Methode der direkten segmentale Intra-Leber-Lieferung Mit einer Rattenleber Hilar Clamp Modell

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Summary

Ein einzigartige Rattenleber hilar Clamp-Modell wurde für die Untersuchung der Auswirkungen von pharmakologischen Molekülen in Lindern Ischämie-Reperfusionsschaden entwickelt. Dieses Modell beinhaltet direkte Kanülierung der Portal Versorgung des ischämischen Lebersegment über einen Zweig des Pfortader, was eine direkte hepatische Lieferung.

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Beal, E. W., Dumond, C., Kim, J. L., Mumtaz, K., Hayes Jr., D., Washburn, K., Whitson, B. A., Black, S. M. Method of Direct Segmental Intra-hepatic Delivery Using a Rat Liver Hilar Clamp Model. J. Vis. Exp. (122), e54729, doi:10.3791/54729 (2017).

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Abstract

Wichtige Leberchirurgie mit Zufluss Okklusion und Lebertransplantation erforderlich macht eine Periode warmer Ischämie und über einen Zeitraum von Reperfusion Ischämie / Reperfusion (I / R) Verletzungen mit unzähligen negativen Folgen führen. Potential I / R-Schaden in marginal Organen für eine Lebertransplantation bestimmt trägt zum Stromgeber Mangel sekundär zu einer verringerten organ Nutzungsrate. Ein erheblicher Bedarf besteht hepatischen I / R-Schaden zu erforschen, um ihre Auswirkungen auf die Transplantatfunktion in der Transplantationsmedizin zu vermitteln. Rattenleber hilar Klemm Modelle werden verwendet, um die Auswirkungen verschiedenen Moleküle auf dem Leber-I / R-Schaden zu untersuchen. Je nach Modell sind diese Moleküle geliefert wurden unter Verwendung von Inhalation, epidurale Infusion, intraperitoneale Injektion, die intravenöse Verabreichung oder Injektion in die periphere mesenterica superior. Eine Rattenleber hilar Klemme Modell wurde bei der Untersuchung der Auswirkungen von pharmakologischen Molekülen in Lindern I / R-Schadens für den Einsatz entwickelt. die described Modell für hilar Klemmrattenleber enthält direkte Kanülierung der Portal Versorgung für hepatische Lieferung direkt segmental zum ischämischen Lebersegment über einen Seitenzweig der Pfortader, ermöglicht. Unser Ansatz ist Ischämie in den linken lateralen und mittleren Lappen für 60 min zu induzieren, während welcher Zeit der untersuchten Substanz infundiert wird. In diesem Fall pegyliertes-Superoxid-Dismutase (PEG-SOD), ein Radikalfänger, wird direkt in das ischämische Segment infundiert. Diese Versuchsreihe zeigt, dass die Infusion von PEG-SOD ist Schutz gegen Leber I / R-Schaden. Vorteile dieses Ansatzes umfassen direkte Injektion des Moleküls in das ischämische Segment mit daraus folgenden Abnahme der Verteilungsvolumen und eine Verringerung der systemischen Nebenwirkungen.

Introduction

Hauptleberchirurgie mit Einströmen Okklusion und Lebertransplantation erfordert eine Periode warmer Ischämie und Reperfusion über einen Zeitraum von Ischämie / Reperfusions (I / R) Verletzungen führenden 1. Die Folgen des I / R - Schadens in der Leber wurden umfassend 1, detailliert 2, 3. Folgen der I / Detail R Verletzungen in der Literatur sind: Erzeugung von reaktiver Sauerstoffspezies, die Einleitung der Entzündungskaskade, einschließlich der Aktivierung von Neutrophilen, Kupffer-Zellen und Endothel-Zellen, die Aktivierung des Häm-Oxygenase-Systems und die Aktivierung der Toll-like-Rezeptoren, einem Ungleichgewicht zwischen Endothelin und Stickstoffmonoxid, die Aktivierung von nuclear factor & kgr; B, und die Förderung von entzündungsfördernden Cytokinen und Adhäsionsmolekül Synthese 1, 2, 3. Diese proinflammatorischen Ereignisse können lead zur Apoptose, Nekrose, Organfehlfunktion und schließlich Organversagen 3.

I / R - Schaden in Organen für eine Lebertransplantation bestimmt kann zu frühen Verlust des Transplantats führen und trägt zur aktuellen Spendermangel als marginal Organe anfälliger für Verletzungen 3 sind. Es gibt zur Zeit 15.226 potenzieller Empfänger auf der Warteliste für eine Lebertransplantation in den Vereinigten Staaten von Amerika 4 und nur 5.950 Lebertransplantationen im Jahr 2015 5 durchgeführt wurden. Durch diese extreme Einschränkung der Organverfügbarkeit, Erforschung Forschung hepatischer I / R-Schaden ist erforderlich, um die Organfunktion und Organauslastung zu optimieren.

