Akım Sitometri Kullanımı rekombinant İyon Kanallarının göreli Hücre Yüzey ve toplam İfade tayini

JoVE Journal
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Kalıtsal kardiyak aritmiler genellikle bir veya daha fazla iyon kanallarının yüzey teslim değiştiren mutasyonlar neden olur. Burada, TSA-201 hücrelerinde eksprese edilen rekombinant iyon kanallarının göreli ve toplam hücre yüzeyi protein ekspresyonunun bir ölçümünü sağlamak için tahliller flow sitometri uyum sağlar.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Bourdin, B., Segura, E., Tétreault, M. P., Lesage, S., Parent, L. Determination of the Relative Cell Surface and Total Expression of Recombinant Ion Channels Using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (115), e54732, doi:10.3791/54732 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Bu çalışma, mevcut akış sitometrisi teknolojisi kullanılarak rekombinant hücrelerde eksprese iyon kanalları gibi zar proteinlerinin nispi hücre yüzey ekspresyonunu bildirmek için güvenilir bir tahlil içerir. İyon kanalları, hücre zarından iyonların akışını yolluk elektrik sinyallerini kontrol etmek için sorumlu olan gözenek oluşturan zar proteinlerdir. Bu, aktivasyon mekanizması, doğa ve lokalize gözenek transit iyon türü seçicilik göre sınıflandırılır. Hücre ve doku düzeylerinde, iyon kanalları aracılığıyla makroskopik iyon akıları biyofiziksel (yolluk ve nüfuz), biyokimyasal (fosforilasyon), ve biyogenezine (sentez, glikosilasyon, insan ticareti ve bozulma) özelliklerinin 1 ürünüdür. Bu işlemlerin her biri, iyon kanallarının her tür için benzersiz olan ve iyon kanalının fizyolojik rolü yerine getirmek için optimize edilmiştir. Sonuç olarak, bir ile bu ince ayarlanmış işlemlerin herhangi değişikliklerkalıtsal ya da çoğu zaman "kanal bozukluğu" olarak ifade edilen bir genetik modifikasyon, hücre homeostazının için zararlı olabilir. Hücre yüzeyinde iyon kanallarının "doğru" miktarda teslim hücre homeostazında kritik olduğunu vurgulamak önemlidir. Hatta küçük artışlar (kazanç fonksiyon-) ve iyon kanal aktivitesinin küçük düşüşler (zarar fonksiyon-) bir ömür boyunca ciddi bir patoloji neden olma potansiyeli var. Olgun iyon kanallarının hücre yüzey teslim Kusur kistik fibrozis (CFTR iyon kanalı) 2 ve uzun QT sendromu şeklinde (kardiyak potasyum kanalları) 3 kardiyak aritmiler gibi birçok kanalopatiler, önemli bir belirleyicisidir.

Kanalopatiler kardiyak ani ölüm 4 ile ilişkilidir. 2,000-1: Bireysel 5 başına 3,000 ve ani aritmik kardiyak ölüm ca yaklaşık yarısından sorumlu olan tüm kardiyak kanalopatiler mevcut dünya çapında yaygınlık en az 1 olduğu düşünülmektedirses 6. Kalp voltaj bağımlı sodyum-, potasyum-disfonksiyon ve kalsiyum seçici iyon kanalları bu süreçte önemli bir rol oynadığı bilinmektedir. L-tipi Ca V 1.2 voltaj bağımlı kalsiyum kanal senkronize kalp kas kasılmasını başlatmak için gereklidir. Kalp L-tipi Ca V 1.2 kanallı yardımcı alt birimden 7-12 α2δ1 ana gözenek oluşturucu Ca V α1 alt birimi ve Ca Vss ve Ca V oluşan çoklu bir alt birim protein kompleksidir. Bu alt birimleri kalp 13 normal elektrik fonksiyonunu desteklemek için gerekli olan arasındaki yardımcı alt birimlerin tam tamamlayıcı plazma membranında fonksiyonel Ca V 1.2 kanal ve dinamik etkileşimleri üretmek için gerekli olduğunu unutmayın. Ca Vss Ca V hücre yüzey ifadesi bir kovalent olmayan nanomolar hidrofobik etkileşim 14 ile 1.2 kanal teşvik etmektedir. Ca V α2δ1 altbirim wi Eş-ifadesiinci Ca V ß-bağlı Ca V α1 pik akımı ifade (5 ila 10 kat) uyarır ve daha olumsuz gerilimlerde kanal aktivasyonunu teşvik etmektedir. Kazanç fonksiyon-Ca V 1.2 L-tipi Ca V 1.2 kanal oluşturan üç ana alt birimden nokta mutasyonları bir dizi ise uzun QT sendromu 15 olarak adlandırılan ventriküler aritmi bir form ile ilişkili olan gözenek oluşturucu alt biriminin mutasyonlar kısa QT sendromu formunda 16,17 aritmi muzdarip hastalarda tespit edilmiştir. İyon kanalları biyokimyasal bakış açısı (protein kimyası) incelenmiştir veya bu tamamlayıcı yaklaşımlar kullanılarak sık sık elektrofizyolojik araçları (akım üreten makineler) kullanılarak olabilir membran proteinlerdir. Elektrofizyoloji, özellikle bütün hücre patch-klemp olarak, iyon kanalları 15 işlevini aydınlatmak için uygun bir yaklaşımdır ama onların biyofizik değişiklikler protein kaçakçılığı değişiklik çözemezseözellikleri. Protein kimyası, ancak çoğu zaman daha küçük çözünür proteinler göre büyük zar proteinlerinin, nispeten düşük ekspresyonuna kullanımı sınırlıdır. floresan okuma kullanarak Sağlam yüksek verimli yöntemleri özellikle iyon kanallarının hücre yüzeyinde ifade değişikliklerini neden protein biyogenezine kusurları gidermek için geliştirilmesi gerekmektedir.

Flow sitometri, hücre sayımı, sıralama, biyomarkır tespiti ve protein mühendisliği 18 kullanılan bir biyofiziksel teknolojidir. Canlı hücreler ya da parçacıkların bir numunesi çözeltisi bir akış sitometresinde enjekte edildiğinde, hücreler makinenin tespit sistemi (Şekil 1) problanabilir tek bir akış halinde sıralanır. 1956 19 üretilen alet sitometresi ilk akış tek bir parametre tespit ama modern akış sitometrelerinde birden lazerler ve 30'dan fazla floresan parametrelerinin 20,21 algılanmasına izin floresan dedektörleri var.Filtreler ve aynalar (emisyon optik) şiddetine orantılı olarak ışık dönüştürmek bir elektronik ağ (fotodiyot ve dedektörler) hücrelerin ışık yayılımı veya floresan ışık yönlendirir. Dijital veri özel yazılım kullanılarak analiz edilmektedir ve birincil çıkış nokta arsa 21 olarak görüntülenir.

Şekil 1
Şekil 1:. Akış biyofiziksel prensipleri sitometrisi sıralama tek hücre, bir veya daha fazla lazer sorgulama noktaları arasında taşır kılıf sıvısı akımı içinde yüksek basınç altında bir ağızlıktan itilir. ışık ışını geçirerek hücreleri tarafından saptırılır ve ileri doğrultuda (ileri dağılım, hem FCS) içinde toplanır ışık hücre büyüklüğü ile orantılı bir sinyal içine ışık dönüştüren bir fotodiyot gönderilir. Işık ayrıca lazer yolu 90 ° açıyla toplanmış ve dedektörler (de denir fotoçoğaltıcılar (PMT)) gönderilir.heyecan fluorochromes hücresinde mevcut ise, bu ışık hücreleri içinde ayrıntı gösterir yana saçılım sinyali (SSC) saptanmasına izin dikroik aynalar ve floresan emisyonu yoluyla yönlendirilir. Üç dedektörleri (Yeşil, Sarı ve Kırmızı) farklı fluorochromes eş zamanlı algılama sağlayan, farklı dalga boyu bant geçiren filtreler ile temsil edilmektedir. Farklı sinyaller harici bilgisayar tarafından sayısallaştırılmış ve hücrelerin özelliklerini ölçmek için analiz edilecektir veri dönüştürülür. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Akış sitometrelerinde yüksek verimlilik kapasitesi rekombinant yabani tip ve ticareti-eksik voltaj bağımlı L-tipi Ca V 1.2 kanalları ve canlı hücrelerde ilişkili alt birimleri göreli membran ifadesini ölçmek için istismar edilmiştir. cDNA co oluştururproteinler için Ding çift eş zamanlı olarak geçirgen olmayan bir floresan konjuge antikoru ve yapısal olarak floresan boylu bir intra-ile tespit edilebilir bir hücre dışı floresan olmayan epitopu taşıdığı etiketlendi. Her iki C-terminal sonra eklenen proteinin hücre dışı bir döngüde yerleştirilmiş hücre-dışı epitop, ve hücre içi flüorofor, protein ile çevrilir. Bu deney serisinde, Ca V α2δ1 proteini içsel hücre içi florofor gibi anti-HA ve mCherry konjüge edilmiş bir hücre dışı hemagglutinin (HA) epitop geçirimsiz FITC (floresein izotiyosiyanat) tarafından tespit edilen (YPYDVPDYA) ifade etmek için tasarlanmış edildi. MCherry-Ca-V α2δ1 HA-etiketli proteinin nispi hücre yüzey ifadesi seviyesini belirlemek için, füzyon proteinini eksprese eden rekombinant hücreler transfeksiyondan sonra hasat ve FITC ile konjüge edilmiş bir fare monoklonal anti-HA epitopu etiketi Antibod ile boyanmıştıry (Şekil 2). FITC Dolayısıyla biyolojik fonksiyonuna müdahale etmek için olası değildir enzim muhabir önemli ölçüde daha küçük olan ve bir organik flüoresan bileşiktir. TSA-201cells aşırı eksprese mCherry- Ca V α2δ1-HA, iki boyutlu araziler 22 FITC floresan ve MCherry floresanın belirgin bir 3-günlük bir artış sağlar. HA epitopunun proteinin hücre-dışı kısmına yerleştirilir olduğu göz önüne alındığında, FITC floresan yoğunluğu sağlam hücrelerin varlığında elde edilen HA-etiketli protein, hücre yüzeyi ekspresyonu göreli indeksi göstermektedir. yapıları HA epitopunun erişilebilirlik sistematik hücre permeabilization sonra FITC sinyali ölçerek doğrulanır. FITC için göreli floresan yoğunlukları göreceli floresan değerleri fo için niteliksel karşılaştırılabilir permeabilize hücrelerde tahmin beri bu önlem de normalize toplam protein ifadesini doğrulayacak hizmetr MCherry permeabilize ve non-permeabilize koşullar 22,23 altında ölçülür. Içsel floresans spektrumu permeabilization sonra daha yüksek değerlere doğru kaydırılır olduğunu ancak kontrol yapı ile karşılaştırıldığında olarak rapor ediliyor tek değer floresan değişiklik olduğuna dikkat etmek önemlidir. Test yapıları için floresan göreli değişiklikler her fluorofor (mCherry veya FITC) için ΔMean Floresan Yoğunluğu (ΔMFI) değerleri kullanılarak hesaplanmıştır. Deneyler florofor bağlı antikor iç floresan deneysel varyasyon sınırlamak için aynı şartlar altında ifade kontrol yapısı floresan yoğunluğunun test yapısı göreceli olarak floresans yoğunluğunu ölçmek için tasarlanmıştır. İki zarı proteinleri başarıyla bu testi kullanılarak incelenmiştir: L-tipi voltaj bağımlı kalsiyum kanal Ca V 1.2 14,22 ve farklı bir seride gözenek oluşturucu alt birimDeneyler, hücre dışı yardımcı Ca V α2δ1 alt birim 22,23. Aşağıdaki protokol 1.2 kanallı kontrol koşulları altında ve iyon kanalının sonrası modifikasyon etkileyen mutasyonların sonrasında kalp L-tipi Ca V Ca V α2δ1 alt biriminin hücre yüzey ekspresyonunu belirlemek için kullanılmıştır. Standart deney koşullarında, FITC floresan hücre yüzeyi MCherry-Ca-V α2δ1-HA proteinleri (referans 22, Şekil 5) için kodlama yapan cDNA ifadesi ile yarı-doğrusal artar.

şekil 2
Şekil 2:. Deney protokolünde akım sitometri toplam ve membran etiketleme şematik gösterimi şeması gerekli ana adımlardan bazıları fl rekombinant iyon kanallarının göreli total ve hücre yüzey ifadesi ölçmek için özetliyorow sitometri. Hücreler (1) TSA-201 hücrelerinde çift etiketli yapım MCherry-Ca-V α2δ1-HA transfekte edilmiş ve önce veya geçirgenliği sonra boyanır (2). (3) çok değişkenli analiz için (4). Sitometresi multiparameter veri akımı elde edilir , bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Çifte Etiketli DNA yapıları

  1. Mevkiye yönelik mutagenez (Şekil 3B) 20 ile D676 ve R677 ile Ca V α2δ1 hücre dışı bağlayıcısı HA epitopu (YPYDVPDYA) yerleştirin. İleri primer gccggattatgcgGGAAAACTCCAAACAACC kullanın ve astar acatcatacggataTCAATAAATTCATTGAAATTTAAAAGAAATTC Ters.
  2. SacI ve SalI siteleri (Şekil 3B) 20 arasında mCherry N-terminine kaynaştırılmış proteini ifade etmek için tasarlanan bir memeli pmCherry-N1 sentezleme vektörüne etiketli HA Ca V α2δ1 cDNA dizisi alt-klonlanmıştır.
    NOT: Uygun kanal fonksiyonu standart elektrofizyolojik yöntemler 24 kullanılarak kontrol yapısı ile test edilmesi gerekmektedir.

2. lipozom aracılığıyla geçici Transfeksiyon (30 dk, Tüm Adımlar Laminar Flow Hood altında yapılmaktadır)

  1. 1. Gün: Plate TSA-201 hücreleri (veya HEKT) içinde yarım milyon2 ml Dulbecco, yüksek glukoz, minimum temel ortam,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin-streptomisin (PS), kültür ortamı ile desteklenmiş (DMEM-HG) 35 mm kültür tabakları. Standart bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. Tripan mavisi kullanarak hücre örneği bir fraksiyondan hücre canlılığını değerlendirmek. Plaka yeterli hücre transfeksiyon anda% 90 izdiham ulaşmak için.
  2. Gün 2: PS olmayan, taze, önceden ısıtılmış (37 ° C), kültür ortamı 2 ml değiştirme kültür ortamı.
  3. Her transfeksiyon numune için, iki adet 1,5 ml'lik tüpler hazırlamak. tüp 1 'de, düşük serum ortamında 250 ul DNA 4 ug seyreltin. boru 2'de, 250 ul serum, indirgenmiş kültür ortamı ile lipozom aracılı transfeksiyon reaktifi 10 ul karıştırın. Kullanmadan önce hafifçe transfeksiyon reaktifi karıştırın.
  4. Oda sıcaklığında 5 dakika süreyle inkübe edilir.
  5. borunun 1 ve boru 2 birleştirin, hafifçe karıştırılır ve oda sıcaklığında en az 20 dakika inkübe edilir.
  6. lipozomlar ekle / DNBir kültür hücreleri kompleksleri ve hafifçe karıştırın kültür çanak sallayın.
  7. 24 saat boyunca CO2 atmosferinde% 5 altında 37 ° C'de inkübe edin.

Akış sitometrisi için 3. Hücrelerin boyanması (3 saat)

  1. Hücre Örnekleri hazırlanması
    1. 3. Gün: dikkatle kültür kabı orta çıkarın ve% 0.05 tripsin-EDTA ile 1x (etilendiamintetraasetik asit) (37 ° C) önceden ısıtılmış 400 ul hücreleri yıkayın.
    2. Tripsin-EDTA 400 ul ilave edin ve 5 dakika hücreleri çanak ayırmak için izin vermek için CO2 atmosferinde% 5 altında 37 ° C de çanak inkübe edin.
    3. PS olmadan soğuk kültür ortamı 1 ml ekleyerek enzim sindirimi durdurun ve yavaşça 4-5 kez pipetleme yüzeyinden tüm hücreleri yıkayın. hücre ölümünü azaltmak için sindirim ve aşırı-pipetle kaçının.
    4. 1.5 ml tüpler içinde hücreleri toplamak ve buz üzerinde hemen yerleştirin. buz soğuk çözümleri kullanmalarını ve içselleştirilmesi önlemek için 4 ° C'de hücreleri tutmakantijenlerini yüzey. floresan sinyal photobleaching sınırlamak için aydınlatma azaltın.
    5. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj tüpleri. Dikkatle aspire ve supernatant atın.
    6. Yeniden askıya fosfat tamponlu tuz 1x 1 ml pelet (PBS) tek bir hücre süspansiyonu hazırlanır.
    7. Kısaca çok yavaşça vorteks tüpleri ve tekrar tamamen kültür ortamı kaldırmak için 3.1.5 ve 3.1.6 adımları.
    8. 1x PBS 600 ul pelet yeniden askıya 3 x 10 6 hücre / mL, en az hücre konsantrasyonunu ayarlamak.
    9. hücre dışı ve hücre içi boyama için iki yeni 1.5 ml tüpler hücreleri bölün. non-spesifik boyanması belirli boyama ayırt etmek uygun kontrolleri içerir.
      NOT: izotip kontrol antikoru arka plan boyama düzeyini değerlendirmek yardımcı olur ve ideal olarak her birincil antikorun konak türleri, izotipini ve fluorofor eşleşmesi gerekir. Aynı de izotip kontrol ve konjüge olmamış antikor kullanarakProtein konsantrasyonu.

tablo 1
Tablo 1: akış sitometri deney kontrol numuneleri hücreleri olmayan geçirgenleştirildi ve geçirgen Her deney şu negatif kontroller içermesi gerekir. (Izo veya konjüge edilmiş antikor ile, antikor olmayan) (1) transfekte edilmemiş hücrelerin. (2) yapısal flüoresan hücre içine florokrom olmayan bir plazmide alt-klonlanmıştır ilgi protein ile transfekte edilmiş hücrelerin (pCMV- Ca V α2δ1-HA) ya da çift isim levhası yapı (pmCherry-Ca-V α2δ1 ve izotip ile ya da, antikor olmayan inkübe eşlenik haline gelen antikor). Tek renk kontrolleri florokrom emisyon örtüşme tazminat kullanılmaktadır. Aynı kontroller olmayan permeabilize aday ve deneyler her dizi koşulları permeabilize.

  1. Bozulmamış Hücre Yüzey BoyamaCanlı Hücreler
    1. Kısım 1.5 ml tüpler içinde 1 x 10 6 hücre / 100 ul.
    2. 5 ug FITC-konjuge monoklonal anti-HA antikor ekleyin / ml, 45 dakika boyunca 4 ° C'de karanlıkta ve bir rocker platformunda (200 rpm) üzerinde hücrelerin inkübe edildi vorteks.
      Not: antikorun optimum konsantrasyon ön titrasyon deneylerinde saptanmıştır (Şekil 4).
    3. Karanlık hücreleri çıkarmak ve 1x PBS / tüp 900 ul ekleyin. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleyin.
    4. Süpernatant aspire edildi ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g'de 1 x PBS, girdap ve santrifüj 1 ml pelletini.
    5. Herhangi bir bağlanmamış antikorların çıkarılması için iki kez yıkama (aşama 3.2.4) tekrarlayın. Bir konjüge edilmemiş birincil antikor kullanılır, uygun ikincil antikor ile inkübe edin.
    6. Son yıkamadan sonra, 1 x 500 ul PBS içinde tekrar süspansiyon hücreleri ve sitometrisi tüpleri Akış 5 ml tek bir hücre süspansiyonu aktarın. hücreyi tutmakörnek çalışan kadar 4 ° C'de karanlıkta s.
    7. Bir Akış sitometresindeki örnekleri çalıştırın. En iyi sonuç için, en kısa sürede ve en geç 24 saat sonra daha akış sitometresinde hücreleri analiz.
  2. Hücre içi Boyama: Fiksasyon, Permeabilization ve Boyama
    1. Kısım 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g'de 1 x 10 6 hücre / 100 1.5 ml tüpler içinde ul ve santrifüjlenir.
    2. stoktan doğrudan sabitleme permeabilization solüsyonu 100 ul supernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri atın.
    3. 20 dakika boyunca 4 ° C'de karanlıkta inkübe edin.
    4. Taze hazırlanmış 1x permeabilization yıkama tamponu 100 ul (damıtılmış H 2 O 10x Permeabilization yıkama tamponu sulandırmak) ekleyin. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g'de tablo santrifüj kullanılarak vorteks, tortu hücreleri.
    5. Aspire ve supernatant atın.
    6. Tekrarlayın 3.3.4 ve 3.3.5 adımları.
    7. 5 ° C'de, FITC-konjuge monoklonal anti-HA antikor ekleyinug / ml, 100 1x permeabilizasyon yıkama tamponu ul ve 30 dakika boyunca 4 ° C'de karanlıkta inkübe önce girdap içinde.
      Not: hücre içi boyama hücre yüzeyi boyama için kullanılan aynı prosedür izlenerek gerçekleştirilir. Saponin-aracılı hücre permeabilization nedenle hücre içi boyama sırasında saponin sürekli huzurunda hücreleri korumak için 1x Perm / Yıkama tamponu ile 1x PBS yerine önemlidir, ancak bir hızla geri dönüşümlü bir süreçtir.
    8. Karanlık hücreleri çıkarın ve 100 ul permeabilization yıkama tampon ekleyin. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleyin.
    9. Aspire dikkatle süpernatan ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g'de 100 ul permeabilizasyon yıkama tamponu girdap ve santrifüj pelletini.
    10. Herhangi bir bağlanmamış antikorların çıkarılması için yıkama (aşama 3.3.9) bir kez daha tekrarlayın.
    11. Son yıkamadan sonra, 1 x 500 ul PBS içinde tekrar süspansiyon hücreleri ve sin aktarmaktüpler sitometri 5 mL akış metini hücre süspansiyonu. akış sitometresi içine örnek enjekte kadar 4 ° C'de karanlıkta tutun hücreleri.
    12. Bir Akış sitometresindeki örnekleri çalıştırın. en kısa sürede, ancak en geç 1 haftadan daha fazla boyama sonrası sitometresinde sabit örneklerini yürüt. aynı gün olmayan permeabilize ve permeabilize hücreleri çalıştırın.

4. Akım Sitometri

  1. Hücre Sıralayıcısı Günlük Kur Cytometer Akış
    1. Akış sitometri yazılımı açın. Optimum enstrüman performansı sağlamak için, deneme hücre sıralayıcı sitometresi akış kalibre ve kurulum öncesi enstrüman kurulum boncuklar kullanılarak (hücre yani lazer ve optik şartnameye performans, lazer ve akış düzgün hizalanmış).
    2. 20 psi kılıf basıncı ile 100 mikron memesi kullanın.
      NOT: meme yok akış sitometresi bir bankta değiştirilecek.
    3. üretici uygun sitometresinin akış hızını ayarlamaer özellikleri. Son derece yüksek akış hızları floresanstaki değişimler saptanmasında hassasiyeti azalacaktır.
    4. ve sarı-yeşil lazerler (mCherry heyecanlandırmak için 561 nm) (Flöresein Isothiocayanate veya FITC heyecanlandırmak için 488 nm) mavi seçin. Bir 530/30 nm ve sırasıyla bir 610/20 nm bant-geçiş filtresi ile FITC ve MCherry floresan seviyeleri toplayın.
    5. doğrusal ölçeği kullanılarak lekesiz hücreler için yan dağılım (SSC) nokta arsa karşı ileri dağılım (FCS) kazanır. nokta arsa sol alt kadranda hücreleri görselleştirmek için her bir dedektörün amplifikasyon ayarlayın.
  2. Bozulmamış Olmayan geçirgen Hücreleri Örnek Okuma
    1. Hücreler bu şekilde sağlam hücreler floresan sinyali sınırlandırarak, hücre artıkları ve hücre agregatları hariç analiz etrafında serbest formu belirleyen canlı olmayan permeabilize hücrelerin P1gate ayarlayın.
      Not: ölü / canlı dışlama boyalar, canlı hücreler üzerinde geçit yerleştirilmesini kolaylaştırmak için kullanılabilir. kaydetmek için 10.000 olayları ayarlayındurma kapı P1. eğer gerekirse olayların daha yüksek bir sayıya bu ayarlayın.
    2. Lekesiz hücrelerinin bazal otofloresans tespit etmek için FITC iki parametre kontur arsa karşı mCherry kazanır. Negatif değerleri göstermek ve nüfus 25 arasındaki çözünürlüğü artırmak için iki logaritmik ölçek kullanın. Günlük floresan yoğunluğu araziler ilk on birimlerinin alt kısmı içinde lekesiz negatif hücreler ayarlamak için her bir dedektörün gerilimini ayarlamak.
    3. 4.1.5 ve 4.1.6 kurulan ayarları kullanarak tüm bozulmamış olmayan geçirgen örnekleri Edinme ve floresan dedektörleri FSC, SSC ve sinyalleri toplamak.
    4. İhracat ve * kaydetmek .fcs dosyaları analiz yazılımı flow sitometri kullanılarak analiz için kullanılacak.
  3. Geçirgen hücrelerin örnek Okuma
    1. permeabilize örneklerde canlı hücreleri seçmek ve 4.1.5 ve 4.1.6 de gösterildiği gibi FSC ve SSC voltajını ayarlamak için P1 kapısı taşıyın.
    2. tüm permeabilize örnekleri Edinme ve FSC, SSC a toplamakfloresan dedektörleri nd sinyaller.
    3. İhracat ve * kaydetmek .fcs dosyaları analiz yazılımı flow sitometri kullanılarak analiz için kullanılacak.
  4. Veri analizi
    1. 4.2.4 ve 4.3.3 kaydedilen analiz yazılımı ve ithalat * .fcs dosyaları flow sitometri başlatın.
    2. Çalışma alanı penceresinde listelenen ilk örnek üzerinde tıklayın. Tüp kimlik numarasına göre adlandırılmış yeni bir pencere otomatik olarak açılır. FSC karşı SSC arsa içinde yolluk işlemini başlatın. canlı hücreler farklı forward scatter ve yan dağılım var herhangi bir enkaz, ölü hücreleri veya agrega bir kapı (P1) canlı hücreler etrafında Elips simgesini kullanarak çizin ve ortadan
    3. FITC (x-ekseni) canlı hücrelerin floresans şiddeti ile mCherry (y-ekseni), iki-parametre dış hat planını çizmek için, x-ekseni ilk tıklayarak FITC bir kanal belirledikten sonra y tıklayarak -Axis ve PE-mCherry-A kanalı seçin. Bir kenarında kadranda işaretleyici konumlandırmak için "Quad" ikonuna tıklayınHer florasan kanalına utofluorescent hücreleri.
      NOT: FITC ve mCherry pozitif hücrelerin etrafında ayarlamak kapı P2 kapısıdır. Floresan negatif hücre popülasyonu P3 kapı olarak adlandırılır. Bu makalede kullanılan temsili yolluk yöntemi için Şekil 5'e bakınız.
    4. P2 ve P3 kapıları seçin ve orijinal çalışma alanı penceresinde "Add İstatistik" ikonuna tıklayın. "Kont" (pozitif hücre sayısı) tıklayın ve "Mean" (her florokrom Ortalama Floresan Yoğunluğu) ya da "Medyan" (her florokrom Medyan Floresan Yoğunluğu) seçenekler listesi arasında istatistik tıklayın. Yine "Add İstatistik" ikonuna tıklayın. Bütün bu değerler otomatik olarak orijinal çalışma penceresine aktarılır.
      NOT: floresan yoğunluğu normal dağılıma takip yalnızca kullanılan "Mean". her durumda, "Medyan" sekmesine tıklayın. MFI böylece Floresan Intensit ortalama atıfta olabiliry ya da Medyan Floresan Yoğunluğu.
      NOT: Bir sonraki adım Sitometre tarafından tanınacak tüm örneklerde Gates'in parametrelerini ve istatistik uygulamaktır.
    5. çalışma penceresinde, sürükle ve çizgi TÜM ÖRNEKLERİ işaretli üzerine kapıları ve istatistik parametreleri bırakmak için fareyi kullanın.
    6. Olmayan permeabilize ve geçirgen hücreleri (- B Şekil 6A) için iki boyutlu kontur (FITC vs mCherry) araziler ve histogramlar (hücre floresan yoğunluğu karşı saymak) bir toplu rapor oluşturun.
    7. Adım 4.4.4 oluşturulan istatistiklerinden, lekeli hücrelerin her florokrom için ortalama floresan yoğunluğu (MFI) hesaplayın. Bu değerden, yüzey ve ilgilenilen proteinin toplam ekspresyonunu ölçmek için boyanmamış hücrelerinden elde edilen MFI değeri çıkarılır.
    8. Her fluorofor (mCherry ve FITC) (- D Şekil 6C) için ΔMFI değerlerini bildirin. Ca ölçülen ΔMFI normalize NOT: floresan yoğunluğu mutlak değeri dolayısıyla, antikorlar ve her laboratuar işçinin teknik yetenekleri toplu bağlı keskin WT yapısı kullanılarak mutant yapının floresan yoğunluğu normalleştirmek için gereğini değişebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu makalede, tahlilinde sitometri iki renkli akımı ile TSA-201cells olarak eksprese edilen rekombinant iyon kanallarının toplam hücre yüzeyi ölçmek için güvenilir bir protokol açıklamaktadır. Bir örnek olarak, görece hücre yüzeyi ve total protein sentezleme Ca V α2δ1subunit için ölçülmüştür. Tahlilinde sitometri iki renkli akış gerçekleştirmek için, Ca V α2δ1 iki kat, bir anti-HA FITC ile konjüge edilmiş antikor ve bir kurucu flüoresan hücre içine MCherry florofor ile tespit edilebilir bir hücre dışı floresan olmayan epitop HA ifade etiketlendi. FITC ve mCherry için uyarma ve emisyon spektrumları FITC 488 nm lazer ile% 88 verim ile heyecanlı ama verim 561 nm lazer ile% 0 azaldığını göstermektedir. 561 nm lazer ama 488 nm lazer ile sadece% 7.6 (Şekil 3) ile uyarıldığı zaman MCherry maksimum floresans 63.9% gösterir. eksitasyon ve emisyon SPEctra her iki fluorophores için seçilen farklı lazerler ve filtreler ile optimum ışık toplama ve minimal örtüşme sergilerler. Verilen florokrom için MFI sürece deneyler, büyük bir hücre popülasyonundan membran proteinlerinin nispi ifade hakkında niceliksel bilgi sağlayabilir sitometri akışı, her bir hücre, Ca V α2δ1 protein ekspresyonu yerine flüoresan hücre sayısı ile doğru orantılıdır. Bu doygunluk ötesinde floresans bağlı antikor konsantrasyonunu kullanarak içerir. Ca V α2δ1 bağlanabilen anti HA FITC ile konjüge edilmiş antikor (Şekil 4) titrasyon eğrisi üç aşamayı gösterir. Resim floresans ilk aşamada tespit edilirken, floresan yoğunluğu, ikinci faz içinde, antikor konsantrasyonunun arttırılması ile üslü olarak artmasına. doygunluğu (üçüncü aşama) alanına sonra antikorun konsantrasyonunun arttırılması nispi floresan niyet etme üzerinde hiçbir etkisi yokturtesi FITC (RFI). Anti HA FITC konjuge antikor doygunluk noktası bu şekilde konjüge-antikor konsantrasyonu deneyler sırasında MFI sınırlayıcı değildir sağlanması, 5 ug / ml'de kurulmuştur.

Etiketli Ca V TSA-201cells ifade α2δ1was ve sitometri analizleri olmayan permeabilize hücreleri (Şekil 5) FITC-konjuge anti-HA mevcudiyetinde gerçekleştirilmiştir akış. Uygun kontroller (Tablo 1), lazer ışınının içinden geçen her hücreye XY değerleri özellikleri akış sitometresinde analiz edildi. Hücre dağılımı nokta araziler (Şekil 5A) üzerinde görüntülenmiştir. FCS / SSC nokta diyagramları hücre örneklerinin hazırlanması, yüksek canlılığı (Şekil 5BA) ile tek bir hücre süspansiyonu içerir teyit etmektedir. canlı hücreler (P1) için seçilen kapak analiz hücrelerin toplam sayısının% 75 temsil eder. toplam protein ifadesi oTSA-201 hücrelerinde f Ca V α2δ1 MCherry floresan orantılı olarak kabul edildi. MCherry FITC karşı kontur araziler ve histogramlar de görüldüğü gibi - pmCherry-Ca V α2δ1-HA ile transfekte (Şekil 5BB Bc), 47% 2 tsa-201 hücrelerinde belirgin MCherry floresan ifade yanı sıra nedeniyle önemli FITC floresan gösteren bulundu olmayan permeabilize hücrelerin Ca V α2δ1 dış HA etiketi bağlanma. antikor olmadan veya izotipi ile gerçekleştirilmektedir Negatif kontrol deneyleri, FITC pozitif transfekte hücrelere veya sadece çok bağlandığını göstermektedir.

Bu protokol, TSA-201cells 23 Ca V α2δ1 toplam ve hücre yüzeyi ekspresyonu N-glikosilasyon rolünü karakterize etmek için kullanıldı. Deneyler, hücre yüzeyi ekspresyonunu değerlendirmek için olmayan permeabilize hücrelerin içinde gerçekleştirilmiştirve permeabilize hücrelerde HA epitopunun erişilebilirliğini teyit yanı sıra total protein ifadesini değerlendirmek için. MFI, her fluorofor (MCherry ya da FITC) için tahmin edilen üzerine Ca V α2δ1 göreli ekspresyon olarak hesaplanmıştır. Mutantlar için ΔMFI değerleri aynı koşullar altında ifade edilen MCherry-Ca-V α2δ1-HA WT aynı gün ölçülen maksimum değere normalize edilmiştir. Bu anti-HA FITC ile konjuge antikor mutlak flüoresan yoğunluğundaki zaman farklılıkları hesaba katmak önemlidir. Şekil 6A'da görüldüğü gibi, VT ve 4xNQ oluşturmak ancak 16xNQ yapısı için arka plan floresans seviyesine yakın bir proteinin plazma zarı neredeyse mevcut olduğunu göstermek için, sigara permeabilize hücrelerin FITC ΔMFI güçlüydü. Deneyler, hücre geçirgenliği sonra yapılan, 16xNQ yapının toplam protein ekspresyonu, aynı zamanda önemli ölçüde olup azalma olduğunu göstermiştir(- D Şekil 6C) permeabilize hücrelerin ya da olmayan permeabilize ölçülen yapısal MCherry floresans ve permeabilize hücrelerin FITC floresan anlaşılmaktadır edildi. Şekil 6B'de görüldüğü gibi, hücresel otofloresansı seviyeleri sağlam olmayan geçirgenleştirildi ve geçirgen hücre arasındaki mutlak floresans değerlerinin karşılaştırılması önleyen hücre geçirgenliği, sonra artmıştır. mCherry için ölçülen ΔMFI floresans besleyici çözeltiyi mCherry nispi floresan sinyalini değiştirmediğini anlamına hem olmayan geçirgenleştirildi ve geçirgen hücre benzer olmuştur. N-glikosilasyon siteleri mutasyonlar, protein biyogenezi / stabilite 23 azalmıştır yayınlanan gözlem destekleyen mCherry için floresan yoğunluğunda bir azalma ile ilişkili bulunmuştur. Bu deney serisinde, permeabilize hücrelerin ölçülen FITC için nispi floresan sinyali b çıktıproteinin N-tipi glikosilasyon durumu hücre dışı FITC-konjuge anti-HA antikoru ile tespit floresan etkileyebilecek öne mCherry için nispi sinyal daha küçük ör. Tamamen hücre geçirgenliği önce ve sonra FITC olan nisbi floresanstaki değişimler protein ifadesini ölçmek için güvenilir bir ölçüm sağlar.

Şekil 3,
Şekil 3: FITC ve mCherry iki renkli sitometri deneyleri için fluorochromes uygun bir çift oluşturur Uyarımı'nı (boş eğrileri) ve 561 nm sarı-ile heyecanlı 488 nm mavi lazer (Aa) ile heyecanlı ve mCherry FITC için emisyon spektrumları (dolu eğrileri). yeşil lazer (Ab). FITC ve mCherry floresan bir 530/30 nm ve 610/20 nm bandpas ile toplanmıştırs sırasıyla filtreler. Farklı lazerler (renkli dikey çizgiler) ve filtrelerin (renkli dikdörtgenler) dalga boyu optimum ışık toplama ve minimal örtüşme için tercih edilmektedir. (B) mCherry-Ca V α2δ1-HA proteininin şematik gösterimi. Ca V α2δ1 iki kat bir anti-HA FITC konjuge antikor ve bir kurucu floresan hücre içi MCherry florokrom tarafından tespit edilebilir bir hücre dışı floresan olmayan epitop HA ifade etiketlendi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Şekil 4:. Ca V α2δ1 bağlanabilen anti HA FITC konjuge monoklonal antikor titrasyonu TSA-201 hücrelerine geçici olarak pmCherry-Ca, V 'ile transfekte edilmiştir 945., 2δ1-HA ve anti-HA FITC-konjüge veya izotip antikorlarının bir dizi inkübe edildi. Sadece FITC sinyali bu panelde analiz edilmektedir. (A), tek parametreli histogramlar y ekseninde hücrelerinin nispi sayısını ve konsantrasyonlarda anti-HA FITC konjuge antikor aralığı (ug / ml 0.01-20 ug) x-ekseni üzerinde FITC floresan gösterirler. (B) FITC MFI bir fonksiyonu olarak bir anti-HA FITC ile konjüge edilmiş antikor için yarı-log grafiği. Titrasyon eğrisi çizgisi değeri R 2 = 0,99561 ile denklemi Bağlama Bir Siteyi kullanarak takıldı. beklendiği gibi izotip antikor için yapılan titrasyon Resim floresan gösterdi. 0.001 0.01 ug / ml konsantrasyonları arka plan gürültü ayırt edilemez. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

1 "> Şekil 5,
Şekil 5:. Analiz numunesi flow sitometri kullanılan yolluk strateji pmCherry-Ca V α2δ1-HA (A) şematik gösterimi ile transfekte olmayan geçirgen TSA-201cells sitometri analizi Temsilcisi akışı. Veriler, uygun yazılım ile kazanılmasından sonra analiz edildi. İlk yolluk strateji ileri dağılım (FSC) ve yan dağılım (SSC) canlı hücreler farklı forward scatter ve yan dağılım var herhangi bir enkaz, ölü hücreleri veya agrega canlı hücreler etrafında bir kapı (P1) görüntülemek ve ortadan kaldırmak için nokta arsa patlatır . FITC karşı mCherry (y-ekseni) (x-ekseni) floresan yoğunluğunun iki parametreli kontur planlarıdır P1 nüfus için sergilendi. Dikdörtgen kapıları pozitif nüfus P2 (FITC ve mCherry) ve negatif nüfus P3 seçmek için hücrelerin otofloresansı kenarına yerleştirildi. T flüoresans seviyesio bölgeye P2 olan hücreleri ve P3 daha sonra hücreler FITC ya MCherry florasan yoğunluğu tek parametreli histogramlar karşı sayısı şu şekilde görüntülenmiştir. Y ve X ekseni üzerinde flüoresans yoğunluğunda bir kayma, sırasıyla Ca V α2δ1 toplam ve membran ifade güvenilir bir dizindir. floresans sinyalinin şiddeti florokrom moleküllerin sayısının bir fonksiyonu olarak artar. belirtildiği gibi her bir durum için (Ba) Temsilcisi FCS / SSC nokta araziler. 10.000 olayların toplam analizi için elde edildi. elips kapısı (P1) düşük FSC (ölü hücreler) ya da yüksek SSC (agrega) ile olayları hariç, canlı hücrelerin etrafındaki gözle çizilir. FITC (x-ekseni) florasan yoğunluğu. Kapıları karşı MCherry (Y-ekseni) (BB) Örnek iki parametreli kontur planlarıdır FITC MCherry pozitif hücrelerin popülasyonları ayırmak için hücre otofloresansı kenarına (P2 kapısı yerleştirilmiştir ) ve negatif flöresanlı hücreler (P3). (Bc) Tek-pagöreceli sayımı (veya maksimum%) floresan yoğunluğu karşı hücreleri (FITC veya mCherry) histogramları parametreyi. P2 kapısı (floresans-pozitif hücreleri) içindeki hücreler için ölçülen floresan yoğunluğu dağılımı gri renkle gösterilir, ve P3 kapısı (floresans-negatif hücreleri), bu hücrelerin floresans yoğunluğunu dağılımı bir kaplama olarak gösterilir saydam gri arsa. Görüldüğü gibi, floresan yoğunluğu MCherry ve FITC hem Ca V α2δ1 iyi ifade ve hücre zarında açıkça mevcut olduğunu göstermek için. Güçlüydü bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 6,
Şekil 6: N -glycosylation siteleri Eşzamanlı mutasyonlar hücre yüzey ex bozulurCa V α2δ1 bir pression. Kararlı TSA-201 Ca V β3 hücreleri geçici pCMV-Ca V 1.2 WT ve pmCherry-Ca V α2δ1-HA WT veya mutantlar ile eş zamanlı olarak transfekte edildi. Yukarıda tarif edildiği gibi olmayan geçirgen (A) ve geçirgen hücreleri (B), anti-HA FITC ile konjüge edilmiş antikor ile boyandı. Anti HA FITC ile konjuge antikor lekeleme (sağ panel) için floresan yoğunluğu dağılımının MCherry karşı FITC floresan (sol panel) ve histogram planı temsilci iki parametreli kontur planlarıdır sonra N -glycosylation mutantlar (NQ) için gösterilmektedir dört sitelerin bozulması (4xNQ: N92Q / N184Q / N468Q / N876Q) ve 16 siteleri (16xNQ: N92Q / N136Q / N184Q / N324Q / N348Q / N468Q / N475Q / N585Q / N594Q / N663Q / N769Q / N812Q / N876Q / N883Q / N973Q sağlam geçirgen olmayan veya NP hücrelerinde (A) ve geçirgen veya P hücreleri (B) / N986Q). distribP2 kapısı (floresans-pozitif hücreleri) içindeki hücreler için ölçülen floresan yoğunluğunun Katkı gri renkle gösterilir, ve P3 kapısı (floresans-negatif hücreleri), bu hücrelerin floresans yoğunluğunu dağılımı saydam bir kaplama olarak gösterilir gri arsa. (B) 'de görüldüğü gibi, otofloresan seviyeleri, hücre geçirgenliği sonra artmıştır. Tüm transfekte HA-etiketli Ca V α2δ1 proteinler, boyalı ve anti-HA antikoru FITC ile tespit edildi gösteren (X-ekseni üzerinde sağ shift olarak görülen) artan bütün permeabilize transfekte edilen hücreler için ölçülen FITC floresan yoğunluğu. (C) bir bar grafiktir sağlam olmayan geçirgen (yüzey ekspresyonu) FITC varlığında ölçülen normalleştirilmiş MFI veya permeabilize hücrelerin (toplam sentezleme) gösterir. göreceli floresan yoğunluğu her bir durum için üç kez (30.000 hücreleri) ölçülür ve hücrelerin üç farklı gruplar halinde yapıldı transfeksiyonunun1 aylık bir süre boyunca ted nedenle veriler, her bir durum için 90.000 hücre için ortalama ± SEM olarak gösterilmiştir. zirve floresan yoğunluğu transfeksiyondan sonra 24 ve 36 saat arasında ulaşıldı. Sağlam olmayan permeabilize hücrelerin ölçülen FITC ΔMFI değerleri Ca V α2δ1-HA hücre yüzey ifadesi için bir indeks olarak kullanılmıştır ve permeabilize hücrelerin ölçülen FITC ΔMFI değerleri, toplam protein ekspresyonu (hücre yüzeyi ve hücre içi protein ifadesini yansıtmaktadır ). FITC ΔMFI FITC pozitif hücreler (P2) floresan yoğunluğunun FITC negatif hücrelerin (P3), FITC floresan yoğunluğu çıkarılarak hesaplandı. aynı yöntem kullanılır mCherry için ΔMFI hesaplanması için kullanılmıştır. MFI değerleri MCherry-Ca-V α2δ1-HA WT aynı gün ölçülen maksimum değere normalize edilmiştir. (D) Çubuk grafik olmayan permeabilize veya permeabilize hücreler (tot ölçülen normalleştirilmiş ΔMFI MCherry gösteriral ifadesi). SEM ± Sonuçlar ortalama olarak ifade edilir , bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu akış sitometri tabanlı deney başarılı Voltaj geçitli kalsiyum kanalları 14,22,26 gözenek oluşturucu etiketli-flüoresan ve ilgili alt birimlerin göre toplam ve hücre yüzeyi seviyelerinin ölçümü uygulanmıştır. Genetik değişimin etkisini araştıran en iyi şekilde kullanılır ve böylece etiketli-floresan etiketli doğal tipte yapının iç floresan yoğunluğu floresan etiketli etiketlenmemiş yapının floresan yoğunluğu daha büyük 100 kat, en az 10 olması gerekir olduğu . Bu özel durumda, bu tarifnamede tarif edilen MCherry-Ca-V α2δ1-HA yapısı gürültü oranı daha büyük bir sinyal ve daha önce yayımlanmış Ca V 1.2-HA ve Ca V 2.3-HA konstruktlarının ölçülmüştür olandan daha büyük bir dinamik aralık bulunmuştur. Bunun için pek çok akla nedeni vardır. Bu iddia edilebilir Ca V ve hücre dışı HA epitopunun yerel çevre945., 2δ1 proteini FITC-konjuge anti-HA antikor sinyal gürültü oranını en üst düzeye çıkarır.

Buna ek olarak, bu yöntem, hücre yüzeyinde protein sayısında bir mutlak değeri sağlamaz akılda tutmak önemlidir. Fonksiyonel kanalı ekspresyonu elde etmek için gerekli etiketli yapı bağıl ifade yan yama kelepçe yana yapılması ve referans 22, Şekil 7'de gösterildiği gibi, aynı koşullar altında deney akış sitometresi ile yine elde edilebilir. Bu verilerden, tepe akım yoğunluğu, iyon kanal aktivitesi global ölçüsü genellikle etiketli Ca V α2δ1 alt biriminin yüzey ifadesinin bir fonksiyonu olarak artar tahmin edilebilir. Bu akım, hücre yüzey ifadesi tahlilinin önemli bir sınırlama endojen iyon kanallarının çalışma için şu anda uygulanamaz kalır. Bunun nedeni olduğu birkaç ticari olarak temin edilebilir antikorlar,özellikle iyon kanalları tahmin dış etki bağlandığı bilinmektedir. Bu nedenle bu TSA-201 hücreleri gibi farklılaşmamış yeniden birleştirici hücre hattı içinde ilave çalışılacak proteinin primer dizisinin genetik manipülasyonu gerektirir.

tahlilinde optimizasyonu kritik adım: epitopun eklenme engel olmamalıdır, çünkü florofor uygun çiftinin belirlenmesi, dış epitopun seçimi ve ekleme sitesinin yeri bu yöntemin başarısı için çok önemlidir protein fonksiyonu. Farklı bir floroforla kombinasyon test edildi. İki harici epitoplar: -, burada R-fikoeritrin - hemagglutinin (HA) epitopu (YPYDVPDYA) ve bungarotoxin bağlayıcı site epitopu (WRYYESSLEPYPD) 27 ve üç geçirimsiz floresan konjuge antikor, yani FITC (fluorescein isothiocyanate) değerlendirildi ve PE-Cy7- konjüge-antikorları. Buna ek olarak, 10'dan fazla farklı eklemeDış HA epitopu için siteler Ca V α2δ1 içinde test edildi. mevkiye-yönelik mutagenez ve yeniden birleştirici DNA teknikleri gerektirir epitopunun yerleştirilmesi ile ilgili olarak, aynı bölge içinde primerler üç set en az tasarımı için tavsiye edilir. 9 artıkları ile, HA epitopu ticari olarak temin floresan-konjuge antikor, ancak 27 nükleotidini sokulması başarı oranı nokta mutasyonu daha düşüktür var olan daha küçük epitop biridir. Tetracysteine motifler (kalıntılar Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys) 2-Tortu, HA epitopunun daha küçük flöresin arsenik firkete bağlayıcı membran geçirgen ve membrana bağlı proteinler 28 analizi için uygun değildir bulunmaktadır. Ön deneyler, iki hücre içi fluorophores MCherry ve yeşil floresan proteini (GFP) ile gerçekleştirilmiştir. fluorophores ihtiyaçları 1) emisyon spektrumları: üç kriter başarılı iyon kanalları ile fluorophores çifti ayırmak için kullanıldıüst üste değil (ayrıntılar için referanslar 20,21 bakınız); 2) etiketli yapı ifadesi standart elektrofizyolojik yöntemler ile doğrulanmış gibi rekombinant hücrelerde fonksiyonel iyon kanal oluşturur; ve 3) kontrol yapısının ifade sağlam bir floresan okuma üretir. etiketi veya fluorofor ekleme kanal fonksiyonu engelliyorsa bu kriterlerden biri, örneğin, yerine getirilmemesi halinde, bir kare bir geri dönün ve dış epitop ve / veya ekleme sitenin yerleştirilmesi site ya değiştirmek zorunda fluorofor. proteinin C-terminal ve fluorofor arasındaki 5-glutamin kalıntısı bir bağlayıcı proteinin işlevini geliştirmek için yardımcı olabilir. Buna ek olarak, protein fonksiyonunun ve / Protein glikosilasyon önemli bir rol oynadığı bilinmektedir olmayan geniş halkalar dış epitopu eklemek için yardımcı olabilir. Bir de küçük teknik yönlerini farkında olması gerekir.

lipozom aracılı transf başarı oranıTSA-201 hücrelerinde ection Ca V α2δ1 içinde iki epitop yerleştirilmesinden sonra azaltılabilir. Bu yüzden, yeni DNA yapılan transfeksiyon verimliliği yeniden kalibre etmek için önerilmektedir. 30 kDa proteini ekleme DNA'nın molekül ağırlığı değiştirir çünkü bu olur. Gerekirse 3 ya da daha uzun bir süre (24-72 saat) 37 ° C'de inkübe hücreleri: 2 ila 1: 1 ila lipozomlar oranı DNA değiştirebilir. Hücrelerin permeabilizing için doğru formülasyonu seçmek önemlidir. Bu proje için değerlendirilebilecek en ev yapımı çözümler hücreleri toplamak ve akış sitometresinin yapışmasına neden olduğu ortaya çıktı.

fluorofor konjüge edilmiş antikor ile hücre boyama sırasında ışığa maruz Bordür Photobleaching ve sinyal kaybını sınırlamak için gereklidir. Floresan arka en aza indirmek için, kullanımdan önce konjuge antikor fazlalığı santrifüj önemlidir. Son olarak, bu t analiz etmek için son derece önem taşımaktadıren kısa sürede ve en geç 24 saat sonra daha da akış sitometresinde o hücreleri. 4 ° C'de gece boyunca lekeli hücrelerin tutulması muhtemel sinyal azaltır ve hücre yaşamını bozar. partiden partiye florofor bağlı antikor iç floresan varyasyonları test yapısının floresans yoğunluğu kontrol yapısı floresan yoğunluğunun bir fonksiyonu aynı deneysel koşullar altında ifade olarak rapor edilmesi gerektiğini dikte eder.

Gürültü oranı genel olarak iyi bir sinyal elde etmek için, hücre ölümünü azaltılması için hücre pipetleme en aza indirmek için ve yavaşça bir 3 x 10 6 hücre / mL akışı enjekte edilir sitometresi hücreleri tekrar süspansiyon önerilir. Daha yüksek hücre konsantrasyonu hücre akışını azaltacak ve akış sitometresinin yapışmasına neden olabilir dikkat edin. Öte yandan, bir düşük hücre konsantrasyonu daha uzun bir işlem süresi gerektirir. Bir böylece ty bağlı konsantrasyonunu ayarlamak gerekebilirhücre PE analiz edilmesi.

Alternatif tahliller: dört büyük kategoride hücre yüzeyi plazma zarı fall at iyon kanallarının varlığını belgelemek için dağıtılan ek yöntemler: 1) fluorofor-konjuge antikor ve hedef protein arasındaki yüksek afiniteli etkileşimi istismar Konfokal görüntüleme yöntemleri; 2) biyotinilasyon reaktifleri ile hedef proteinin kovalent modifikasyon dayanan protein kimyası teknikleri; 3) Durağan olmayan gürültü analizi Elektrofizyolojik önlemler; Radyoaktif probları ile hedef proteinin ve 4) fotoafinite etiketleme. Voltaj geçitli kalsiyum kanalı, tritiye (±) ile fotoafinite etiketleme durumunda - [3H] PN 200-100, dihidropiridin ailesinin bir yüksek afiniteli liganddır, 1980'lerin 31 yaygın olarak kullanılmıştır. Bu çok hassas bir tahlil kalır ama gelişiyle aşağıdaki modası düşmüş radyoaktif madde 31, manipülasyonu içerirÖzellikle genç araştırmacılar ile son derece hassas floresan ve lüminesans sondaları. Buna ek olarak, yüzey ifadesi ve işlevi arasındaki ilişki bu yaklaşımın kapsamı dışındadır şekilde antagonist varlığında, iyon kanal aktivitesi ölçülmesi imkansızdır. Deneysel süreklilik diğer ucunda, iyon kanallarının durağan olmayan gürültü analizi dakika süren kayıtları için istikrarlı taban ile yüksek kaliteli gigaseal yama-kelepçe kayıtları gerektirir. Bu yaklaşımla biri herhangi bir potansiyel 32-34 ölçülen ortalama akımın bir fonksiyonu olarak gürültü varyansı komplo grafiğin eğiminden tek bir hücrede açık iyon kanallarının sayısını elde edebilirsiniz. Bu standart elektrofizyolojik yaklaşımlar aynı ziynet görüntüler. Bu ek spektral analizi 32-34, değil hücre biyologları bir elyaf ile iyi bir aşinalık gerektirir bir emek-yoğun ve düşük verimli bir yöntemdir. analysi başka, bu türs zarında toplam proteinlerin sayısı farklı olabilir (açık durumda) aktif iyon kanallarının sayısını tanımlar. biotin reaktifleri ile hücre yüzey proteinleri Etiketleme plazma membranında bulunan proteinleri tespit etmek nispeten etkili bir araçtır. Bu yöntem, biotin ve daha yüksek afinite ve membran geçirgenliği olmayan streptavidin veya avidin moleküllerine biyotin bağlanması yüksek özgüllük kovalent olmayan membran proteinlerinin kovalent modifikasyonunu patlatır. Bu yaklaşım niteliksel güvenilir ama engel ya da düzenli western blot tekniği kullanılarak proteinleri ortaya ilişkili miktar sorunları ile sınırlıdır. Konfokal görüntüleme ve türevleri geniş çapta hücre yüzeyi 35 ile birlikte zar proteinlerinin birlikte-lokalizasyonunu belge için kullanılır. Nitel plazma zarı izolasyon veya sukroz gradient 36 olmadan diferansiyel santrifüj teknikleri kullanılarak mümkün kalır. Yukarıda tarif edilen akış sitometri Assa gibiY, hedef protein ve bir florofor ile konjüge edilmiş antikor arasında yüksek düzeyde spesifik etkileşimi üzerine dayanır. Özellikle toplam iç yansıma floresan görüntüleme, membran yüzeyinde 37,38 tekli iyon kanallarının dağılımı ve moleküler davranışı rapor verebilir güçlü bir yaklaşımdır. okuması kesinlikle göz alıcı ama düşük verimlilik küçük hacimli bir yaklaşım olmaya devam etmektedir. Bu tahlillerin hepsi bilimsel liyakat var. yüksek verimli akış sitometri tabanlı tahlil okuma tekrarlanabilirlik ve ölçülebilir metrik açısından üstün olduğunu ancak büyük kurumlarda temel tesislerinin bir parçası olan hücre bölmeleri sitometri çok lazer akışına kolay erişim gerektirir. Floresans tabanlı levha okuyucular daha ucuz ve daha kolay erişilebilir ama sinyal gürültü oranı nedeniyle daha yüksek bir floresan arka plan büyük ölçüde önemli ölçüde daha düşük olduğu aynı deney koşulları altında, aynı yapıları ile ölçülmüştür elde edildi. fluorofor-konjuge edilmiş bir Maliyetiantikorlarının verilmesinin de deney yapıları ile işlenmesi gereken uygun kontrol deneyleri sayısı nedeniyle özellikle çarpanlarına edilebilir. Aynı konuda bir varyasyonları aktivitesi kemiluminesans 29,30 ile tahlil edilebilir enzim bayırturpu peroksidaz veya alkalin fosfataz Enzim raportör antikor-maliyetli floresan boya ile konjüge edilmiş antikor değişen içerir.

Sonuç: İki renkli flüoresan deneyleri, akış sitometre kullanılarak kültürlenmiş hücrelerde eksprese edilen rekombinant proteinlerinin nispi hücre yüzey ekspresyonunu değerlendirmek için geliştirilmiştir. Sadece iki floresan parametreler bu mevcut deneyde kullanılmıştır, ancak bu yaklaşımın yüksek esneklik gösteren, tek bir hücre 30'dan flüoresan eş zamanlı olarak saptanması için uygun olan akış sitometrisi. Bu yüksek verimli ultrasensitif tahlil genetik mutasyonların 22,26 veya posttranslasyonel modifikasyonların etkisini araştırmak için adapte edilebilirons 23, yanı sıra membran proteinleri teknikleri 39 yüzey kaçakçılığı için chaperones farmakolojik profil okuyan olarak. Bu protokol arkasındaki itici güç izolasyon rekombinant hücrelerde iyon kanallarının membran ifadesi genetik mutasyonların etkisini değerlendirmek için ihtiyaçtan doğdu. Farklı allel mutasyonlarının bir arada ani kardiyak ölüm 40 tetiklemek için gerekli olabilir çünkü modeli hücre hatlarında mutant kanal disfonksiyonu şiddeti her zaman kısmen mutasyon taşıyıcılarında 5 klinik belirtilerin şiddeti ile ilişkili değildir dikkat etmek ne kadar önemli olduğunu 41. Bu bağlamda, bu deney kaybı fonksiyon-mutasyonları 22 ile bağlantılı tek bir gendeki tek ya da çoklu mutasyonları incelemek hızlı bir birinci basamak yaklaşımı temin olarak görülebilir. Cardiomyocy farklılaşmış hücrelerin gelecekte aynı yapıların virüs aracılı ifadesini tahayyül etmek ancak makuldürte soyu. seçmeler homojen hücre popülasyonunun süspansiyonu ve rapor floresan canlı hücreleri işlemek sitometresi Genel olarak, diğer görüntüleme ya da lüminesan teknikleri ile karşılaştırıldığında, akar. Bu süreç bile yumuşak koşullar 42 altında, paraformaldehid, yerel plazma zarı geçirgenliği uyaran bir işlemle tespit için gerek kalmadan yapılır. Tahlil çalışma günde birkaç yüz numunelerin kadar analiz ile, hızlı spesifik ve uygundur. analizine ek olarak, hücreler sonunda, aynı zar proteininin daha yüksek ya da daha düşük seviyelerde ifade eden hücrelerin fonksiyonel potansiyelini değerlendirmek için akış sitometrisi ile düzenlenmiş olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit New England Biolabs E0554S Can be substitute with QuickChange site-directed mutagenesis Kit (Agilent, #200523).
Tubes 1.5 ml Sarstedt 72-690-001
Tubes 15 ml  Sarstedt  62-554-002
Disposable graduated Tranfer Pipets  VWR 160001-192 
100 mm culture dish Corning 430167 For standard culture of HEKT cells.
35 mm culture dish Falcon 353001 For standard culture of HEKT cells.
Serological pipette 1 ml Sarstedt 86.1251.001
Serological pipette 5 ml Sarstedt 86.1253.001
Serological pipette 10 ml Sarstedt 86.1254.001
Serological pipette 25 ml Sarstedt 86.1285.001
Dulbecco's high-glucose medium Life Technologies 12100-046 Warm in 37 °C water bath before use.
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, US origin Life Technologies 16140-071
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Life Technologies 15140-122
Lipofectamine 2000  Life Technologies 11668-019 For liposomal transfection. Can be substituted with calcium phosphate transfection.
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Life Technologies 31985-070 Warm in 37 °C water bath before use.
Trypsin-EDTA (1x) 0.05%, phenol red Life Technologies 25300-062
1.5 ml microtubes Sarstedt 72.690.001
 Phosphate Buffered Saline 1x Fisher BP661-10 Can be "home-made".
Anti-HA FITC conjugated antibody Sigma H7411
IgG1−FITC Isotype Control antibody Sigma F6397
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit BD Biosciences 554714 Fixation/Permeabilization. Permeabilization/Wash solution, store at 4 °C.
Hemacytometer Fisher 49105161
Trypan Blue Fisher 15250061 To access cell viability.
Refrigerated Microcentrifuge, 5430R Eppendorf  A14H172200
Forma Steri-Cycle CO2 Incubator Fisher 370
Laboratory Platform Rocker Fisher 545034
Water Bath VWR 89032-216
BD FACSARIA III  BD Biosciences 648282 Flow cytometer.
FlowJo Software v10 FlowJo FlowJo v10 Dongle For data analysis.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Delisle, B. P., Anson, B. D., Rajamani, S., January, C. T. Biology of Cardiac Arrhythmias: Ion Channel Protein Trafficking. Circ. Res. 94, 1418-1428 (2004).
  2. Birault, V., Solari, R., Hanrahan, J., Thomas, D. Y. Correctors of the basic trafficking defect of the mutant F508del-CFTR that causes cystic fibrosis. Curr Opin Chem Biol. 17, 353-360 (2013).
  3. Balijepalli, S. Y., Anderson, C. L., Lin, E. C., January, C. T. Rescue of Mutated Cardiac Ion Channels in Inherited Arrhythmia Syndromes. J. Cardiovas Pharm. 56, 113-122 (2010).
  4. Gargus, J. J. Unraveling Monogenic Channelopathies and Their Implications for Complex Polygenic Disease. Am. J. Hum. Genet. 72, 785-803 (2003).
  5. Abriel, H., Zaklyazminskaya, E. V. Cardiac channelopathies: Genetic and molecular mechanisms. Gene. 517, 1-11 (2013).
  6. Behr, E. R., et al. Sudden arrhythmic death syndrome: familial evaluation identifies inheritable heart disease in the majority of families. Eur Heart J. 29, 1670-1680 (2008).
  7. Catterall, W. A. Structure and regulation of voltage-gated Ca2+ channels. Annu. Rev. Cell Dev.Biol. 16, 521-555 (2000).
  8. Peterson, B. Z., DeMaria, C. D., Adelman, J. P., Yue, D. T. Calmodulin is the Ca2+ sensor for Ca2+ -dependent inactivation of L- type calcium channels. Neuron. 22, 549-558 (1999).
  9. Dolphin, A. C. Calcium channel diversity: multiple roles of calcium channel subunits. Curr.Opin.Neurobiol. 19, 237-244 (2009).
  10. Dai, S., Hall, D. D., Hell, J. W. Supramolecular assemblies and localized regulation of voltage-gated ion channels. Physiol Rev. 89, 411-452 (2009).
  11. Gao, T., et al. Identification and subcellular localization of the subunits of L-type calcium channels and adenylyl cyclase in cardiac myocytes. J. Biol. Chem. 272, 19401-19407 (1997).
  12. Carl, S. L., et al. Immunolocalization of sarcolemmal dihydropyridine receptor and sarcoplasmic reticular triadin and ryanodine receptor in rabbit ventricle and atrium. J. Cell Biol. 129, 673-682 (1995).
  13. Abriel, H., Rougier, J. S., Jalife, J. Ion Channel Macromolecular Complexes in Cardiomyocytes: Roles in Sudden Cardiac Death. Circ. Res. 116, 1971-1988 (2015).
  14. Bourdin, B., et al. Molecular Determinants of the Cavb-induced Plasma Membrane Targeting of the Cav1.2 Channel. J. Biol. Chem. 285, 22853-22863 (2010).
  15. Raybaud, A., et al. The Role of the GX9GX3G Motif in the Gating of High Voltage-activated Calcium Channels. J. Biol. Chem. 281, 39424-39436 (2006).
  16. Burashnikov, E., et al. Mutations in the cardiac L-type calcium channel associated with inherited J-wave syndromes and sudden cardiac death. Heart Rhythm. 7, 1872-1882 (2010).
  17. Hennessey, J. A., et al. A CACNA1C Variant Associated with Reduced Voltage-Dependent Inactivation, Increased Cav1.2 Channel Window Current, and Arrhythmogenesis. PLoS ONE. 9, e106982 (2014).
  18. Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y., Nalbant, A. Flow cytometry: basic principles and applications. Crit Rev Biotechnol. 1-14 (2016).
  19. Graham, M. D. The Coulter Principle: Foundation of an Industry. J. Lab. Autom. 8, 72-81 (2003).
  20. Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J. Immunol. Methods. 243, 77-97 (2000).
  21. Rothe, G. Cellular Diagnostics. Basics, Methods and Clinical Applications of Flow Cytometry. Sack, U., Tarnok, A., Rothe, G. Karger. Basel. 53-88 (2009).
  22. Bourdin, B., et al. Functional Characterization of Cavalpha2delta Mutations Associated with Sudden Cardiac Death. J. Biol. Chem. 290, 2854-2869 (2015).
  23. Tetreault, M. P., et al. Identification of glycosylation sites essential for surface expression of the Cavalpha2delta1 subunit and modulation of the cardiac Cav1.2 channel activity. J. Biol. Chem. 291, 4826-4843 (2016).
  24. Senatore, A., Boone, A. N., Spafford, J. D. Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells. J Vis Exp. (47), (2011).
  25. Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Herzenberg, L. A., Parks, D. R. Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed. Nat.Immunol. 7, 681-685 (2006).
  26. Shakeri, B., Bourdin, B., Demers-Giroux, P. O., Sauve, R., Parent, L. A quartet of Leucine residues in the Guanylate Kinase domain of Cavbeta determines the plasma membrane density of the Cav2.3 channel. J Biol Chem. 287, 32835-32847 (2012).
  27. Morton, R. A., Baptista-Hon, D. T., Hales, T. G., Lovinger, D. M. Agonist- and antagonist-induced up-regulation of surface 5-HT3A receptors. Br. J. Pharmacol. 172, 4066-4077 (2015).
  28. Hoffmann, C., et al. Fluorescent labeling of tetracysteine-tagged proteins in intact cells. Nat. Protocols. 5, 1666-1677 (2010).
  29. Cockcroft, C. J. Ion Channels: Methods and Protocols. Gamper, N. Humana Press. Totowa, NJ. 233-241 (2013).
  30. Gonzalez-Gutierrez, G., Miranda-Laferte, E., Neely, A., Hidalgo, P. The Src Homology 3 Domain of the beta-Subunit of Voltage-gated Calcium Channels Promotes Endocytosis via Dynamin Interaction. J. Biol.Chem. 282, 2156-2162 (2007).
  31. Galizzi, J. P., Borsotto, M., Barhanin, J., Fosset, M., Lazdunski, M. Characterization and photoaffinity labeling of receptor sites for the Calcium channel inhibitors d-cis-diltiazem, (+/-)-bepridil, desmethoxyverapamil, and (+)-PN 200-110 in skeletal muscle transverse tubule membranes. J. Biol.Chem. 261, 1393-1397 (1986).
  32. Bezanilla, F. The voltage sensor in voltage-dependent ion channels. Physiol.Rev. 80, 555-592 (2000).
  33. Sigworth, F. J. The variance of sodium current fluctuations at the node of Ranvier. J Physiol. 307, 97-129 (1980).
  34. Bailey, M. A., Grabe, M., Devor, D. C. Characterization of the PCMBS-dependent modification of KCa3.1 channel gating. J. Gen. Physiol. 136, 367-387 (2010).
  35. Fletcher, P. A., Scriven, D. R., Schulson, M. N., Moore, E. D. Multi-Image Colocalization and Its Statistical Significance. Biophys. J. 99, 1996-2005 (2010).
  36. Lizotte, E., Tremblay, A., Allen, B. G., Fiset, C. Isolation and characterization of subcellular protein fractions from mouse heart. Anal. Biochem. 345, 47-54 (2005).
  37. Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. J. Cell Sci. 123, 3621-3628 (2010).
  38. Yamamura, H., Suzuki, Y., Imaizumi, Y. New light on ion channel imaging by total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. J. Pharmacol. Sci. 128, 1-7 (2015).
  39. Wible, B. A., et al. HERG-Lite-R: A novel comprehensive high-throughput screen for drug-induced hERG risk. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 52, 136-145 (2005).
  40. Wilde, A. A. M., Brugada, R. Phenotypical Manifestations of Mutations in the Genes Encoding Subunits of the Cardiac Sodium Channel. Circ. Res. 108, 884-887 (2011).
  41. Milano, A., et al. Sudden Cardiac Arrest and Rare Genetic Variants in the Community. Circ Cardiovasc Genet. (2016).
  42. Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. G. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nat. Meth. 9, 152-158 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics