림. 오른쪽 로브 포털은 척추 경 고정되고 오른쪽 로브 허혈성이다.

그림 2
그림 2 : 해부학 삽화. 포털 쥐의 간 해부학 그림은 정맥 곁가지를 통해 유관. 간 좌측 및 중간 엽 포털 척추 경을 봉합에 의해 포위되고, 미세 혈관 클램프는 관다발 주위에 체결하기 위해 사용되었다. 왼쪽과 중간 엽은 허혈성 있습니다.

그림 3
그림 3 : 장비 셋업. 이 그림은 일을 보여줍니다 전자 악기 설정합니다.

그림 4
그림 4 : 수술실 셋업. 이 그림은 수술실 설정을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
그림 5 : 복부 헤어의 트리밍. 이 그림은 복부 머리의 트리밍을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 6 : 고정화 및 피부 절개. 이 그림은 쥐의 피부 절개의 고정을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7
그림 7 : 늑골 견인기 배치 및 안구 내용 제거술. 이 그림은 늑골 견인기 배치 및 내장 적출을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 8
그림 8 : 장소 봉합의, 표준. 이 그림은 봉합의 위치를 ​​보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 9
그림 9 : 하대 정맥에서 혈액 그리기. 이 그림은 하대 정맥에서 채혈을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 10
그림 10 : 정맥 지점은 오프 묶여 철회. 분기 묶었 및 수축 된 지정 맥이 그림은 보여줍니다. ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54729/54729fig10large.jpg "target ="_ blank "> 검색이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 11
그림 11 : 캐 뉼러의 프로세스. 이 그림은 삽관의 과정을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 12
그림 12 : 캐 뉼러. 이 그림은 삽관을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 13 : 대표 결과 : 쥐 폐문 클램프 모델을 사용하여 페 길화 수퍼 옥사이드 디스 뮤 타제의 직접 분절 간내 배달. NS 정상 식염수 =. PEG-SOD = 슈퍼 옥사이드 디스 뮤 타제 - 페 길화, ALT = 알라닌 아미노기 전이 효소, MDA는 말론 디 알데히드 =. A. 혈청 알라닌 아미노 전이 효소 (ALT 뮤 / mL)로 미리 폐문 클램프 및 120 분 후 재관류를 비교. 제어부 (NS) 전 문부 클램프 제어 120 분 후 재관류시 (NS) (p <0.001) 사이의 유의 한 차이가있다. 120 분 후 재관류 (p <0.05)에서 제어부 (NS)과 실험군 (PEG-SOD) 사이에 상당한 차이가있다. 학생의 T-테스트가 사용되었다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 제어 주입 (NS)는 오른쪽으로 로브 (비 폐문 클램프)에 B. 티슈 말론 디 알데히드실험 D 주사 (PEG-SOD)는 큰 차이를 설명하지 않는다. 좌엽 (포스트 폐문 클램프 재관류) 제어 주입 (NS)와 티슈 말론 디 알데히드 바로 로브 (비 폐문 클램프) p <0.001보다 상당히 다르다. 좌엽 (포스트 폐문 클램프 및 재관류) 실험 주사 (PEG-SOD) p <0.005 대 제어 주입 (NS)와 티슈 말론 상당히 상이한 레벨을 갖는다. 학생의 T-테스트가 사용되었다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 제어 주입 (NS) 실험 주사 (PEG-SOD)과 C. 오른쪽 로브 (비 폐문 클램프)의 조직 글루타티온은 유의 한 차이를 설명하지 않는다. 좌엽 (포스트 폐문 클램프 재관류) 제어 주입 (NS)와 티슈 글루타티온 제어 주입 (NS) p <0.05 오른쪽 로브 (비 폐문 클램프)보다 상당히 다르다. 좌엽 (포스트 폐문 클램프 재관류)을 제어 조직 injectio과 글루타티온 상당히 상이한 레벨을 갖는실험 주입 대 N (NS) (PEG-SOD) p <0.005. 학생의 T-테스트가 사용되었다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. D. 웨스턴 블롯은 대조군 동물의 오른쪽 로브 (비 폐문 클램프) 대 좌측 엽 (포스트 폐문 클램프 재관류) (생리 식염수)의 간 조직에서 절단 된 카스파 제 -3 증가 입증. E. 서양 오점을 보여주는 제어 (생리 식염수)로 처리 동물에 비해 PEG-SOD로 치료 동물의 간 조직에서 쪼개진 카스파 제 -3 감소했다. 절단 된 카스파 제 -3 간 조직에서의 F. 레벨이 크게 후 폐문 클램프 재관류 동물 (p <0.05) 증가된다. 학생의 T-테스트가 사용되었다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. G.은 (PEG-SOD 주입) 실험 동물의 좌측 엽 간 조직 및 (생리 식염수 주입) 대조군의 좌엽의 간 조직과 비교에서, 쪼개진 카스파 제 -3이 크게 저하제어 (생리 식염수)로 처리 동물에 비해 PEG-SOD로 치료 imals. 학생의 T-테스트가 사용되었다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다.

Discussion

이러한 일련의 실험이 증명이 대조군에 비해 왼쪽으로 PEG-SOD 및 ALT의 방출에 크게 감소되었다 중간 엽, 세포막의 지질 과산화 (MDA)와 글루타치온의 유지 (GSH)의 주입 (생리 식염수 ). 알라닌 아미노 전이 효소 (ALT)를 포함한 간 조직 트랜스 아미나은 간세포 손상의 마커를 설정됩니다. 좌측 엽 PEG-SOD 주입되는 ALT의 감소는 PEG-SOD의 보호 효과를 시사한다. 증가 된 조직 MDA는 지질 과산화를 증가 나타냅니다 산화 스트레스 및 조직 손상의 마커 간주됩니다. 활성 산소의 과잉 생산은 MDA (26)의 생산의 증가를 야기한다. PEG-SOD 주입 한 동물의 좌측 및 중간 엽 조직에서 MDA의 현저한 감소는 PEG-SOD의 보호 효과를 보여준다. 이 PEG-SOD는 손상으로부터 세포를 보호하는 현재의 이해와 일치부분적으로 감소 된 반응성 산소 종 (27)에 의해 발생. 또한, 활성 산소 종의 존재 하에서, 글루타치온 디설파이드 글루타티온 (GSH) (28)로 감소된다. 상기 PEG-SOD 주사 간 좌측 및 중간 엽에서 GSH에서 유지 PEG-SOD의 보호 효과를 강화한다. 또한 허혈 재관류 손상에 노출 된 조직에서, 절단 된 카스파 제 3, 아폽토시스의 생성물이 증가한다는 증명된다. PEG-SOD 처리 좌측 엽 절단 된 카스파 제 -3의 감소는 PEG-SOD는 세포 자멸의 감소에 이르게 것을 시사한다.

과산화물 디스 뮤타 아제 (SOD)의 활성 산소 종의 중독에서 중요한 효소이다. 효소는 과산화수소와 물로 두 수퍼 옥사이드 음이온의 전환을 촉매한다. 효소 카탈라제는 프로세스 (25)를 완성 물 및 산소를 과산화수소로 변환한다. 의 반감기네이티브 SOD 공액 폴리에틸렌 글리콜 - 슈퍼 옥사이드 디스 뮤타 아제 (SOD-PEG)의 개발까지 실험 모델에서의 사용을 제한했다. 폴리에틸렌 글리콜에 컨쥬 게이션 SOD의 14 시간을 6 분에서의 반감기를 증가시킨다. 구엔은 등. 전신 배달 (29)를 사용하여 쥐 모델에서 간 허혈에서 지질 과산화를 완화 할 수있는 능력을 보여 주었다.

기술 여기에 설명 된 일부는 이전에 문헌에 기술 된 잠재적 인 수정의 다양한있다. 모델에 사용 된 분자에 따라 흡입 (11), 경막 외 주입 (12), 복강 내 주사 17, 18, 21, 22, 정맥 내 투여 10, 14, 15을 사용하여 전달 된 8> P, 19, 23, 24 또는 주사.

이 프로토콜에서 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 가장 중요한 것은 문맥의 삽관입니다. 치료는 정맥을 잘라 구멍이 너무 크지 않도록주의해야합니다. 조직은 매우 탄력적 및 정공은 자체적으로 확대된다. 우리는 미세 수술 가위로 0.5 mm 인 구멍을 절단하여 시작하는 것이 좋습니다. 캐 뉼러는 손 절차의 일부를 수행하려는 경우보다 민첩성 허용하는기구를 사용하여 구멍을 통해 공급 될 수있다. 처음에 캐 뉼러를 공급하면서 또한, 정맥의 뒤쪽 벽에 구멍을 파고 않도록 좌우 포털 정맥의 분기점을 향해 직접 겨냥한다. 캐뉼라 팁 분기점에 도달하면, 그 다음 특정 왼쪽 정맥 내로 공급 될 수있다동맹국. 정맥은 왼쪽과 중간 엽을 모두 공급하는 왼쪽 포털 정맥에 공급되면, 그 위치는 정맥 내부를 느낌에 의해 수동으로 확인할 수 있습니다. 그 위치는 간장의 공급 세그먼트의 창백 효과를 차가운 생리 식염수를 소량 주입으로보고 확인할 수있다.

쥐의 간 문부 클램프 모델 간 허혈 - 재관류 손상을 입증하기위한 재현하고 안정적인 플랫폼을 제공합니다. 가변 폐문 클램프 모델은 산화 방지제 및 다른 작은 분자가 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14의 보호 효과를 연구하는 연구자들이 사용되어왔다. 변화 점은 혈관 클램프를 포함 할 수 있습니다 담관이 포함되어 있는지의 여부 허혈성 만들어진 세그먼트 ED, 재관류 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18의 기간의 길이, 19, 20, 21. 이 모델은 분자 투여 경로 투여의 영향을 연구하기 위해 사용되는 경우 또한 이기종 8, 10, 11,"> 12, 14, 15, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 24. 상술 한 방법에 몇 가지 장점이있다이. 우선, 허혈성 세그먼트 포털 공급 직접 캐 뉼러에 직접 분절 간 전송을 허용 연구중인 약물 물질. 이것은 내부 제어로서 간 다른 돌출부의 이용을 허용한다. 둘째, 분절 간 삽관이 검토되고 분자에 대한 분포의 감소 된 용적을 허용한다. 이러한 접근하여 같은 전신 부작용의 위험을 줄일 물질이. 관심 간 세그먼트에 직접 주입 간 세그먼트의 직접 삽관 전 허혈을 제공하는 물질을 가능하게한다, 내 허혈 후 허혈. 이는 허혈 - 재관류 손상 사이클의 어느 지점에서 분자의 효과를 연구 할 수 있습니다. 허혈성 시간의 증가 길이 가능한 것 간 재생을 연구하는 부상 추가적인 기회의 증가 수준.

이 방법의 몇 가지 제한이있다. 첫 번째는 창업 비용이다. 수술 현미경의 구입은 이미 하나를 가지고 있지 않는 실험실의 중요한 시작 비용이 될 수 있습니다. 이 기술은 현미경없이 어렵거나 불가능할 수있다. 두 번째는 곡선 시간을 배우고있다. 이 절차는 비교적 간단하지만 그것은 연습이 필요하며 만약 초보자가 전문가가되기 위해 절차의 상당수를 필요로 할 것 같다.

요약하면,이 모델은 간 허혈 - 재관류 손상을 연구하기 위해, 재현 간단하고 비용 효율적인 플랫폼을 수 있습니다. 프로토콜에 폴리에틸렌 GL 여기 설명되었지만ycol - 슈퍼 옥사이드 디스 뮤 타제, 자유 라디칼 스 캐빈 저 (25), 주입 된이 모델은 간에서 I / R 손상에 미치는 영향을 평가하기 위해 다른 약물 물질의 다양한 주입하는 데 사용할 수 있습니다.

Disclosures

모든 저자들이 더 공개가 없습니다보고합니다.

Acknowledgments

우리는 그의 설명 작업 데니스 마티아스을 인정하고 싶습니다. 이 작품은 NIH T32AI 106704-01A1와 오하이오 주립 대학의 장기 이식, 관류, 엔지니어링 및 재생을위한 T 플레쉬 기금에 의해 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sprague-Dawley Rat  Harlan Sprague Dawley Inc.  200- 250 grams 
Surgical Microscope  Leica  M500-N w/ OHS
Charcoal Canisters Kent Scientific SOMNO-2001-8
Isoflurane Molecular Weight 184.5  Piramal Healthcare
Pressure-Lok Precision Analytical Syringe   Valco Instruments Co, Inc.  SOMNO-10ML
Electrosurgical Unit Macan  MV-7A
Warming Pad Braintree Scientific  HHP2
SomnoSuite Small Animal Anesthesia System Kent Scientific  SS-MVG-Module
PhysioSuite Kent Scientific  PS-MSTAT-RT
Isoflurane chamber  Kent Scientific SOMNO-0530LG
SurgiVet Isotec CDS 9000 Tabletop
Oxygen  Praxair 98015
27-0 Micro-Cannula Braintree Scientific  MC-28
Rib retractors  Kent Scientific  INS600240
Polyethylene Glycol - Superoxide Dismutase (PEG-SOD) Sigma Aldrich  S9549 SIGMA
GenieTouch Kent Scientific
Normal Saline Baxter NDC 0338-0048-04
4 x 4 Non-Woven Sponges  Criterion 104-2411
Sterile Q-Tips Henry Schein Animal Health 1009175
U-100 27 Gauge Insulin Syringe Terumo 22-272328
5 mL Syringe BD  REF 309603
4-0 Braided Silk Suture Deknatel, Inc. 198737LP
7-0 Braided Silk Suture Teleflex Medical  REF 103-S
1.8 mL Arcticle Cryogenic Tube USA Scientific  1418-7410
Microsurgical Instruments
Name Company  Catalog Number Comments
Small Scissors  Roboz  RS-5610
Large Scissors S&T  SAA-15
Forceps - Large Angled S&T  JFCL-7
Forceps - Small Angled  S&T FRAS-15 RM-8
Clip Applier ROBOZ RS-5440
Scissors - non micro FST 14958-11 14958-11
Forceps - Straight Tip  S&T  FRS-15 RM8TC
Large Microsurgical Clip Fine Scientific Tools 18055-01
Small Microsurgical Clip Fine Scientific Tools 18055-01
Small Microsurgical Clip Fine Scientific Tools 18055-02
Small Microsurgical Clip Fine Scientific Tools 18055-03
Other Instruments
Name Company  Catalog Number Comments
Small Mosquito Clamps Generic 
Analysis 
Name Company  Catalog Number Comments
Alannine aminotransferase (ALT) assay  Biovision K752-100
Malondialdehye (MDA) assay  Abcam  ab118970
Glutathione (GSH) assay Cayman Chemical 7030002
Antibodies - Cleaved Caspase-3 and Actin  Cell Signaling Tecnology Antibody 9661
ImageJ Software  National Institutes of Health 
RIPA Lysis and Extraction Buffer  Millipore 10-188

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References

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