Tiermodelle verwendet, um Leber I / R Verletzungen gehören Ratte hilar Klammer Modelle und Rattenlebertransplantationsmodellen zu untersuchen. Es gibt eine Vielzahl von Ratten hilar Klemm Modellen derzeit im Einsatz. Die häufigste ist eine, in der die Pfortader, Leberarterie und Gallen duct Zuführen der linken lateralen und medianen Lappen verklemmt werden unter Verwendung mikrochirurgisches Klammern 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 für 30 bis 60 min 6, 7, 10, 13, 14 und dann auf einem Zeitraum der Reperfusion von 60 min bis 24 h 7, 9, 10, 13, 14 erlaubt. Die linken lateralen und medianen Keulen der Rattenleber umfassen etwa 70% des Leberparenchym 9. Einige Protokolle entworfen ischämische Präkonditionierung zu untersuchen sind intermittierende Verspannung der hilar Gefäßeoder der Hintergliedmaße vor längerer Ischämie induziert durch die hilar Gefäße Klemm 9, 13. Darüber hinaus gibt es in der Literatur beschrieben sind mehrere Modifikationen. Die erste ist , die Pfortader und Leberarterie Versorgung der linken lateralen und medianen Keulen klemmen, jedoch ausgenommen den Gallengang 15. Eine zweite Modifikation ist durch Einklemmen der Pfortader, Leberarterie und Gallengang vor ihrer Teilung 16, 17, 18, 19, 20 insgesamt hepatischer Ischämie zu induzieren. Eine dritte Modifikation umfasst Klemmung der hilar Gefäße rechten Lappen für 30 bis 60 min 8. Eine weitere Modifikation betrifft in einem Hinterbeine 13 , um Verletzungen in der Leber zu induzieren , das Gefäßbündel Klemm, 21 1A-D dargestellt.

Rattenleber hilar Klemm Modelle wurden verwendet, um die Auswirkungen verschiedenen Moleküle und Verbindungen auf dem hepatischen I / R zu studieren. Je nach Modell verwendet wurden , hat diese Moleküle geliefert Inhalation mittels 11, epidurale Infusion 12, intraperitoneale Injektion 17, 18, 21, 22, intravenöse Verabreichung 10, 14, 15, 19, 23, 24 oder Injektion in die peripheren mesenterica superior 8 .

Das Modell für hilar Klemme Rattenleber in diesem Bericht includ detailliertES direkte Kanülierung der Portal Versorgung des ischämischen Segment über einen Seitenzweig der Pfortader (Abbildung 2), die für die direkte segmentale hepatische Lieferung der pharmakologischen Substanz in Untersuchung ermöglicht. Unser Ansatz ist Ischämie in den linken lateralen und medianen Keulen für 60 min zu induzieren, während welcher Zeit eine Infusion der Substanz untersucht, in diesem Fall pegyliertes-Superoxid - Dismutase, ein Radikalfänger 25 wird direkt in das ischämische Segment infundiert . Die Blutproben werden vor der Induktion der Ischämie und bei 120 min nach der Reperfusion entnommen. An diesem Punkt wird die Ratte getötet und Proben werden von den linken und mittleren Lappen genommen. Zusätzlich werden Proben aus dem rechten Lappen genommen als interne Kontrolle zu dienen.

Es gibt zahlreiche Vorteile dieses Ansatzes. In erster Linie, wenn die pharmakologische Substanz zu untersuch direkt das Volumen o in das ischämische Segment injiziert werden kann,f Verteilung ist im Vergleich zu dem Volumen der Verteilung der Injektion in den systemischen Kreislauf oder die Peritonealhöhle recht gering. Zusätzlich reduziert dieser Ansatz, wenn auch nicht beseitigt, was die Möglichkeit der systemischen Nebenwirkungen.

Protocol

Alle Verfahren wurden nach den Richtlinien des Institutional Animal Care durchgeführt und der National Research Council Leitfaden für die Humane Pflege und Verwendung von Labortieren (IACUC) und hat die Zulassung von der Ohio State University IACUC Ausschuss unterzogen.

1. Erstes Set-up

  1. Set-up das Operationsmikroskop und OP (Bild 3, Bild 4). Schalten Sie alle Geräte einschließlich der für die Aufrechterhaltung der Anästhesie und Überwachung von Vitalfunktionen. Schalten Sie die Elektrochirurgiegerät und wärmende Unterlage. Positionieren der Infusionspumpe in der Nähe des Operationstisches.
    1. Zeichnet bis 10 ml Flüssigkeit zur Inhalation von Isofluran (Molekulargewicht 184,5) in der Anästhesie Spritze und es in dem Anästhesiegerät.
    2. Set-up einen 200 ml-Behälter mit flüssigem Stickstoff in der Nähe der Operationstisch und ein anderer in der Nähe der Zentrifuge, wo Blutproben verarbeitet werden.
    3. Position die chirurgischen Instrumente, 4-0 und 7-0 geflochtener Seidenfaden, steriles Wattestäbchen, 4x4 Vlies Schwämme, 5 ml Spritzen und 27 Gauge Insulinspritzen in der Nähe des Operationstisches.
  2. Bereiten Sie die Isofluran Kammer und sicherzustellen, dass eine ausreichende Isofluran Anästhesie wird in dem Induktions-Verabreichungssystem instilliert.

2. Einleitung der Narkose

  1. Bevor Sie die Ratte auf die folgende persönliche Schutzausrüstung (PSA) setzen Handhabung: OP-Maske, chirurgische Handschuhe und Einweg-Kleid.
  2. Wiegen Sie die Ratte und das Gewicht aufgezeichnet.
    HINWEIS: Sprague Dawley Ratten verwendet werden soll.
  3. Legen Sie die Ratte in der Anästhesie Kammer und schalten Sie die Isofluran und Sauerstoff. Isofluran Anästhesie induziert die Kammer verwenden.
  4. Clip des Bauch Haar des Tieres mit einem elektrischen Haarschneider für sauberere Belichtung (Abbildung 5) zu ermöglichen.
  5. Legen Sie das Tier zurück in die Isofluran Kammer für einen zusätznal eine Minute. Führen Sie eine Zehe Prise Narkosetiefe zu überprüfen.

3. Verfahren

  1. Positionieren Sie die Ratte mit der Nase des Tieres in der Bugspitze und vier Extremitäten immobilisiert mit Beschränkungen oder Klebeband auf der Erwärmung Pad.
  2. Weiterhin Anästhesie unter Verwendung das Anästhesieverabreichungssystem, Bugkonus und Isofluran Anästhesie mit 3,6% für die Tiere zwischen 200 und 250 g und 4% für Tiere mit einem Gewicht von mehr als 250 g wiegen. Bestätigen Narkosetiefe durch eine Zehe Prise und eine Haut Prise durchführen.
  3. Führe einen Bauchschnitt von der Mittellinie pubis durch die Haut unter Verwendung einer scharfen Schere (6) auf xiphoid.
  4. Einen Einschnitt in der Bauchhöhle entlang der linea alba von pubis den Bauch kümmert xiphoid und gibt nicht die Blase oder Darm zu beschädigen. Da die Leber nach vorne auf das Bauchfell in der Nähe des Xiphoid klebt auch sicher, dass es vor Releases in dieser ar die Bauchdecke zu Einschneidenea.
  5. Führe einen transversalen Schnitt durch die Haut und das Peritoneum auf der Ebene der unteren Grenze des rechten Leberlappens.
  6. Schalt die Anästhesie bis zu 1,6% für die Tiere zwischen 200 und 250 g und 2% für Tiere mit einem Gewicht von mehr als 250 g wiegen.
  7. Zurückziehen des Xiphoid eine gekrümmte Moskitoschelle.
  8. Ort Rippe Retraktoren , die Rippen so weit voneinander entfernt wie möglich von der Mittellinie gezogen (Figur 7). Schneiden Sie die falciform, Zwerchfell und Magen-Bänder. Flip die Leber sich mit der befeuchteten sterilen Wattestäbchen.
  9. Schneiden Sie zusätzliche Bänder nach Bedarf Zugang zum porta zu gewinnen. Führen viszerale Rotation mit Kochsalzlösung angefeuchtet Gaze (Abbildung 7).
  10. Entfernen Sie das lockere Bindegewebe, das Portal hilum mit scharfer oder stumpfer Dissektion liegt. Entfernen Sie das lockere Bindegewebe, die Länge der Pfortader liegt.
  11. Verwenden einer Pinzette durch den lockeren t schiebenAusgabe hinter dem linken Pfortader, Arterie und Gallengang ein Fenster machen und platzieren 4-0 Pott Naht aber nicht Cinch nach unten (Abbildung 8).
  12. Deaktivieren Sie das lockere Bindegewebe über den hinteren Ast in die Pfortader aus, die etwa die Höhe der rechten Niere in an kommen. Diese Ader wird für Kanülierung verwendet werden.
  13. Zeichne 0,5 ml Blut aus der vena cava inferior (IVC) mit einer Insulinspritze (Abbildung 9). Platzieren Sie die 0,5 ml Blut in einem kleinen Fläschchen, Zentrifuge bei 135 × g für 12 min. Versuchen serum abzusaugen.
    1. Wenn eine klare Linie nicht zwischen roten Blutkörperchen und Serum erkannt werden, versuchen, für weitere 2 bis Zentrifuge - 3 min bei 135 x g. Absaugen Serum und in einem Fläschchen für Alanin-Aminotransferase (ALT). Schnapp dieser Probe einzufrieren indem es direkt in flüssigem Stickstoff platziert.
  14. Schneiden Sie zwei Stücke von 7-0 Naht und Ort in der Nähe der Vene, die Kanüle eingesetzt werdention. Legen Sie die erste 7-0 Schleife um diese Vene so weit medial wie möglich. Bindung Diese Schleife und es verwendet , zum Zurückziehen mit einer gekrümmten Moskitoklemme (Abbildung 10). Legen Sie eine zweite 7-0 Schleife auf der Vene, die mit den Pfortader zur Kanülierung in der Nähe seiner Kreuzung verwendet werden und eine Krawatte platzieren, aber nicht Cinch nach unten.
  15. Bereiten Sie die Infusionspumpe mit einer 5 ml-Spritze mit 3 ml Reagenz. Prime der Schlauch.
  16. Clamp distale Pfortader eine mikroSchelle.
    Hinweis: das wird Blutung reduzieren, wenn die Vene für Kanülierung eingeschnitten wird.
  17. Geschnitten, um ein 0,5 mm Loch in der Vene zwischen dem 7-0 Aufenthalt Naht und dessen Schnittpunkt mit den Pfortader mit kleiner mikro Schere. Verwenden 27-0 Katheter das linke Pfortader - System (11, 12) kanülieren. Setzen Sie den Katheter vorbei an der Gabelung der linken und rechten Pfortader.
  18. Überprüfen Sie die Platzierung der Kanüle durch infusing 1 ml normaler Kochsalzlösung und sehen für den linken seitlichen und mittleren Leberlappen zu Blanch. Manuell bestätigt, dass Katheter über den Abzug des rechten Pfortader, aber nicht über den Abzug des Vene Portal die Mittellappen Fütterung.
  19. Cinch auf dem Pott Naht und Ischämie Zeit beginnen. Ziehen Sie 7-0 Naht um Vene und 27-0 Katheter in Position zu halten und die Klemme vom distalen Pfortader entfernen.
  20. Starten Sie die Infusion von Polyethylenglykol-Superoxid-Dismutase (SOD-PEG, 0,00067 g / ml) unter Verwendung der Infusionspumpe. Starten Sie die Infusion so nahe wie möglich zu Beginn der ischämischen Zeit.

4. Überwachung

  1. Weiter des Tieres Vitalfunktionen in der gesamten Infusion zu überwachen. Liefern 2 ml 0,9% normaler Kochsalzlösung oder 2 ml PEG-SOD (0,00067 g / ml) in 0,9% physiologische Kochsalzlösung über einen Zeitraum von 15 min gelöst.

5. Reperfusion

  1. Erlauben Sie eine Stunde von Beginn des i passierenschemic Zeit. Dies ist 1-h warme Ischämie Zeit.
  2. Entfernen Sie den Pott Naht. Entfernen Sie den Katheter 27-0. Cinch Sie die 7-0 Naht um die Vene. Notieren Sie sich die Zeit. Dies markiert den Zeitpunkt der Reperfusion.

6. Fortsetzung Sampling

  1. Zeichne 0,5 ml Blut aus dem IVC bei 120 min nach der Reperfusion. Zeichnen Sie das Blut langsam zu vermeiden rote Blutkörperchen lysieren. Langsam tropft das Blut in ein Fläschchen. Stellen Sie sicher, dass aus dem IVC Ausbluten wird nach jeder Blutentnahme gesteuert.
    1. Wenn es fortgesetzt wird, sanften Druck mit einem sterilen Wattestäbchen oder einen kleinen 1 cm mal 1 cm Abschnitt geschnitten aus Gaze gelten Blutungen.
  2. Zentrifuge bei 135 × g für 12 min. Wenn eine ausreichende Trennung nicht erreicht wird, versuchen, eine zusätzliche 2 bis 3 min bei 135 x g.
  3. Die Hälfte des Serums in einem Fläschchen für die spätere Verarbeitung für ALT. Snap gefrieren diese Proben.

7. Euthanasie

  1. Während die Ratte noch unter Narkose ist schneiden Sie den IVC und superior Hohlvene (SVA) und bis Blutung, Atmung und Herzschlag aufhören überwachen.
  2. Einzuschneiden die Membran und führt eine kurze Hepatektomie durch die Membran in einem Kreis Einschneiden und Einschneiden zusätzliches Bindegewebes, das die Leber bleibt die Bauchhöhle verbindet. Entfernen Sie die Leber aus der Peritonealhöhle.
  3. Nehmen Sie vier Proben von den linken und mittleren Lappen der Leber und vier Proben aus dem rechten Leberlappen. Die Proben sollten so groß wie möglich sein, und ihre Größe wird nur durch die Menge der zur Verfügung stehenden Lebergewebe begrenzt werden. Legen Sie diese in kleinen, markierten Fläschchen und Snap freeze in dem flüssigen Stickstoff. Verwenden dieser für eine spätere Verarbeitung zur Gewebe Adenosintriphosphat (ADP), Malondialdehyd (MDA) und Glutathion (GSH).

8. Post-Experiment Analyse

  1. Bestimmen, Glutathion (GSH), Malondialdehyd (MDA) und Alanin-Aminotransferase (ALT) Aktivitäten in Lebergewebe und Serumproben unter Verwendung von diagnostischen Kitsnach den Anweisungen des Herstellers.
  2. Homogenisiert das Lebergewebe mit Lysepuffer und Quantifizierung einer Bradford-Assay. Analysieren Gewebelysat durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Immunoblot-Antikörper gegen Caspase-3 gespalten und Aktin werden. Quantifizieren Western-Blots mit öffentlich zugänglicher Software.

Representative Results

Dieses Experiment wurde mit 2 Gruppen von n = 3 durchgeführt, die jeweils Ratten. Drei Rattenlebern wurden mit 2 ml normaler Kochsalzlösung (NS) mit der Infusionspumpe über einen Zeitraum von 15 min injiziert. Drei Rattenlebern wurden mit 2 ml normaler Kochsalzlösung (NS), gemischt mit pegyliertem-Superoxid-Dismutase (SOD-PEG, 0,00067 g / ml) injiziert, mit der Infusionspumpe über einen Zeitraum von 15 min. Wie in dem oben beschriebenen Protokoll wurden Blutproben vorge hilar Klemme und bei 120-min nach der Reperfusion entnommen. Außerdem wird nach Beendigung von 120 min-Reperfusion vier Lebergewebeproben aus den linken und den mittleren Lappen und vier Leberproben entnommen wurden, wurden von dem rechten Lappens der Rattenleber entnommen.

Serum-Alanin-Aminotransferase (ALT) wurde gemessen vorge hilar Klemme und bei 120-min nach der Reperfusion in der Kontrolle (NS) und experimentellen (PEG-SOD) Tiere. Es gab einen signifikanten Unterschied zwischen dem ALT Kontrollniveau (NS)Tiere vorge hilar Klemme und bei 120-min nach der Reperfusion. Es gab einen signifikanten Unterschied zwischen ALT Kontrollniveau (NS) und Versuchstieren (PEG-SOD) bei 120-min (Figur 13A). Tissue Malonaldehyd (MDA) wurde sowohl für die Steuerung (NS) und experimentelle (PEG-SOD) in Tieren rechten und linken Lappen der Leber gemessen. Gewebe MDA in rechten Lappen (nicht hilar Klemme) mit Steuereinspritzung (NS) und experimenteller Injektion (PEG-SOD) zeigen keinen signifikanten Unterschied. Linke Lappen (post-hilar Klemme und Reperfusion) Gewebe MDA mit Steuereinspritzung (NS) ist wesentlich anders als rechte Lappen (nicht hilar Klemme) p <0,001. Linkes Lappens (post-hilar Klemme und Reperfusion) weist eine deutlich unterschiedliche Niveaus von Geweben MDA mit Kontrollinjektion (NS) gegenüber experimentelle Injektion (PEG-SOD) p <0,005 (Abbildung 13B). Tissue Glutathion (GSH) wurde gemessen und Gewebe Glutathion in rechten Lappens (non-hilar Klemme) mit Kontrollinjektion (NS) and experimentelle Injektion (PEG-SOD) zeigt keinen signifikanten Unterschied. Linkes Lappens (post-hilar Klemme und Reperfusion) Gewebe GSH mit Kontrollinjektion (NS) ist wesentlich anders als rechte Lappen (nicht hilar Klemme) mit Kontrollinjektion (NS) p <0,05. Linkes Lappens (post-hilar Klemme und Reperfusion) weist eine deutlich unterschiedliche Niveaus von Geweben Glutathion mit Kontrollinjektion (NS) gegenüber experimenteller Injektion (PEG-SOD) p <0,005 (Abbildung 13C). Western - Blot wurde Vergleich rechten und linken Lappen von Kontrolltieren durchgeführt und erhöht demonstriert gespalten Caspase-3 im linken Lappen nach hilar Klammer und Reperfusion (13D). Eine zweite Western - Blot wurde die linken Lappe von Tieren durchgeführt , mit Kontrolle behandelten und den Vergleich mit PEG-SOD (Figur 13E). Dies zeigt gespaltene Caspase-3 im Lebergewebe von mit PEG-SOD behandelten Tiere verringert. Densitometrie wurde auch Demonstra durchgeführtting , dass das Niveau von Caspase-3 gespalten in Lebergewebe in der linken Seite im Vergleich rechten Lappens von Kontrolltieren (13F) signifikant erhöht wird. Im Vergleich demonstriert die linken Lappens Lebergewebe von Versuchstieren, infundiert mit PEG-SOD und linke Lappens Lebergewebe von Kontrolltieren, infundiert mit normaler Saline, Densitometrie signifikant verringert gespaltene Caspase-3 in Tieren, die mit PEG-SOD im Vergleich zu Tieren behandelt mit Regelung (Figur 13 g) behandelt.

Abbildung 1
Abbildung 1: Anatomische Abbildungen. Anatomische A. Darstellung der Rattenleber. B. Anatomische Darstellung der Rattenleber. Das Portal Stiels auf der linken und der mittlere Lappen der Leber eingeklemmt. Die linke und die mittlere Lappen sind ischämische. C. AnatomischeDarstellung der Rattenleber. Das Portal Stiels an den linken Lappen geklemmt. Der linke Lappen ist ischämisch. D. Anatomische Darstellung der Rattenleber. Das Portal Stiels an den rechten Lappen eingeklemmt ist und der rechte Lappen ist ischämisch.

Figur 2
Abbildung 2: Anatomische Abbildungen. Anatomische Darstellung der Rattenleber mit Pfortader über einen Seitenzweig einer Kanüle versehen. Das Portal Pedikel zu den linken und mittleren Leberlappen wird durch eine Naht umgeben ist und eine Klemme microvessel verwendet worden um das vaskuläre Bündel zu spannen. Die linke und die mittlere Lappen sind ischämische.

Abbildung 3
Abbildung 3: Instrument Set-up. Diese Figur zeigt th e Instrument Set-up.

Abbildung 4
Abbildung 4: Operating Room Set-up. Diese Abbildung zeigt das OP-Set-up. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5
Abbildung 5: Trimmen von Bauchbehaarung. Diese Figur zeigt das Beschneiden der Bauch Haar. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 6: Immobilisation und Hautinzision. Diese Figur zeigt die Immobilisierung der Ratte und der Hautschnitt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 7
Abbildung 7: Rib Retractor Platzierung und Ausnehmen. Diese Figur zeigt die Rippenspreizer Platzierung und Ausweiden. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 8
Abbildung 8: Platz ment von Suture. Diese Figur zeigt die Platzierung der Naht. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

9
Abbildung 9: Blutentnahme aus der unteren Hohlvene. Diese Figur zeigt Blutentnahme aus der unteren Hohlvene. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

10
Abbildung 10: Vein Zweig abgebunden und zurückgezogen wird . Diese Figur zeigt Vene Zweig abgebunden und zurückgezogen wird. ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54729/54729fig10large.jpg“target =‚_ blank‘> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

11
Abbildung 11: Prozess der Kanülierung. Diese Figur zeigt den Prozess der Kanülierung. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

12
Abbildung 12: Kanülierung. Diese Figur zeigt die Kanülierung. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Inhalt“fo: keep-together.within-page = "1"> 13
Abbildung 13: Repräsentative Ergebnisse: Direkte segmentale Intrahepatische Lieferung von pegyliertem-Superoxid - Dismutase Mit einer Ratte Hilar Clamp Modell. NS = normale Kochsalzlösung. PEG-SOD = pegyliertem-Superoxid-Dismutase, ALT = Alanin-Aminotransferase, MDA = Malondialdehyd. A. Serum Alaninaminotransferase (ALT, mU / ml) im Vergleich zwischen vorge hilar Klemme und 120 min nach der Reperfusion. Es gibt einen signifikanten Unterschied zwischen der Kontroll (NS) vorge hilar Klemme und Kontrolle (NS) bei 120-min nach der Reperfusion (p <0,001). Es gibt auch einen signifikanten Unterschied zwischen der Kontroll (NS) und experimentellen Gruppen (PEG-SOD) bei 120-min nach der Reperfusion (p <0,05). Ein T-Test verwendet wurde. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung. B. Gewebe - Malondialdehyd in rechten Lappens (non-hilar Klemme) mit Kontrollinjektion (NS) eind experimentelle Injektion (PEG-SOD) zeigt keinen signifikanten Unterschied. Linke Lappen (post-hilar Klemme und Reperfusion) Gewebe Malondialdehyd mit Steuereinspritzung (NS) sind wesentlich anders als rechte Lappen (nicht hilar Klemme) p <0,001. Linkes Lappens (post-hilar Klemme und Reperfusion) weist eine deutlich unterschiedliche Niveaus der Gewebe Malonaldehyd mit Kontrollinjektion (NS) gegenüber experimentelle Injektion (PEG-SOD) p <0,005. Ein T-Test verwendet wurde. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung. C. Gewebe - Glutathion in rechten Lappen (nicht hilar Klemme) mit Steuereinspritzung (NS) und experimenteller Injektion (PEG-SOD) zeigt keinen signifikanten Unterschied. Linkes Lappens (post-hilar Klemme und Reperfusion) Gewebe Glutathion mit Kontrollinjektion (NS) ist wesentlich anders als rechte Lappen (nicht hilar Klemme) mit Kontrollinjektion (NS) p <0,05. Linke Lappen (post-hilar Klemme und Reperfusion) haben deutlich verschiedene Ebene des Gewebe Glutathion mit Kontrolle injection (NS) gegenüber experimenteller Injektion (PEG-SOD) p <0,005. Ein T-Test verwendet wurde. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung. D. Western - Blot - gespaltene Caspase-3 in Lebergewebe des linken Lappens (post-hilar Klemme und Reperfusion) gegenüber der rechten Lappens (non-hilar Klemme) von Kontrolltieren (normale Salzlösung) erhöht demonstriert. E. Westernblot Demonstrieren verringert gespaltenen Caspase-3 in Lebergewebe von Tieren mit PEG-SOD im Vergleich zu Tieren mit Kontrolle (normale Salzlösung) behandelt , behandelt. F. Ebene gespaltener Caspase-3 in Lebergewebe wird in post-hilar Klemme und Reperfusion Tieren (p <0,05) signifikant erhöht. Ein T-Test verwendet wurde. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung. G. In linken Lappens Lebergewebe von Versuchstieren (infundiert mit PEG-SOD) und linken Lappens Lebergewebe der Kontrolltiere (infundiert mit normaler Salzlösung) zu vergleichen, wird signifikant verringert gespaltene Caspase-3 in einemimals behandelt mit PEG-SOD im Vergleich zu Tieren mit Kontrolle (normale Salzlösung) behandelt. Ein T-Test verwendet wurde. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung.

Discussion

Diese Reihe von Experimenten gezeigt, dass die Injektion von PEG-SOD in die linken und mittleren zu einem signifikanten Abnahme führten Keulen in der Freisetzung von ALT, Lipidperoxidation der Zellmembranen (MDA) und die Wartung von Glutathion (GSH) im Vergleich mit den Kontrollen (Normal Saline ). Lebergewebe Transaminasen einschließlich Alanin-Aminotransferase (ALT) erfüllt sind Marker von hepatozellulären Verletzung. Die Verringerung der ALT, wenn der linke Lappen mit PEG-SOD injiziert wird, schlägt vor, eine schützende Wirkung von PEG-SOD. Erhöhte Gewebe MDA zeigt an Lipidperoxidation erhöht, und ist ein Marker für oxidativen Stress und Gewebeverletzung betrachtet. Die Überproduktion von reaktiven Sauerstoffspezies verursacht eine Erhöhung der Produktion von MDA 26. Die signifikante Reduktion der Gewebe MDA im Tiere links und mittleren Lappen, wenn sie mit PEG-SOD injiziert zeigt eine protektive Wirkung von PEG-SOD. Dies steht im Einklang mit dem aktuellen Verständnis, dass PEG-SOD Zellen vor Schäden schütztdurch teilweise reduzierte reaktive Sauerstoffspezies 27. Zusätzlich wird in der Gegenwart von reaktiver Sauerstoffspezies, Glutathion - Disulfid an Glutathion (GSH) 28 verringert. Die Wartung in GSH in den linken und mittleren Leberlappen mit PEG-SOD injizierten weiter verstärkt die schützende Wirkung von PEG-SOD. Außerdem wird gezeigt, dass es gespaltene Caspase-3 erhöht wird, ein Produkt von Apoptose, ausgesetzt in Gewebe Ischämie-Reperfusionsschaden. Die Abnahme der gespaltenen Caspase-3 in dem linken Lappens, wenn es mit PEG-SOD behandeln legt nahe, daß PEG-SOD zu einer Abnahme der Apoptose führt.

Superoxid-Dismutase (SOD) ist ein kritisches Enzym in der Detoxikation von reaktiver Sauerstoffspezies. Das Enzym katalysiert die Umwandlung von zwei Superoxidanionen zu Wasserstoffperoxid und Wasser. Das Enzym Katalase wandelt dann Wasserstoffperoxid zu Wasser und Sauerstoff, die Vollendung des Prozesses 25. Die Halbwertszeit vonnativer SOD beschränkt seine Verwendung in experimentellen Modellen, bis die Entwicklung von konjugierten Polyethylenglykol-Superoxid-Dismutase (PEG-SOD). Konjugation von SOD an Polyethylenglykol erhöht die Halbwertszeit von 6 min bis 14 h. Nguyen et al. seine Fähigkeit bewiesen Lipidperoxidation in hepatischer Ischämie in einem Rattenmodell, wobei die systemische Zufuhr 29 zu mildern.

Es gibt eine Vielzahl von möglichen Modifikationen der Technik hier detailliert und einige haben zuvor in der Literatur beschrieben worden. Je nach Modell verwendeten Molekülen geliefert wurde unter Verwendung von Inhalations 11, epidurale Infusion 12, intraperitoneale Injektion 17, 18, 21, 22, intravenöse Verabreichung 10, 14, 15 19, 23, 24 oder Injektion in die peripheren mesenterica superior 8.

Es gibt mehrere wichtige Schritte in diesem Protokoll. Das wichtigste ist die Kanülierung der Pfortader. Es muss darauf geachtet werden, dass das Loch in der Vene schnitt nicht zu groß ist. Das Gewebe ist sehr elastisch und das Loch wird auf ihrem eigenen vergrößert. Wir empfehlen, beginnend durch ein Loch, das Schneiden von 0,5 mm mit der mikrochirurgischen Schere ist. Die Kanüle kann durch das Loch zugeführt werden, unter Verwendung eines Instruments, das für größere Flexibilität ermöglicht, als wenn dieser Teil des Verfahrens von Hand durchzuführen versucht. Zusätzlich können, während zunächst die Kanüle zugeführt wird, sollte es direkt in Richtung der Gabelung der linken und rechten Pfortader gerichtet werden, um zu vermeiden, dass ein Loch durch die Rückwand der Vene Stossen. Wenn die Kanülenspitze die Gabelung erreicht, kann es dann in die linke Vene zugeführt werden, um spezifischeVerbündete. Sobald die Kanüle in die linken Pfortader zugeführt wird, die sowohl die linke und mittlere Lappen liefert, kann seine Position manuell durch das Gefühl im Innern der Vene bestätigt werden. Seine Position kann auch durch Injektion eine kleine Menge kalten Salzes und zu sehen, die Abblassen Wirkung auf den mitgelieferten Segmenten der Leber bestätigt werden.

Die Leber hilar Clamp-Modell in der Ratte stellt eine reproduzierbare und stabile Plattform für hepatische ischämische Reperfusionsverletzung demonstriert. Variable hilar Klemm Modelle wurden von Forschern verwendet , um die schützende Wirkung von anti-Oxidantien zu studieren und andere kleine Moleküle , 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14. Punkte Variations umfassen, die Schiffe sind Klemm ed, welches Segment ischämischen vorgenommen werden, ob oder ob nicht der Gallengang enthalten ist und die Länge des Zeitraums der Reperfusion 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21. Zusätzlich wird , wenn dieses Modell die Auswirkungen der Verabreichung eines Moleküls , dem Weg der Verabreichung zu untersuchen verwendet wird 8 auch heterogen ist, 10, 11,„> 12, 14, 15, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 24. Es gibt mehrere Vorteile der beschriebenen Vorgehensweise. Erstens direkte Kanülierung des Portals Versorgung des ischämischen Segment ermöglicht die direkte segmentale hepatischen Lieferung die pharmakologische Substanz untersucht. Diese Nutzung der anderen Lappen der Leber als interne Kontrolle ermöglicht. Zweitens segmentale Leber Kanülierung für ein reduziertes Verteilungsvolumen für das Molekül untersucht werden kann. reduziert Dieser Ansatz, wodurch das Risiko von systemischen Nebenwirkungen wie direkt in die Leber interessierendes Segment. Direkte Kanülierung des hepatischen Segments ermöglicht die Substanz die Substanz injiziert, um vor-Ischämie geliefert werden, Intra-Ischämie oder post-Ischämie. Dies ermöglicht die Untersuchung der Wirkung des Moleküls an einer beliebigen Stelle in der Ischämie-Reperfusionsschaden Zyklus. Mit zunehmender Länge der ischämischen Zeit und erhöhte Verletzungs zusätzliche Möglichkeit zur Leberregeneration studieren würde zur Verfügung steht.

Es gibt auch einige Grenzen dieses Ansatzes. Die erste ist Anlaufkosten. Der Kauf eines Operationsmikroskop konnte eine deutliche Anlaufkosten für ein Labor sein, die nicht bereits eine besitzen. Diese Technik kann ohne Mikroskop schwierig oder unmöglich sein. Die zweite ist Lernkurve Zeit. Obwohl dieses Verfahren relativ einfach ist, dauert es einige Übung erfordern und es ist wahrscheinlich, dass ein Anfänger eine beträchtliche Anzahl von Verfahren erfordert ein Experte zu werden.

Zusammenfassend ermöglicht dieses Modell für eine reproduzierbare, einfache und kostengünstige Plattform Leberischämie-Reperfusionsschaden zu studieren. Obwohl in dem hier beschriebenen Protokoll Polyethylen glycol-Superoxid - Dismutase, ein Radikalfänger 25, infundiert wurde, könnte dieses Modell verwendet werden , um eine Vielzahl von verschiedenen pharmakologischen Substanzen , um einzuzuflößen ihre Auswirkungen auf die I / R - Schaden in der Leber zu bewerten.

Disclosures

Alle Autoren berichten, dass sie keine Angaben haben.

Acknowledgments

Wir möchten, dass Dennis Mathias für seine illustrative Arbeit anzuerkennen. Diese Arbeit wurde durch die NIH T32AI 106704-01A1 und T. Flesch Fonds für Organtransplantation, Perfusion, Ingenieurwesen und Regeneration an der Ohio State University unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sprague-Dawley Rat  Harlan Sprague Dawley Inc.  200- 250 grams 
Surgical Microscope  Leica  M500-N w/ OHS
Charcoal Canisters Kent Scientific SOMNO-2001-8
Isoflurane Molecular Weight 184.5  Piramal Healthcare
Pressure-Lok Precision Analytical Syringe   Valco Instruments Co, Inc.  SOMNO-10ML
Electrosurgical Unit Macan  MV-7A
Warming Pad Braintree Scientific  HHP2
SomnoSuite Small Animal Anesthesia System Kent Scientific  SS-MVG-Module
PhysioSuite Kent Scientific  PS-MSTAT-RT
Isoflurane chamber  Kent Scientific SOMNO-0530LG
SurgiVet Isotec CDS 9000 Tabletop
Oxygen  Praxair 98015
27-0 Micro-Cannula Braintree Scientific  MC-28
Rib retractors  Kent Scientific  INS600240
Polyethylene Glycol - Superoxide Dismutase (PEG-SOD) Sigma Aldrich  S9549 SIGMA
GenieTouch Kent Scientific
Normal Saline Baxter NDC 0338-0048-04
4 x 4 Non-Woven Sponges  Criterion 104-2411
Sterile Q-Tips Henry Schein Animal Health 1009175
U-100 27 Gauge Insulin Syringe Terumo 22-272328
5 mL Syringe BD  REF 309603
4-0 Braided Silk Suture Deknatel, Inc. 198737LP
7-0 Braided Silk Suture Teleflex Medical  REF 103-S
1.8 mL Arcticle Cryogenic Tube USA Scientific  1418-7410
Microsurgical Instruments
Name Company  Catalog Number Comments
Small Scissors  Roboz  RS-5610
Large Scissors S&T  SAA-15
Forceps - Large Angled S&T  JFCL-7
Forceps - Small Angled  S&T FRAS-15 RM-8
Clip Applier ROBOZ RS-5440
Scissors - non micro FST 14958-11 14958-11
Forceps - Straight Tip  S&T  FRS-15 RM8TC
Large Microsurgical Clip Fine Scientific Tools 18055-01
Small Microsurgical Clip Fine Scientific Tools 18055-01
Small Microsurgical Clip Fine Scientific Tools 18055-02
Small Microsurgical Clip Fine Scientific Tools 18055-03
Other Instruments
Name Company  Catalog Number Comments
Small Mosquito Clamps Generic 
Analysis 
Name Company  Catalog Number Comments
Alannine aminotransferase (ALT) assay  Biovision K752-100
Malondialdehye (MDA) assay  Abcam  ab118970
Glutathione (GSH) assay Cayman Chemical 7030002
Antibodies - Cleaved Caspase-3 and Actin  Cell Signaling Tecnology Antibody 9661
ImageJ Software  National Institutes of Health 
RIPA Lysis and Extraction Buffer  Millipore 10-188

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References

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