Determinación de la superficie celular y Expresión relativa total de canales de iones recombinante mediante citometría de flujo

JoVE Journal
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

arritmias cardíacas hereditarias son a menudo causados ​​por mutaciones que alteran la entrega superficie de uno o más canales de iones. Aquí, adaptamos citometría de flujo ensayos para proporcionar una cuantificación de la expresión de la proteína total y la superficie celular relativa de los canales iónicos recombinantes expresadas en células TSA-201.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Bourdin, B., Segura, E., Tétreault, M. P., Lesage, S., Parent, L. Determination of the Relative Cell Surface and Total Expression of Recombinant Ion Channels Using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (115), e54732, doi:10.3791/54732 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Este documento proporciona un ensayo fiable para informar de la superficie celular de expresión relativa de las proteínas de membrana como canales iónicos expresados ​​en las células recombinantes utilizando la tecnología de citometría de flujo existente. Los canales iónicos son proteínas de membrana formadores de poros que son responsables del control de señales eléctricas por gating el flujo de iones a través de la membrana celular. Se clasifican por el mecanismo de activación, la naturaleza, y la selectividad de las especies de iones que transitan a través del poro donde se localizan. En los niveles celulares y tisulares, los flujos de iones a través de los canales iónicos macroscópicas son el producto de las propiedades biofísicas 1 (gating y la permeabilidad), bioquímica (fosforilación), y la biogénesis (síntesis, glicosilación, el tráfico y la degradación). Cada uno de estos procesos es única para cada tipo de canales de iones y está optimizado para cumplir el papel fisiológico del canal de iones. En consecuencia, las alteraciones en cualquiera de estos procesos-finas sintonizado a través de unaheredada o una modificación genética, a menudo referido como "canalopatía", puede ser perjudicial para la homeostasis celular. Es importante hacer hincapié en que la entrega de la cantidad "correcta" de los canales iónicos en la superficie celular es crítica para la homeostasis celular. Incluso pequeños incrementos (ganancia de función) y disminuciones pequeñas (pérdida de la función) en la actividad de los canales iónicos tienen el potencial de causar una patología grave durante toda la vida. Los defectos en la entrega de la superficie celular de los canales iónicos maduro es un determinante importante en numerosos canalopatías, como la fibrosis quística (CFTR canal iónico) 2 y arritmias cardiacas de forma síndrome de QT largo (canales de potasio cardíacos) 3.

Canalopatías se asocian con la muerte súbita cardiaca 4. La prevalencia actual en todo el mundo de todas las canalopatías cardiacas se piensa que es al menos 1: 2,000-1: 3,000 por persona 5 y son responsables de cerca de la mitad de la súbita arrítmica ca muerte cardíacases 6. Disfunción cardíaca en sodio dependientes de voltaje, potasio, calcio y los canales iónicos selectivos se sabe que juegan un papel clave en este proceso. Se requiere que el 1.2 canales de calcio dependientes de voltaje tipo L Ca V para iniciar la contracción del músculo cardíaco sincronizado. La cardiaca de tipo L Ca V 1.2 canales es un complejo de proteínas de múltiples subunidades compuesto por el principal Ca subunidad α1 V de formación de poros y Ca V SS y Ca V α2δ1 subunidades auxiliares 7-12. Tenga en cuenta que se requiere el complemento completo de subunidades auxiliares para producir funcionales Ca V 1.2 canales en la membrana plasmática y las interacciones dinámicas entre estas subunidades son esenciales para apoyar la función eléctrica normal del corazón 13. Ca V ß promueve la expresión de la superficie celular de Ca V 1.2 canales a través de un nanomolar de interacción hidrofóbica no covalente 14. La co-expresión de la subunidad V wi α2δ1 Caunido a la ß TH Ca V V α1 Ca estimula la expresión corriente de pico (de 5 a 10 veces) y promueve la activación del canal a voltajes más negativos. Ganancia de función de las mutaciones de la subunidad formadora de poros Ca V 1.2 se han asociado con una forma de arritmias ventriculares llamado el síndrome de QT largo 15 mientras que una serie de mutaciones puntuales en las tres subunidades principales que forman el tipo L Ca V 1.2 canales han sido identificados en sujetos que sufren de arritmias de forma síndrome de QT corto 16,17. Los canales iónicos son proteínas de membrana que pueden ser investigados desde una perspectiva bioquímica (la química de proteínas) o utilizando herramientas electrofisiológicos (máquinas generadoras de corriente) y, a menudo utilizando estos enfoques complementarios. Electrofisiología, en particular de células enteras patch-sujeción, es un enfoque adecuado para dilucidar la función de los canales iónicos 15 pero no puede resolver modificaciones en el tráfico de proteínas a partir de los cambios en su biofísicopropiedades. química de proteínas ha, sin embargo, a menudo limitado el uso debido a la relativamente baja expresión de grandes proteínas de la membrana en relación con las proteínas solubles más pequeños. Robustos métodos de alto rendimiento utilizando la lectura de fluorescencia se deben desarrollar con el fin de abordar específicamente los defectos de la biogénesis de proteínas que causan cambios en la expresión de la superficie celular de los canales iónicos.

La citometría de flujo es una tecnología biofísico empleada en el recuento de células, la clasificación, la detección de biomarcadores y la ingeniería de proteínas 18. Cuando se inyecta una solución de muestra de células vivas o partículas en un citómetro de flujo, las células se ordenan en una única corriente que se puede probar por el sistema de detección de la máquina (Figura 1). La primera citómetro de flujo instrumento producido en 1956 19 detectado sólo un parámetro pero citómetros de flujo modernos tienen múltiples láseres y detectores de fluorescencia que permiten la detección de más de 30 parámetros fluorescentes 20,21.Filtros y espejos (óptica de emisión) dirigen la dispersión de la luz o luz fluorescente de las células a una red electrónica (fotodiodo y detectores) que convierten la luz en proporción a su intensidad. Los datos digitales se analizan usando un software especializado y la salida principal se muestra como un gráfico de puntos 21.

Figura 1
Figura 1:. Principios biofísicos de citometría de flujo clasificar las células individuales son empujados a través de una boquilla a alta presión dentro de una corriente de fluido de funda que les mueve a través de uno o más puntos de interrogación láser. El haz de luz es desviado por las células que pasan y la luz recogida en la dirección hacia adelante (Forward Scatter, FCS) se envía a un fotodiodo que convierte la luz en una señal proporcional al tamaño de la célula. La luz también se recoge en un ángulo de 90 ° a la trayectoria de láser y se envía a detectores (también llamados fotomultiplicadores (PMT)).Esta luz se dirige a través de espejos dicroicos que permiten la detección de la señal de dispersión lateral (SSC), que refleja la granularidad dentro de las células, y las emisiones fluorescentes si fluorocromos excitados están presentes en la célula. Tres detectores (verde, amarillo y rojo) se representan con diferentes filtros de paso de banda de longitud de onda, lo que permite la detección simultánea de diferentes fluorocromos. Las diferentes señales son digitalizadas por un ordenador externo y se convierten en datos que serán analizados para cuantificar las características de las células. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La capacidad de alto rendimiento de citómetros de flujo fue explotada para cuantificar la expresión en la membrana relativa de tipo salvaje recombinante y la trata con deficiencia de voltaje de tipo L Ca V 1.2 canales y subunidades asociadas en las células vivas. construcciones de ADNc coding para las proteínas se marcaron doblemente para llevar simultáneamente un epítopo no fluorescente extracelular que puede ser detectado por un anticuerpo conjugado fluorescente impermeable y un fluoróforo intracelular que es constitutivamente fluorescente. Tanto el epítopo extracelular, insertado en un bucle extracelular de la proteína, y el fluoróforo intracelular, insertado después de la C-terminal, se traducen con la proteína. En esta serie de experimentos, la proteína V α2δ1 Ca fue diseñado para expresar una hemaglutinina extracelular (HA) epítopo (YPYDVPDYA) detectada por un impermeable FITC (isotiocianato de fluoresceína) conjugada anti-HA y mCherry como el fluoróforo intracelular intrínseco. Para determinar el nivel de expresión de la superficie celular relativa de la V α2δ1 mCherry-Ca proteína etiquetada con HA, se recogieron las células recombinantes que expresan la proteína de fusión después de la transfección, y se tiñeron con el anticuerpo monoclonal de ratón anti-HA antibod etiqueta de epítopo conjugado con FITCy (Figura 2). FITC es un compuesto fluorescente orgánico que es considerablemente más pequeño que los reporteros de la enzima y por lo tanto no es tan probable que interfiera con la función biológica. mCherry- Ca V α2δ1-HA sobreexpresa en TSA-201cells, produce un aumento de 3 registro significativo de la fluorescencia FITC y la fluorescencia mCherry en gráficos bidimensionales 22. Dado que el epítopo HA se encuentra en la porción extracelular de la proteína, la intensidad de fluorescencia de FITC obtiene en presencia de células intactas reflejan el índice relativo de la expresión de la superficie celular de la proteína etiquetada con HA. La accesibilidad del epítopo HA en las construcciones se valida sistemáticamente mediante la medición de la señal de FITC después de la permeabilización celular. Esta medida también sirve para corroborar la expresión de la proteína total normalizada ya que las intensidades relativas de fluorescencia de FITC estimaron en células permeabilizadas son cualitativamente comparables con los valores de fluorescencia relativa FOr mCherry mide bajo permeabilizadas y no permeabilizadas condiciones 22,23. Es importante tener en cuenta que el espectro de fluorescencia intrínseca se desplaza hacia valores más altos después de la permeabilización, pero que el único valor que se informa es el cambio en la intensidad de fluorescencia en comparación con la construcción de control. Los cambios relativos en la intensidad de fluorescencia de las construcciones de ensayo se calculan utilizando la intensidad de fluorescencia ΔMean (ΔMFI) los valores para cada fluoróforo (mCherry o FITC). Los experimentos están diseñados para medir la intensidad de fluorescencia de la construcción de ensayo con respecto a la intensidad de fluorescencia de la construcción de control expresado en las mismas condiciones para limitar las variaciones experimentales en la fluorescencia intrínseca del anticuerpo fluoróforo conjugado. Dos proteínas de la membrana fueron estudiados con éxito utilizando este ensayo: la subunidad formadora de poros del canal de calcio dependiente de voltaje de tipo L Ca V 1.2 14,22 y en una serie diferente deexperimentos, el auxiliar extracelular Ca V α2δ1 subunidad 22,23. Se usó el siguiente protocolo para determinar la expresión de la superficie celular de la Ca V α2δ1 subunidad de la cardíaco L-tipo Ca V 1.2 canal en condiciones de control y después de las mutaciones que afectan a la modificación postraduccional del canal iónico. En condiciones experimentales estandarizadas, la fluorescencia de la superficie celular de FITC aumenta casi linealmente con la expresión de ADNc que codifica para las proteínas α2δ1-HA mCherry-Ca V (Figura 5 de la referencia 22).

Figura 2
Figura 2:. Representación esquemática de etiquetado total y membrana en la citometría de flujo protocolo experimental El esquema se describen algunos de los principales pasos necesarios para cuantificar la expresión total y superficie celular relativa de los canales iónicos recombinantes por flflujo citometría. Las células se transfectaron con la construcción de doble etiquetado mCherry-Ca V α2δ1-HA en TSA-201 células (1) y se tiñeron antes o después de la permeabilización (2). Multiparamétricos datos se adquieren en un citómetro de flujo (3) para el análisis multivariado (4). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. construcciones de ADN Tagged Doblemente

  1. Insertar el epítopo HA (YPYDVPDYA) en el enlazador extracelular de Ca V α2δ1 entre D676 y R677 por mutagénesis dirigida al sitio (Figura 3B) 20. Utilice gccggattatgcgGGAAAACTCCAAACAACC Cebador inverso y acatcatacggataTCAATAAATTCATTGAAATTTAAAAGAAATTC imprimación.
  2. Subclonar la secuencia de ADNc del V α2δ1 HA Ca etiquetado en el vector de expresión de mamífero pmCherry-N1 diseñado para expresar la proteína fusionada al N-terminal de mCherry entre los sitios SacI y SalI (Figura 3B) 20.
    NOTA: la función del canal apropiado necesita ser probado con la construcción de control usando métodos electrofisiológicos estándar 24.

2. La transfección transitoria mediada por liposomas (30 min, todos los pasos se realizan bajo flujo laminar Hood)

  1. Día 1: Placa de medio millón de TSA-201 células (o) en HEKT35 placas de cultivo mm con 2 ml de Dulbecco medio esencial mínimo de alta glucosa (DMEM-HG) complementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y medio (PS) cultura de penicilina-estreptomicina al 1%. Recuento de células utilizando un hemocitómetro estándar. Evaluar la viabilidad celular a partir de una fracción de la muestra de células usando azul tripán. suficientes células de la placa para alcanzar 90% de confluencia en el momento de la transfección.
  2. Día 2: Cambio medio de cultivo con 2 ml de (37 ° C) medio de cultivo fresco precalentado sin PS.
  3. Para cada muestra de transfección, preparar dos tubos de 1,5 ml. En el tubo 1, diluir 4 g de ADN en 250 l de medio de suero reducido. En el tubo 2, la mezcla 10 l de reactivo de transfección mediada por liposomas con 250 l de medio de cultivo reducido suero. Mezclar suavemente el reactivo de transfección antes de su uso.
  4. Incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
  5. Combinar los contenidos de tubo 1 y el tubo 2, se mezcla suavemente y se incuba al menos 20 min a temperatura ambiente.
  6. Añadir los liposomas / DNA los complejos a las células cultivadas y agitándolo suavemente la placa de cultivo para mezclar.
  7. Se incuba a 37 ° C en 5% de CO2 durante 24 horas.

3. La tinción de células para citometría de flujo (3 hr)

  1. Preparación de muestras de células
    1. Día 3: Eliminar medio de la placa de cultivo cuidadosamente y se lavan las células con 400 l de pre-calentado (37 ° C) 0,05% de tripsina-EDTA 1x (ácido etilendiaminotetraacético).
    2. Añadir 400 l de tripsina-EDTA y se incuba la placa a 37 ° C bajo 5% de CO2 durante 5 min para permitir que las células se desprenden de la placa.
    3. Detener la digestión con enzimas mediante la adición de 1 ml de medio de cultivo frío sin PS y lavar todas las células de la superficie pipeteando suavemente 4-5 veces. Evitar el exceso de la digestión y el exceso de pipeteado para reducir la muerte celular.
    4. Recoger las células en tubos de 1,5 ml y colocar inmediatamente en hielo. Utilice soluciones frías de hielo y mantener las células a 4 ° C para evitar la internalizaciónantígenos de la superficie. Disminución de iluminación para limitar photobleaching de la señal fluorescente.
    5. tubos de centrifugación a 400 xg durante 5 min a 4 ° C. aspirar con cuidado y descartar el sobrenadante.
    6. Vuelva a suspender el sedimento en 1 ml de 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS) para preparar una suspensión de células individuales.
    7. En resumen vórtice los tubos suavemente y repita los pasos 3.1.5 y 3.1.6 para eliminar por completo el medio de cultivo.
    8. Vuelva a suspender el precipitado en 600 l de PBS 1x y ajustar la concentración de células a un mínimo de 3 x 10 6 células / ml.
    9. Dividir las células en dos nuevos tubos de 1,5 ml para la tinción extracelular e intracelular. Incluir los controles adecuados para discriminar la tinción específica de tinción no específica.
      NOTA: El anticuerpo de control de isotipo ayuda a evaluar el nivel de la tinción de fondo e idealmente debe coincidir con las especies huéspedes de cada anticuerpo primario, isotipo y fluoróforo. Utilice el control de isotipo y el anticuerpo conjugado al mismola concentración de proteínas.

tabla 1
Tabla 1: citometría de flujo de muestras de control para el experimento no se permeabilizaron y se permeabilizaron células Cada experimento tiene que incluir los siguientes controles negativos:. (1) células no transfectadas (sin anticuerpo, con el isotipo o con el anticuerpo conjugado). (2) Las células transfectadas con la proteína de interés se subclona en un plásmido sin constitutiva fluorocromo intracelular fluorescente (pCMV-Ca V α2δ1-HA) o con la construcción doblemente etiquetada (pmCherry-Ca V α2δ1 y se incubaron sin anticuerpo, con el isotipo o con el anticuerpo conjugado). controles individuales de color se utilizan para la compensación de superposición de emisión fluorocromo. Los mismos controles se ejecutan para no permeabilized y se permeabilizaron las condiciones de cada serie de experimentos.

  1. La tinción de superficie celular de IntactLas células vivas
    1. Alícuota de 1 x 10 6 células / 100 l en tubos de 1,5 ml.
    2. Añadir el anticuerpo monoclonal conjugado con FITC anti-HA en 5 mg / ml y, vórtice antes de incubar las células en una plataforma de balancín (200 rpm) en la oscuridad a 4 ° C durante 45 min.
      NOTA: Se determinó la concentración óptima de anticuerpo en los experimentos de titulación preliminar (Figura 4).
    3. Eliminar las células de la oscuridad y añadir 900 l de PBS 1x / tubo. Centrifugar a 400 xg durante 5 min a 4 ° C.
    4. Aspirar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 1 ml de PBS 1x, vortex y centrifugar a 400 g durante 5 min a 4 ° C.
    5. Repetir el lavado (etapa 3.2.4) dos veces para eliminar cualquier anticuerpo no unido. Si se utiliza un anticuerpo primario sin conjugar, se incuban con el anticuerpo secundario apropiado.
    6. Después del lavado final, resuspender las células en 500 l de 1x PBS y transferir la suspensión de células individuales en 5 ml de citometría de flujo tubos. Mantenga la células en la oscuridad a 4 ° C hasta que se ejecuta la muestra.
    7. Ejecutar las muestras en un citómetro de flujo. Para obtener los mejores resultados, analizar las células en el citómetro de flujo tan pronto como sea posible y no más tarde de 24 horas después.
  2. La tinción intracelular: La fijación, permeabilización y tinción
    1. Alícuota 1 x 10 6 células / 100 l en tubos de 1,5 ml y centrifugar a 400 xg durante 5 min a 4 ° C.
    2. Desechar las células sobrenadante y resuspender en 100 l de solución de fijación-permeabilización directamente desde el almacén.
    3. Incubar en la oscuridad a 4 ° C durante 20 minutos.
    4. Añadir 100 l de 1 x tampón de permeabilización lavado recién preparada (diluida 10x tampón de permeabilización de lavado en agua destilada H 2 O). células de vórtice y sedimento utilizando una centrífuga de mesa a 400 xg durante 5 min a 4 ° C.
    5. Aspirar y descartar el sobrenadante.
    6. Repita los pasos 3.3.4 y 3.3.5.
    7. Añadir anticuerpo anti-HA monoclonal conjugado con FITC a 5mg / ml en 100 l de 1 x tampón de permeabilización y el lavado, vórtice antes de incubar las células en la oscuridad a 4 ° C durante 30 minutos.
      NOTA: La tinción intracelular se lleva a cabo siguiendo el mismo procedimiento que el utilizado para la tinción de la superficie celular. permeabilización celular mediada saponina es sin embargo, un proceso reversible de forma rápida, por lo tanto, es importante reemplazar 1x PBS con tampón 1x Perm / Wash para mantener las células en la presencia constante de la saponina durante la tinción intracelular.
    8. Eliminar las células de la oscuridad y añadir 100 l de tampón de permeabilización-lavado. Centrifugar a 400 xg durante 5 min a 4 ° C.
    9. Aspirar cuidadosamente el sobrenadante y resuspender el precipitado en 100 l de tampón de permeabilización de lavado, vórtice y se centrifuga a 400 g durante 5 min a 4 ° C.
    10. Repetir el lavado (paso 3.3.9) una vez más para eliminar cualquier anticuerpo no unido.
    11. Después del lavado final, resuspender las células en 500 l de 1x PBS y transferir el pecadosuspensión de células GLE a 5 ml de citometría de flujo tubos. Mantener las células en la oscuridad a 4 ° C hasta que la inyección de la muestra en el citómetro de flujo.
    12. Ejecutar las muestras en un citómetro de flujo. Ejecutar las muestras fijadas en el citómetro tan pronto como sea posible pero no más tarde de 1 semana después de la tinción. Ejecutar las células no permeabilizadas y permeabilizadas en el mismo día.

4. Citometría de Flujo

  1. Citómetro de flujo célula de establecimiento Clasificador diario
    1. Encienda el software de citometría de flujo. Antes del experimento, calibrar y configurar el citómetro de flujo separador celular para garantizar un rendimiento óptimo del instrumento (es decir, láser y la óptica están funcionando según las especificaciones, el láser y la celda de flujo están alineados correctamente) mediante el uso de cuentas de configuración del instrumento.
    2. Utilice la boquilla 100 micras con presión de funda 20 psi.
      NOTA: La boquilla no tiene que ser cambiado en un banco citómetro de flujo.
    3. Ajuste del caudal del citómetro de acuerdo con la fabriespecificación er. Excesivamente altas velocidades de flujo disminuirá la sensibilidad en la detección de variaciones en la fluorescencia.
    4. Seleccione azul (488 nm para excitar la fluoresceína Isothiocayanate o FITC) y amarillo-verde (561 nm para excitar mCherry) láser. Recoger los niveles de fluorescencia FITC y mCherry con una nm 530/30 y con un filtro de paso de banda 610/20 nm respectivamente.
    5. Adquirir la dispersión frontal (FCS) frente a dispersión lateral (SSC) diagrama de puntos de células no teñidas utilizando la escala lineal. Ajustar la amplificación de cada detector para visualizar las células en el cuadrante inferior izquierdo del gráfico de puntos.
  2. Lectura muestra de células intactas para no permeabilizadas-
    1. Ajuste el P1gate para células no permeabilizadas en vivo por la delimitación de una forma libre alrededor de las células a analizar con exclusión de los desechos celulares y agregados de células, lo que limita la señal de fluorescencia de las células intactas.
      NOTA: en vivo colorantes de exclusión / muertas se pueden utilizar para facilitar la colocación de compuerta en células vivas. Conjunto 10.000 eventos para grabaren la puerta de parada P1. Establecer esto a un mayor número de eventos si es necesario.
    2. Adquirir mCherry frente FITC gráfico de contorno de dos parámetros de línea de base para detectar autofluorescencia de las células teñidas. Utilice la escala bi-logarítmica para mostrar los valores negativos y mejorar la resolución entre las poblaciones 25. Ajustar el voltaje de cada detector para establecer las células negativas no teñidas dentro de la parte inferior de los primeros diez unidades de las parcelas de intensidad de fluorescencia de registro.
    3. Adquirir todas las muestras intactas no permeabilizadas utilizando los ajustes establecidos en 4.1.5 y 4.1.6 y recoger FSC, SSC y señales de los detectores de fluorescencia.
    4. Exportar y guardar archivos * .fcs que se utilizarán para el análisis mediante citometría de flujo de software de análisis.
  3. Lectura de la muestra de células permeabilizadas
    1. Mover la puerta P1 para seleccionar células vivas en las muestras permeabilizadas y ajustar el FSC y SSC tensión como se muestra en 4.1.5 y 4.1.6.
    2. Adquirir todas las muestras permeabilizadas y recoger FSC, SSC unaseñales de ND en los detectores de fluorescencia.
    3. Exportar y guardar archivos * .fcs que se utilizarán para el análisis mediante citometría de flujo de software de análisis.
  4. Análisis de los datos
    1. Poner en marcha el análisis de citometría de flujo de software e importación * .fcs archivos guardados en 4.2.4 y 4.3.3.
    2. Haga clic en el primer ejemplo que aparece en la ventana del espacio de trabajo. Una nueva ventana llamada después de que el número de identificación de tubo se abre automáticamente. Iniciar el proceso de compuerta en la trama de SSC frente a FSC. Dibuje una puerta (P1) mediante el icono de la elipse alrededor de las células vivas y eliminar cualquier desecho, células muertas, o agregados que tienen diferentes dispersión frontal y dispersión lateral de células vivas
    3. Para dibujar el gráfico de contorno de dos parámetros de la mCherry (eje y) frente a FITC (eje x) la intensidad de fluorescencia de las células vivas, primero haga clic en el eje x y elegir el FITC-Un canal y, a continuación, haga clic en la ordenada y elegir el eje x-PE-A mCherry canal. Haga clic en el icono "Quad" para colocar el marcador cuadrante en el borde de unautofluorescent células en cada canal de fluorescencia.
      NOTA: La puerta en torno a las células FITC y mCherry positivos es la puerta P2. La población de células negativo de fluorescencia se conoce como la puerta P3. Vea la Figura 5 para el método de compuerta representativo utilizado en este artículo.
    4. Seleccionar P2 y P3 puertas y hacer clic en el icono "Agregar Estadísticas" en la ventana del área de trabajo original. Haga clic en "Count" (número de células positivas) y hacer clic en "Mean" (intensidad media de fluorescencia de cada fluorocromo) o "mediana" (Mediana Intensidad de fluorescencia de cada fluorocromo) estadísticas entre la lista de opciones. Haga clic en la opción "Agregar Estadísticas" de nuevo. Todos estos valores se transfieren automáticamente a la ventana de área de trabajo original.
      NOTA: El "medio" se utiliza sólo si la intensidad de la fluorescencia sigue una distribución normal. En cualquier otro caso, haga clic en la pestaña "mediana". IMF por lo tanto puede referirse a fluorescencia media intensitLa intensidad de la fluorescencia y o mediana.
      NOTA: El siguiente paso es aplicar los parámetros y estadísticas de Gates a todas las muestras sondeadas por el citómetro.
    5. En la ventana de área de trabajo, utilizar el ratón para arrastrar y soltar los parámetros puertas y estadísticas sobre la línea marcada todas las muestras.
    6. Generar un informe lote de gráficos bidimensionales de nivel, (mCherry vs FITC) y los histogramas (recuento de células frente a la intensidad de fluorescencia) para las células no permeabilizadas y permeabilizadas (Figuras 6A - B).
    7. De las estadísticas generadas en el paso 4.4.4, calcular la intensidad media de fluorescencia (MFI) para cada fluorocromo para las células teñidas. A partir de este valor, restar el valor de MFI obtenido a partir de células no teñidas de cuantificar la superficie y la expresión total de la proteína de interés.
    8. Reportar los valores ΔMFI para cada fluoróforo (mCherry y FITC) (Figura 6 C - D). Normalizar la ΔMFI medido para el Ca NOTA: El valor absoluto de la intensidad de fluorescencia puede variar mucho dependiendo del lote de anticuerpos y las capacidades técnicas de cada trabajador de laboratorio, de ahí la necesidad de normalizar la intensidad de fluorescencia de la construcción de mutantes utilizando la construcción WT.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En este artículo se describe un protocolo fiable para cuantificar la superficie total y celular de los canales iónicos recombinantes expresadas en TSA-201cells por un flujo de dos colores citometría de ensayo. A modo de ejemplo, la superficie de la célula y la expresión relativa de proteína total se cuantificó para el V α2δ1subunit Ca. Para llevar a cabo el flujo de dos colores ensayo de citometría, Ca V α2δ1 fue etiquetado doblemente para expresar un epítopo HA no fluorescente extracelular que puede ser detectado por un anticuerpo anti-HA conjugado con FITC y un fluorescente fluoróforo mCherry intracelular constitutiva. Los espectros de excitación y emisión para FITC y mCherry muestran que FITC se excita con una eficiencia del 88% por el láser de 488 nm, pero la eficacia disminuye a 0% con el láser de 561 nm. El mCherry muestra 63,9% de su máximo de fluorescencia cuando es excitado con el láser de 561 nm, pero sólo 7,6% con el láser de 488 nm (Figura 3). La excitación y la emisión spectra para ambos fluoróforos exhiben recogida de luz óptima y un mínimo de superposición con los diferentes láseres y filtros seleccionados. Citometría de flujo ensayos podrían proporcionar información cuantitativa acerca de la expresión relativa de las proteínas de membrana de una población de células grandes, siempre que el MFI para el fluorocromo dado es directamente proporcional a la expresión de la proteína de Ca V α2δ1 en cada celda en lugar del número de células fluorescentes. Esto implica el uso de una concentración de anticuerpo de fluorescencia conjugado más allá de la saturación. La curva de valoración para el anticuerpo anti-HA conjugado con FITC unión a Ca V α2δ1 (Figura 4) muestra tres fases. Si bien no se detectó fluorescencia en la primera fase, la intensidad de fluorescencia aumenta exponencialmente con el aumento de la concentración de anticuerpos en la segunda fase. Después de que el punto de saturación (tercera fase), el aumento de la concentración del anticuerpo no tiene efecto sobre la inten fluorescencia relativasidad (RFI) de FITC. El punto de saturación de anticuerpos anti-HA conjugado con FITC se estableció en 5 g / ml, lo que garantiza que la concentración del conjugado de anticuerpos no está limitando la MFI durante los experimentos.

El Ca V etiquetado α2δ1was expresa en TSA-201cells y citometría de flujo Los ensayos se llevaron a cabo en presencia del conjugado con FITC anti-HA en células no permeabilizadas (Figura 5). Controles apropiados (Tabla 1) se analizaron en el citómetro de flujo que valores de atributos XY para cada célula pasa por el haz de láser. La distribución celular se visualiza en gráficos de puntos (Figura 5A). FCS / SSC gráficos de puntos confirman que la preparación de muestras de células proporciona una única suspensión de células con una alta viabilidad (Figura 5Ba). La puerta seleccionado por células vivas (P1) representa 75% del número total de células analizadas. La expresión de la proteína total of Ca V α2δ1 en células TSA-201 se consideró que era proporcional a la fluorescencia mCherry. Como se ve en las mCherry frente a FITC gráficos de contorno e histogramas (Figura 5BB - AC), 47 2% de células TSA-201 transfectadas con pmCherry-Ca V α2δ1-HA se encontraron para expresar significativamente la fluorescencia mCherry, así como mostrar la fluorescencia FITC significativo debido a la unión a la etiqueta externa HA de Ca V α2δ1 en células no permeabilizadas. experimentos de control negativo realizadas sin anticuerpo o con el isotipo indican que el FITC se une sólo o principalmente a las células transfectadas positivamente.

Este protocolo se utilizó para caracterizar el papel de la N-glicosilación en la expresión total y superficie celular de Ca V α2δ1 en TSA-23 201cells. Los experimentos se llevaron a cabo en células no permeabilizadas para evaluar la expresión en la superficie celulary en las células permeabilizadas para evaluar la expresión de proteína total, así como la confirmación de la accesibilidad del epítopo HA. Expresión relativa de Ca V α2δ1 se calculó sobre la base de la IMF estima para cada fluoróforo (mCherry o FITC). Valores ΔMFI para los mutantes se normalizaron al valor máximo medido el mismo día para mCherry-Ca V α2δ1-HA WT expresado en las mismas condiciones. Esto es importante para dar cuenta de las variaciones en el tiempo de la intensidad de fluorescencia absoluta del anticuerpo conjugado anti-HA FITC. Como se ve en la Figura 6A, el ΔMFI para FITC en células no permeabilizadas era fuerte para el WT y el 4xNQ construyen pero cerca del nivel de la fluorescencia de fondo para el constructo 16xNQ lo que indica que la proteína es casi ausente de la membrana plasmática. Los ensayos conducidos después de la permeabilización celular, mostraron que la expresión de proteína total de la construcción 16xNQ también se redujo significativamente sise infiere de la fluorescencia FITC en células permeabilizadas o de la fluorescencia mCherry constitutiva medido en no permeabilizadas y en células permeabilizadas (Figura 6C - D). Como se ve en la Figura 6B, los niveles de autofluorescencia celulares aumentaron después de la permeabilización de células, lo que impide la comparación de los valores de fluorescencia absolutas entre las células no permeabilizadas y permeabilizadas intactas. La fluorescencia ΔMFI medido para mCherry fue similar para ambos células no permeabilizadas y permeabilizadas que significa que la solución de permeabilización no altera la señal de fluorescencia relativa de mCherry. Las mutaciones de los sitios de N-glicosilación se asoció con una disminución en la intensidad de fluorescencia para mCherry apoyo a la observación publicado que la biogénesis de proteína / estabilidad se redujo 23. En esta serie de experimentos, la señal de fluorescencia relativa para FITC medida en células permeabilizadas resultó be incluso más pequeño que la señal relativa para mCherry lo que sugiere que el estado de glicosilación de tipo N de la proteína podría influir en la intensidad de la fluorescencia detectada por el anticuerpo conjugado con FITC anti-HA en el dominio extracelular. En total, los cambios en la fluorescencia relativa de FITC antes de después de la permeabilización celular proporcionan una métrica fiable para cuantificar la expresión de proteínas.

figura 3
Figura 3: FITC y mCherry forman una pareja adecuada de fluorocromos para los ensayos de citometría de dos colores de excitación (curvas vacías) y espectros de emisión (curvas llenas) para FITC emocionados con 488 nm láser azul (Aa) y mCherry emocionados con 561 nm amarillo-. láser verde (Ab). FITC y la fluorescencia mCherry se recogieron con un 530/30 nm y un 610/20 nm bandpass filtros respectivamente. La longitud de onda de los láseres diferentes (líneas verticales de colores) y los filtros (rectángulos de color) se eligen para la recogida de luz óptima y un mínimo de superposición. (B) Representación esquemática de la proteína HA-α2δ1 mCherry-Ca V. Ca V α2δ1 fue doblemente etiquetada para expresar un epítopo HA no fluorescente extracelular que puede ser detectado por un anticuerpo anti-HA conjugado con FITC y un fluorescente fluorocromo mCherry intracelular constitutiva. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4:. La titulación de anticuerpo monoclonal anti-HA conjugado con FITC unión a Ca V α2δ1 TSA-201 células fueron transfectadas transitoriamente con pmCherry-Ca V & # 945; 2δ1-HA y se incubaron con una serie de anticuerpos anti-HA conjugados con FITC o isotipo. Sólo la señal FITC está siendo analizado en este panel. (A) histogramas de un solo parámetro visualizan el número relativo de células en el eje Y y la intensidad de fluorescencia FITC en el eje x para el rango de anticuerpo anti-HA conjugado con FITC de concentraciones (0,01 a 20 mg / ml). (B) Gráfico Semi-log para el anticuerpo anti-HA conjugado con FITC como una función de la IMF de FITC. La curva de valoración se realiza utilizando una ecuación sitio de unión con un valor de línea de tendencia R2 = 0,99561. Titulación realizado para el anticuerpo de isotipo no mostró fluorescencia como se esperaba. Las concentraciones de 0,001 a 0,01 g / ml son indistinguibles del ruido de fondo. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1 "> Figura 5
Figura 5: Flujo de Representante análisis de citometría de no permeabilizadas TSA-201cells transfectadas con pmCherry Ca-V α2δ1-HA (A) Representación esquemática de la estrategia de compuerta utilizado en citometría de flujo muestra de análisis.. Los datos fueron analizados después de la adquisición con el software apropiado. La primera estrategia compuerta se aprovecha de una dispersión frontal (FSC) y dispersión lateral (SSC) gráfico de puntos para mostrar una puerta (P1) alrededor de las células vivas y eliminar cualquier desecho, células muertas, o agregados que tienen diferentes dispersión frontal y dispersión lateral de células vivas . Dos parámetros gráficos de contorno de la mCherry (eje y) frente a FITC (eje x) la intensidad de fluorescencia se muestran para la población P1. puertas rectangulares fueron colocados en el borde de la autofluorescencia de las células para seleccionar el P2 positiva población (FITC y mCherry) y la P3 población negativa. El nivel de fluorescencia para tque las células dentro de la región P2 y P3 se visualizaron usando recuento de células posterior frente a la intensidad de fluorescencia histogramas de un solo parámetro FITC o mCherry. Un cambio en la intensidad de fluorescencia en el eje x y y proporciona un índice fiable de la expresión total y de la membrana de Ca V α2δ1 respectivamente. La intensidad de la señal de fluorescencia aumenta como una función del número de moléculas de fluorocromo. (Ba) Representante FCS / gráficos de puntos de SSC para cada condición como se ha dicho. Un total de 10.000 eventos fueron adquiridos para su análisis. La puerta de la elipse (P1) es dibujado por el ojo alrededor de las células vivas con exclusión de los eventos con baja FSC (células muertas) o altas SSC (agregados). (Bb) representativos de dos parámetros gráficos de contorno de la (eje y) mCherry frente a FITC (eje x) la intensidad de fluorescencia. Gates, fueron colocados en el borde de la autofluorescencia de las células para separar las poblaciones de células FITC mCherry positivos (puerta P2 ) y las células fluorescentes negativos (P3). (Bc) Single-paparáme- histogramas de las células frente a la intensidad de fluorescencia (FITC) o mCherry recuento relativo (o% del valor máximo). La distribución de la intensidad de fluorescencia medido para células dentro de la puerta P2 (células de fluorescencia positiva) se muestran en gris y la distribución de intensidad de fluorescencia para las células presentes en la puerta P3 (células de fluorescencia-negativo) se muestra como una superposición en una parcela gris transparente. Como se ve, la intensidad de fluorescencia fue fuerte tanto para mCherry y FITC que indica que el Ca V α2δ1 se expresa bien y claramente presente en la membrana celular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6
Figura 6: mutaciones simultánea de sitios -glycosylation N interrumpidos superficie celular exsión de Ca V α2δ1. V células beta 3 TSA-201 Ca estables fueron transfectadas transitoriamente simultáneamente con pCMV-Ca V 1.2 WT y pmCherry Ca-V-HA α2δ1 WT o mutantes. No permeabilizadas (A) y células permeabilizadas (B) se tiñeron con anticuerpo anti-HA conjugado con FITC como se describe anteriormente. Representativos gráficos de contorno de dos parámetros de mCherry frente a FITC fluorescencia (paneles de la izquierda) y el histograma parcelas de la distribución de la intensidad de fluorescencia de la tinción de anticuerpo conjugado anti-HA FITC (paneles de la derecha) se muestran para N mutantes -glycosylation (NQ) después de la interrupción de cuatro sitios (4xNQ: N92Q / N184Q / N468Q / N876Q) y 16 sitios (16xNQ: N92Q / N136Q / N184Q / N324Q / N348Q / N468Q / N475Q / N585Q / N594Q / N663Q / N769Q / N812Q / N876Q / N883Q / N973Q / N986Q) en células no permeabilizadas o NP intactos (a) y en las células permeabilizadas o P (B). la distriblución de la intensidad de fluorescencia medido para células dentro de la puerta P2 (células de fluorescencia positiva) se muestran en gris, y la distribución de la intensidad de fluorescencia de células presentes en la puerta P3 (células de fluorescencia-negativo) se muestra como una superposición de una manera transparente parcela gris. Como se ve en (B), los niveles de autofluorescencia aumentaron después de la permeabilización celular. La intensidad de fluorescencia de FITC medido para todas las células transfectadas permeabilizadas aumento (visto como un desplazamiento a la derecha en el eje x) que indica que todas las proteínas V α2δ1 etiquetados-HA Ca transfectadas se tiñeron y detectados por el anticuerpo anti-HA FITC. Gráfico (C) de barras muestra la MFI normalizado medido en la presencia de FITC en (expresión en la superficie) intacto no permeabilizadas o células permeabilizadas (expresión total). La densidad relativa de fluorescencia se midió por triplicado para cada condición (30.000 células) y en tres diferentes lotes de células transfected durante un período de 1 mes, por tanto, los datos se muestran como la media ± SEM de 90.000 células para cada condición. Se llegó a la intensidad de fluorescencia pico entre 24 y 36 horas después de la transfección. Los valores ΔMFI para FITC medidos en células intactas no permeabilizadas se utilizó como un índice de la expresión en la superficie celular de Ca V α2δ1-HA, y los valores ΔMFI para FITC medidos en células permeabilizadas reflejan la expresión de la proteína total (superficie celular y expresión de la proteína intracelular ). ΔMFI para FITC se calculó restando la intensidad de fluorescencia FITC de las células negativas FITC (P3) de la intensidad de fluorescencia de las células positivas a FITC (P2). El mismo método se utiliza para calcular la ΔMFI para mCherry. Valores de MFI se normalizaron al valor máximo medido el mismo día para mCherry-Ca V α2δ1-HA WT. (D) Gráfico de barras que muestra el ΔMFI normalizado medido en mCherry no permeabilizadas o células permeabilizadas (totAl expresión). Los resultados se expresan como media ± SEM favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Este ensayo basado en citometría de flujo se aplicó con éxito a la medición de los niveles totales y de la superficie celular relativas de las subunidades marcado fluorescentemente formadores de poros y asociado de los canales de calcio dependientes de voltaje 14,22,26. Se utiliza mejor en la investigación de los efectos de mutaciones genéticas y por lo tanto requiere que la intensidad de la fluorescencia intrínseca de la construcción de tipo salvaje marcado fluorescentemente etiquetado sea al menos 10 a 100 veces mayor que para la intensidad de fluorescencia de la construcción sin etiquetar marcado fluorescentemente . En este caso particular, la construcción de V α2δ1-HA mCherry-Ca describe en este documento produjo una señal mayor a la proporción de ruido y un rango dinámico mayor de lo que se midió para el Ca V publicado previamente 1,2-HA y Ca V 2.3-HA constructos. Hay muchas razones imaginables para esto. Se puede especular que el entorno local del epítopo HA en el dominio extracelular de la Ca V &# 945; proteína 2δ1 maximiza la relación señal a ruido del anticuerpo anti-HA conjugado con FITC.

Además, es importante tener en cuenta que este método no proporciona un valor absoluto en el número de proteínas en la superficie celular. La expresión relativa de la construcción de etiquetado requerido para obtener la expresión canal de función se puede obtener, sin embargo, mediante la realización de lado a lado de patch-clamp y citometría de flujo experimentos en las mismas condiciones como se muestra en la Figura 7 de referencia 22. A partir de estos datos, se puede estimar que la densidad de corriente de pico, una medida global de la actividad de los canales iónicos, en general, aumenta como una función de la expresión en la superficie de la subunidad Ca V α2δ1 etiquetado. La principal limitación de este ensayo actual expresión en la superficie celular es que no se puede aplicar en este momento para el estudio de los canales iónicos endógenos. Esto es debido al hecho de que algunos anticuerpos disponibles comercialmentese sabe que se une específicamente a dominios externos predichos de los canales iónicos. Por lo tanto, requiere una manipulación genética de la secuencia primaria de la proteína a ser estudiado expresada en una línea celular recombinante indiferenciada tal como células TSA-201.

Los pasos críticos en la optimización del ensayo: La identificación del par apropiado de fluoróforos, la elección del epítopo externo, y la localización del sitio de inserción son cruciales para el éxito de este método porque la inserción del epítopo no debe interferir con función de la proteína. Se probaron diferentes combinaciones de fluoróforos. Dos epítopos externos: la hemaglutinina (HA) epítopo (YPYDVPDYA) y la unión bungarotoxina-situ epítopo (WRYYESSLEPYPD) 27 y tres anticuerpos conjugados fluorescentes impermeables se evaluaron, a saber, el FITC (isotiocianato de fluoresceína) -, la R-ficoeritrina - y los PE-conjugados Cy7--anticuerpos. Además, más de 10 inserción diferentesitios para el epítopo HA externo fueron analizadas con un máximo de Ca V α2δ1. En lo que se refiere a la inserción del epítopo que requiere mutagénesis dirigida al sitio y las técnicas de ADN recombinante, se aconseja para diseñar un mínimo de tres juegos de cebadores dentro de la misma región. Con 9 residuos, el epítopo HA es uno de los epítopos más pequeños para los que existe anticuerpos fluorescentes conjugado comercialmente disponibles, pero la tasa de éxito de la inserción de 27 nucleótidos es más bajo que para el punto de mutación. Motivos de tetracisteína (residuos Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys) son 2-residuo más pequeño que el epítopo HA, pero el aglutinante horquilla arsenical fluoresceína es permeante de membrana y no es adecuado para el análisis de las proteínas unidas a la membrana 28. Los experimentos preliminares se realizaron con dos fluoróforos intracelulares de proteínas mCherry y verde fluorescente (GFP). Tres criterios se utilizan para discriminar el par de fluoróforos con éxito los canales de iones: 1) los espectros de emisión de las necesidades fluoróforosno se superponen (ver referencias 20,21 para más detalles); 2) la expresión de la construcción etiquetado genera canal iónico funcional en células recombinantes como validado por métodos electrofisiológicos estándar; y 3) la expresión de la construcción de control produce una lectura fluorescente robusta. Si uno de estos criterios no se cumple, por ejemplo, si la inserción de la etiqueta o el fluoróforo interfiere con la función del canal, uno tiene que volver al punto de partida y modificar ya sea el sitio de inserción del epítopo externo y / o el sitio de inserción del fluoróforo. Un enlazador de residuos de 5-glutamina entre el C-terminal de la proteína y el fluoróforo puede ayudar a mejorar la función de la proteína. Además, podría ser útil para insertar el epítopo externo en grandes bucles que no se sabe que juegan un papel crítico en la función de las proteínas y / glicosilación de proteínas. Uno también tiene que ser consciente de los aspectos técnicos menores.

La tasa de éxito de transf mediada por liposomasreflexión en las células TSA-201 podría ser disminuido después de la inserción de los dos epítopos dentro de Ca V α2δ1. Por lo tanto se sugiere volver a calibrar la eficacia de la transfección con las nuevas construcciones de ADN. Esto sucede porque la inserción de una proteína de 30 kDa cambia el peso molecular del ADN. Se podría modificar el ADN relación de liposomas a a 1: 2 a 1: 3 si es necesario o se incuban las células a 37 ° C durante un período de tiempo más largo (24 a 72 h). Es importante elegir la formulación correcta para permeabilizar las células. La mayoría de las soluciones caseras evaluados para este proyecto resultó para hacer que las células se agreguen y obstruyan el citómetro de flujo.

Frenar la exposición a la luz, mientras que la tinción de la célula con el anticuerpo conjugado fluoróforo es esencial para limitar photobleaching y la pérdida de señal. Para minimizar fondo fluorescente, es importante para centrifugar el exceso de anticuerpo conjugado antes de su uso. Por último, es de la máxima importancia para analizar tél las células en el citómetro de flujo tan pronto como sea posible, y no más tarde de 24 horas después. Mantener las células teñidas durante la noche a 4 ° C probablemente reducirá la señal y poner en peligro la supervivencia celular. Las variaciones en la fluorescencia intrínseca del anticuerpo conjugado con fluoróforo de lote a lote dictan que la intensidad de fluorescencia de la construcción de prueba necesita ser informado que una función de la intensidad de fluorescencia de la construcción de control expresado en condiciones experimentales idénticas.

Para conseguir una buena señal global a ruido, se recomienda para reducir al mínimo el pipeteado de células para reducir la muerte celular y para volver a suspender suavemente las células de tal manera que se inyectan a 3 x 10 6 células / ml en el citómetro de flujo. Tenga en cuenta que una concentración de células más alto reducirá el flujo de células y podría obstruir el citómetro de flujo. Por otro lado, una concentración de células inferior requerirá un tiempo de procesamiento más largo. Uno puede por lo tanto tienen que ajustar la concentración dependiendo de la type de las células a analizar.

ensayos alternativos: metodologías adicionales desplegados para documentar la presencia de los canales iónicos en la membrana plasmática caída de la superficie celular en cuatro grandes categorías: 1) los métodos de imagen confocal que aprovechan la interacción de alta afinidad entre los anticuerpos fluoróforo conjugado y la proteína diana; 2) Técnicas de la química de proteínas que descansan sobre la modificación covalente de la proteína diana por reactivos de biotinilación; 3) medidas electrofisiológicas de análisis de ruido no estacionario; y 4) marcaje por fotoafinidad de la proteína diana con sondas radiactivas. En el caso del canal de calcio dependiente de voltaje, el etiquetado de fotoafinidad con tritiada (±) - [3 H] PN 200-100, un ligando de alta afinidad de la familia de dihidropiridina se utiliza ampliamente en la década de 1980 31. Sigue siendo un ensayo muy sensible, sino que implica la manipulación de material radiactivo 31, que ha caído en desuso después de la llegadaLas sondas de fluorescencia y luminiscencia de altamente sensibles, especialmente con los investigadores más jóvenes. Además, es imposible para medir la actividad del canal iónico en presencia del antagonista, de manera que la correlación entre la expresión de la superficie y la función está más allá del alcance de este enfoque. En el otro extremo del continuo experimental, análisis de ruido no estacionario de los canales iónicos requiere grabaciones gigaseal patch-clamp de alta calidad con la línea de base estable para las grabaciones de un minuto de duración. Con este enfoque se puede extraer el número de los canales iónicos abiertos en una sola célula a partir de la pendiente de la gráfica el trazado de la varianza del ruido en función de la corriente media medida en cualquier dado el potencial 32-34. Se muestra las mismas trampas de enfoques electrofisiológicos estándar. Es un método de trabajo intensivo y de bajo rendimiento que requiere además una buena familiaridad con el análisis espectral 32-34, no un elemento básico de los biólogos celulares. Además, este tipo de analysis identifica el número de canales de iones activos (en el estado abierto) que pueden ser diferentes que el número de proteínas totales en la membrana. Etiquetado de las proteínas de la superficie celular con reactivos de biotina es una herramienta relativamente eficiente para identificar las proteínas presentes en la membrana plasmática. Este método aprovecha la modificación covalente de proteínas de la membrana por la biotina y la más alta afinidad y alta especificidad de unión de biotina a estreptavidina-membrana impermeable o moléculas de avidina no covalente. Este enfoque es cualitativamente confiable, pero se ve obstaculizada o limitada por cuestiones de cuantificación asociados regularmente con revelar las proteínas mediante la técnica de Western blot. De formación de imágenes confocal y sus derivados se utilizan ampliamente para documentar la co-localización de las proteínas de membrana con la superficie celular 35. Cualitativa aislamiento membrana plasmática sigue siendo posible usando técnicas de centrifugación diferencial con o sin gradiente de sacarosa 36. Al igual que en el flujo ASSA citometría descrito anteriormentey, que se basa en la interacción altamente específica entre la proteína diana y un anticuerpo conjugado con fluoróforo. Formación de imágenes de fluorescencia de reflexión total interna, en particular, es un enfoque poderoso que podría reportar la distribución y el comportamiento molecular de los canales iónicos individuales en la superficie de la membrana 37,38. La lectura es, sin duda llamativo, pero sigue siendo un enfoque de pequeño volumen bajo rendimiento. Todos estos ensayos tienen su mérito científico. El ensayo basado en citometría de flujo de alto rendimiento es superior en términos de reproducibilidad de lectura y métricas cuantificables pero requiere un fácil acceso al flujo multi-láser citometría de clasificadores de células que forman parte de las instalaciones centrales en grandes instituciones. lectores de placas basadas en fluorescencia son más baratos y más accesibles, pero la relación señal a ruido obtenidos midieron con las mismas construcciones en las mismas condiciones experimentales fue significativamente menor debido en gran parte a un fondo de fluorescencia más alta. Costo del un fluoróforo-conjugadoticuerpos también pueden tenerse en cuenta en especial por el número de experimentos de control adecuados que tienen que ser procesados ​​con las construcciones de ensayo. Variaciones sobre el mismo tema incluyen cambiar el anticuerpo conjugado con colorante fluorescente para anticuerpos reportero de la enzima peroxidasa o fosfatasa alcalina rábano picante, que la actividad enzimática puede ser ensayada por quimioluminiscencia 29,30-rentable.

Conclusión: los ensayos de fluorescencia de dos colores se han desarrollado para estimar la expresión en la superficie celular relativa de las proteínas recombinantes expresadas en células cultivadas utilizando citómetros de flujo. Aunque se utilizaron sólo dos parámetros fluorescentes en este ensayo actual, la citometría de flujo es susceptible a la detección simultánea de más de 30 sondas fluorescentes en una sola célula, lo que demuestra la alta flexibilidad de este enfoque. Este ensayo ultrasensible de alto rendimiento se puede adaptar para investigar el impacto de las mutaciones genéticas 22,26 o MODIFICACI postraduccionalesons 23, así como estudiar el perfil farmacológico de chaperones para el tráfico de superficie de las proteínas técnicas de membrana 39. El impulso detrás de este protocolo surgió de la necesidad de evaluar de manera aislada el impacto de las mutaciones genéticas en la expresión en la membrana de los canales iónicos en las células recombinantes. Sin embargo, es importante señalar que la gravedad de la disfunción canal mutante en líneas de células modelo no siempre se correlaciona con la gravedad de los síntomas clínicos en portadores de la mutación 5 en parte debido a una combinación de mutaciones en diferentes alelos podrían ser necesarias para desencadenar la muerte súbita cardíaca 40 , 41. En este contexto, este ensayo puede ser visto como proporcionar una rápida aproximación de primer paso de estudiar las mutaciones individuales o múltiples en un solo gen asociado con mutaciones de pérdida de función 22. Sin embargo, es plausible imaginar en el futuro la expresión mediada por virus de los mismos constructos en células diferenciadas de cardiomyocyTe linaje. En general, en comparación con otras técnicas de imagen o luminiscentes, citómetro de flujo clasificadores manejan células vivas en suspensión y el informe de la intensidad de fluorescencia de una población celular homogénea. Este proceso se realiza sin la necesidad de la fijación con paraformaldehído, un proceso que induce la permeabilización de la membrana de plasma local, incluso en condiciones suaves 42. El ensayo es rápido, específico y conveniente con el análisis de hasta varios cientos de muestras por día de trabajo. Además del análisis, las células con el tiempo pueden ser ordenados por citometría de flujo para evaluar el potencial funcional de las células que expresan niveles más altos o más bajos de la misma proteína de la membrana.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit New England Biolabs E0554S Can be substitute with QuickChange site-directed mutagenesis Kit (Agilent, #200523).
Tubes 1.5 ml Sarstedt 72-690-001
Tubes 15 ml  Sarstedt  62-554-002
Disposable graduated Tranfer Pipets  VWR 160001-192 
100 mm culture dish Corning 430167 For standard culture of HEKT cells.
35 mm culture dish Falcon 353001 For standard culture of HEKT cells.
Serological pipette 1 ml Sarstedt 86.1251.001
Serological pipette 5 ml Sarstedt 86.1253.001
Serological pipette 10 ml Sarstedt 86.1254.001
Serological pipette 25 ml Sarstedt 86.1285.001
Dulbecco's high-glucose medium Life Technologies 12100-046 Warm in 37 °C water bath before use.
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, US origin Life Technologies 16140-071
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Life Technologies 15140-122
Lipofectamine 2000  Life Technologies 11668-019 For liposomal transfection. Can be substituted with calcium phosphate transfection.
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Life Technologies 31985-070 Warm in 37 °C water bath before use.
Trypsin-EDTA (1x) 0.05%, phenol red Life Technologies 25300-062
1.5 ml microtubes Sarstedt 72.690.001
 Phosphate Buffered Saline 1x Fisher BP661-10 Can be "home-made".
Anti-HA FITC conjugated antibody Sigma H7411
IgG1−FITC Isotype Control antibody Sigma F6397
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit BD Biosciences 554714 Fixation/Permeabilization. Permeabilization/Wash solution, store at 4 °C.
Hemacytometer Fisher 49105161
Trypan Blue Fisher 15250061 To access cell viability.
Refrigerated Microcentrifuge, 5430R Eppendorf  A14H172200
Forma Steri-Cycle CO2 Incubator Fisher 370
Laboratory Platform Rocker Fisher 545034
Water Bath VWR 89032-216
BD FACSARIA III  BD Biosciences 648282 Flow cytometer.
FlowJo Software v10 FlowJo FlowJo v10 Dongle For data analysis.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Delisle, B. P., Anson, B. D., Rajamani, S., January, C. T. Biology of Cardiac Arrhythmias: Ion Channel Protein Trafficking. Circ. Res. 94, 1418-1428 (2004).
  2. Birault, V., Solari, R., Hanrahan, J., Thomas, D. Y. Correctors of the basic trafficking defect of the mutant F508del-CFTR that causes cystic fibrosis. Curr Opin Chem Biol. 17, 353-360 (2013).
  3. Balijepalli, S. Y., Anderson, C. L., Lin, E. C., January, C. T. Rescue of Mutated Cardiac Ion Channels in Inherited Arrhythmia Syndromes. J. Cardiovas Pharm. 56, 113-122 (2010).
  4. Gargus, J. J. Unraveling Monogenic Channelopathies and Their Implications for Complex Polygenic Disease. Am. J. Hum. Genet. 72, 785-803 (2003).
  5. Abriel, H., Zaklyazminskaya, E. V. Cardiac channelopathies: Genetic and molecular mechanisms. Gene. 517, 1-11 (2013).
  6. Behr, E. R., et al. Sudden arrhythmic death syndrome: familial evaluation identifies inheritable heart disease in the majority of families. Eur Heart J. 29, 1670-1680 (2008).
  7. Catterall, W. A. Structure and regulation of voltage-gated Ca2+ channels. Annu. Rev. Cell Dev.Biol. 16, 521-555 (2000).
  8. Peterson, B. Z., DeMaria, C. D., Adelman, J. P., Yue, D. T. Calmodulin is the Ca2+ sensor for Ca2+ -dependent inactivation of L- type calcium channels. Neuron. 22, 549-558 (1999).
  9. Dolphin, A. C. Calcium channel diversity: multiple roles of calcium channel subunits. Curr.Opin.Neurobiol. 19, 237-244 (2009).
  10. Dai, S., Hall, D. D., Hell, J. W. Supramolecular assemblies and localized regulation of voltage-gated ion channels. Physiol Rev. 89, 411-452 (2009).
  11. Gao, T., et al. Identification and subcellular localization of the subunits of L-type calcium channels and adenylyl cyclase in cardiac myocytes. J. Biol. Chem. 272, 19401-19407 (1997).
  12. Carl, S. L., et al. Immunolocalization of sarcolemmal dihydropyridine receptor and sarcoplasmic reticular triadin and ryanodine receptor in rabbit ventricle and atrium. J. Cell Biol. 129, 673-682 (1995).
  13. Abriel, H., Rougier, J. S., Jalife, J. Ion Channel Macromolecular Complexes in Cardiomyocytes: Roles in Sudden Cardiac Death. Circ. Res. 116, 1971-1988 (2015).
  14. Bourdin, B., et al. Molecular Determinants of the Cavb-induced Plasma Membrane Targeting of the Cav1.2 Channel. J. Biol. Chem. 285, 22853-22863 (2010).
  15. Raybaud, A., et al. The Role of the GX9GX3G Motif in the Gating of High Voltage-activated Calcium Channels. J. Biol. Chem. 281, 39424-39436 (2006).
  16. Burashnikov, E., et al. Mutations in the cardiac L-type calcium channel associated with inherited J-wave syndromes and sudden cardiac death. Heart Rhythm. 7, 1872-1882 (2010).
  17. Hennessey, J. A., et al. A CACNA1C Variant Associated with Reduced Voltage-Dependent Inactivation, Increased Cav1.2 Channel Window Current, and Arrhythmogenesis. PLoS ONE. 9, e106982 (2014).
  18. Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y., Nalbant, A. Flow cytometry: basic principles and applications. Crit Rev Biotechnol. 1-14 (2016).
  19. Graham, M. D. The Coulter Principle: Foundation of an Industry. J. Lab. Autom. 8, 72-81 (2003).
  20. Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J. Immunol. Methods. 243, 77-97 (2000).
  21. Rothe, G. Cellular Diagnostics. Basics, Methods and Clinical Applications of Flow Cytometry. Sack, U., Tarnok, A., Rothe, G. Karger. Basel. 53-88 (2009).
  22. Bourdin, B., et al. Functional Characterization of Cavalpha2delta Mutations Associated with Sudden Cardiac Death. J. Biol. Chem. 290, 2854-2869 (2015).
  23. Tetreault, M. P., et al. Identification of glycosylation sites essential for surface expression of the Cavalpha2delta1 subunit and modulation of the cardiac Cav1.2 channel activity. J. Biol. Chem. 291, 4826-4843 (2016).
  24. Senatore, A., Boone, A. N., Spafford, J. D. Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells. J Vis Exp. (47), (2011).
  25. Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Herzenberg, L. A., Parks, D. R. Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed. Nat.Immunol. 7, 681-685 (2006).
  26. Shakeri, B., Bourdin, B., Demers-Giroux, P. O., Sauve, R., Parent, L. A quartet of Leucine residues in the Guanylate Kinase domain of Cavbeta determines the plasma membrane density of the Cav2.3 channel. J Biol Chem. 287, 32835-32847 (2012).
  27. Morton, R. A., Baptista-Hon, D. T., Hales, T. G., Lovinger, D. M. Agonist- and antagonist-induced up-regulation of surface 5-HT3A receptors. Br. J. Pharmacol. 172, 4066-4077 (2015).
  28. Hoffmann, C., et al. Fluorescent labeling of tetracysteine-tagged proteins in intact cells. Nat. Protocols. 5, 1666-1677 (2010).
  29. Cockcroft, C. J. Ion Channels: Methods and Protocols. Gamper, N. Humana Press. Totowa, NJ. 233-241 (2013).
  30. Gonzalez-Gutierrez, G., Miranda-Laferte, E., Neely, A., Hidalgo, P. The Src Homology 3 Domain of the beta-Subunit of Voltage-gated Calcium Channels Promotes Endocytosis via Dynamin Interaction. J. Biol.Chem. 282, 2156-2162 (2007).
  31. Galizzi, J. P., Borsotto, M., Barhanin, J., Fosset, M., Lazdunski, M. Characterization and photoaffinity labeling of receptor sites for the Calcium channel inhibitors d-cis-diltiazem, (+/-)-bepridil, desmethoxyverapamil, and (+)-PN 200-110 in skeletal muscle transverse tubule membranes. J. Biol.Chem. 261, 1393-1397 (1986).
  32. Bezanilla, F. The voltage sensor in voltage-dependent ion channels. Physiol.Rev. 80, 555-592 (2000).
  33. Sigworth, F. J. The variance of sodium current fluctuations at the node of Ranvier. J Physiol. 307, 97-129 (1980).
  34. Bailey, M. A., Grabe, M., Devor, D. C. Characterization of the PCMBS-dependent modification of KCa3.1 channel gating. J. Gen. Physiol. 136, 367-387 (2010).
  35. Fletcher, P. A., Scriven, D. R., Schulson, M. N., Moore, E. D. Multi-Image Colocalization and Its Statistical Significance. Biophys. J. 99, 1996-2005 (2010).
  36. Lizotte, E., Tremblay, A., Allen, B. G., Fiset, C. Isolation and characterization of subcellular protein fractions from mouse heart. Anal. Biochem. 345, 47-54 (2005).
  37. Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. J. Cell Sci. 123, 3621-3628 (2010).
  38. Yamamura, H., Suzuki, Y., Imaizumi, Y. New light on ion channel imaging by total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. J. Pharmacol. Sci. 128, 1-7 (2015).
  39. Wible, B. A., et al. HERG-Lite-R: A novel comprehensive high-throughput screen for drug-induced hERG risk. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 52, 136-145 (2005).
  40. Wilde, A. A. M., Brugada, R. Phenotypical Manifestations of Mutations in the Genes Encoding Subunits of the Cardiac Sodium Channel. Circ. Res. 108, 884-887 (2011).
  41. Milano, A., et al. Sudden Cardiac Arrest and Rare Genetic Variants in the Community. Circ Cardiovasc Genet. (2016).
  42. Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. G. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nat. Meth. 9, 152-158 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics