Определение относительной клеточной поверхности и Total экспрессии рекомбинантных ионных каналов с помощью проточной цитометрии

JoVE Journal
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Наследственные нарушения ритма сердца часто бывают вызваны мутациями, которые изменяют доставку поверхности одного или нескольких ионных каналов. Здесь мы приспосабливаемся проточной цитометрии анализов, чтобы обеспечить количественную оценку относительной общей и поверхностной клеточной экспрессии белка рекомбинантных ионных каналов, выраженные в клетках TSA-201.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Bourdin, B., Segura, E., Tétreault, M. P., Lesage, S., Parent, L. Determination of the Relative Cell Surface and Total Expression of Recombinant Ion Channels Using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (115), e54732, doi:10.3791/54732 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Эта статья обеспечивает надежный анализ, чтобы сообщить об относительной экспрессии на клеточной поверхности мембранных белков, таких как ионные каналы, выраженные в рекомбинантных клетках с использованием существующей технологии проточной цитометрии. Ионные каналы являются пороформирующие мембранные белки, которые отвечают за регулирование электрических сигналов с помощью стробирования поток ионов через клеточную мембрану. Они классифицируются по механизму активации, природы и селективности видов ионов, проходящих через поры, где они локализованы. На клеточном и тканевом уровнях, макроскопические потоки ионов через ионные каналы являются продуктом биофизической (стробирования и проникания), биохимические (фосфорилирования), и биогенеза (синтез, гликозилирование, торговля людьми и деградации) свойств 1. Каждый из этих процессов является уникальным для каждого типа ионных каналов и оптимизирована для выполнения физиологической роли ионного канала. Следовательно, изменения в любой из этих доработаны процессов черезунаследованные или генные модификации, часто упоминается как "channelopathy", может быть вредным для клеточного гомеостаза. Важно подчеркнуть, что обеспечение «правильного» количества ионных каналов на поверхности клетки имеет решающее значение для клеточного гомеостаза. Даже небольшое увеличение (коэффициента усиления из-функции) и небольшое снижение (с потерей функции) в канале активности ионов имеют потенциал, чтобы вызвать серьезные патологии в течение жизни. Дефекты в доставке на клеточной поверхности зрелых ионных каналов является важным фактором , определяющим в многочисленных каналопатии, таких как муковисцидоз (CFTR ионного канала) 2 и сердечных аритмий длинного интервала QT формы синдрома (сердечных калиевых каналов) 3.

Каналопатии связаны с сердечной внезапной смерти 4. В настоящее время во всем мире распространенность всех сердечных каналопатии считается по меньшей мере , 1: 2,000-1: 3000 в индивидуальной 5 и несут ответственность за примерно половину внезапной сердечной смерти от аритмии окSES 6. Дисфункция сердечного напряжения закрытого калиевые, натрий-и кальциевые селективные ионные каналы, как известно, играют ключевую роль в этом процессе. 1.2 потенциалзависимыми кальциевых каналов L-типа Ca V необходим для инициации синхронизированного сокращения мышц сердца. Сердечный L-типа Ca V 1,2 канал белковый комплекс мульти-субъединица состоит из основного порообразующего Са V & alpha ; 1 субъединицы и Ca V ß и Ca V α2δ1 вспомогательных подразделений 7-12. Обратите внимание , что полный комплект вспомогательных подразделений требуется для производства функциональных Ca V 1,2 каналов в плазматической мембране и динамические взаимодействия между этими субъединицами имеют важное значение для поддержания нормальной электрической функции сердца 13. Ca V ß способствует поверхности экспрессии клеток Са V 1,2 каналов через нековалентному наномолярной гидрофобного взаимодействия 14. Co-выражение V α2δ1 субъединиц Wi Caго Са V SS переплете Са V α1 стимулирует экспрессию пикового тока ( от 5 до 10 раз) и способствует активации канала при более отрицательных напряжений. Усиление-оф-функции мутации порообразующего субъединицей Ca V 1.2 были связаны с формой желудочковой аритмией называется длинный QT синдром 15 в то время как множество точечных мутаций в трех основных субъединиц , образующих L-типа Ca V 1.2 канала были выявлены у пациентов , страдающих от аритмий короткого интервала QT формы синдрома 16,17. Ионные каналы являются мембранные белки, которые могут быть исследованы с биохимической перспективной (белковой химии) с использованием или электрофизиологических инструментов (вольт-генераторные машины) и часто используя эти дополнительные подходы. Электрофизиологии, в частности , цельноклеточной патч-зажим, является подходящим подход к выяснению функции ионных каналов 15 , но не может разрешить изменения в области незаконного оборота белка с изменениями в их биофизическихсвойства. химии белков, однако, часто ограниченное применение из-за относительно низкой экспрессии больших мембранных белков относительно небольших растворимых белков. Надежные методы с высокой пропускной способностью с помощью флуоресцентной считывания необходимо разработать для того, чтобы конкретно рассмотреть дефекты белка биогенезе вызывая изменения в клеточной поверхности экспрессии ионных каналов.

Проточная цитометрия является биофизической технологии , используемой в подсчета клеток, сортировки, обнаружения биомаркеров и белковой инженерии 18. Когда раствор образца живых клеток или частиц вводят в проточном цитометре, клетки упорядочены в единый поток , который может быть зондируется системой обнаружения машины (рис 1). Первый поток цитометра прибора , произведенного в 1956 году 19 обнаружен только один параметр , но современные проточные цитометры несколько лазеров и детекторов флуоресценции , которые позволяют обнаруживать более 30 флуоресцентных параметров 20,21.Фильтры и зеркала (эмиссионные оптика) направляют рассеяния света или лампы дневного света клеток к электронной сети (фотодиод и детекторы), которые преобразуют свет пропорционально его интенсивности. Цифровые данные анализируются с помощью специализированного программного обеспечения и первичный выход отображается как точка участка 21.

Рисунок 1
Рисунок 1:. Биофизические принципы проточной цитометрии сортировки Отдельные клетки выталкиваются через сопло под высоким давлением в потоке оболочки текучей среды , которая перемещает их через один или несколько лазерных точек допроса. Световой пучок отклоняется проходящими клеток и света, собираемого в прямом направлении (вперед Scatter, FCS), отправляется на фотодиод, который преобразует свет в сигнал, пропорциональный размеру клетки. Свет также собирается под углом к ​​лазерному пути 90 ° и направлен детекторы (называемые также умножители (ФЭУ)).Этот свет проходит через дихроичных зеркал, которые позволяют обнаружение бокового рассеяния сигнала (SSC), который отражает детализацию в клетках, а также флуоресцентных излучений, если возбужденные флуорохромы присутствуют в клетке. Три детекторы (зеленый, желтый и красный) представлены с разными фильтрами длины волны полосовых, что позволяет одновременное обнаружение различных флюорохромами. Различные сигналы преобразуются в цифровую форму с помощью внешнего компьютера и преобразуются в данные , которые будут проанализированы для количественного определения характеристик ячеек. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Высокой пропускная способность цитометров была использована для количественного определения относительной экспрессии мембранного рекомбинантного дикого типа и торговли людьми с дефицитом напряжения закрытого L-типа Ca V 1.2 каналов и связанных с ними субъединиц в живых клетках. кДНК создает совместноеDing для белков были двукратно помеченный одновременно нести внеклеточный нефлуоресцентного эпитоп, который может быть обнаружен с помощью непроницаемого флуоресцентного конъюгированных антител и внутриклеточный флуорофором, который конститутивно флуоресцентный. Оба внеклеточный эпитоп, вставленный во внеклеточной петле белка, и внутриклеточный флуорофор, вставленный после С-конца, пересчитаны с белком. В этой серии экспериментов V α2δ1 белок Са сконструированные для экспрессии внеклеточного гемагглютинина (HA) эпитоп (YPYDVPDYA) обнаружен непроницаемым FITC (флуоресцеин изотиоцианатом) -conjugated анти-HA и mCherry как внутренняя внутриклеточного флуорофора. Для определения относительного уровня экспрессии на клеточной поверхности клиновидного α2δ1 mCherry-Ca HA-меченый белок, рекомбинантные клетки , экспрессирующие слитый белок , собирали после трансфекции, и окрашивали ФИТЦ-конъюгированного мышиных моноклональных анти-HA эпитоп тег antibodY (рисунок 2). FITC представляет собой органическое соединение, которое флуоресцентный значительно меньше, чем ферментных репортеров и, следовательно, как вероятно, не препятствовать биологической функции. mCherry- Ca V α2δ1-HA избыточно экспрессируется в TSA-201cells, производит значительное увеличение 3-журнала в флуоресценции FITC и mCherry флуоресценции на двумерных участков 22. Учитывая, что эпитоп HA находится во внеклеточной части белка, интенсивность флуоресценции для FITC, полученный в присутствии неповрежденных клеток отражают относительный показатель клеточной поверхностной экспрессии HA-меченого белка. Доступность эпитопа HA в конструкциях систематически проверяется путем измерения сигнала FITC после клеточной проницаемости. Эта мера также служит для подтверждения нормализованное общее экспрессию белка, так как относительные интенсивности флуоресценции для FITC оценивается в проницаемыми клеток качественно сопоставимы с относительными значениями флуоресценции Foг mCherry измеряется при проницаемыми и непермеабилизированных условиях 22,23. Важно отметить, что собственный спектр флуоресценции смещается в сторону более высоких значений после того, как пермеабилизации но сообщается единственное значение является изменение интенсивности флуоресценции по сравнению с конструкцией управления. Относительные изменения интенсивности флуоресценции для испытаний конструкций оцениваются с использованием интенсивности флуоресценции (ΔMean ΔMFI) значения для каждого флуорофора (mCherry или FITC). Эксперименты предназначены для измерения интенсивности флуоресценции тест конструкта по отношению к интенсивности флуоресценции конструкции управления выраженной в тех же условиях, чтобы ограничить экспериментальные вариации в собственной флуоресценции флуорофора-конъюгированных антител. Два мембранных белков были успешно изучены с помощью этого анализа: в качестве порообразующего субъединицей напряжения закрытого кальциевых каналов L-типа Ca V 1,2 14,22 и в другой серииЭксперименты, внеклеточный Ca вспомогательный V α2δ1 субъединица 22,23. Следующий протокол использовали для определения экспрессии клеточной поверхности Са V α2δ1 субъединицей сердца L-типа Ca V 1,2 каналов в контрольных условиях и после мутаций , влияющих на посттрансляционной модификации ионного канала. В рамках стандартных экспериментальных условиях клеточной поверхности флуоресценции FITC увеличивает квази- линейно с выражением кДНК , кодирующей mCherry-Ca V α2δ1-HA белков (рисунок 5 из ссылки 22).

фигура 2
Рис . 2: Схематическое представление полной и мембранной маркировки в проточной цитометрии экспериментальный протокол Схема описывает некоторые из основных шагов , необходимых для количественной оценки относительной общей и поверхностной клеточной экспрессии рекомбинантных ионных каналов Ф.Л.вл цитометрии. Клетки трансфицируют с двойным меченого строительство mCherry-Ca V α2δ1-HA в TSA-201 клеток (1) и окрашивают до или после того, как пермеабилизации (2). Многопараметрические данные получают в проточном цитометре (3) для многомерного анализа (4). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Конструкции Вдвойне Меченый ДНК

  1. Вставьте эпитоп HA (YPYDVPDYA) во внеклеточной линкера Ca V α2δ1 между D676 и R677 с помощью сайт - направленного мутагенеза (рис 3B) 20. Использование прямого праймера gccggattatgcgGGAAAACTCCAAACAACC и обратного праймера acatcatacggataTCAATAAATTCATTGAAATTTAAAAGAAATTC.
  2. Подклон последовательность кДНК меченой HA Ca V α2δ1 в вектор экспрессии млекопитающих pmCherry-N1 предназначенный для экспрессии белка , слитый с N-концом mCherry между сайтами SacI и SalI (фигура 3В) 20.
    Примечание: Соответствующая функция канала должна быть проверена с помощью конструкции управления с использованием стандартных электрофизиологических методов 24.

2. опосредованную липосомами Переходный Трансфекция (30 мин, все шаги выполняются под ламинарным потоком Hood)

  1. День 1: Пластинчатые полмиллиона клеток TSA-201 (или HEKT) в35 мм чашки культуры с 2 мл Дульбекко высокой глюкозы минимально необходимой среды Игла (DMEM-HG), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллин-среде стрептомицина (PS) культуры. Граф клеток с использованием стандартного гемоцитометра. Оценка жизнеспособности клеток из фракции образца клеток с использованием трипанового синего. Пластинчатые достаточное количество клеток, чтобы достигнуть 90% сплошности во время трансфекции.
  2. День 2: Изменение культуральной среды с 2 мл свежей предварительно нагретом (37 ° С) культуральной среде без PS.
  3. Для каждого образца трансфекции, подготовить две 1,5 мл пробирки. В трубе 1, развести 4 мкг ДНК в 250 мкл восстановленного сыворотки среды. В трубке 2, смешивают 10 мкл липосом-опосредованной трансфекции реагента 250 мкл культуральной среды, не содержащей сыворотки снижается. Осторожно перемешать реагент трансфекции перед использованием.
  4. Выдержите в течение 5 мин при комнатной температуре.
  5. Смешайте содержимое трубки 1 и трубки 2, аккуратно перемешать и инкубировать по меньшей мере 20 мин при комнатной температуре.
  6. Добавить липосом / DNА комплексы в культуре клеток и осторожно встряхните культуры блюдо перемешать.
  7. Инкубировать при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2 атмосферы в течение 24 часов.

3. Окрашивание клеток для проточной цитометрии (3 ч)

  1. Подготовка образцов мобильных
    1. День 3: Удалить среду из культуральной чашки тщательно и промыть клетки с 400 мкл предварительно нагретом (37 ° С) 0,05% трипсин-ЭДТА 1x (этилендиаминтетрауксусной кислоты).
    2. Добавить 400 мкл трипсина-ЭДТА и инкубировать блюдо при температуре 37 ° С в атмосфере 5% CO 2 атмосфере в течение 5 мин , чтобы позволить клеткам отсоединиться от тарелки.
    3. Остановить фермент пищеварение путем добавления 1 мл культуральной среды без холодной PS и промойте все клетки с поверхности пипеткой осторожно 4-5 раз. Избегайте чрезмерного пищеварения и чрезмерной пипеткой, чтобы уменьшить гибель клеток.
    4. Сбор клеток в 1,5 мл пробирки и помещают непосредственно на льду. Использование льда холодные растворы и сохранить клетки при 4 ° С для предотвращения интернализацииповерхностных антигенов. Снижение освещения для ограничения фотообесцвечивания флуоресцентного сигнала.
    5. Центрифуга трубки при 400 мкг в течение 5 мин при 4 ° С. Тщательно аспирата и отбросить супернатант.
    6. Повторно приостанавливать осадок в 1 мл фосфатно-солевого буфера 1х (PBS) с целью получения суспензии отдельных клеток.
    7. Кратко вихре трубки очень аккуратно и повторите шаги 3.1.5 и 3.1.6, чтобы полностью удалить культуральной среды.
    8. Повторное приостановить осадок в 600 мкл 1x PBS и регулировать концентрацию клеток до минимум 3 × 10 6 клеток / мл.
    9. Разделите клетки в двух новых 1,5 мл пробирки для внеклеточного и внутриклеточного окрашивания. Включить соответствующие элементы управления для различения специфическое окрашивание от неспецифического окрашивания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: контрольное антитело изотипа помогает оценить уровень фонового окрашивания и в идеале должны соответствовать каждого первичного антитела вида хозяина изотип и флуорофор. Используйте контроль изотипа и конъюгированных антител в то жеКонцентрацию белка.

Таблица 1
Таблица 1: Flow-цитометрии контрольные образцы для эксперимента непермеабилизированных и проницаемыми клетки Каждый эксперимент должен включать в себя следующие негативные элементы управления:. (1) Nontransfected клетки (без антител, с изотипа или с сопряженными антителом). (2) Трансфицированных клетки с интересующим белком субклонировали в плазмиде без конститутивного флуоресцентного внутриклеточного флуорохромом (pCMV- Са V α2δ1-HA) , или с двукратно меченого конструкции (pmCherry-Ca V α2δ1 и инкубируют без антител, с изотипа или с сопряженный антитела). Одиночные контроля цвета используются для компенсации флюорохром перекрытия излучения. Одни и те же элементы управления для запуска непермеабилизированных и проницаемыми условий в каждой серии экспериментов.

  1. Поверхности клеток Окрашивание неповрежденнымиЖивые клетки
    1. Алиготе 1 х 10 6 клеток / 100 мкл в 1,5 мл пробирки.
    2. Добавляют ФИТЦ-конъюгированного моноклональные антитела анти-HA при концентрации 5 мкг / мл и, вихревое перед инкубацией клеток на качалке платформы (200 оборотов в минуту) в темноте при температуре 4 ° С в течение 45 мин.
      Примечание: Оптимальная концентрация антител определяли в предварительных экспериментах по титрованию (рисунок 4).
    3. Удалить клетки из темноты и добавить 900 мкл 1X PBS / пробирку. Центрифуга при 400 х г в течение 5 мин при температуре 4 ° С.
    4. Аспирируйте супернатант и ресуспендируют осадок в 1 мл 1x PBS, вихря и центрифуге при 400 х г в течение 5 мин при температуре 4 ° С.
    5. Повторите промывку (этап 3.2.4) дважды для удаления несвязанного антитела. Если несопр первичное антитело используют, инкубировать с соответствующим вторичным антителом.
    6. После последней промывки клетки вновь суспендируют в 500 мкл PBS и 1х передача одноклеточной суспензии в 5 мл проточной цитометрии трубки. Держите ячейкуs в темноте при 4 ° С до запуска образца.
    7. Запуск образцов на цитометра потока. Для достижения наилучших результатов анализа клетки на проточном цитометре как можно скорее и не позднее, чем через 24 часа после.
  2. Внутриклеточные Окрашивание: Закрепление, пермеабилизирующего и Окрашивание
    1. Аликвоты 1 × 10 6 клеток / 100 мкл в 1,5 мл пробирки и центрифугируют при 400 х г в течение 5 мин при температуре 4 ° С.
    2. Удалите супернатант и ресуспендирования клеток в 100 мкл фиксации-пермеабилизации раствора непосредственно со склада.
    3. Инкубируют в темноте при температуре 4 ° С в течение 20 мин.
    4. Добавляют 100 мкл свежеприготовленного 1x пермеабилизации-буфера для промывки (разбавленные 10х пермеабилизации-промывочный буфер в дистиллированной H 2 O). Вихревые и осадка клеток с использованием настольной центрифуге при 400 мкг в течение 5 мин при 4 ° С.
    5. Отберите и отбросить супернатант.
    6. Повторите шаги 3.3.4 и 3.3.5.
    7. Добавить FITC-конъюгированного моноклональных анти-HA антитела на 5мкг / мл в 100 мкл 1x пермеабилизации-буфера для промывки и, вихрем перед инкубацией клеток в темноте при температуре 4 ° С в течение 30 мин.
      Примечание: внутриклеточное окрашивание производится по той же методике, что и использованный для окрашивания поверхности клетки. Сапонины-опосредованной проницаемости клеточной мембраны является однако, быстро обратимый процесс, поэтому важно, чтобы заменить 1X PBS буфером 1x Пермь / промывочного, чтобы сохранить клетки в постоянном присутствии сапонинов во время внутриклеточного окрашивания.
    8. Удалить клетки из темноты и добавляют 100 мкл пермеабилизации-промывочный буфер. Центрифуга при 400 х г в течение 5 мин при температуре 4 ° С.
    9. Отберите тщательно супернатант и ресуспендируют осадок в 100 мкл пермеабилизации-буфера для промывки, вихря и центрифуге при 400 х г в течение 5 мин при температуре 4 ° С.
    10. Повторите промывку (этап 3.3.9) еще раз для удаления несвязанного антитела.
    11. После последней промывки клетки вновь суспендируют в 500 мкл PBS и 1х передать грехгле клеточной суспензии до 5 мл проточной цитометрии трубок. Хранить клетки в темноте при 4 ° С до инъекции пробы в проточном цитометре.
    12. Запуск образцов на цитометра потока. Запуск фиксированных образцов на цитометра как можно скорее, но не позднее чем за 1 неделю после окрашивания. Выполните непермеабилизированных и проницаемыми клетки в тот же день.

4. Проточная цитометрия

  1. Проточный цитометр Cell сортировщик Daily Setup
    1. Включите программное обеспечение проточной цитометрии. До эксперимента, откалибровать и настроить поток цитометра ячейки сортировщик для обеспечения оптимальной производительности инструмента (т.е. лазер и оптика выполняют спецификации, лазерный и поток ячейки правильно выровнены) с помощью установки прибора бусинки.
    2. Используйте насадку 100 мкм с 20 фунтов на квадратный дюйм давления оболочки.
      Примечание: Насадка не должна быть изменена на скамейке проточном цитометре.
    3. Установить скорость потока цитометр в соответствии с производстэр спецификация. Чрезвычайно высокие скорости потока уменьшается чувствительность при обнаружении изменений в флуоресценции.
    4. Выберите синий (488 нм для возбуждения флуоресцеин Isothiocayanate или FITC) и желто-зеленый (561 нм для возбуждения mCherry) лазеров. Собирают уровни флуоресценции FITC и mCherry с 530/30 нм и с 610/20 нм полосовой фильтр соответственно.
    5. Приобретать рассеяния вперед (FCS) в зависимости от бокового рассеяния (SSC) точка участка для неокрашенных клеток с использованием линейной шкалы. Отрегулируйте усиление каждого детектора, чтобы визуализировать клетки в нижнем левом квадранте точечного участка.
  2. Пример Чтение Малонарушенные непермеабилизированных клеток
    1. Установите P1gate для живых непермеабилизированных клеток путем очерчивания свободную форму вокруг клеток, которые будут проанализированы за исключением остатков клеток и клеточных агрегатов, тем самым ограничивая сигнал флуоресценции интактных клеток.
      Примечание: Live / мертвые красители исключения могут быть использованы для облегчения размещения затвора на живые клетки. Набор 10000 событий для записитормозящей ворот P1. Установите на более высокий число событий, если это будет необходимо.
    2. Приобретать mCherry по сравнению с FITC двупараметрической контура участка для определения базовой линии аутофлюоресценции неокрашенных клеток. Используйте би-логарифмической шкалы , чтобы показать отрицательные значения и улучшить разрешение между населением 25. Отрегулировать напряжение каждого из детекторов для установки неокрашенных отрицательных клеток в нижней части первых десяти единиц графиков интенсивности флуоресценции журнала.
    3. Приобретают все неповрежденные непермеабилизированных образцы с использованием параметров, установленных в 4.1.5 и 4.1.6, и собирать FSC, SSC и сигналы детекторов флуоресценции.
    4. Экспорт и сохранение * .fcs файлы, которые будут использоваться для анализа с помощью проточной цитометрии программного обеспечения для анализа.
  3. Пример Чтение проницаемыми клеток
    1. Перемещение P1 ворота для выбора живых клеток в образцах проницаемыми и регулировать FSC и SSC напряжения, как показано в разделе 4.1.5 и 4.1.6.
    2. Приобретают все проницаемыми образцы и собирать FSC, SSC Aй сигналы детекторов флуоресценции.
    3. Экспорт и сохранение * .fcs файлы, которые будут использоваться для анализа с помощью проточной цитометрии программного обеспечения для анализа.
  4. Анализ данных
    1. Запуск проточной цитометрии программного обеспечения для анализа и импорта * .fcs файлов, сохраненных в 4.2.4 и 4.3.3.
    2. Нажмите на первом образце, перечисленных в окне рабочего пространства. Новое окно имени трубки идентификационного номера открывается автоматически. Запустить процесс стробирования в участке SSC по сравнению с FSC. Нарисуйте ворота (P1) с помощью значка Эллипс вокруг живых клеток и устранить любой мусор, мертвые клетки, или агрегаты, которые имеют различные рассеяния вперед и боковые разброс, чем живые клетки
    3. Чтобы нарисовать двухпараметрическое контур график mCherry (ось у) по сравнению с FITC (ось х) интенсивности флуоресценции живых клеток, нажмите сначала на оси х и выбрать-A FITC канал, а затем нажмите на у Оу и выбрать PE-mCherry-A канал. Нажмите на иконку "Quad", чтобы поместить квадранта маркер на краюutofluorescent клеток в каждом канале флуоресценции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ворота расположены вокруг FITC и mCherry положительных клеток является Р2 ворот. Флуоресценция отрицательной клеточной популяции называется Р3 ворот. На рисунке 5 репрезентативного метода стробирования , используемой в данной статье.
    4. Выберите P2 и P3 ворота и нажмите на иконку "Добавить Статистика" в исходном окне рабочего пространства. Нажмите на кнопку "Count" (количество положительных клеток) и нажмите на кнопку "Среднее" (средней интенсивности флуоресценции каждого флуорохромом) или "Медиана" (медиана интенсивности флуоресценции каждого флуорохромом) Статистика среди списка опций. Нажмите на иконку "Добавить Статистика" еще раз. Все эти значения автоматически передаются в исходное окно рабочего пространства.
      Примечание: «среднее» используется только тогда, когда интенсивность флуоресценции следует нормальное распределение. В любом другом случае, нажмите на вкладку "Медиана". MFI, таким образом, может относиться к средняя флуоресценция Intensitу или медиана интенсивности флуоресценции.
      Примечание: Следующий шаг должен применять параметры и статистику Врат "ко всем образцам зондировали с помощью цитометра.
    5. В окне рабочей области, использовать мышь, чтобы перетащить параметры ворота и статистика на линии, помеченной всех образцов.
    6. Сформировать пакетный отчет двумерных контурных графиков (mCherry против FITC) и гистограмм (подсчет клеток в зависимости от интенсивности флуоресценции) для непермеабилизированных и проницаемыми клеток (Фигуры 6A - В).
    7. Из статистики, полученной на этапе 4.4.4, вычислить среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) для каждого флуорохрома для окрашенных клеток. Из этого значения, вычесть значение MFI, полученную из клеток неокрашенных для количественной оценки поверхности и общую экспрессию интересующего белка.
    8. Отчет значения ΔMFI для каждого флуорофора (mCherry и FITC) (рис 6C - D). Нормализация ΔMFI измеренную для Ca Примечание: Абсолютное значение интенсивности флуоресценции может резко изменяться в зависимости от партии антител и технических способностей каждого лаборантом, следовательно, необходимость нормализации интенсивности флуоресценции мутантного конструкции, используя конструкцию WT.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В данной статье описывается надежный протокол для количественной оценки общей и клеточной поверхности рекомбинантных ионных каналов, выраженные в TSA-201cells потоком двухцветного цитометрии. В качестве примера, относительная клеточной поверхности и общее экспрессии белка определяли количественно для V α2δ1subunit Са. Для выполнения потока двухцветную цитометрии, Са V α2δ1 вдвойне помечены выразить внеклеточный нефлуоресцентного эпитоп HA , который может быть обнаружен с помощью анти-HA ФИТЦ-конъюгированного антитела и конститутивного флуоресцентного внутриклеточного mCherry флуорофора. Спектры возбуждения и эмиссии для FITC и mCherry показывают, что FITC возбуждается с эффективностью 88% по 488 нм лазер, но КПД снижается до 0% с 561 нм лазером. MCherry показывает 63,9% от его максимальной флуоресценции при возбуждении лазером на 561 нм , но только 7,6% с 488 нм лазера (рис 3). Возбуждение и излучение спеCtra для обоих флуорофоров демонстрируют оптимальный сбор света и минимальное перекрытие с различными лазерами и фильтрами выбранных. Проточная цитометрия анализы могут обеспечить количественную информацию об относительной экспрессии мембранных белков из большой популяции клеток до тех пор , как MFI для данного флуорохрома прямо пропорциональна выражению белка Ca V α2δ1 на каждой ячейке , а не от количества флуоресцирующих клеток. Это связано с использованием концентрации флуоресцентного-конъюгированных антител за насыщением. Кривая титрования для анти-HA ФИТЦ-конъюгированного антитела , связывающегося с Ca V α2δ1 (рис 4) показаны три фазы. В то время как не флуоресценции не было обнаружено в первой фазе, интенсивность флуоресценции экспоненциально возрастает с увеличением концентрации антител во второй фазе. После того, как точки насыщения (третий этап), увеличение концентрации антител не оказывает никакого влияния на относительную флуоресцентной Intenплотность (RFI) ФИТЦ. Анти-HA FITC-конъюгированные антитела точка насыщения была установлена ​​на уровне 5 мкг / мл, обеспечивая таким образом, что концентрация конъюгированного-антитела не ограничивает MFI в ходе экспериментов.

Помечено Ca V α2δ1was выражается в TSA-201cells и проточной цитометрии анализы проводили в присутствии FITC-конъюгированным анти-HA в непермеабилизированных клеток (рисунок 5). Соответствующие контроли (Таблица 1) были проанализированы на цитометр потока , что значения атрибутов ху для каждой ячейки , проходящей через лазерный луч. Распределение клеток визуализируется на участках точечных (рис 5А). FCS / SSC точечные участки подтверждают , что получение образцов клеток обеспечивает клеточную суспензию с высокой жизнеспособностью (рисунок 5BA). Выбранный ворота для живых клеток (P1) составляет 75% от общего числа клеток, проанализированных. Общее экспрессия белка Oе Са V α2δ1 в клетках TSA-201 считается пропорциональной флуоресценции mCherry. Как видно на mCherry по сравнению с FITC изополей и гистограмм (рис 5BB - до Р.Х.), 47 2% TSA-201 клеток , трансфицированных pmCherry-Са V α2δ1-HA были обнаружены значительно выразить mCherry флуоресценции, а также показывает значительную FITC флуоресценции из - за связывание с внешним HA тег Ca V α2δ1 в непермеабилизированных клетках. Отрицательные контрольные эксперименты, проведенные без антитела или с изотипа показывают, что FITC связывается только или главным образом к положительно трансфицированных клеток.

Этот протокол был использован для характеристики роли N-гликозилирования на общей и поверхностной клеточной экспрессии Са V α2δ1 в TSA-201cells 23. Эксперименты проводились в непермеабилизированных клетках, чтобы оценить экспрессию на клеточной поверхностии в проницаемыми клетках, чтобы оценить общее экспрессию белка, а также подтверждающие доступность эпитопа HA. Относительное выражение Ca V α2δ1 был вычислен на основе ИТР оценивается для каждого флуорофора (mCherry или FITC). Значения ΔMFI для мутантов были нормализованы к максимальному значению , измеренному в тот же день для mCherry-Са V α2δ1-HA WT выражается в тех же условиях. Это важно, чтобы учитывать изменения в течение долгого времени в абсолютной интенсивности флуоресценции конъюгированных антител анти-HA FITC. Как видно на рисунке 6А ΔMFI для FITC в непермеабилизированных клетках был сильным для WT и 4xNQ построить , но близко к фоновому уровню флуоресценции для данной конструкции 16xNQ указывает , что белок практически отсутствует из плазматической мембраны. Анализы проводились после проницаемости клеточной мембраны, показал, что общее выражение белка конструкции 16xNQ был также значительно снижен ли онобыло выведено из флуоресценции FITC в проницаемыми клеток или от конститутивного mCherry флуоресценции , измеренной в непермеабилизированных и в пермеабилизированных клетках (фиг.6С - D). Как видно на рисунке 6B, клеточные уровни автофлюоресценции увеличилось после проницаемости клеточной мембраны, что предотвращает сравнение абсолютных значений флуоресценции между неповрежденными непермеабилизированных и проницаемыми клеток. ΔMFI флуоресценции измеряли mCherry была одинакова для обоих непермеабилизированных и проницаемыми клетками, означающей, что решение пермеабилизации не изменяет относительную флуоресценции сигнала mCherry. Мутации N-сайтов гликозилирования было связано с уменьшением интенсивности флуоресценции для mCherry поддерживающей опубликованного наблюдения , что белок Биогенез / стабильность была снижена 23. В этой серии экспериментов, относительная сигнал флуоресценции для FITC измеряется в проницаемыми клеток оказалось бе даже меньше относительного сигнала для mCherry позволяет предположить, что статус гликозилирования N-тип белка может влиять на интенсивность флуоресценции, обнаруженную с FITC-конъюгированным анти-HA антитела во внеклеточном домене. В целом изменения в относительной флуоресценции FITC до после проницаемости клеточной мембраны обеспечивают надежный показатель для количественной оценки экспрессии белка.

Рисунок 3
Рисунок 3: FITC и mCherry образуют подходящую пару флюорохромами для двухцветных цитометрии анализов возбуждения (пустые кривые) и спектры излучения (заполненные кривые) для FITC возбужденных с 488 нм синим лазером (Аа) и mCherry возбуждении 561 нм желтый-. зеленый лазер (Ab). FITC и mCherry флуоресценции были собраны с 530/30 нм и 610/20 нм bandpass фильтры соответственно. Длина волны различных лазеров (цветные вертикальные линии) и фильтров (цветные прямоугольники) выбраны для оптимального сбора света и минимальным перекрытием. (Б) Схематическое представление mCherry-Ca V α2δ1-HA белка. Ca V α2δ1 был вдвойне помечены выразить внеклеточный нефлуоресцентного эпитоп HA , которые могут быть обнаружены с помощью анти-HA FITC-конъюгированного антитела и конститутивного флуоресцентного внутриклеточного mCherry флуорохромом. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4
На рис . 4: титрование анти-HA ФИТЦ-конъюгированного моноклонального антитела , связывающегося с Ca V α2δ1 TSA-201 клетки были трансфицированы с pmCherry-Ca V & # 945; 2δ1-ХА и инкубировали с различными анти-HA FITC-конъюгированных или изотипа антител. Только сигнал FITC анализируется в этой панели. (А) гистограмм однопараметрические отображения относительное количество клеток на оси у и интенсивность флуоресценции FITC на оси х , для анти-HA ФИТЦ-конъюгированного антитела диапазоне концентраций (0,01-20 мкг / мл). (Б) полулогарифмический график для анти-HA FITC-конъюгированных антител в зависимости от MFI ФИТЦ. Кривая титрования устанавливается с помощью One Site Binding уравнение со значением трендовая R 2 = 0.99561. Титрование проводили для изотипа антитела не показали флуоресценции, как и ожидалось. Концентрации от 0,001 до 0,01 мкг / мл неотличимы от фонового шума. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

1 "> Рисунок 5
Рисунок 5: Представитель проточной цитометрии анализа непермеабилизированных TSA-201cells трансфицированных pmCherry-Са V α2δ1-HA (А) Схематическое представление стратегии стробирования , используемой в проточной цитометрии образца для анализа.. Данные были проанализированы после приобретения с помощью соответствующего программного обеспечения. Первая стратегия стробирования использует прямой разброс (FSC) и бокового рассеяния (SSC) точка участок, чтобы отобразить ворота (P1) вокруг живых клеток и устранить любой мусор, мертвые клетки, или агрегаты, которые имеют различные рассеяния вперед и боковые разброс, чем живые клетки , Двухпараметрические контурные графики на mCherry (ось у) по сравнению с FITC (ось х) интенсивности флуоресценции были показаны для населения P1. Прямоугольные ворота были размещены на краю аутофлюоресценции клеток, чтобы выбрать положительное P2 популяции (FITC и mCherry) и отрицательную Р3 населения. Уровень флуоресценции для тон клетки в пределах области P2 и P3 были визуализированы с помощью подсчет клеток по сравнению с последующей FITC или mCherry интенсивности флуоресценции гистограмм одного параметра. Сдвиг в интенсивности флуоресценции на Y- и оси х обеспечивает надежный показатель общего и мембранной экспрессии Са V α2δ1 соответственно. Интенсивность сигнала флуоресценции возрастает в зависимости от количества флуорохромом молекул. (Ba) представитель FCS / SSC точечные участки для каждого условия, как указано. В общей сложности 10000 событий были приобретены для анализа. Эллипс ворота (P1) обращается вокруг глаз живых клеток, за исключением событий с низким FSC (мертвые клетки) или высоких SSC (агрегатов). (Бб) Представительные двупараметрические контура участки на mCherry (ось у) по сравнению с FITC (ось х) интенсивность флуоресценции. Gates были размещены на краю автофлюоресценции клеток для разделения популяций FITC-mCherry положительных клеток (P2 затвора ), так и отрицательные флуоресцентные клетки (Р3). (Bc) Single-раметру гистограмм относительного подсчета (или% от макс) по сравнению с клетками интенсивности флуоресценции (FITC или mCherry). Распределение интенсивности флуоресценции , измеренной для клеток внутри P2 ворот (флуоресцентных положительных клеток) показаны серым цветом, а распределение интенсивности флуоресценции для клеток , присутствующих в Р3 ворот (флюоресцентных-отрицательных клеток) отображается в виде наложения при аналогово прозрачный серый участок. Как видно, интенсивность флуоресценции была сильна для обоих mCherry и FITC , указывающий , что Са V α2δ1 хорошо выражена и четко присутствует на клеточной мембране. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 6
Рисунок 6: Одновременный мутации -glycosylation участков N нарушена клеточной поверхности ехприжимное Са V α2δ1. Стабильные V & beta ; 3 клетки TSA-201 Ca были трансфицированы одновременно с PCMV-Са V 1,2 WT и pmCherry-Са V α2δ1-HA WT или мутантов. Непермеабилизированных (А) и проницаемыми клетки (B) окрашивали анти-HA ФИТЦ-конъюгированного антитела , как это описано выше. Представительные двупараметрические контурные графики mCherry по сравнению с FITC флуоресценции (слева панели) и гистограммы участков распределения интенсивности флуоресценции для сопряженного с использованием меченых антител анти-HA FITC (справа панели) показаны для N мутантов -glycosylation (NQ) после нарушение четырех сайтов (4xNQ: N92Q / N184Q / N468Q / N876Q) и 16 сайтов (16xNQ: N92Q / N136Q / N184Q / N324Q / N348Q / N468Q / N475Q / N585Q / N594Q / N663Q / N769Q / N812Q / N876Q / N883Q / N973Q / N986Q) в интактных непермеабилизированных или NP клетках (а) и в проницаемыми или Р - клеток (в). DISTRIBделения интенсивности флуоресценции , измеренной для клеток внутри P2 ворот (флуоресценция положительных клеток) показаны серым цветом, а распределение интенсивности флуоресценции для клеток , присутствующих в P3 ворот (флуоресценция-отрицательных клеток) отображается в виде наложения в прозрачной серый участок. Как видно на фигуре (В), уровни автофлюоресценции увеличилась после проницаемости клеточной мембраны. Интенсивность флуоресценции для FITC измеряли для всех трансфицированных проницаемыми клеток увеличивалось (рассматривается как сдвиг вправо на оси х) , что указывает , что все трансфицированные HA-меченый Ca V α2δ1 белки окрашивали и детектируется с антителом анти-HA FITC. (С) Гистограмма показывает нормализованный MFI , измеренный в присутствии FITC в интактной непермеабилизированных (поверхностной экспрессии) или проницаемыми клеток (общее выражение). Относительную плотность флуоресценции измеряли в трех экземплярах для каждого условия (30000 клеток), а также в трех различных партий клеток transfecTed в течение 1 месяца, следовательно, данные представлены в виде среднего значения ± SEM для 90000 клеток для каждого условия. была достигнута пиковая интенсивность флуоресценции между 24 и 36 ч после трансфекции. Значения ΔMFI для FITC , измеренные в интактных непермеабилизированных клеток использовали в качестве показателя клеточной поверхности экспрессии Са V α2δ1-HA, и значения ΔMFI для FITC , измеренные в проницаемыми клеток отражает полное экспрессию белка (поверхности клеток и внутриклеточной экспрессии белка ). ΔMFI для FITC рассчитывалась путем вычитания интенсивности флуоресценции FITC ФИТЦ отрицательных клеток (Р3) от интенсивности флуоресценции положительных клеток FITC (P2). Тот же метод был применен для расчета ΔMFI для mCherry. Значения MFI были нормализованы до максимального значения , измеренного в тот же день для mCherry-Са V α2δ1-HA WT. (D) Гистограмма показывает нормированный ΔMFI mCherry измеряется в непермеабилизированных или проницаемыми клеток (TOTаль выражение). Результаты выражены в виде среднего значения ± SEM Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Этот поток анализа цитометрии на основе был успешно применен к измерению относительного общего и клеточной поверхности уровней флуоресцентно-меченного пороформирующий и связанного субъединиц напряжения закрытого кальциевых каналов 14,22,26. Это лучше всего использовать при исследовании влияния генетических мутаций и, таким образом, требует, чтобы характеристическая интенсивность флуоресценции дикого типа конструкции флуоресцентно-меченного меченой быть по крайней мере от 10 до 100 раз больше, чем для интенсивности флуоресценции флуоресцентно-меченного немаркированной конструкции , В данном конкретном случае, клиновой α2δ1-ХА конструкция mCherry-Са , описанные здесь дали больший соотношение сигнал - шум и больший динамический диапазон , чем то , что было измерено ранее опубликованной Ca V 1,2-ХА и Са V 2,3-HA конструкции. Есть много мыслимые причины. Можно предположить , что локальное окружение эпитопа HA во внеклеточном домене Са V &# 945; 2δ1 белок увеличивает отношение сигнал-шум ФИТЦ-конъюгированного антитела анти-HA.

Кроме того, важно иметь в виду, что этот метод не обеспечивает абсолютное значение количества белков на поверхности клетки. Относительное выражение помеченного конструкции , необходимой для получения экспрессии функционального канала может быть получена , тем не менее, выполняя бок о бок патч-зажим и проточной цитометрии экспериментов в тех же условиях , как показано на рисунке 7 ссылки 22. Исходя из этих данных, можно оценить , что пиковое значение плотности тока, глобальной мерой активности ионных каналов, как правило , увеличивается в зависимости от поверхностной экспрессии меченых Ca V α2δ1 субъединицей. Основным ограничением этого тока Анализ экспрессии на клеточной поверхности остается фактом, что она не может быть применена в это время к изучению эндогенных ионных каналов. Это связано с тем, что несколько коммерчески доступных антителИзвестно, что специфически связываются с прогнозируемыми внешними доменами ионных каналов. Таким образом, она требует генетической манипуляции первичной последовательности белка изучаться, выраженное в недифференцированном рекомбинантной клеточной линии, такие как клетки TSA-201.

Критические шаги в оптимизации анализа: Идентификация соответствующей пары флуорофоров, выбор внешнего эпитопа и локализация сайта вставки имеют решающее значение для успеха этого метода, потому что вставка эпитопа не должны мешать функция белка. Были испытаны различные флуорофором комбинации. Два внешних эпитопы: гемагглютинин (НА) эпитоп (YPYDVPDYA) и бунгаротоксина-связывающий сайт эпитоп (WRYYESSLEPYPD) 27 и три непроницаемые флуоресцентные конъюгированные антитела были оценены, а именно FITC (Флуоресцеинизотиоцианат) -, R-фикоэритрин - и ПЭ-Cy7- конъюгированные-антитела. Кроме того, более 10 различных вставкисайты для внешнего HA эпитопа были испытаны в Са V α2δ1. Что касается вставки эпитопа, который требует сайт-направленного мутагенеза и методов рекомбинантной ДНК, рекомендуется проектировать как минимум трех наборов праймеров в пределах той же самой области. С 9 остатков, эпитоп HA является одним из меньших эпитопов, для которых существует коммерчески доступных флуоресцентных-конъюгированные антитела, но вероятность успеха вставки 27 нуклеотидов ниже, чем для точечной мутации. Tetracysteine мотивы (остатки Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys) являются 2-остаток меньше эпитоп HA , а флуоресцеина мышьяковый шпилька связующее вещество представляет собой мембранный проникающего и не подходит для анализа связанных с мембранами белков 28. Предварительные эксперименты были проведены с двумя внутриклеточными флуорофоров mCherry и зеленого флуоресцентного белка (GFP). Три критерия использовались для различения успешной пары флуорофоров с ионными каналами: 1) спектры излучения потребности флуорофоровчтобы не перекрываться (см ссылки 20,21 для более подробной информации); 2) выражение помеченного конструкции генерирует функциональный ионного канала в рекомбинантных клетках, подтвержденных с помощью стандартных электрофизиологических методов; и 3) выражение конструкции управления производит надежную флуоресцентного считывания. Если один из этих критериев не выполняется, например, если вставка тега или флуорофора мешает функции канала, необходимо вернуться к исходной точке и изменить либо сайт вставки внешнего эпитоп и / или в месте введения флуорофора. Линкер из 5-глутамин остатков между С-концом белка и флуорофора может способствовать улучшению функции белка. Кроме того, это может помочь вставить внешние эпитоп в больших петель, которые не известно, играют важную роль в функции белка и / гликозилирования белков. Кроме того, нужно знать о незначительных технических аспектах.

Степень успеха липосом-опосредованной элеменпрогиб в клетках TSA-201 может быть уменьшена после вставки двух эпитопов в Са V α2δ1. Поэтому предлагается откалибровать эффективность трансфекции с новыми ДНК-конструкций. Это происходит потому, что введение 30 кДа белка изменяет молекулярную массу ДНК. Можно было бы модифицировать ДНК соотношение липосом до 1: 2 до 1: 3, если это необходимо или инкубировать клетки при 37 ° С в течение более длительного периода времени (24-72 ч). Важно выбрать правильную формулировку для permeabilizing клеток. Большинство самодельных решений, оцениваемые для этого проекта оказалось, чтобы заставить клетки к агрегации и забивают поток цитометр.

Сдерживание воздействия света во время окрашивания клетки с флуорофором антитела, конъюгированного имеет важное значение для ограничения фотообесцвечивание и потери сигнала. Для того, чтобы свести к минимуму флуоресцентного фона, важно центрифугировать избыток конъюгированных антител перед использованием. И, наконец, полнейшего значение для анализа тон клетки на проточном цитометре, как можно скорее, как и не позднее, чем через 24 часа после. Ведение окрашенных клеток в течение ночи при температуре 4 ° С, скорее всего, уменьшить сигнал и ухудшает выживаемость клеток. Вариации в собственной флуоресценции флуорофора-конъюгированных антител от партии к партии диктуют, что интенсивность флуоресценции испытательной конструкции должно быть сообщено как функция от интенсивности флуоресценции конструкции управления выражается в одинаковых экспериментальных условиях.

Для достижения общего хорошего отношения сигнала к шуму, рекомендуется свести к минимуму клеток пипетирования , чтобы уменьшить гибель клеток и мягко ресуспендирования клеток таким образом, что 3 х 10 6 клеток / мл вводят в проточном цитометре. Учтите, что более высокая концентрация клеток уменьшает поток клеток и может засорить проточного цитометра. С другой стороны, более низкая концентрация клеток потребует более длительного времени обработки. Таким образом, можно иметь регулировать концентрацию в зависимости от Tyре клеток для анализа.

Альтернативные анализы: дополнительные методики, развернутые документировать наличие ионных каналов на клеточной поверхности плазматической мембраны падения в четыре большие категории: 1) Конфокальные методы визуализации, эксплуатирующие взаимодействие имеют высокое сродство между флуорофором-конъюгированные антитела и белка-мишени; 2) методы химии белков лежит на ковалентной модификации белка-мишени путем биотинилирования реагентов; 3) Электрофизиологические меры нестационарного анализа шума; и 4) фотоаффинное мечение белка-мишени с радиоактивными зондами. В случае напряжения закрытого кальциевых каналов, фотоаффинное мечение с тритием ( & plusmn ; ) - [3 Н] PN 200-100, с высоким сродством лигандом семейства дигидропиридина широко использовался в 1980 - х 31. Он остается очень чувствительным анализом , но включает в себя манипуляции с радиоактивным материалом 31, который упал из моды после появлениявысокочувствительных флуоресценции и люминесценции зондов, особенно с более молодыми исследователями. Кроме того, невозможно измерить активность канала иона в присутствии антагониста, таким образом, что соотношение между поверхностной экспрессии и функции выходит за рамки этого подхода. На другом конце экспериментального континуума, нестационарный анализ шума ионных каналов требует высокого качества записи gigaseal патч-зажим с устойчивой основой для минутного записей. При таком подходе можно извлечь число открытых ионных каналов в одной ячейке из наклона графического построения графика дисперсии шума в зависимости от среднего значения тока , измеренного при любом заданном потенциале 32-34. Он отображает те же атрибуты стандартных электрофизиологических подходов. Это трудоемкий и низкой пропускной способностью метод , который требует также хорошо знаком со спектральным анализом 32-34, а не основным продуктом клеточных биологов. Кроме того, этот тип analysis идентифицирует количество активных ионных каналов (в открытом состоянии), которая может отличаться от числа общих белков в мембране. Мечение белков клеточной поверхности с биотин реагентов является относительно эффективным средством для идентификации белков, присутствующих в плазматической мембране. Этот метод использует ковалентной модификации мембранных белков биотином и еще более высоким сродством и высокой специфичностью Нековалентная связывания биотина с мембраной impermeant стрептавидином или авидином молекул. Такой подход является качественно надежным, но затруднена или ограничена вопросами количественной оценки регулярно, связанных с выявлением белков с помощью Вестерн-блот-технику. Конфокальной изображения и его производные широко используются для документирования совместной локализации мембранных белков с поверхностью 35 клеток. Качественная изоляция плазмы мембрана остается возможным использованием методов дифференциального центрифугирования с использованием или без градиента сахарозы 36. Как и в описанном выше проточной цитометрии с АссаY, она опирается на весьма специфическое взаимодействие между белком-мишенью и флуорофор-конъюгированных антител. Полное внутреннее отражение флуоресценции изображений , в частности, представляет собой мощный подход , который мог бы сообщить распределение и молекулярного поведения одиночных ионных каналов на поверхности мембраны 37,38. Отсчет определенно выделяющийся, но остается низкой пропускной способности малого объема подход. Все эти анализы имеют свою научную ценность. С высокой пропускной способностью потока анализа цитометрии на основе превосходит с точки зрения считывания воспроизводимости и поддающихся количественной оценке показателей, но требует легкий доступ к мульти-лазерной проточной цитометрии клеток сортировщики, которые являются частью основных средств в крупных учреждениях. читатели флюоресценции на основе пластины дешевле и более доступными, но отношение сигнал-шум, полученного измеряется с теми же конструкциями, в тех же экспериментальных условиях была значительно ниже, в значительной степени к более высокой фоновой флуоресценции. Стоимость флуорофора-конъюгированные А.Н.tibodies также могут быть разложены в особенно из-за числа соответствующих контрольных экспериментов, которые должны быть обработаны с помощью тестовых конструкций. Вариации на ту же тему включают изменение флуоресцентного красителя антитела конъюгированные с экономически эффективной хреном пероксидазой или щелочной фосфатазы фермента репортера антитела, активность фермента может быть проанализирована с помощью хемилюминесценции 29,30.

Вывод: Двухцветные флуоресцентные анализы были разработаны для оценки относительной экспрессии клеточной поверхности рекомбинантных белков, экспрессированных в культивируемые клетки с использованием цитометров. Хотя только два флуоресцентных параметры использовались в этом текущем анализе методом проточной цитометрии поддается одновременного обнаружения более 30 флуоресцентных зондов на одной клетке, демонстрируя высокую гибкость этого подхода. Это с высокой пропускной способностью сверхчувствительного анализа может быть адаптирована для изучения влияния генетических мутаций 22,26 или посттрансляционных modificatiДополнения 23, а также изучение фармакологического профиля шаперонов для оборота поверхности мембранных белков методами 39. Стимулом этого протокола возникла из необходимости оценки в изоляции влияния генетических мутаций на экспрессию мембранного ионных каналов в рекомбинантных клетках. Важно, однако , отметить , что выраженность мутантного канала дисфункции в линиях модельных клеток не всегда коррелирует с тяжестью клинических симптомов у носителей мутации 5 отчасти потому , что комбинация мутаций в различных аллелей может потребоваться , чтобы вызвать внезапной сердечной смерти 40 , 41. В этом контексте, этот анализ можно рассматривать как обеспечение быстрого первого шага аппроксимацию изучения одной или нескольких мутаций в одном гене , связанный с с потерей функции мутаций 22. Это, однако правдоподобно представить в будущем вирус-опосредованной экспрессии тех же конструкций в дифференцированных клетках cardiomyocyт.е родословная. В целом, по сравнению с другими методами визуализации или люминесцентными, проточный цитометр сортировочные обрабатывать живые клетки в суспензии и отчет интенсивности флуоресценции гомогенной популяции клеток. Этот процесс осуществляется без необходимости фиксации с параформальдегидом, процесс , который вызывает местную плазматическую мембрану пермеабилизации, даже в мягких условиях 42. Анализ является быстрым, специфическим и удобно с анализом до нескольких сотен образцов за рабочий день. В дополнение к анализу, клетки в конечном счете, могут быть отсортированы с помощью проточной цитометрии для оценки функционального потенциала клеток, экспрессирующих более высокие или более низкие уровни того же мембранного белка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit New England Biolabs E0554S Can be substitute with QuickChange site-directed mutagenesis Kit (Agilent, #200523).
Tubes 1.5 ml Sarstedt 72-690-001
Tubes 15 ml  Sarstedt  62-554-002
Disposable graduated Tranfer Pipets  VWR 160001-192 
100 mm culture dish Corning 430167 For standard culture of HEKT cells.
35 mm culture dish Falcon 353001 For standard culture of HEKT cells.
Serological pipette 1 ml Sarstedt 86.1251.001
Serological pipette 5 ml Sarstedt 86.1253.001
Serological pipette 10 ml Sarstedt 86.1254.001
Serological pipette 25 ml Sarstedt 86.1285.001
Dulbecco's high-glucose medium Life Technologies 12100-046 Warm in 37 °C water bath before use.
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, US origin Life Technologies 16140-071
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Life Technologies 15140-122
Lipofectamine 2000  Life Technologies 11668-019 For liposomal transfection. Can be substituted with calcium phosphate transfection.
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Life Technologies 31985-070 Warm in 37 °C water bath before use.
Trypsin-EDTA (1x) 0.05%, phenol red Life Technologies 25300-062
1.5 ml microtubes Sarstedt 72.690.001
 Phosphate Buffered Saline 1x Fisher BP661-10 Can be "home-made".
Anti-HA FITC conjugated antibody Sigma H7411
IgG1−FITC Isotype Control antibody Sigma F6397
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit BD Biosciences 554714 Fixation/Permeabilization. Permeabilization/Wash solution, store at 4 °C.
Hemacytometer Fisher 49105161
Trypan Blue Fisher 15250061 To access cell viability.
Refrigerated Microcentrifuge, 5430R Eppendorf  A14H172200
Forma Steri-Cycle CO2 Incubator Fisher 370
Laboratory Platform Rocker Fisher 545034
Water Bath VWR 89032-216
BD FACSARIA III  BD Biosciences 648282 Flow cytometer.
FlowJo Software v10 FlowJo FlowJo v10 Dongle For data analysis.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Delisle, B. P., Anson, B. D., Rajamani, S., January, C. T. Biology of Cardiac Arrhythmias: Ion Channel Protein Trafficking. Circ. Res. 94, 1418-1428 (2004).
  2. Birault, V., Solari, R., Hanrahan, J., Thomas, D. Y. Correctors of the basic trafficking defect of the mutant F508del-CFTR that causes cystic fibrosis. Curr Opin Chem Biol. 17, 353-360 (2013).
  3. Balijepalli, S. Y., Anderson, C. L., Lin, E. C., January, C. T. Rescue of Mutated Cardiac Ion Channels in Inherited Arrhythmia Syndromes. J. Cardiovas Pharm. 56, 113-122 (2010).
  4. Gargus, J. J. Unraveling Monogenic Channelopathies and Their Implications for Complex Polygenic Disease. Am. J. Hum. Genet. 72, 785-803 (2003).
  5. Abriel, H., Zaklyazminskaya, E. V. Cardiac channelopathies: Genetic and molecular mechanisms. Gene. 517, 1-11 (2013).
  6. Behr, E. R., et al. Sudden arrhythmic death syndrome: familial evaluation identifies inheritable heart disease in the majority of families. Eur Heart J. 29, 1670-1680 (2008).
  7. Catterall, W. A. Structure and regulation of voltage-gated Ca2+ channels. Annu. Rev. Cell Dev.Biol. 16, 521-555 (2000).
  8. Peterson, B. Z., DeMaria, C. D., Adelman, J. P., Yue, D. T. Calmodulin is the Ca2+ sensor for Ca2+ -dependent inactivation of L- type calcium channels. Neuron. 22, 549-558 (1999).
  9. Dolphin, A. C. Calcium channel diversity: multiple roles of calcium channel subunits. Curr.Opin.Neurobiol. 19, 237-244 (2009).
  10. Dai, S., Hall, D. D., Hell, J. W. Supramolecular assemblies and localized regulation of voltage-gated ion channels. Physiol Rev. 89, 411-452 (2009).
  11. Gao, T., et al. Identification and subcellular localization of the subunits of L-type calcium channels and adenylyl cyclase in cardiac myocytes. J. Biol. Chem. 272, 19401-19407 (1997).
  12. Carl, S. L., et al. Immunolocalization of sarcolemmal dihydropyridine receptor and sarcoplasmic reticular triadin and ryanodine receptor in rabbit ventricle and atrium. J. Cell Biol. 129, 673-682 (1995).
  13. Abriel, H., Rougier, J. S., Jalife, J. Ion Channel Macromolecular Complexes in Cardiomyocytes: Roles in Sudden Cardiac Death. Circ. Res. 116, 1971-1988 (2015).
  14. Bourdin, B., et al. Molecular Determinants of the Cavb-induced Plasma Membrane Targeting of the Cav1.2 Channel. J. Biol. Chem. 285, 22853-22863 (2010).
  15. Raybaud, A., et al. The Role of the GX9GX3G Motif in the Gating of High Voltage-activated Calcium Channels. J. Biol. Chem. 281, 39424-39436 (2006).
  16. Burashnikov, E., et al. Mutations in the cardiac L-type calcium channel associated with inherited J-wave syndromes and sudden cardiac death. Heart Rhythm. 7, 1872-1882 (2010).
  17. Hennessey, J. A., et al. A CACNA1C Variant Associated with Reduced Voltage-Dependent Inactivation, Increased Cav1.2 Channel Window Current, and Arrhythmogenesis. PLoS ONE. 9, e106982 (2014).
  18. Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y., Nalbant, A. Flow cytometry: basic principles and applications. Crit Rev Biotechnol. 1-14 (2016).
  19. Graham, M. D. The Coulter Principle: Foundation of an Industry. J. Lab. Autom. 8, 72-81 (2003).
  20. Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J. Immunol. Methods. 243, 77-97 (2000).
  21. Rothe, G. Cellular Diagnostics. Basics, Methods and Clinical Applications of Flow Cytometry. Sack, U., Tarnok, A., Rothe, G. Karger. Basel. 53-88 (2009).
  22. Bourdin, B., et al. Functional Characterization of Cavalpha2delta Mutations Associated with Sudden Cardiac Death. J. Biol. Chem. 290, 2854-2869 (2015).
  23. Tetreault, M. P., et al. Identification of glycosylation sites essential for surface expression of the Cavalpha2delta1 subunit and modulation of the cardiac Cav1.2 channel activity. J. Biol. Chem. 291, 4826-4843 (2016).
  24. Senatore, A., Boone, A. N., Spafford, J. D. Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells. J Vis Exp. (47), (2011).
  25. Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Herzenberg, L. A., Parks, D. R. Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed. Nat.Immunol. 7, 681-685 (2006).
  26. Shakeri, B., Bourdin, B., Demers-Giroux, P. O., Sauve, R., Parent, L. A quartet of Leucine residues in the Guanylate Kinase domain of Cavbeta determines the plasma membrane density of the Cav2.3 channel. J Biol Chem. 287, 32835-32847 (2012).
  27. Morton, R. A., Baptista-Hon, D. T., Hales, T. G., Lovinger, D. M. Agonist- and antagonist-induced up-regulation of surface 5-HT3A receptors. Br. J. Pharmacol. 172, 4066-4077 (2015).
  28. Hoffmann, C., et al. Fluorescent labeling of tetracysteine-tagged proteins in intact cells. Nat. Protocols. 5, 1666-1677 (2010).
  29. Cockcroft, C. J. Ion Channels: Methods and Protocols. Gamper, N. Humana Press. Totowa, NJ. 233-241 (2013).
  30. Gonzalez-Gutierrez, G., Miranda-Laferte, E., Neely, A., Hidalgo, P. The Src Homology 3 Domain of the beta-Subunit of Voltage-gated Calcium Channels Promotes Endocytosis via Dynamin Interaction. J. Biol.Chem. 282, 2156-2162 (2007).
  31. Galizzi, J. P., Borsotto, M., Barhanin, J., Fosset, M., Lazdunski, M. Characterization and photoaffinity labeling of receptor sites for the Calcium channel inhibitors d-cis-diltiazem, (+/-)-bepridil, desmethoxyverapamil, and (+)-PN 200-110 in skeletal muscle transverse tubule membranes. J. Biol.Chem. 261, 1393-1397 (1986).
  32. Bezanilla, F. The voltage sensor in voltage-dependent ion channels. Physiol.Rev. 80, 555-592 (2000).
  33. Sigworth, F. J. The variance of sodium current fluctuations at the node of Ranvier. J Physiol. 307, 97-129 (1980).
  34. Bailey, M. A., Grabe, M., Devor, D. C. Characterization of the PCMBS-dependent modification of KCa3.1 channel gating. J. Gen. Physiol. 136, 367-387 (2010).
  35. Fletcher, P. A., Scriven, D. R., Schulson, M. N., Moore, E. D. Multi-Image Colocalization and Its Statistical Significance. Biophys. J. 99, 1996-2005 (2010).
  36. Lizotte, E., Tremblay, A., Allen, B. G., Fiset, C. Isolation and characterization of subcellular protein fractions from mouse heart. Anal. Biochem. 345, 47-54 (2005).
  37. Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. J. Cell Sci. 123, 3621-3628 (2010).
  38. Yamamura, H., Suzuki, Y., Imaizumi, Y. New light on ion channel imaging by total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. J. Pharmacol. Sci. 128, 1-7 (2015).
  39. Wible, B. A., et al. HERG-Lite-R: A novel comprehensive high-throughput screen for drug-induced hERG risk. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 52, 136-145 (2005).
  40. Wilde, A. A. M., Brugada, R. Phenotypical Manifestations of Mutations in the Genes Encoding Subunits of the Cardiac Sodium Channel. Circ. Res. 108, 884-887 (2011).
  41. Milano, A., et al. Sudden Cardiac Arrest and Rare Genetic Variants in the Community. Circ Cardiovasc Genet. (2016).
  42. Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. G. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nat. Meth. 9, 152-158 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics