على الانترنت الحجم الاستبعاد والتبادل الأيوني اللوني على SAXS خط الأشعة

1Structural Biology Group, European Synchrotron Radiation Facility, 2European Molecular Biology Laboratory, 3School of Chemical and Physical Sciences, Keele University, 4Groupe de Microscopie Electronique et Méthodes, Institut de Biologie Structurale
Biochemistry
 

Summary

تحديد هيكل الحل من البروتين زاوية صغيرة للأشعة السينية نثر (SAXS) يتطلب عينات monodisperse. هنا، نقدم احتمالين لضمان الحد الأدنى من التأخير بين إعداد العينات والحصول على البيانات: الإنترنت الحجم الاستبعاد اللوني (SEC) على الانترنت والتبادل الأيوني اللوني (IEC).

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Brennich, M. E., Round, A. R., Hutin, S. Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline. J. Vis. Exp. (119), e54861, doi:10.3791/54861 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

زاوية صغيرة البيولوجي الأشعة السينية نثر (BioSAXS) هي تقنية قوية في مجال البيولوجيا الجزيئية والهيكلية المستخدمة لتحديد الهيكل حل، وحجم الجسيمات والشكل، ونسبة الجزيئات السطح إلى الحجم. هذه التقنية هي التي تنطبق على مجموعة واسعة جدا من الظروف حل تغطي مجموعة واسعة من تركيزات والقيم ودرجة الحموضة، ونقاط القوة الأيونية، ودرجات الحرارة والمواد المضافة وغيرها، ولكن مطلوب العينة أن تكون monodisperse. أدى هذا التحذير إلى تنفيذ أنظمة اللوني السائل على beamlines SAXS. هنا، نحن تصف التكامل المنبع من حجم الاستبعاد (SEC) والتبادل الأيوني اللوني (IEC) على خط الأشعة، وأساليب مختلفة لخلفية الطرح الأمثل، والحد من البيانات. وكمثال على ذلك، ونحن تصف كيف نستخدم SEC- وIEC-SAXS على جزء من الضروري بروتين فيروس جدري D5، ويتألف من مجال D5N هيليكاز. علينا أن نحدد شكله العام والوزن الجزيئي، والتي تبين هيكل hexameric من الالبروتين ه.

Introduction

BioSAXS هو أداة قوية لتحديد شكل الأشياء نانو الحجم 1-4. تشتت الأشعة السينية بواسطة محلول يحتوي على الجزيئات، الحجم في نطاق نانومتر، يتم تسجيلها في زوايا منخفضة جدا. هذا النطاق الزاوي يحتوي على معلومات حول معلمات العالمية: نصف قطر الدوران. وعلى مسافة أكبر intraparticle. شكل الجسيمات. ودرجة للطي، وتمسخ، أو اضطراب. هذه التقنية لا تتطلب البلورات، وجزيء يبقى في الحل، وبالتالي يمكن أن تبقى في ظروف محاكاة بعض المعالم الهامة للخلية، مثل القوة الأيونية، ودرجة الحموضة، وما إلى ذلك معرفة هذه العوامل قد تساعد على تحديد، على سبيل المثال، الدولة بلازميدة قليلة القسيمات ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية لبروتين من الفائدة أو للتحقق من صحة نموذج مقترح للمجمع. توصيف تفاعلات البروتين البروتين في ظروف عازلة مختلفة، وخلق نماذج من المجالات المفقودة، وصقل النماذج التماثل، وديإنهاء الدول مطوية وتكشفت منفصلة لا يمكن أن يؤديها بسرعة وبسهولة 5.

كما هو الحال مع أي تقنية، BioSAXS لديها نقاط ضعف جوهرية: عينات مجمعة أو التشويه والتحريف، خليط من جزيئات، وعينات غير متجانسة، أضرار الإشعاع، وعدم التطابق المخزن المؤقت قد يؤدي إلى بيانات الامم المتحدة للتفسير. بالنسبة لكثير من أساليب التحليل، يفترض ضمنا أن العينة هي monodisperse، شرط أن غالبا ما يكون من الصعب الحصول عليها في الممارسة العملية. في كثير من الحالات، وتدهور العينة خفية ولا يمكن الكشف في البيانات من تلقاء نفسها، وأية محاولة لتفسير البيانات يعطي نتائج غير دقيقة أو حتى مضللة. للتغلب على هذه العقبات، تم تنفيذ مجموعة من اللوني الحجم الاستبعاد (SEC) وSAXS على العديد من beamlines لضمان جودة البيانات ولجعل هذه التقنية أكثر سهولة لعينات من الصعب على نحو متزايد 6-11. وأضاف نحن في الآونة الأخيرة طريقة جديدة للذخيرة عن طريق وضع على الانترنت التبادل الأيونياللوني (IEC) -coupled SAXS 12. وفي كلتا الطريقتين قد تفتح SAXS إلى مجموعة واسعة من الجزيئات البيولوجية مستحيلة سابقا لتحليلها. اختيار الأسلوب الذي لاستخدام يعتمد على الخواص الفيزيائية الحيوية من الجزيئات من الفائدة.

المجلس الأعلى للتعليم يفصل الجزيئات التي حجمها، حيث هناك حاجة إلى ما لا يقل عن فارق 10٪ في الكتلة الجزيئية واضحة للفصل. القيود المادية من العمود والخصائص الفسيولوجية للعينات، مثل أسطح مسعور، والمرونة، وعدم الاستقرار، كما يعقد جمع البيانات وتحليلها، وتفسيرها.

التبادل الأيوني اللوني، الذي يفصل بين الجزيئات على أساس عهدتهم، وبالتالي تقارب ملزمة لالعمود IEC، ويمكن استخدامها بدلا من أو بالإضافة إلى المجلس الأعلى للتعليم. مجموع شحنة يمكن التلاعب بها بسهولة عن طريق تغيير درجة الحموضة، أو متفاوتة تركيز الملح من المنطقة العازلة، وتوفير وسيلة بسيطة نسبيا لايل تسيطر عليهاution من الجزيئات من العمود IEC. باستخدام هذا الاتهام، والفصل بين أنواع وأحجام مختلفة من جزيئات مماثلة، الذي من شأنه أن يكون الأمر خلاف ذلك من الصعب فصل، لا يمكن أن يؤديها بشكل روتيني مع IEC. بالإضافة إلى ذلك، IEC لديها ميزة كونها قادرة على التعامل مع عينات المخفف، يسمح احد لتجنب الخطوات تركيز، والتي تحمل المخاطر المحتملة لتغيير طبيعة البروتين. للأسف، وتوزيع التهمة هي غاية العينة التي تعتمد، IEC يتطلب الأمثل فيما يتعلق درجة الحموضة وتركيز الملح 13،14.

بالنسبة لكثير من البروتينات التي يصعب التعبير، تنقية، أو كليهما، تتوفر لدراسة كميات منخفضة فقط من العينة. ومن المهم أن تكون فعالة والتقليل من عدد من الخطوات لتنقية، وبالتالي، فإن الخسائر. لهذا السبب، فإن الخطوة تنقية الأخيرة على الانترنت مباشرة قبل الحصول على البيانات SAXS، من أجل زيادة احتمال جمع مجموعة بيانات جيدة.

هنا، نقدم ومقارنة عبر الإنترنت SEC-SAXS وIEC-SAXS. نفذت كل من التقنيات على خط الأشعة BioSAXS BM29 في مرفق الأوروبي السنكروترون الإشعاع (ESRF) في غرونوبل، فرنسا 15. كحالة اختبار، كنا المجال D5N وهيليكاز من البروتين فيروس جدري D5، التي كانت صعبة نوعا ما لتحليل الهيكلية باستخدام طرق أخرى. فيروس جدري هو عضو في عائلة فيروسات جدرية وهو 98٪ مطابقة للفيروس الجدري، وسبب الجدري. باستخدام نظام اللقاحية ندرس آلية التكرار، مع التركيز هنا على أساسي D5 هيليكاز-بريميز.

D5 هو بروتين 95 كيلو دالتون مع-archeo حقيقية النواة بريميز (AEP) نطاق-N محطة 16 تليها منطقة العنقودية السيستين (احتياط 240-345) 16. وعلاوة على ذلك نحو محطة سي تأتي مجال D5N (احتياط 340-460)، الذي يرتبط دائما مع D5 من نوع helicases، وأخيرا الفصيلة 3 (SF3) نطاق هيليكاز (احتياط 460-785) 17 (شملت رقمالبريد 1A). المجال هيليكاز من D5 يبني هيكل حلقة hexameric أن هناك حاجة للربط محكم على الحمض النووي. وذلك بفضل دراسات SAXS وEM الأخيرة، والهياكل منخفضة الدقة من بريميز والمجالات هيليكاز معروفة الآن 18.

هنا، وتبين لنا كيفية استخدام تقنيات اللوني تنفذ على الانترنت على خط الأشعة BioSAXS BM29 في ESRF لاكتساب نظرة ثاقبة لبنية جزء C-محطة (بقايا 323-785) من D5.

Protocol

1. وصف إعداد متصل والجيل عينة من البروتين D5 الحذف

ملاحظة: D5 323-785 بناء (الشكل 1A) تم استنساخ، أعرب وتنقيته كما هو موضح 18.

  1. استنساخ بناء في ناقلات pProEx HTB
    1. أداء البلمرة رد فعل (PCR) على D5R باستخدام 5'-GCGCCATGGGTAATAAACTGTTTAATATTGCAC 3 الاشعال "و5'-ATGCAAGCTTTTACGGAGATGAAATATCCTCTATGA-3 'ومزيج تفاعل PCR مع البلمرة، وبعد المشورة الشركة المصنعة.
    2. تنقية شظايا PCR عبر أعمدة الدوران، بعد المشورة الشركة المصنعة.
    3. هضم شظايا PCR والبلازميد مع جنة التحقيق الوطنية السودانية والانزيمات تقييد HindIII، بناء على توصيات الشركة المصنعة لتكوين العازلة وفترة حضانة.
    4. تشغيل شظايا على هلام الاغاروز 1٪ في المخزن تاي 0.5X (20 ملي تريس، 10 ملم حمض الخليك،و 0.5 ملي EDTA) وصمة عار الجل مع صبغة الحمض النووي.
    5. فضح هلام لضوء الأشعة فوق البنفسجية.
      الحذر: ارتداء معدات السلامة الشخصية! قطع العصابات من شظايا PCR هضمها والبلازميد هضمها وتنقية الحمض النووي باستخدام تنقية جل عدة عمود الدوران، بناء على توصيات الشركة المصنعة.
    6. Ligate شظايا PCR المنقى إلى البلازميد باستخدام طقم ربط سريع، بناء على توصيات الشركة المصنعة.
    7. تحويل عن طريق الصدمة الحرارية المنتج من رد فعل ربط إلى البكتيريا المختصة الأمثل لتضخيم البلازميد.
      1. إضافة نصف الناتج ربط إلى قارورة من البكتيريا.
      2. احتضان الأنبوب رد فعل على الجليد لمدة 20 دقيقة.
      3. احتضان الأنبوب في 42 درجة مئوية لمدة 30 ثانية.
      4. وضع أنبوب على الجليد لمدة 2 دقيقة.
      5. إضافة 1 مل من لوريا Bertani (LB) مرق (ميلر) بدون المضادات الحيوية والسماح للخلايا التعافي عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
      6. تدور أسفل الخلايا في 16100 x ج فوص 3 الصورة في الطاولة microtube الطرد المركزي وإزالة معظم المتوسطة.
      7. انتشار الخلايا على لوحة أجار LB مع الأمبيسلين (50 ميكروغرام النهائي / مل) والسماح للمستعمرات تنمو عند 37 درجة مئوية خلال الليل.
    8. وضع مستعمرة إلى 3 مل من LB مع الأمبيسلين (50 ميكروغرام النهائي / مل) وتنمية الثقافة عند 37 درجة مئوية، والهز في 160 دورة في الدقيقة ليلة وضحاها.
    9. اتبع تعليمات من عدة miniprep لاستخراج البلازميد.
    10. إرسال عينة من البلازميد لتسلسل وتحليل تسلسل لعدم وجود طفرات ولالإدراج الصحيح.
    11. تحويل pProEx HTB D5 323-785 بناء على البكتيريا الأمثل للتعبير البروتين (استخدم 1 ميكرولتر واتبع الخطوات في الخطوة 1.1.7). نشر البكتيريا على لوحة أجار LB مع الأمبيسلين (50 ميكروغرام / مل النهائي).
    12. لخلق ثقافة ابتداء، ووضع مستعمرة واحدة في 300 مل من LB مع الأمبيسلين (50 ميكروغرام / مل النهائي) وتنمو البكتيريا عند 37 درجة مئوية، والهز في 160 صمساء ليلة وضحاها.
  2. تطعيم 12 × 1 لتر من LB بحضور الأمبيسلين (50 ميكروغرام / مل النهائي)، ولكل منها 20 مل من pProEx HTB D5 323-785 البكتيريا ثقافة المبتدئين عند 37 درجة مئوية حتى على OD 600 = 0.3 يتم التوصل إليه. خفض درجة الحرارة إلى 18 درجة مئوية، ولحث على التعبير في لOD 600 = 0.5 مع 1 ملم IPTG. احتضان الثقافات، تهتز لها في 160 دورة في الدقيقة و 18 درجة مئوية خلال الليل.
  3. حصاد البكتيريا عن طريق الطرد المركزي في 50000 x ج وعند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. Resuspend والكريات البكتيرية في حوالي 150 مل من تحلل العازلة (50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك [الرقم الهيدروجيني 7]، 150 مم كلوريد الصوديوم، و 5 ملي MgCl 2 و 10 ملي β-المركابتويثانول، و 10٪ الجلسرين) مع مثبطات الأنزيم البروتيني 1X و 25 وحدة ( U) / 10 مل الدناز. ليز البكتيريا عبر صوتنة على الجليد (1 بوصة التحقيق، والطاقة بنسبة 50٪، و 0.5 ليالي نبض، 0.5 الصورة وقفة، 3X 5 دقائق).
  4. تحميل طاف على عمود النيكل تقارب (ني العمود، 1.5 مل حجم السرير)، وأغسلها مع 10 مجلدات العمود (CV) من بinding العازلة (50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك [الرقم الهيدروجيني 7]، 150 مم كلوريد الصوديوم، و 10 ملي β-المركابتويثانول، و 10٪ الجلسرين)، و 10 السيرة الذاتية لغسل العازلة (50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك [الرقم الهيدروجيني 7] (1)، M كلوريد الصوديوم، و 10 ملي β-المركابتويثانول، و 10٪ الجلسرين)، و 10 السيرة الذاتية لغسل ايميدازول (50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك [الرقم الهيدروجيني 7]، 150 مم كلوريد الصوديوم، و 10 ملي β-المركابتويثانول، و 10٪ الجلسرين، و 30 ملي ايميدازول). أزل D5 323-785 (20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك [الرقم الهيدروجيني 7]، 150 مم كلوريد الصوديوم، و 10 ملي β-المركابتويثانول، و 10٪ الجلسرين، و 200 ايميدازول ملم).
  5. تفقد خطوات تنقية مختلفة عبر كبريتات الصوديوم دوديسيل (SDS) الكهربائي للهلام -polyacrylamide (PAGE).
    1. تحميل 2-20 ميكرولتر من كل خطوة تنقية التدفق من خلال مختلطة مع صبغ 1X تحميل (2X: 4٪ SDS، الجلسرين 20٪، و 120 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك [الرقم الهيدروجيني 6.8]، و 0.02٪ وزن / حجم برموفينول الأزرق) على 10 ٪ SDS جل وتشغيلها في 200 V في 1X Laemmli العازلة تشغيل (25 ملي تريس، 0.192 M الجلايسين، و 0.1٪ SDS).
    2. وصمة عار الجل مع Coomassie حل الزرقاء جاهزة للاستخدام.
  6. غير شاملHANGE المخزن المؤقت للبروتين مزال مع العازلة ملزمة باستخدام عمود تحلية وفقا لدليل الشركة المصنعة.
  7. يلتصق صاحب العلامة بإضافة التبغ إحفر الفيروسات التضمين النووية لببتيداز داخلية (TEV، 1 ملغ / 100 ملغ من البروتين) إلى حل البروتين. يحضن في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها.
  8. تحقق عملية الهضم عن طريق أداء SDS-PAGE (راجع الخطوة 1.5)
  9. تتوازن عمود ني في المخزن ملزم. اسمحوا الحل البروتين تمر عبر وغسل الخرز مع 2 السيرة الذاتية لغسل العازلة ايميدازول في حين جمع التدفق من خلال.
  10. تركيز البروتين باستخدام مكثف الطرد المركزي إلى الحجم النهائي من 0.5 مل.
  11. حقن البروتين تتركز على عمود الحجم الاستبعاد معايرتها مع العازلة هلام الترشيح (20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك [الرقم الهيدروجيني 7]، 150 مم كلوريد الصوديوم، و 10٪ الجلسرين، و 1 ملي dithiothreitol [DTT]).
  12. جمع من خلال تدفق في 0.5 مل الكسور.
  13. تحقق من وجود ونقاء من البروتين في عينات الذروة من قبلأداء SDS-PAGE (راجع الخطوة 1.5).
  14. الجمع بين الكسور من ذروة مزال من D5 323-785. تمييع العينة إلى 25 ملي كلوريد الصوديوم و 5٪ الجلسرين مع الحفاظ على تركيزات تريس وDTT ثابت (لمدة 5 مل من محلول البروتين في 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك [الرقم الهيدروجيني 7]، 150 مم كلوريد الصوديوم، و 10٪ الجلسرين، و 1 ملي DTT، أولا إضافة 5 مل من 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك [الرقم الهيدروجيني 7] و 1 ملي DTT، ثم إضافة 20 مل من 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك [الرقم الهيدروجيني 7]، 5٪ الجلسرين، و1 ملم DTT).
  15. تحميل العينة على عمود التبادل الأيوني. استخدام العازلة ألف (20 ملي تريس [الرقم الهيدروجيني 7]، 25 مم كلوريد الصوديوم، و 5٪ الجلسرين، و1 ملم DTT) وB العازلة (20 ملي تريس [الرقم الهيدروجيني 7] (1)، M كلوريد الصوديوم، و 5٪ الجلسرين، و1 ملم DTT) لتشكيل التدرج الملح من 25 مم إلى 1 م.
  16. جمع بروتين مزال في 1.5 مل الكسور.
  17. تحقق من وجود ونقاء من البروتين في عينات الذروة عن طريق أداء SDS-PAGE (راجع الخطوة 1.5 والشكل 1B)
  18. Reconcentrate الحل البروتين في المكثف الطرد المركزي إلى الحجم النهائي من 0.5 مل.
  19. RERUن البروتين تتركز على عمود الحجم الاستبعاد في المخزن هلام الترشيح (20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك [الرقم الهيدروجيني 7]، 150 مم كلوريد الصوديوم، و 5٪ الجلسرين، و 1 ملي DTT؛ انظر الخطوة 1.11).

2. جمع البيانات

ملاحظة: طلب شعاع الوقت في أقرب وقت ممكن. لESRF، مبادئ توجيهية بشأن أنواع الوصول المتاحة وكيفية تقديم طلب ويمكن الاطلاع على:
http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Applying . بعد قبول هذا الاقتراح، ودعوة للتجربة، يكون جميع المشاركين لإكمال التدريب في مجال السلامة. بعد التحقق من التدريب، وملء في "A-شكل" (عبر البوابة المستخدم ESRF) أن يعلن الباحثون زيارة خط الأشعة للتجربة، جنبا إلى جنب مع معلومات الأمان المطلوبة على العينات. اتصل الشخص الذي يمكن الاتصال المحلي لمناقشة التجربة.

  1. جمع البيانات SEC-SAXS
    ملاحظة: للحصول فقط. tتنقية المعهد الوطني للإحصاء، واستخدام السائل اللوني (HPLC) نظام عالية الأداء المثبتة في BM29. ويتكون النظام من الغاز الراحل في الخط، مضخة ثنائي، صمام لاختيار العازلة والتدرجات، وهو الاوتوماتيكى، مجموعة photospectrometer UV-VIS، وconductometer. ويعلق مباشرة على الشعرية التدفق من خلال وحدة التعرض SAXS 19.
    1. وضع 1 مل من المخزن المؤقت الترشيح هلام جانبا. ربط زجاجة عازلة لنظام المجلس الأعلى للتعليم (الافتراضي هو المنفذ A).
    2. اختيار معدل التدفق اعتمادا على عمود في الاستخدام. ملاحظة: للحصول على عمود الحجم الاستبعاد المستخدمة هنا، فإن معدل تدفق 0.1 مل / دقيقة. تحديد الحد الأقصى للضغط على العمود، علما أن الضغط الخلفي، وضبط الوقت اقتناء إلى 1.2 على الأقل السيرة الذاتية.
    3. تدفق المضخات والأنابيب المنبع من خلال وظيفة "لصناعة السيارات في تطهير".
    4. انتظر حتى يتم ملء النظام مع العازلة وربط العمود. تتوازن العمود عن طريق تمرير لا يقل عن 1.5 السيرة الذاتية.
    5. تشابكالقفص وقياس عازلة جانبا في خطوة 2.1.1، وذلك باستخدام المغير عينة للسيطرة على الاختلاف في إشارة بسبب الأضرار الناجمة عن الإشعاع. تستمر فقط إذا كان هناك أي ضرر الإشعاع إلى المخزن المؤقت.
    6. تبديل نظام التحكم في خط الأشعة إلى وضع HPLC. أن تجري اختبار العازلة، وجمع 200 لقطة مع 1 ثانية لكل الإطار. كتابة عدد من التهم التي قدمها كشف في مؤامرة شدة لخص.
      ملاحظة: يجب أن تتطابق إشارة المخزن المؤقت قياس سابقا، وشدة لخص مع مرور الوقت يجب أن تظل ثابتة. إذا كان إشارة لا تتطابق أو ليست ثابتة، لا بد من موازنة أطول للنظام.
    7. تدور باستمرار العينة في 13000 x ج في جهاز للطرد المركزي الطاولة microtube لمدة 10 دقيقة على الأقل.
    8. ملء العينة إلى قارورة زجاجية HPLC متوافق (المقدمة) ووضعها في السيارات حاقن. لاحظ موقف جيد.
    9. التعشيق القفص التجريبية باستخدام الإجراء القياسي، كما هو موضح في التدريب في مجال السلامة العضو.
    10. تسجيل الدخول إلى وإنشاء مجلد لتخزين البيانات من خلال برنامج حاسوبي لمراقبة خط الأشعة.
    11. برمجة نظام HPLC باستخدام "دفعة سريعة" الميزة. تعيين موقع تخزين للبيانات الأشعة فوق البنفسجية إلى المجلد الذي تم إنشاؤه في الخطوة 2.1.10. تأكد من تفعيل تحويل ASCII التلقائي للبيانات الأشعة فوق البنفسجية، تخزين ملف ASCII في نفس المجلد.
      1. اختيار حجم الحقن وموقف جيد. إضافة القياس إلى الوقوف في طوابير عن طريق الضغط على زر "ابدأ". يقوم البرنامج يسأل لإنقاذ دفعة واحدة. الاستعداد لإنقاذ، ولكن لا تضغط على زر "حفظ"، وهذا يبدأ تلقائيا القياس.
    12. إعداد المعلمات جمع البيانات في برنامج حاسوبي لمراقبة خط الأشعة. اختيار عدد من الإطارات بحيث إجمالي وقت جمع البيانات في فائض طفيف في اكتساب الوقت المحدد في الخطوة 2.1.2.
    13. فتح مصراع السلامة والبدء في جمع البيانات SAXS باستخدام برنامج حاسوبي لمراقبة خط الأشعة. تحقق من أن البيانات هي مجلس النوابالمكتسبة بصورة مباشرة. مقارنة البيانات التي تم جمعها حديثا إلى البيانات التي تم جمعها في الخطوة 2.1.6 وتحقق من أن عدد من التهم في شدة لخص يبقى ثابتا لا يقل عن 100 إطارات ويطابق القيمة من الخطوة 2.1.6.
      1. بدء المجلس الأعلى للتعليم تشغيل عن طريق الضغط على زر "حفظ"، كما أعدت في الخطوة 2.1.11، ولاحظ رقم الإطار عرض في البرنامج camserver عندما يتم الانتهاء من الحقن ويبدأ الحصول على البيانات للأشعة فوق البنفسجية.
    14. بعد جمع البيانات، فتح قاعدة البيانات ISPyB 20 في فتح "الحصول على البيانات" علامة التبويب واضغط على زر "الذهاب" للوصول إلى مجموعة البيانات ونتائج التحليل الآلي 21.
  2. جمع البيانات IEC-SAXS
    ملاحظة: بدلا من التدرج الخطي المستمر تطبق عادة في التجارب الانتخابية المستقلة، استخدم التدرج خطوة حكيمة التي تتم زيادة القيمة من B العازلة في الخطوات المنفصلة المحددة مسبقا.
    1. إنشاء برنامج HPLC لsampl الدراسيخالية من البريد عازلة التشغيل. برنامج التدرج خطوة حكيمة تبدأ من 0٪ B العازلة وزيادة بنسبة 5 نقاط مئوية بعد سنتين السيرة الذاتية حتى وصلت إلى 100٪ من B العازلة.
    2. وضع بعض من كل عازلة جانبا. ربط زجاجة مع قليل الملح العازلة ألف إلى ميناء ألف واحد مع ارتفاع الملح B العازلة إلى ميناء B.
    3. اختيار معدل التدفق والبقاء تحت ضغط الحد من العمود (في هذا المثال، 1 مل / دقيقة).
    4. كما في الخطوة 2.1.3، تدفق مضخات وأنابيب المنبع باستخدام وظيفة "لصناعة السيارات في تطهير".
    5. تتوازن النظام في قليل الملح عازلة ألف (راجع الخطوة 1.15) وربط العمود التبادل الأيوني. انتظر حتى يتم معايرتها العمود تماما (لا يقل عن 1.5 CV).
    6. استخدام المخزن المؤقت جانبا في خطوة 2.2.2 لفحص مخازن A و B لأضرار الأشعة باستخدام المغير عينة، كما في الخطوة 2.1.5.
    7. تحقق المخزن المؤقت يخرج من العمود، كما في الخطوة 2.1.6. مقارنة إشارة إلى إشارة العازلة وسجلتها في الخطوة 2.2.6. ملاحظة ثانيةعدد من التهم في مؤامرة شدة لخص.
    8. إنشاء مجلد لتخزين البيانات على المدى العازلة.
    9. إعداد جمع البيانات في وضع نظام HPLC. اختيار عدد من الإطارات بحيث إجمالي وقت جمع البيانات في فائض من الوقت الكلي للتشغيل IEC (راجع الخطوة 2.2.1).
    10. فتح مصراع السلامة والبدء في جمع البيانات SAXS. تحقق من أن تشرع بشكل صحيح وانقر نقرا مزدوجا تأكد من أن شدة لخص تبقى ثابتة في القيمة سجلته في الخطوة 2.2.7 لا يقل عن 100 إطارات.
    11. استخدام "واحدة تشغيل" ميزة من البرنامج HPLC وبدء التدرج خطوة حكيمة المبرمجة في خطوة 2.2.1. للحقن، تعيين عدد القارورة إلى -1 من أجل حقن أي عينة في هذه الخطوة. كتابة عدد من إطارات المكتسبة كما يبدأ البرنامج.
    12. إنشاء برنامج HPLC على المدى العينة. برنامج التدرج خطوة حكيمة تبدأ من 0٪ من العازلة B. تقدير النسبة المئوية للB العازلة في كل قمة تقاس حاليا في الخطوة 1.1.5 ( (الشكل 1C). إضافة الخطوة النهائية في 100٪ B العازلة 2.5 السيرة الذاتية.
    13. تدور باستمرار العينة في 13000 x ج في جهاز للطرد المركزي الطاولة microtube لمدة 10 دقيقة على الأقل.
    14. تمييع D5 323-785 في تركيز الملح من العازلة ألف (25 مم) عن طريق خلطها مع 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك [الرقم الهيدروجيني 7]، و 10٪ الجلسرين، و 1 ملي DTT.
    15. تحميل عينة يدويا على العمود. وضع المنطقة العازلة أنبوب مساهمة في عينة المخفف بعد التوقف مضخات لتجنب تشكيل فقاعات الهواء. فصل عمود من أجهزة الكشف عن لجمع مباشرة من خلال تدفق من العمود.
      1. عندما الحاوية عينة فارغة تقريبا، وعودة أنبوب مدخلات عازلة ألف (مرة أخرى التوقف المضخات أثناء نقل أنبوب) وإعادة ضخ العازلة مع ولنقل عينة من الأنبوب إلى العمود. مرة واحدة وكانت العينة كلهاتحميل، وتمرير 2 السيرة الذاتية العازلة A، ومن ثم إعادة العمود إلى كاشفات.
    16. على المدى عينة، إنشاء مجلد لتخزين البيانات.
    17. فتح مصراع السلامة والبدء في جمع البيانات SAXS. تحقق من أن جمع البيانات العائدات بشكل صحيح وانقر نقرا مزدوجا تأكد من أن شدة لخص تبقى ثابتة في القيمة سجلته في الخطوة 2.2.7 لا يقل عن 100 إطارات.
    18. استخدام "واحدة تشغيل" ميزة من البرنامج HPLC لبدء التدرج خطوة حكيمة المبرمجة في خطوة 2.2.12. للحقن، تعيين عدد القارورة إلى -1 من أجل حقن أي عينة في هذه الخطوة. كتابة عدد من إطارات المكتسبة كما يبدأ البرنامج.
    19. "الحصول على البيانات" المفتوحة في ISPyB 20 ثم اضغط على "الذهاب" للنظر في مجموعة البيانات والتحليل الآلي 21.
    20. تصدير البيانات للأشعة فوق البنفسجية من نظام HPLC إلى تنسيق ASCII من خلال برنامج "تحليل Postrun".

3.SEC-SAXS لحد من البيانات وتحليل

  1. فتح البيانات في الحصول على البيانات في ISPyB عن طريق الضغط على زر "الذهاب". تحديد في الاستعراض الذي يؤطر لجمع البيانات SAXS تتوافق مع ذروة شطف. تحقق من أن نصف قطر الدوران غير مستقر في جميع أنحاء الذروة.
  2. تأكد من أن تصحيح عازلة الآلي أجريت بشكل صحيح. إطارات حمولة من الجزء المركزي من الذروة إلى البرنامج الذي ينفذ التلاعب بالبيانات SAXS التجريبية ملفات 22 ومتوسط لهم. ثم، تحميل ملف عازلة إنشاؤه تلقائيا وتحقق ما إذا كانت المناطق عالية ف الإطارات المتوسط والمباراة إطارات العازلة.
  3. مقارنة الإطارات المكتسبة في جميع أنحاء ذروة كميا باستخدام اختبار CORMAP 23.
    1. تحميل الطرح إنشاؤه تلقائيا (* ملفات _sub.dat) من الإطارات التي تغطي المنطقة من اهتمام.
    2. توسيع نطاقها لبعضها البعض عن طريق الضغط على زر "جدول".
    3. Comparالبريد لهم باستخدام "مقارنة البيانات" الميزة. يجب أن تكون هناك تغييرات منتظمة بين الإطارات في جميع أنحاء الذروة.
  4. فتح جميع * -_ إطارات sub.dat من الفائدة، ودمجها باستخدام زر "دمج"، واحفظ الملف المدمج في شكل دات.
  5. تحديد نصف قطر الدوران مع أداة "دائرة نصف قطرها من الدوران" في البرنامج، مشيرا إلى نقطة البيانات الأولى في النطاق Guinier لاحق الاقتصاص من البيانات في دقة منخفضة.
  6. تحديد وظيفة التوزيع زوج من المسافة مع أداة "المسافة التوزيع" في البرنامج وحفظ الملف .out الناتج كما gnom.out.

4. أساسه النمذجة

  1. على جهاز يونكس، تشغيل برنامج إعادة الإعمار 40 × أساسه نموذج دون قيود التماثل. إنشاء مجلد جديد ونسخ ملف gnom.out إليها. تشغيل البرنامج على النحو التالي:
    ل((ط = 1؛ ط <= 40؛ ط ++))؛ القيام dammif gnom.out -ms -p dammifp1_ $ ط. دواحد
  2. بالقياس، قم بتشغيل برنامج أساسه نموذج إعادة الإعمار مع القيود التماثل للتناظر ستة أمثالها في مجلد الثاني:
    ل((ط = 1؛ ط <= 40؛ ط ++))؛ تأليف dammif gnom.out -ms -s P6 -p dammifp6_ $ ط. فعله
  3. تنسيق بين جميع ملفات الإخراج برنامج أساسها نموذج من أساسه إعادة الإعمار (* -1.pdb). في المجلدين من الخطوات 4.1 و 4.2، تشغيل damaver -a * -1.pdb.
  4. فتح الاتحاد من جميع النماذج (damaver.pdb) فضلا عن نموذج تصفيتها لحجم الصحيح (damfilt.pdb) في مناسبة البرمجيات التصور الجزيئي 26 ومقارنتها.
  5. فتح ملف damsel.log في محرر النص. نموذج على النحو الوارد في "المرجعية" في الجزء السفلي من الملف هو النموذج الأكثر تمثيلا.

تخفيض 5. IEC-SAXS البيانات، والتحليل، والنمذجة

  1. في البرنامج الذي ينفذ التلاعب مع ملفات البيانات SAXS التجريبية 22، تحميل حوالي 50 SAXS إطارات من كل خطوة اختلاطعلى المدى العازلة، اضغط على زر "متوسط"، وحفظ النتائج.
  2. وبناء على نتائج لصناعة السيارات في معالجة المتاحة عبر ISPyB، وتحديد الأطر التي من التجربة تتوافق مع شطف من البروتين والتحقق من أن (أولي) نصف قطر الدوران غير مستقر في جميع أنحاء الذروة.
  3. تحميل الإطارات في التجريبية للبرنامج ملفات البيانات التلاعب SAXS 22 والمتوسط منها، كما فعلت بالنسبة للإطارات عازلة (راجع الخطوة 5.1). ثم، تحميل الملفات عازلة إنشاؤه في الخطوة 5.1 و مقارنة المناطق عالية ف (فوق 4.2 نانومتر -1) لإيجاد منطقة عازلة يطابق المتوسط من الذروة.
    ملاحظة: يجب أن يكون هناك منهجية موازنة بين متوسط ​​من ذروة والعازلة. إذا يبدو أن منحنى العينة تقع بين اثنين من منحنيات العازلة، أقحم منحنيات عن طريق حساب المتوسط.
  4. طرح المخزن المؤقت تحديدها على أنها أفضل مباراة من منحنى متوسط ​​تناثر ذروة جزء وحفظ subtr الناتجةملف تصرف. وبالإضافة إلى ذلك، إنشاء منحنيات تطرح باستخدام متوسط ​​منحنيات عازلة من السابقة والتالية الخطوات خلط لتقدير هامش الخطأ في الطرح.
  5. كرر الخطوات من 5.3 و 5.4 على حدة لنصفين الأيمن والأيسر من ذروة ومقارنة النتائج لتلك من الخطوة 5.4 للتحقق من استقرار إشارة في جميع أنحاء الذروة.
  6. اتبع الخطوات 3.5 و 3.6 لجميع منحنيات طرح ثلاثة من الخطوة 5.4.
  7. مقارنة النتائج لجميع منحنيات ثلاثة تطرح.
    ملاحظة: فقط النتائج أن تظل قوية ضمن هامش الخطأ في الطرح يمكن الوثوق بها.
  8. أداء النمذجة كما في الخطوات 4.1 و 4.2 لأفضل الطرح تحديدها في الخطوة 5.3.
  9. اتبع الخطوة 4،3-4،5 لتحقيق المواءمة بين النماذج والتعرف على واحد الأكثر تمثيلا.

6. مقارنة بين نتائج

  1. تشغيل برنامج إلى فرض هياكل 3D 12 على نماذج تمثيلية من المجلس الأعلى للتعليم (الخطوة 4.5) لالبيانات د IEC-SAXS (خطوة 5.9) مع التماثل P6: supcomb model_sec.pdb model_iec.pdb
  2. استيراد model_sec.pdb وmodel_iec-r.pdb في برنامج التصور الجزيئي.
  3. فتح ملفات .fir من modelsec.pdb و-r.pdb modeliec في جدول بيانات وإنشاء رسم بياني 2D من منحنيات تشتت التجريبية ومحسوبة.

Representative Results

يتم سرد نتائج التحليل ثابتة خالية من نموذج في الجدول 1. وأظهر تحليل البيانات 323-785 SEC-SAXS D5 تقدير الكتلة الجزيئية (من تحليل Porod) من 345 كيلو دالتون مقابل 338 كيلو دالتون، لاحظ استخدام IEC-SAXS. كلاهما في اتفاق مع كتلة المتوقع من 6 مرات 53.5 كيلو دالتون (321 كيلو دالتون) لمسدوس. وأجرى النمذجة أساسه كل من مجموعات البيانات مع أي تماثل المفروضة (SEC-SAXS: χ 2 = 0.88، IEC-SAXS: χ 2 = 3.1) واستخدام C6 التماثل (SEC-SAXS: χ 2 = 1.0، IEC-SAXS : χ 2 = 4). كما تناسبها الشاملة للبيانات نثر لكل من إعادة البناء قابلة للمقارنة في كلتا الحالتين (1D الشكل وE)، C6 التماثل يمكن الافتراض. وهكذا، فإن نموذج يتوافق مع بنية تشبه مخروط سداسية مع قناة المركزية، والذي يظهر عرقلت جزئيا (SEC: الشكل 1F، IEC: الشكل 1H). دراسة نماذج فردية قبل المتوسط ​​يدل على أن هذه العراقيل من المرجح أن تكون قطعة أثرية من عملية المتوسط.

شكل 1
الشكل 1: تحليل البيانات SAXS ومقارنة D5 323 -785 (شخصية مقتبسة من المراجع 12 و 18). أ) بنية المجال التخطيطي للبروتين D5 و D5 323-785. ب) غير متصل التبادل الأيوني اللوني مع الإشارة إلى القمم الثلاث. البرتقالي منحنى: الامتصاصية في 280 نانومتر (الاتحاد الافريقي)، المنحنى الأزرق: النسبة المئوية من العازلة ب. النسب المئوية من B العازلة في القمم وأشار. C) على الانترنت التبادل الأيوني اللوني. مفتاح اللون كما في B. بالإضافة إلى ذلك، يشار إلى قياس كثافة باللون الأخضر. تناثر تجريبي منحنىالثانية احتساب منحنى من طراز حصلت عليها D SEC-SAXS) وIEC E) تحليل البيانات من D5 323-785. نموذج F) حبة من D5 323-785 استنادا إلى بيانات المجلس الأعلى للتعليم والبيانات G) IEC. H) تراكب من النماذج المجلس الأعلى للتعليم واللجنة الانتخابية المستقلة. تم إنشاء لوحات في F) إلى H) باستخدام برنامج التصور الجزيئي 24. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

معلمات جمع البيانات
صك: ESRF BM29
الطول الموجي (أ) 0.99
ف المدى (أ -1) ،0032-0،49
عينة إلى كشف المسافة 2،864 م
وقت التعرض (ثانية) 1 في إطار
مجموعة تركيز غ
درجة الحرارة (K) 293
الكاشف بيلاتوس 1M (Dectris)
الجريان (الفوتونات / ثانية) 1 × 10 12
شعاع حجم (ميكرون 2) 700 × 700
المعلمات الهيكلية للD5 323-785، المجلس الأعلى للتعليم
أنا 0 (سم -1) [من Guinier] 0.0237
النمو الحقيقي (أ) [من Guinier] 48
ف دقيقة R ز - س كحد أقصى R ز تستخدم لGuinier 0،77-1،24
D ماكس (أ) [من ص (ص)] 145
ف المدى تستخدم لص (ص) (أ -1) 0،02-0،17
Porod المجلد الخامس ص (3) [من مبعثر] (570 ± 5) × 10 3
الجزيئية كتلة M ص (كيلو دالتون) [من الخامس ص] 345
تحسب أحادى السيد من تسلسل (كيلو دالتون) 321
المعلمات الهيكلية للD5 323-785، IEC
أنا 0 (سم -1) [من Guinier] 0.386
النمو الحقيقي (أ) [من Guinier] 46.5 ± 0.1
ف دقيقة R ز - س كحد أقصى R ز تستخدم لGuinier 0،44-1،29
D ماكس (أ) [من ص (ص)] 120
ف المدى تستخدم لص (ص) (أ -1) 0،03-0،18
Porod المجلد الخامس ص (& #197؛ 3) [من مبعثر] (577 ± 5) × 10 3
الجزيئية كتلة M ص (كيلو دالتون) [من الخامس ص] 339
تحسب hexameric السيد من تسلسل (كيلو دالتون) 321

الجدول 1: معلمات البيانات SAXS. ويلخص الجدول المعلمات من الحصول على البيانات SAXS والتحليل.

Discussion

بالنسبة للعديد من الجزيئات، وتنقية الخطوة النهائية باستخدام الكروماتوغرافيا مطلوب قبل جمع البيانات SAXS للحصول على مجموعة البيانات ذات نوعية جيدة. ومع ذلك، لا تزال ليس كل عينات مستقرة؛ أنها قد تكون عرضة للتجميع أو إعادة موازنة إلى خليط من الدول oligomerization. لذلك، لا بد من تنقية الخطوة النهائية على الانترنت على خط الأشعة لتقليل الوقت بين تنقية وجمع البيانات من أجل الحصول على البيانات SAXS أفضل نوعية. اعتمادا على الخواص الفيزيائية الحيوية من البروتين من الفائدة، قد يتم اختياره SEC-SAXS أو IEC-SAXS للحصول على جودة عينة المثلى. هنا، على بناء بروتين مشتق من هيليكاز / بريميز D5، وأوضح كل من التقنيات ومناقشتها.

الحصول على البيانات SEC-SAXS أصبحت أكثر وأكثر توحيدا ومتاح في العديد من beamlines BioSAXS. تحليل البيانات، وخصوصا الطرح الخلفية، واضحة ومباشرة وسهلة نسبيا. ومع ذلك، إشارة عازلة مستقرةوفصل كاف من أنواع الجزيئات يبقى أساسيا. لذا، فمن الأهمية بمكان أن تخصيص وقت كاف للتوازن العمود تماما. يمكن أن فشل هذه الطريقة يكون راجعا إلى الملوثات المستمرة مشابهة من حيث الحجم للبروتين من الفائدة، وتركيزات منخفضة، والمخازن حساسة للإشعاع.

في الممارسة العملية، في البداية، من المحتمل أن تستخدم الأسلوب المفضل لمعظم عينات الجزيئات SEC-SAXS. ومع ذلك، العديد من البروتوكولات تنقية تتطلب خطوة IEC السابقة بسبب وجود ملوثات أو التجميع. وبالنظر إلى أن كل خطوة التركيز واللوني ويرتبط مع خسائر من عينة (تقدر بنحو 30-50٪) والوقت، مباشر IEC-SAXS هو مفيد. للعينات التي لا يمكن تنقيته من قبل المجلس الأعلى للتعليم، سواء كان ذلك بسبب وجود "الملوثات" ذات الحجم المماثل أو لأنها مجموع بشدة في تركيزات اللازمة، IEC-SAXS ستكون دائما النهج الأفضل ملاءمة. أيضا، دعمت معدلات التدفق العاليمن قبل العديد من الأعمدة IEC يمكن أن تساعد على تقليل زمن العبور بين تنقية والقياس. في المثال المقدمة هنا، كان يستخدم IEC مع شطف خطوة، والذي يسمح للفصل بين القمم وثيقة من D5 323-785 من الملوثات عن طريق اختيار بعناية الخطوات تركيز الملح. من حيث المبدأ، على عدد من الخطوات غير محدود، ولكن من الناحية العملية، مطلوب 1 على الأقل خطوة في الذروة، وليس الكثير يجب أن يتم اختياره. للأسلوب خلفية الطرح هو موضح أعلاه، لا بد من قياس عدد كبير نسبيا من المؤلفات عازلة مختلفة من أجل العثور على مطابقة واحدة.

والجانب السلبي المشتركة لكل التقنيات هو عدم وجود معلومات دقيقة تركيز البروتين. ونتيجة لهذا، تقرير شامل دقيق على أساس نثر الأمام غير ممكن. للبروتينات كروية مثل D5 323-785، ويوفر حجم Porod بديل، وإن كان أقل دقة، وتقدير الشامل، ولكن للبروتينات عالية مرنة أو المختلين، فإن هذا النهج لا تكون صالحة.

وهناك تباين في خطوة حكيمة التدرج طريقة IEC-SAXS المقدمة هنا هو استخدام الانحدار الخطي بدلا من ذلك. في حين أنه من الممكن للعمل مع العديد من الخطوات المطلوبة لعزل القمم دون استخدام شطف تدريجي، في النهج الخطية الانحدار، هو مطلوب منها لتحسين شروط التدرج بعناية من أجل فصل قمم تماما قبل البدء في SAXS تجربة. خلفية الطرح في هذا النهج يمكن أن يتم إطار من الحكمة ويتسن التحقق من هذه المقارنة من الأطر الفردية، ولكنه يتطلب معالجة البيانات أكثر تقدما، وبرامج مخصصة ليست موجودة بعد.

اختيار عمود مناسبة أمر حاسم لكلا التقنيات، كما أنه يحدد الفصل بين الأنواع الجزيئات. أعمدة الحجم استبعاد تختلف في قدرة التحميل، ومدى حجم الجزيئات للانفصال، والقرار، في حين تختلف أعمدة التبادل الأيوني في نوع وكثافةالتهم عن أداء وظائفها.

في حين أن بروتوكول المعروضة هنا تقتصر على خط الأشعة ESRF BM29، والتكيف مع أي خط الأشعة SAXS الآخر، من حيث المبدأ، واضحة. المتطلبات الرئيسية هي عالية بما فيه الكفاية تدفق الأشعة السينية وجهاز الكشف عن مناسبة (مثالي واحد الفوتون العد)، للحصول على البيانات معقولة الإشارة إلى الضوضاء في نطاق ثانية أو أقل، ونظام اللوني السائل عبر الإنترنت قادر على خلق التدرجات. ومن شأن التنفيذ المحدد، بالطبع، يعتمد على البيئة خط الأشعة المحلية.

النتائج التي تم الحصول عليها في D5 323-785 باستخدام الطريقتين تختلف قليلا. نصف قطر الدوران هو أصغر قليلا لبيانات اللجنة الانتخابية المستقلة من لبيانات المجلس الأعلى للتعليم، وتحول الدنيا المحلية من منحنى نثر لناقلات نثر أكبر قليلا. وهذا يعني أن D5 323-785 قياس مع IEC-SAXS قليلا أكثر إحكاما من D5 323-785 قياس مع SEC-SAXS. هذا قد بالبريد بسبب وجود خلافات في إعداد العينات، في وقت ما بين تنقية والقياس (IEC أسرع)، أو، أقل احتمالا، إلى الملوثات في عينة تنقيته المجلس الأعلى للتعليم. نماذج حبة تم الحصول عليها بشكل مستقل تماما مع كل الأساليب قابلة للمقارنة (الشكل 1H). D5 323-785 يظهر جوفاء، هيكل hexameric المتوقع 18.

في الختام، على شبكة الإنترنت التبادل الأيوني والانترنت حجم الاستبعاد اللوني طرق تنقية الكيميائية الحيوية الهامة التي يمكن أن يقترن مباشرة إلى SAXS 6،7،9-12،25،26. الطرح خلفية البيانات IEC-SAXS قليلا أكثر صعوبة وغموضا من لSEC-SAXS، ولكن من الممكن مع ذلك. اعتمادا على الخواص الفيزيائية الحيوية من البروتين من الفائدة، سواء المجلس الأعلى للتعليم وIEC-SAXS تسمح لتعظيم الاستفادة من فصل الأنواع مع المزايا الكامنة. التي تنص على أن خطوات التحقق من صحة (كما هو موضح) لوحظ بشكل صحيح، يمكن تحليل البيانات الناتجة خفة دمالثقة ساعة، ونماذج يمكن تحديد باستخدام الأدوات القياسية المتاحة داخل المجتمع. معا، وكلاهما تقنيات تسمح الانفصال عبر الإنترنت لمجموعة واسعة من الجزيئات البيولوجية، مما أسفر عن البيانات لا يمكن الوصول إليها عن طريق قياسات ثابتة القياسية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,4-dithiothreitol [DTT] Euromedex EU0006-B
10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gel Biorad 4561033
2x Phusion Flash PCR Master Mix ThermoFisher scientific F 548
acetic acid glacial VWR Chemicals (BDH Prolabo) 20104.298
Agarose D-5 Euromedex LF45130653
Amicon Ultra -15 Centrifugal filters Ultracel -30K Millipore Ltd UFC903024
Ampicillin sodium salt Euromedex EU0400-D
Benzonase Novagene 70750-3
bromophenol blue  MERCK 8122
Complete protease inhibitor cocktail  Roche 11231400
Econo-Pac 10 DG Desalting column Bio-rad 732-2010
EDTA Sigma E-5134
Glycerol VWR Chemicals (BDH Prolabo) 24388.295
Glycine Euromedex 26-128-6405-C
HindIII Roche 656313
HisSelect HF Nickel Affinity Gel Sigma H0537
Hydrochloric acid (HCl) VWR Chemicals (BDH Prolabo) 20252.295
Imidazole AppliChem Panreac A1073,0500
InstantBlue Expedeon ISB1L
LB broth Miller Fluka Analytical L3152
MgCl2 ICN Biomedicals Inc. 191421
NaCl VWR Chemicals (BDH Prolabo) 27808.297
NcoI Fermentas ER0571
One Shot BL21 Star (DE3)  ThermoFisher scientific C6010-03
pProEx HTb vector  Addgene 10711018
Primer  Eurofins mwg operon
QIAprep Spin Miniprep kit QIAGEN 27106
QIAquick Gel extraction kit QIAGEN 28706
QIAquick PCR purification kid QIAGEN 28106
SDS  Sigma 75746
Superose 6 10/300 GL GE Healthcare 17-5172-01
SYBR Safe DNA gel stain Invitrogen life technology S33102
T4 ligase ThermoFisher scientific EL0011
TEV home made
TOP 10 Invitrogen life technology C404003 
Tris base Euromedex 26-128-3094-B
Uno Q 1R column  Bio-rad 720 0011
β-mercaptoethanol MPBiomedicals, LLC 194834
Name Company Catalog Number Comments
Softwares
Beamline control software BsXCuBE ESRF Pernot et al. (2013), J. Synchrotron Rad. 20, 660-664 local development
Camserver software Dectris n.a. detector control software
DAMAVER ATSAS 2.6.0 http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html program to align ab initio models 
DAMMIF ATSAS 2.6.0 http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html ab initio model reconstruction program
HPLC program Biologic Duo Flow Bio-rad
HPLC program LabSolutions Shimadzu n.a.
ISPyB ESRF De Maria Antolinos et al. (2015). Acta Cryst. D71, 76-85. local development
PRIMUS ATSAS 2.6.0 http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html program, which performs the manipulation with experimental SAXS
PyMOL DeLano Scientific LLC https://www.pymol.org/ software for visualization
SUPCOMB ATSAS 2.6.0 http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html program to superimpose 3D structures
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
BioLogic Duo Flow Biorad
BioLogic Biofrac Fraction collector Biorad
HPLC system Shimadzu
Labsonic P Sartorius Stedim biotech BBI8535108

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Graewert, M. A., Svergun, D. I. Impact and progress in small and wide angle X-ray scattering (SAXS and WAXS). Curr. Opin. Struct. Biol. 23, 748-754 (2013).
  2. Jacques, D. A., Trewhella, J. Small-angle scattering for structural biology-Expanding the frontier while avoiding the pitfalls. Protein Sci. 19, 642-657 (2010).
  3. Kikhney, A. G., Svergun, D. I. A practical guide to small angle X-ray scattering (SAXS) of flexible and intrinsically disordered proteins. FEBS Lett. 589, 2570-2577 (2015).
  4. Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution. Q. Rev. Biophys. 40, 191-285 (2007).
  5. Vestergaard, B. Analysis of biostructural changes, dynamics, and interactions - Small-angle X-ray scattering to the rescue. Arch. Biochem. Biophys. (2016).
  6. David, G., Pérez, J. Combined sampler robot and high-performance liquid chromatography: a fully automated system for biological small-angle X-ray scattering experiments at the Synchrotron SOLEIL SWING beamline. J. Appl. Crystallogr. 42, 892-900 (2009).
  7. Graewert, M. A., et al. Automated Pipeline for Purification, Biophysical and X-Ray Analysis of Biomacromolecular Solutions. Sci. Rep. 5, (2015).
  8. Lambright, D., et al. Complementary techniques enhance the quality and scope of information obtained from SAXS. ACA Trans. 1-12 (2013).
  9. Mathew, E., Mirza, A., Menhart, N. Liquid-chromatography-coupled SAXS for accurate sizing of aggregating proteins. J. Synchrotron Radiat. 11, 314-318 (2004).
  10. Round, A., et al. Determination of the GH3. 12 protein conformation through HPLC-integrated SAXS measurements combined with X-ray crystallography. Acta Crystallogr. Sect. D. Biol. Crystallogr. 69, 2072-2080 (2013).
  11. Watanabe, Y., Inoko, Y. Size-exclusion chromatography combined with small-angle X-ray scattering optics. J. Chromatogr. 1216, 7461-7465 (2009).
  12. Hutin, S., Brennich, M. E., Maillot, B., Round, A. Online ion-exchange chromatography for small angle X-ray scattering. Acta Cryst. (2016).
  13. Selkirk, C. Ion-exchange chromatography. Protein Purification Protocols. 125-131 (2004).
  14. Yigzaw, Y., Hinckley, P., Hewig, A., Vedantham, G. Ion exchange chromatography of proteins and clearance of aggregates. Curr. Pharm. Biotechnol. 10, 421-426 (2009).
  15. Pernot, P., et al. Upgraded ESRF BM29 beamline for SAXS on macromolecules in solution. J. Synchrotron Radiat. 20, 660-664 (2013).
  16. Iyer, L. M., Koonin, E. V., Leipe, D. D., Aravind, L. Origin and evolution of the archaeo-eukaryotic primase superfamily and related palm-domain proteins: structural insights and new members. Nucleic Acids Res. 33, 3875-3896 (2005).
  17. Singleton, M. R., Dillingham, M. S., Wigley, D. B. Structure and mechanism of helicases and nucleic acid translocases. Annu. Rev. Biochem. 76, 23-50 (2007).
  18. Hutin, S., et al. Domain organization of vaccinia virus helicase-primase D5. J. Virol. 4604-4613 (2016).
  19. Round, A., et al. BioSAXS Sample Changer: a robotic sample changer for rapid and reliable high-throughput X-ray solution scattering experiments. Acta Crystallogr. Sect. D. Biol. Crystallogr. 71, 67-75 (2015).
  20. De Maria Antolinos, A., et al. ISPyB for BioSAXS, the gateway to user autonomy in solution scattering experiments. Acta Crystallographica Section D. 71, 76-85 (2015).
  21. Brennich, M. E., et al. Online data analysis at the ESRF bioSAXS beamline, BM29. J. Appl. Crystallogr. 49, (2016).
  22. Petoukhov, M. V., Konarev, P. V., Kikhney, A. G., Svergun, D. I. ATSAS 2.1-towards automated and web-supported small-angle scattering data analysis. J. Appl. Crystallogr. 40, 223-228 (2007).
  23. Franke, D., Jeffries, C. M., Svergun, D. I. Correlation Map, a goodness-of-fit test for one-dimensional X-ray scattering spectra. Nat. Methods. 12, 419-422 (2015).
  24. Schrodinger, LLC. The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8. (2015).
  25. Jensen, M. H., et al. Time-resolved SAXS measurements facilitated by online HPLC buffer exchange. J. Synchrotron Radiat. 17, 769-773 (2010).
  26. Hynson, R. M., Duff, A. P., Kirby, N., Mudie, S., Lee, L. Differential ultracentrifugation coupled to small-angle X-ray scattering on macromolecular complexes. J. Appl. Crystallogr. 48, 769-775 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics