Online Storlek-utanförskap och Jonbyteskromatografi på en SAXS beamline

1Structural Biology Group, European Synchrotron Radiation Facility, 2European Molecular Biology Laboratory, 3School of Chemical and Physical Sciences, Keele University, 4Groupe de Microscopie Electronique et Méthodes, Institut de Biologie Structurale
Biochemistry
 

Summary

Bestämningen av den lösning strukturen av ett protein genom liten vinkel röntgenspridning (SAXS) kräver monodispersa prover. Här presenterar vi två möjligheter att säkerställa minimala fördröjningar mellan provberedning och datainsamling: nätet storleks (SEC) och online-jonbyteskromatografi (IEC).

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Brennich, M. E., Round, A. R., Hutin, S. Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline. J. Vis. Exp. (119), e54861, doi:10.3791/54861 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Biologisk liten vinkel röntgenspridning (BioSAXS) är en kraftfull teknik i molekyl- och strukturbiologi används för att bestämma lösningen struktur, partikelstorlek och form, och surface-to-volymförhållande av makromolekyler. Tekniken är applicerbar på ett mycket stort antal olika lösningsbetingelser som spänner över ett brett intervall av koncentrationer, pH-värden, jonstyrkor, temperaturer, tillsatser, etc., men provet måste vara monodispersa. Denna varning ledde till genomförandet av vätskekromatografi system på SAXS strålrör. Här beskriver vi den uppströms belägna integrering av storleksuteslutningskromatografi (SEC) och jonbyteskromatografi (IEC) på en beamline, olika metoder för optimal bakgrundssubtraktion, och datareduktion. Som ett exempel, beskriver vi hur vi använder sek- och IEC-SAXS på ett fragment av den essentiella vaccinia-virusprotein D5, som består av en D5N helikas domän. Vi bestämmer dess övergripande form och molekylvikt, visar hexamera strukturen av the protein.

Introduction

BioSAXS är ett kraftfullt verktyg för att bestämma formen av nanostora objekt 1-4. Spridningen av röntgenstrålar med en lösning innehållande makromolekyler, dimensioneras på nm, registreras vid mycket små vinklar. Detta vinkelområde innehåller information om globala parametrar: tröghetsradie; den största intraparticle avstånd; partikelformen; och graden av vikning, denaturering, eller störning. Tekniken kräver inte kristaller, och makromolekylen stannar i lösning och sålunda kan hållas under förhållanden som efterliknar vissa viktiga parametrar i cellen, såsom jonstyrka, pH, etc. Kunskapen om dessa faktorer kan bidra till att bestämma, till exempel, det fysiologiskt relevanta oligomera tillstånd av ett protein av intresse eller för att validera en föreslagen modell av ett komplex. Karakterisering av protein-proteininteraktioner i olika buffertbetingelser, skapande av modeller för saknade domäner, förfining av homologimodeller, och determinering av diskreta vikta och ovikta tillstånd kan utföras snabbt och enkelt 5.

Som med alla teknik, har BioSAXS inneboende svagheter: aggregerade eller denaturerade prover, blandningar av partiklar, heterogena prover, strålningsskada, och buffert obalanser kan resultera i un-tolkningsbara data. För många analysmetoder, är det underförstått antas att provet är monodispers, ett krav som ofta är svårt att få i praktiken. I många fall är nedbrytningen av provet subtila och kan inte upptäckas i data på egen hand, och alla försök att tolka data ger felaktiga eller missvisande resultat. För att övervinna dessa hinder, var kombinationen av storleks (SEC) och SAXS implementeras på många strålrör att säkerställa uppgifternas kvalitet och för att göra denna teknik mer tillgänglig för allt svårare prov 6-11. Nyligen har vi lagt en ny metod för att repertoaren genom att utveckla nätet jonbytekromatografi (IEC) -kopplade SAXS 12. Båda teknikerna öppnar SAXS till ett brett spektrum av biologiska partiklar som tidigare omöjliga att analysera. Valet av vilken metod som ska användas beror på de biofysikaliska egenskaperna hos partiklarna av intresse.

SEC separerar makromolekyler genom sin storlek, varigenom det krävs åtminstone en skillnad i skenbar molekylmassa 10% för separationen. Fysiska begränsningar i kolumnen och fysiologiska egenskaper av proverna, som hydrofoba ytor, flexibilitet och bristande stabilitet, även komplicera datainsamling, analys och tolkning.

Jonbyteskromatografi, som separerar molekyler baserat på deras laddning och därmed deras bindningsaffinitet till IEC-kolonn, kan användas i stället för eller som tillägg till SEC. Den totala laddningen kan lätt manipuleras genom att förändra pH, eller variera saltkoncentrationen i buffert, vilket ger en relativt enkel metod för kontrollerad elution av molekylerna från IEC-kolonnen. Genom att använda avgiften, separation av liknande typer och storlekar av molekyler, som annars skulle vara svåra att separera, kan utföras rutinmässigt med IEC. Dessutom har IEC fördelen av att kunna ta itu med utspädda prover så att en för att undvika koncentrationssteg, som bär den potentiella risken för denaturering av proteinet. Tyvärr, som laddningsöverföringen är mycket prov beroende, kräver IEC optimering beträffande pH och saltkoncentrationerna 13,14.

För många proteiner som är svåra att uttrycka, rena, eller båda, endast låga mängder av provet är tillgängliga för att studera. Det är viktigt att vara effektiv och för att minimera antalet reningssteg och därmed förlusterna. Av denna anledning är det sista reningssteget på nätet direkt före SAXS datainsamling, för att öka sannolikheten för att samla in en bra datamängd.

HärPresenterar vi och jämföra på nätet SEC-SAXS och IEC-SAXS. Båda teknikerna genomfördes på BioSAXS beamline BM29 vid anläggningen European Synchrotron Radiation (ESRF) i Grenoble, Frankrike 15. Som ett testfall, använde vi D5N och helikas domän vacciniavirus protein D5, som var ganska svårt att strukturellt analysera med hjälp av andra metoder. Vaccinia virus är en medlem av Poxviridae familjen och är 98% identisk med den variolavirus, orsaken till smittkoppor. Med hjälp av vaccinia systemet, studerar vi replikering maskiner, fokuserar här på det väsentliga helikas-primas D5.

D5 är ett protein med en N-terminal Archeo-eukaryot primas (AEP) domän 16 följt av ett cystein klusterområdes (res. 240 till 345) 16 95-kDa. Ytterligare mot C-terminalen kommer en D5N domän (res. 340 till 460), som alltid är förknippad med D5-typ helikaser, och slutligen en superfamilj 3 (SF3) helikas domän (res. 460 till 785) 17 (Figure 1A). Den helikas domänen av D5 bygger en hexamerisk ringstruktur som behövs för tät bindning till DNA. Tack vare de senaste SAXS och EM studier är lågupplösta strukturerna i primas och Helicase domäner nu kända 18.

Här visar vi hur man använder genomförda nätet kromatografitekniker på BioSAXS beamline BM29 vid ESRF att få insikt i strukturen av C-terminalt fragment (rest 323-785) av D5.

Protocol

1. Beskrivning av Offline Förberedelse och prov Generation av en D5 radering Protein

OBS: D5 323-785 konstruktionen (figur 1 A) klonades, uttrycktes och renades såsom beskrivits 18.

  1. Klona konstruktionen i pProEx HTB vektorn
    1. Utföra en polymeraskedjereaktion (PCR) på D5R med användning av de 5'-GCGCCATGGGTAATAAACTGTTTAATATTGCAC-3 'och 5'-ATGCAAGCTTTTACGGAGATGAAATATCCTCTATGA-3' primers och en PCR-reaktionsblandning med polymeras, följande tillverkarens råd.
    2. Rena PCR-fragmenten via spinnkolonner, enligt tillverkarens råd.
    3. Smälta PCR-fragment och plasmiden med Ncol och Hindlll-restriktionsenzymer, i enlighet med tillverkarens rekommendationer för buffertsammansättning och inkubationstiden.
    4. Köra fragmenten på en 1% agarosgel i 0,5x TAE-buffert (20 mM Tris, 10 mM ättiksyra,och 0,5 mM EDTA) och fläcka gelén med ett DNA-färgämne.
    5. Exponera gelén för UV-ljus.
      Varning: Använd personlig skyddsutrustning! Skära ut banden av de digererade PCR-fragment och den digererade plasmiden och rena DNA med användning av en gelrening spinnkolonn kit, enligt tillverkarens rekommendationer.
    6. Ligera de renade PCR-fragmenten in i plasmiden genom att använda en snabb ligeringssats, i enlighet med tillverkarens rekommendationer.
    7. Transform via värmechock produkten från ligeringsreaktionen i kompetenta bakterier optimerade för plasmid-amplifiering.
      1. Tillsätt hälften av ligeringsprodukten till en flaska med bakterier.
      2. Inkubera reaktionsröret på is under 20 min.
      3. Inkubera röret vid 42 ° C under 30 s.
      4. Placera röret på is under 2 min.
      5. Tillsätt 1 ml Luria Bertani (LB) buljong (Miller) utan antibiotika och låta cellerna återhämta sig vid 37 ° C under 1 h.
      6. Snurra ner cellerna vid 16.100 xg for 3 si en bords mikrorör centrifug och ta bort de flesta av mediet.
      7. Sprida cellerna på en LB-agarplatta med ampicillin (50 mikrogram / ml slutlig) och låta kolonierna växa vid 37 ° C över natten.
    8. Sätt en koloni i 3 ml LB med ampicillin (50 mikrogram / ml slutlig) och växa kulturen vid 37 ° C, skakning vid 160 rpm över natten.
    9. Följ instruktionerna på miniprep kit för att extrahera plasmid.
    10. Skicka ett prov av plasmid för sekvensbestämning och analysera sekvensen för frånvaron av mutationer och för korrekt införing.
    11. Omvandla pProEx HTB D5 323-785 bygga i bakterier optimerade för proteinuttryck (använd en mikroliter och följ anvisningarna i steg 1.1.7). Sprida bakterierna på en LB-agarplatta med ampicillin (50 mikrogram / ml slutlig).
    12. Att skapa en startkultur, sätta en koloni i 300 ml LB med ampicillin (50 mikrogram / ml slutlig) och odla bakterier vid 37 ° C, skakning vid 160 rpm över natten.
  2. Inokulera 12 x 1 L LB i närvaro av ampicillin (50 | ig / ml slutlig), var och en med 20 ml av pProEx HTB D5 323-785 bakterier startkultur vid 37 ° C tills en OD 600 = 0,3 har uppnåtts. Reducera temperaturen till 18 ° C och inducera expression vid en OD 600 = 0,5 med 1 mM IPTG. Inkubera kulturerna, skaka dem vid 160 rpm och 18 ° C över natten.
  3. Skörda bakterier genom centrifugering vid 50000 x g och vid 4 ° C under 30 min. Resuspendera bakteriella pellets i approximativt 150 ml lysbuffert (50 mM Tris-HCl [pH 7], 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 10 mM β-merkaptoetanol och 10% glycerol) med 1x proteashämmare och 25 enheter ( U) / 10 ml DNas. Lyse bakterierna via ultraljudsbehandling på is (1-tums-sond, 50% effekt, 0,5-s puls, 0,5-s paus, 3x 5 min).
  4. Ladda supematanten på en nickelaffinitetskolonn (Ni-kolonn, 1,5-ml bäddvolym), och tvätta den med 10 kolonnvolymer (CV) av binding buffert (50 mM Tris-HCl [pH 7], 150 mM NaCl, 10 mM β-merkaptoetanol och 10% glycerol), 10 CV av tvättbuffert (50 mM Tris-HCl [pH 7], en M NaCl, 10 mM β-merkaptoetanol och 10% glycerol), och 10 CV av imidazol tvätt (50 mM Tris-HCl [pH 7], 150 mM NaCl, 10 mM β-merkaptoetanol, 10% glycerol och 30 mM imidazol). Eluera D5 323-785 (20 mM Tris-HCl [pH 7], 150 mM NaCl, 10 mM β-merkaptoetanol, 10% glycerol och 200 mM imidazol).
  5. Inspektera de olika reningsstegen via natriumdodecylsulfat (SDS) -polyacrylamide gelelektrofores (PAGE).
    1. Belastning 2-20 mikroliter av varje reningssteg genomflödes blandad med 1x laddningsfärg (2x: 4% SDS, 20% glycerol, 120 mM Tris-HCl [pH 6,8], och 0,02% vikt / volym bromfenolblått) på en 10 % SDS-gel och köra dem vid 200 V i 1 x Laemmli rinnande buffert (25 mM Tris, 0,192 M glycin och 0,1% SDS).
    2. Fläcka gelén med en färdig att använda Coomassie-blå lösning.
  6. excndra buffert av det eluerade proteinet med bindningsbuffert med användning av en avsaltningskolonn enligt tillverkarens manual.
  7. Klyva His-taggen genom att tillsätta Tobacco Etch Virus kärninneslutnings en endopeptidas (TEV, 1 mg / 100 mg protein) till proteinlösningen. Inkubera vid rumstemperatur över natten.
  8. Kontrollera digestion genom att utföra SDS-PAGE (se steg 1.5)
  9. Jämvikta Ni-kolonnen i bindningsbuffert. Låt proteinlösningen passerar genom och tvätta pärlorna med 2 CV av imidazol tvättbuffert samtidigt samla genomflödet.
  10. Koncentrera proteinet med hjälp av en centrifugalkoncentrator till en slutlig volym av 0,5 ml.
  11. Injicera den koncentrerade proteinet på en storleksuteslutande kolonn ekvilibrerad med gelfiltrering buffert (20 mM Tris-HCl [pH 7], 150 mM NaCl, 10% glycerol och 1 mM ditiotreitol [DTT]).
  12. Samla genomflödet i 0,5-ml fraktioner.
  13. Kontrollera förekomsten och renheten av proteinet i topp proverna medutföra SDS-PAGE (se steg 1.5).
  14. Kombinera fraktioner av det eluerade toppen av D5 323-785. Späda provet till 25 mM NaCl och 5% glycerol och samtidigt hålla de Tris och DTT-koncentrationer konstant (för 5 ml proteinlösning i 20 mM Tris-HCl [pH 7], 150 mM NaCl, 10% glycerol och 1 mM DTT, först tillsätt 5 ml 20 mM Tris-HCI [pH 7] och 1 mM DTT, och sedan lägga till 20 ml 20 mM Tris-HCI [pH 7], 5% glycerol och 1 mM DTT).
  15. Ladda provet på en jonbytarkolonn. Använd buffert A (20 mM Tris [pH 7], 25 mM NaCl, 5% glycerol och 1 mM DTT) och buffert B (20 mM Tris [pH 7], en M NaCl, 5% glycerol och 1 mM DTT) för att bilda en saltgradient från 25 mM till 1 M.
  16. Samla upp det eluerade proteinet i 1,5-ml fraktioner.
  17. Kontrollera förekomsten och renheten av proteinet i toppproverna genom att utföra SDS-PAGE (se steg 1,5 och figur 1B)
  18. Återkoncentrera proteinlösningen i en centrifugalkoncentrator till en slutlig volym av 0,5 ml.
  19. rerun det koncentrerade proteinet på ett storleksuteslutningskolonn i gel filtreringsbuffert (20 mM Tris-HCl [pH 7], 150 mM NaCl, 5% glycerol och 1 mM DTT; se steg 1,11).

2. Datainsamling

OBS: Begäran balk tid så tidigt som möjligt. För ESRF, kan riktlinjer för tillgängliga åtkomsttyper och om hur man lämnar in en ansökan finns på:
http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Applying . Efter godkännande av förslaget och en inbjudan för experimentet, alla deltagare måste fylla i en säkerhetsutbildning. Efter validering av utbildning, fyll i "A-formen" (via ESRF användarportal) att förklara forskarna besöker strålröret för experimentet, tillsammans med erforderlig säkerhetsinformationen på proven. Kontakta lokal kontaktperson för att diskutera experimentet.

  1. SEC-SAXS datainsamling
    OBS: För online rening använder HPLC (HPLC) installerat på BM29. Systemet består av en in-line avgasare, en binär pump, en ventil för urval buffert och gradienter, en autosampler, en UV-VIS array fotospektrometer och en conductometer. Det är direkt ansluten till genomströmnings kapillär av SAXS exponeringsenheten 19.
    1. Fyll på 1 ml gelfiltreringen bufferten åt sidan. Anslut buffertflaskan till SEC-systemet (standard är port A).
    2. Väljer flödeshastigheten beroende på kolonnen i användning. Anmärkning: För storleksuteslutningskolonn som används här, är flödeshastigheten 0,1 ml / min. Definiera det maximala trycket för kolonnen, ta del av mottrycket, och ställa förvärvet tid att åtminstone 1,2 CV.
    3. Spola pumpar och uppströms rören via "auto-utrensning" -funktion.
    4. Vänta tills systemet är fyllt med bufferten och anslut kolonnen. Jämvikt kolonnen genom att passera åtminstone 1,5 CV.
    5. Interlockburen och mäta buffert som avsatts i steg 2.1.1, med hjälp av provväxlare att kontrollera för variation av signalen på grund av strålningsskador. Endast fortsätta om det inte finns någon strålningsskador till bufferten.
    6. Växla beamline kontrollsystem för att HPLC-läget. Gör en testkörning av buffert, samla 200 ramar med 1 s per ram. Skriv ner antalet pulser som ges av detektorn i den summerade intensitets tomt.
      OBS: Signalen ska matcha tidigare uppmätta buffert, och den summerade intensiteten över tiden bör vara konstant. Om signalen inte matchar eller inte är konstant, krävs en längre jämvikt av systemet.
    7. Centrifugera ner provet vid 13000 x g i en bords mikrorör centrifug under åtminstone 10 min.
    8. Fyll provet i en HPLC-kompatibel glasflaska (medföljer) och placera den i autoinjektor. Notera brunnen position.
    9. Låsa den experimentella buren med hjälp av standardförfarande, vilket förklaras i användarsäkerhetsutbildning.
    10. Logga in och skapa en mapp för datalagring genom strålröret styrprogram.
    11. Programmera HPLC-systemet med hjälp av "snabba batch" -funktionen. Ställa in lagringsplatsen för UV-data till mappen som skapades i steg 2.1.10. Se till att aktivera den automatiska ASCII omvandling av UV-data, lagra ASCII-fil i samma mapp.
      1. Välj injektionsvolymen och väl läge. Lägg mätningen kö genom att trycka på "Start" -knappen. Programmet kommer att be för att rädda partiet. Förbered för att spara, men inte trycka på knappen "Spara", eftersom det startar automatiskt mätningen.
    12. Ställ upp för datainsamling parametrar i strålröret styrprogram. Välj antalet ramar så att den totala datainsamlingen tiden är i ett litet överskott av förvärvet definierad i steg 2.1.2.
    13. Öppna säkerhetsslutaren och starta SAXS datainsamling med hjälp av strålrör styrprogram. Kontrollera att uppgifterna är correkt förvärvas. Jämför nyinsamlade data till data som samlats in i steg 2.1.6 och kontrollera att antalet pulser i den summerade intensiteten förblir konstant under minst 100 ramar och matchar värdet från steg 2.1.6.
      1. Starta SEC drivs genom att trycka på "Spara" -knappen, som framställts i steg 2.1.11, och notera ramnumret visas i camserver programvaran när injektionen är avslutad och UV datainsamling startar.
    14. Efter datainsamling, öppna ISPyB databasen 20 vid Öppna "datainsamling" -fliken och tryck på "Go" för att komma till datamängden och resultaten av automatisk analys 21.
  2. IEC-SAXS datainsamling
    OBS: I stället för kontinuerlig linjär gradient som används allmänt inom IEC experiment använder en stegvis gradient i vilken mängden buffert B ökar i förinställda diskreta steg.
    1. Skapa HPLC-program för en sample-fri buffert springa. Programmera en stegvis gradient som startar från 0% buffert B och öka med 5 procentenheter efter två CV tills 100% av buffert B nås.
    2. Lägga en del av varje buffert åt sidan. Anslut flaskan med låg saltbuffert A till port A och en med hög saltbuffert B till port B.
    3. Väljer flödeshastigheten och hålla sig under tryckgränsen av kolonnen (i detta exempel, 1 ml / min).
    4. Som i steg 2.1.3, spola pumparna och uppströms slang med hjälp av "auto-utrensning" -funktion.
    5. Jämvikta systemet i svag saltbuffert A (se steg 1,15) och anslut jonbytarkolonn. Vänta tills kolonnen helt ekvilibreras (åtminstone 1,5 CV).
    6. Använd buffert avsatt i steg 2.2.2 att undersöka buffertar A och B för strålskador använder provbytaren, som i steg 2.1.5.
    7. Kontrollera bufferten kommer ut ur kolonnen, som i steg 2.1.6. Jämföra signalen till signalen från buffert A registreras i steg 2.2.6. Notera igenantal räknas i den summerade intensitets tomt.
    8. Skapa en mapp för datalagring för bufferten körningen.
    9. Inrätta datainsamling i HPLC-system läget. Välja antalet ramar så att den totala datainsamlingstiden är i överskott av den totala tiden i IEC körningen (se steg 2.2.1).
    10. Öppna säkerhetsslutaren och börja insamling SAXS-data. Kontrollera att det genomförs korrekt och dubbelkolla att den summerade intensiteten konstant vid värdet noteras i steg 2.2.7 minst 100 ramar.
    11. Använd "Single Run" -funktionen av HPLC-mjukvaran och starta stegvis gradient programmerad i steg 2.2.1. För injicering, ställa flaskan nummer till -1 för att injicera inget prov i detta steg. Skriv ner antalet ramar som erhållits med programmet startar.
    12. Skapa HPLC programmet för provkörningen. Programmera en stegvis gradient som startar från 0% av buffert B. Uppskattning andelen buffert B vid varje topp mäts offline i steg 1.1.5 ( (Figur 1C). Lägg ett sista steg med 100% buffert B för 2,5 CV.
    13. Centrifugera ner provet vid 13000 x g i en bords mikrorör centrifug under åtminstone 10 min.
    14. Späd D5 323-785 in i saltkoncentration av buffert A (25 mM) genom att blanda den med 20 mM Tris-HCl [pH 7], 10% glycerol och 1 mM DTT.
    15. Ladda provet manuellt på kolonnen. Sätta buffert A ingångsröret in i utspädda provet efter ett uppehåll pumparna för att undvika bildandet av luftbubblor. Koppla bort kolonnen från detektorerna för att direkt samla genomströmning från kolonnen.
      1. När provbehållaren är nästan tom, återinmatningsröret i buffert A (återigen pausa pumparna medan du flyttar röret) och starta pumpningen med buffert A för att överföra provet från slangen till kolonnen. När väl hela provet har varitladdad, passera 2 CV buffert A, och sedan återansluta kolumnen till detektorerna.
    16. För prov sikt skapa en mapp för datalagring.
    17. Öppna säkerhetsslutaren och börja insamling SAXS-data. Kontrollera att datainsamlingen fortsätter korrekt och dubbelkolla att den summerade intensiteten konstant vid värdet noteras i steg 2.2.7 minst 100 ramar.
    18. Använd "Single Run" -funktionen av HPLC-programvara för att starta stegvis gradient programmerad i steg 2.2.12. För injicering, ställa flaskan nummer till -1 för att injicera inget prov i detta steg. Skriv ner antalet ramar som erhållits med programmet startar.
    19. Öppna "datainsamling" i ISPyB 20 och tryck på "Go" för att titta på datauppsättningen och automatisk analys 21.
    20. Exportera UV-data från HPLC-systemet till ASCII-format via programvaran "Postrun Analysis".

3.SEC-SAXS Data Reduction & Analys

  1. Öppna data i datainsamling i ISPyB genom att trycka på knappen "Go". Bestäm i översikten som ramar för insamling SAXS data motsvarar elueringen topp. Verifiera att tröghetsradie är stabil under hela topp.
  2. Kontrollera att den automatiska buffert korrigeringen utfördes korrekt. Lastbågar från den centrala delen av toppen i ett program som utför manipulationer med experimentella SAXS datafiler 22 och i genomsnitt dem. Sedan laddar automatiskt genererade buffertfilen och kontrollera om hög q regioner i genomsnitt ramar och buffertramar match.
  3. Jämför ramarna förvärvats under toppen kvantitativt med hjälp av CORMAP testet 23.
    1. Ladda automatiskt skapade subtraktioner (* _sub.dat filer) av ramar som täcker regionen av intresse.
    2. Skala dem till varandra genom att trycka på "Skala" -knappen.
    3. Compare dem med hjälp av "jämförelse av data" -funktionen. Det bör inte finnas några systematiska förändringar mellan ramarna hela toppen.
  4. Öppna alla * -_ sub.dat ramar av intresse, slå ihop dem med hjälp av "Merge" -knappen, och spara den sammanslagna filen i .dat format.
  5. Bestämma tröghetsradie med "tröghetsradie" verktyg i programmet och att notera den första datapunkten i Guinier intervallet för senare beskärning av data med låg upplösning.
  6. Bestäm par avstånd fördelningsfunktionen med "Avstånd Distribution" verktyg i programmet och spara den resulterande .out filen som gnom.out.

4. från början modellering

  1. På en Unix maskin, köra en 40 x ab initio modell återuppbyggnadsprogrammet utan symmetri begränsningar. Skapa en ny mapp och kopiera gnom.out filen till den. Kör programmet enligt följande:
    för ((i = 1; i <= 40; i ++)); göra dammif gnom.out -MS p dammifp1_ $ i; dett
  2. Analogt, kör en ab initio modell återuppbyggnadsprogram med symmetribegränsningar för sexfaldig symmetri i en andra mapp:
    för ((i = 1; i <= 40; i ++)); do dammif gnom.out -MS -s P6 p dammifp6_ $ i; Klart
  3. Rikta alla ab initio modell återuppbyggnadsprogram utdatafiler (* -1.pdb). I de två mappar från steg 4,1 och 4,2, kör damaver -a * -1.pdb.
  4. Öppna union av alla modeller (damaver.pdb) samt modell filtreras till rätt volym (damfilt.pdb) i en lämplig molekylär visualiseringsprogram 26 och jämföra dem.
  5. Öppna damsel.log filen i en textredigerare. Modellen listad som "referens" längst ned i filen är den mest representativa modellen.

5. IEC-SAXS Data Reduction, analys och modellering

  1. I det program som utför manipulation med experimentella SAXS datafiler 22, laddar ca 50 SAXS ramar från varje blandningsstegetbuffert körningen genom att trycka på "genomsnittliga" -knappen, och spara resultaten.
  2. Baserat på de automatiska bearbetningsresultat är tillgängliga via ISPyB, identifiera vilka ramar av experimentet motsvarar elueringen av proteinet och kontrollera att (preliminärt) tröghetsradie är stabil under toppen.
  3. Ladda ramarna i den experimentella SAXS datafiler manipulation program 22 och i genomsnitt dem, som gjort för buffertramar (se steg 5,1). Därefter laddar buffert filer som genereras i steg 5,1 och jämföra hög q regioner (över 4,2 nm -1) för att hitta en buffert som matchar genomsnitt från toppen.
    OBS: Det bör finnas någon systematisk förskjutning mellan den genomsnittliga från toppen och bufferten. Om provkurvan verkar falla mellan två buffert kurvor, interpolera sina kurvor genom att beräkna genomsnittet.
  4. Subtrahera bufferten identifierats som den bästa matchningen från den genomsnittliga spridningskurvan för toppfraktionen och spara den resulterande SUBTRhandlat fil. Dessutom skapar dras kurvor med hjälp av genomsnittliga buffertkurvorna från de föregående och följande blandningssteg för att uppskatta felmarginalen för subtraktion.
  5. Upprepa steg 5,3 och 5,4 individuellt för de vänstra och högra halvorna av topp och jämför resultaten med de från steg 5,4 till kontrollen för stabiliteten av signalen i hela topp.
  6. Följ steg 3,5 och 3,6 för alla tre subtraheras kurvor från steg 5,4.
  7. Jämföra resultaten för alla tre subtraherade kurvor.
    Obs: Endast resultat som förblir robust inom felmarginalen för subtraktion kan lita på.
  8. Utför modellering som i steg 4,1 och 4,2 för bästa subtraktion identifierats i steg 5,3.
  9. Följ steg 4,3-4,5 för att anpassa modellerna och för att identifiera den mest representativa.

6. Jämförelse av resultaten

  1. Kör ett program för att överlagra 3D-strukturer 12 på de representativa modeller av SEC (steg 4,5) end IEC-SAXS data (steg 5,9) med P6 symmetri: supcomb model_sec.pdb model_iec.pdb
  2. Importera model_sec.pdb och model_iec-r.pdb i en molekylär visualisering programvara.
  3. Öppna .fir filer av modelsec.pdb och modeliec-r.pdb i ett kalkylblad och skapa en 2D-graf över experimentella och beräknade spridningskurvor.

Representative Results

Resultaten av modellfria invariant analys listas i tabell 1. Analysen av D5 323-785 SEC-SAXS data visade en molekylvikt uppskattning (från en Porod analys) av 345 kDa jämfört med 338 kDa, observeras med hjälp IEC-SAXS. Båda är i överensstämmelse med den förväntade massan av 6 gånger 53,5 kDa (321 kDa) för en hexamer. Ab initio modellering av både dataset genomfördes utan införde symmetri (SEC-SAXS: χ 2 = 0,88, IEC-SAXS: χ 2 = 3,1) och med hjälp av C6 symmetri (SEC-SAXS: χ 2 = 1,0, IEC-SAXS : χ 2 = 4). Som de övergripande passar till uppgifter spridnings för både rekonstruktioner är jämförbara i båda fallen (figur 1D och E), kan antas C6 symmetri. Sålunda motsvarar modellen till en hexagonal konliknande struktur med en central kanal, som visas partiellt blockerade (SEC: Figur 1F; IEC: Figur 1H). En undersökning av enskilda modeller före medelvärdes visar att detta hinder är sannolikt en artefakt av medelvärdesprocessen.

Figur 1
Figur 1: SAXS dataanalys och jämförelse av D5 323 -785 (figur anpassad från Referenser 12 och 18). A) Schematisk domänstrukturen hos D5 protein och D5 323-785. B) Offline jonbyte kromatogram med angivande av de tre topparna. Orange kurva: Absorbans vid 280 nm (au), blå kurva: procentsats av buffert B. Procent av buffert B vid topparna anges. C) Online jonbyte kromatogram. Färgknapp som i B. Dessutom är den uppmätta intensiteten anges i grönt. Den experimentella spridnings kurva and beräknad kurva av modellen erhålls genom SEC-SAXS D) och IEC E) analys av data från D5 323-785. F) Bead modell D5 323-785 baserat på SEC data och G) IEC-data. H) överlagring av SEC och IEC-modeller. Panelerna i F) till H) skapades med en molekylär visualiseringsprogram 24. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Datainsamlings parametrar
Instrument: ESRF BM29
Våglängd (Å) 0,99
q-typ (a -1) 0,0032-0,49
Prov till detektor avstånd 2,864 m
Exponeringstid (sek) En per ram
koncentrationsområde na
Temperatur (K) 293
Detektor Pilatus 1M (Dectris)
Flux (fotoner / s) 1 × 10 12
Strålstorlek (^ m 2) 700 × 700
Strukturella parametrar för D5 323-785, SEC
I 0 (cm -1) [från Guinier] 0,0237
Rg (a) [från Guinier] 48
q min R g - q max R g används för Guinier 0,77-1,24
Dmax (Å) [från p (r)] 145
q-range som används för p (r) (Å -1) 0,02-0,17
Porod volym Vp (A 3) [från Scatter] (570 ± 5) × 10 3
Molekylmassa M r (kDa) [från Vp] 345
Beräknat mono Mr från sekvens (kd) 321
Strukturella parametrar för D5 323-785, IEC
I 0 (cm -1) [från Guinier] 0,386
Rg (a) [från Guinier] 46,5 ± 0,1
q min R g - q max R g används för Guinier 0,44-1,29
Dmax (Å) [från p (r)] 120
q-range som används för p (r) (Å -1) 0,03-0,18
Porod volym Vp (& #197; 3) [från Scatter] (577 ± 5) × 10 3
Molekylmassa M r (kDa) [från Vp] 339
Beräknat hexamer Mr från sekvens (kd) 321

Tabell 1: SAXS dataparametrar. Tabellen sammanfattar parametrar SAXS datainsamling och analys.

Discussion

För många makromolekyler, är ett slutligt reningssteg med hjälp av kromatografi krävs före SAXS datainsamling för att erhålla en god kvalitet datamängd. Men inte alla prover förblir stabilt; de kan vara benägna att aggregering eller återjämvikt till en blandning av oligomerisering tillstånd. Därför är ett slutligt nätet reningssteget på strålröret som krävs för att minimera tiden mellan rening och datainsamling för att erhålla SAXS uppgifter bäst kvalitet. Beroende på de biofysikaliska egenskaperna hos proteinet av intresse, kan SEC-SAXS eller IEC-SAXS väljas för att uppnå optimal provkvalitet. Här, på en proteinkonstruktion som härrör från helikas / primas D5 är båda teknikerna förklaras och diskuteras.

Förvärv av SEC-SAXS data blir mer och mer standardiserade och finns på många BioSAXS strålrör. Dataanalys, särskilt bakgrund subtraktion, är relativt enkelt och lätt. Men en stabil buffert signaloch tillräcklig separation av makromolekylära arter förblir avgörande. Därför är det viktigt att reservera tillräckligt med tid att jämvikta kolonnen noggrant. Misslyckande av denna metod kan vara på grund av ihållande föroreningar av liknande storlek till proteinet av intresse, låga koncentrationer, och strålningskänsliga buffertar.

I praktiken, initialt, är SEC-SAXS kan komma att användas som metod för valet för de flesta makromolekylära prover. Ändå många reningsprotokoll kräver en tidigare IEC steg på grund av förekomsten av föroreningar eller aggregering. Med tanke på att varje koncentration och kromatografi steg är förknippad med förluster av prov (uppskattningsvis 30-50%) och tid, är direkt IEC-SAXS fördelaktig. För prover som inte kan renas genom SEC, vare sig det beror på närvaron av liknande storlek "föroreningar" eller för att de allvarligt aggregat vid koncentrationer som krävs skulle IEC-SAXS alltid vara bättre lämpade strategi. Också, de högre flödeshastigheter som stödsav många IEC kolonner kan bidra till att minska överföringstiden mellan rening och mätning. I exemplet som presenteras här, var IEC används med en stegeluering, vilket möjliggör separation av de nära toppar av D5 323-785 från föroreningar genom att noggrant välja steg saltkoncentrationen. I princip är antalet steg obegränsad, men i praktiken är åtminstone ett steg per topp krävs, och inte alltför många bör väljas. För bakgrunden subtraktion metod som beskrivits ovan, är det mycket viktigt att mäta ett relativt högt antal olika buffertkompositioner i syfte att finna den matchande en.

En gemensam nackdel med båda teknikerna är bristen på exakt information proteinkoncentration. På grund av detta, är det inte möjligt exakt massbestämning baserad på framåtspridning. För globulära proteiner såsom D5 323-785 ger Porod volym ett alternativ, om än mindre exakt, massa uppskattning, men för mycket flexibla eller oordnade proteinerSkulle detta tillvägagångssätt inte vara giltig.

En variant av stegvis gradient IEC-SAXS metod som presenteras här är användningen av en linjär gradient i stället. Även om det är möjligt att arbeta med så många steg som önskas för att isolera under toppar med användning av en stegvis eluering, i linjär gradient tillvägagångssätt, krävs det för att optimera gradientförhållandena noggrant för att separera toppar helt före start av SAXS experimentera. Bakgrund subtraktion i denna strategi kan göras ram-wise och kunde kontrolleras genom att jämföra de enskilda bildrutor, men det kräver mer avancerad datahantering, och en särskild programvara inte finns ännu.

Valet av en lämplig kolonn är kritisk för båda teknikerna, eftersom den avgör separationen av de makromolekylära arter. Storlek-uteslutningskolonner skiljer sig i lastkapacitet, storleksordningen av avskiljbara makromolekyler, och upplösning, medan jonbytarkolonnerna varierar i slag och densitetenderas immobiliserade avgifter.

Medan det protokoll som presenteras här är specifika för ESRF beamline BM29, anpassning till någon annan SAXS beamline är i princip enkel. De viktigaste kraven är en tillräckligt hög röntgenflöde och en lämplig detektor (helst enkelfotonräknande), att förvärva rimliga signal-brusdata i området av sekunder eller mindre, och en online-kromatografisystem vätska med förmåga att skapa gradienter. Av det exakta genomförandet skulle, naturligtvis, att bero på den lokala beamline miljön.

De erhållna resultaten på D5 323-785 genom att använda de två metoderna skiljer sig något. Tröghetsradie är något mindre för IEC data än för SEC data och den lokala minima av spridningskurvan flyttas till något större spridnings vektorer. Detta innebär att D5 323-785 mätt med IEC-SAXS är något mer kompakt än D5 323-785 mätt med SEC-SAXS. Detta kan be på grund av skillnader i provberedning, i tiden mellan rening och mätning (IEC är snabbare), eller, mindre troligt, att en förorening i SEC-renade provet. Pärlan modeller erhållits helt oberoende med båda metoderna är jämförbara (figur 1H). D5 323-785 visar den förväntade ihåliga, hexamera strukturen 18.

Sammanfattningsvis nätet jonbyte och nätet storlek kromatografi är viktiga biokemiska reningsmetoder som kan kopplas direkt till SAXS 6,7,9-12,25,26. Bakgrunden subtraktion av IEC-SAXS data något svårare och tvetydig än för SEC-SAXS, men det är ändå möjligt. Beroende på de biofysikaliska egenskaperna hos proteinet av intresse, både SEC och IEC-SAXS möjliggöra optimering av arter separation med inneboende fördelar. Förutsatt att valideringssteg (såsom beskrivits) är korrekt observeras, kan resulterande data analyseras with förtroende och modeller kan bestämmas med hjälp av standardverktyg som finns i samhället. Tillsammans båda teknikerna tillåter nätet separation för ett brett spektrum av biologiska makromolekyler, vilket ger uppgifter inte är tillgängliga via standard statiska mätningar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,4-dithiothreitol [DTT] Euromedex EU0006-B
10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gel Biorad 4561033
2x Phusion Flash PCR Master Mix ThermoFisher scientific F 548
acetic acid glacial VWR Chemicals (BDH Prolabo) 20104.298
Agarose D-5 Euromedex LF45130653
Amicon Ultra -15 Centrifugal filters Ultracel -30K Millipore Ltd UFC903024
Ampicillin sodium salt Euromedex EU0400-D
Benzonase Novagene 70750-3
bromophenol blue  MERCK 8122
Complete protease inhibitor cocktail  Roche 11231400
Econo-Pac 10 DG Desalting column Bio-rad 732-2010
EDTA Sigma E-5134
Glycerol VWR Chemicals (BDH Prolabo) 24388.295
Glycine Euromedex 26-128-6405-C
HindIII Roche 656313
HisSelect HF Nickel Affinity Gel Sigma H0537
Hydrochloric acid (HCl) VWR Chemicals (BDH Prolabo) 20252.295
Imidazole AppliChem Panreac A1073,0500
InstantBlue Expedeon ISB1L
LB broth Miller Fluka Analytical L3152
MgCl2 ICN Biomedicals Inc. 191421
NaCl VWR Chemicals (BDH Prolabo) 27808.297
NcoI Fermentas ER0571
One Shot BL21 Star (DE3)  ThermoFisher scientific C6010-03
pProEx HTb vector  Addgene 10711018
Primer  Eurofins mwg operon
QIAprep Spin Miniprep kit QIAGEN 27106
QIAquick Gel extraction kit QIAGEN 28706
QIAquick PCR purification kid QIAGEN 28106
SDS  Sigma 75746
Superose 6 10/300 GL GE Healthcare 17-5172-01
SYBR Safe DNA gel stain Invitrogen life technology S33102
T4 ligase ThermoFisher scientific EL0011
TEV home made
TOP 10 Invitrogen life technology C404003 
Tris base Euromedex 26-128-3094-B
Uno Q 1R column  Bio-rad 720 0011
β-mercaptoethanol MPBiomedicals, LLC 194834
Name Company Catalog Number Comments
Softwares
Beamline control software BsXCuBE ESRF Pernot et al. (2013), J. Synchrotron Rad. 20, 660-664 local development
Camserver software Dectris n.a. detector control software
DAMAVER ATSAS 2.6.0 http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html program to align ab initio models 
DAMMIF ATSAS 2.6.0 http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html ab initio model reconstruction program
HPLC program Biologic Duo Flow Bio-rad
HPLC program LabSolutions Shimadzu n.a.
ISPyB ESRF De Maria Antolinos et al. (2015). Acta Cryst. D71, 76-85. local development
PRIMUS ATSAS 2.6.0 http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html program, which performs the manipulation with experimental SAXS
PyMOL DeLano Scientific LLC https://www.pymol.org/ software for visualization
SUPCOMB ATSAS 2.6.0 http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html program to superimpose 3D structures
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
BioLogic Duo Flow Biorad
BioLogic Biofrac Fraction collector Biorad
HPLC system Shimadzu
Labsonic P Sartorius Stedim biotech BBI8535108

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Graewert, M. A., Svergun, D. I. Impact and progress in small and wide angle X-ray scattering (SAXS and WAXS). Curr. Opin. Struct. Biol. 23, 748-754 (2013).
  2. Jacques, D. A., Trewhella, J. Small-angle scattering for structural biology-Expanding the frontier while avoiding the pitfalls. Protein Sci. 19, 642-657 (2010).
  3. Kikhney, A. G., Svergun, D. I. A practical guide to small angle X-ray scattering (SAXS) of flexible and intrinsically disordered proteins. FEBS Lett. 589, 2570-2577 (2015).
  4. Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution. Q. Rev. Biophys. 40, 191-285 (2007).
  5. Vestergaard, B. Analysis of biostructural changes, dynamics, and interactions - Small-angle X-ray scattering to the rescue. Arch. Biochem. Biophys. (2016).
  6. David, G., Pérez, J. Combined sampler robot and high-performance liquid chromatography: a fully automated system for biological small-angle X-ray scattering experiments at the Synchrotron SOLEIL SWING beamline. J. Appl. Crystallogr. 42, 892-900 (2009).
  7. Graewert, M. A., et al. Automated Pipeline for Purification, Biophysical and X-Ray Analysis of Biomacromolecular Solutions. Sci. Rep. 5, (2015).
  8. Lambright, D., et al. Complementary techniques enhance the quality and scope of information obtained from SAXS. ACA Trans. 1-12 (2013).
  9. Mathew, E., Mirza, A., Menhart, N. Liquid-chromatography-coupled SAXS for accurate sizing of aggregating proteins. J. Synchrotron Radiat. 11, 314-318 (2004).
  10. Round, A., et al. Determination of the GH3. 12 protein conformation through HPLC-integrated SAXS measurements combined with X-ray crystallography. Acta Crystallogr. Sect. D. Biol. Crystallogr. 69, 2072-2080 (2013).
  11. Watanabe, Y., Inoko, Y. Size-exclusion chromatography combined with small-angle X-ray scattering optics. J. Chromatogr. 1216, 7461-7465 (2009).
  12. Hutin, S., Brennich, M. E., Maillot, B., Round, A. Online ion-exchange chromatography for small angle X-ray scattering. Acta Cryst. (2016).
  13. Selkirk, C. Ion-exchange chromatography. Protein Purification Protocols. 125-131 (2004).
  14. Yigzaw, Y., Hinckley, P., Hewig, A., Vedantham, G. Ion exchange chromatography of proteins and clearance of aggregates. Curr. Pharm. Biotechnol. 10, 421-426 (2009).
  15. Pernot, P., et al. Upgraded ESRF BM29 beamline for SAXS on macromolecules in solution. J. Synchrotron Radiat. 20, 660-664 (2013).
  16. Iyer, L. M., Koonin, E. V., Leipe, D. D., Aravind, L. Origin and evolution of the archaeo-eukaryotic primase superfamily and related palm-domain proteins: structural insights and new members. Nucleic Acids Res. 33, 3875-3896 (2005).
  17. Singleton, M. R., Dillingham, M. S., Wigley, D. B. Structure and mechanism of helicases and nucleic acid translocases. Annu. Rev. Biochem. 76, 23-50 (2007).
  18. Hutin, S., et al. Domain organization of vaccinia virus helicase-primase D5. J. Virol. 4604-4613 (2016).
  19. Round, A., et al. BioSAXS Sample Changer: a robotic sample changer for rapid and reliable high-throughput X-ray solution scattering experiments. Acta Crystallogr. Sect. D. Biol. Crystallogr. 71, 67-75 (2015).
  20. De Maria Antolinos, A., et al. ISPyB for BioSAXS, the gateway to user autonomy in solution scattering experiments. Acta Crystallographica Section D. 71, 76-85 (2015).
  21. Brennich, M. E., et al. Online data analysis at the ESRF bioSAXS beamline, BM29. J. Appl. Crystallogr. 49, (2016).
  22. Petoukhov, M. V., Konarev, P. V., Kikhney, A. G., Svergun, D. I. ATSAS 2.1-towards automated and web-supported small-angle scattering data analysis. J. Appl. Crystallogr. 40, 223-228 (2007).
  23. Franke, D., Jeffries, C. M., Svergun, D. I. Correlation Map, a goodness-of-fit test for one-dimensional X-ray scattering spectra. Nat. Methods. 12, 419-422 (2015).
  24. Schrodinger, LLC. The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8. (2015).
  25. Jensen, M. H., et al. Time-resolved SAXS measurements facilitated by online HPLC buffer exchange. J. Synchrotron Radiat. 17, 769-773 (2010).
  26. Hynson, R. M., Duff, A. P., Kirby, N., Mudie, S., Lee, L. Differential ultracentrifugation coupled to small-angle X-ray scattering on macromolecular complexes. J. Appl. Crystallogr. 48, 769-775 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics