الببتيد المستمدة من طريقة لنقل الجينات والبروتينات عبر الخلوي والحواجز Organellar في النباتات

Genetics
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Chuah, J. A., Horii, Y., Numata, K. Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants. J. Vis. Exp. (118), e54972, doi:10.3791/54972 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

1. إعداد صياغات الببتيد القائم على

  1. إعداد حلول الأوراق المالية من كل الببتيد على النحو التالي: (KH) 9 -BP100 (1 ملغ / مل أو 800 نانومتر)، Cytcox- (KH) 9 (1 ملغ / مل)، BP100 (1 ملغ / مل) و (BP100) 2 K 8 (70 ميكرومتر). وزن الكمية المطلوبة من كل الببتيد في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل ويضاف الماء عالى النقاء تعقيمها حل الببتيد. تخلط جيدا من قبل pipetting المتكررة حتى يتم الحصول على حل واضح.
  2. تضخيم وتنقية DNA البلازميد (PDNA)، الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل (dsDNA) و RNA المزدوج تقطعت بهم السبل (الرنا المزدوج الجديلة) وفقا لمنهجيات الجزيئية القياسية. في 1.5 مل أنابيب microcentrifuge، وجعل الحلول الأسهم مع تركيز 1 ملغ / مل (PDNA وdsDNA) أو 400 نانومتر (الرنا المزدوج الجديلة).
  3. إعداد محلول المخزون البروتين مع تركيز 7 ميكرومتر، عن طريق إذابة 1 ملغ من البروتين (على سبيل المثال، الكحول نازعة، ADH) مسحوق في 1 مل من محلول كربونات الصوديوم (0.1 م، ودرجة الحموضة 9). تسمية البروتين مع fتحقيقات luorescent مثل رودامين B (رهب) وفقا لبروتوكولات موحدة لتمكين التصور المجهري للبروتين تسليمها إلى الخلايا.
  4. الجمع بين مكونات كل منها في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل.
    1. لتركيبات الببتيد PDNA تستهدف السيتوبلازم، إضافة 6.4 ميكرولتر من (KH) 9 -BP100 (1 ملغ / مل) إلى 20 ميكرولتر من PDNA (1 ملغ / مل)، وتخلط جيدا من قبل pipetting. يسمح هذا المزيج على استقرار لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة 25 درجة مئوية. إضافة 773.6 ميكرولتر من الماء عالى النقاء تعقيمها لتمييع الحل إلى الحجم النهائي من 800 ميكرولتر. استخدام بناء PDNA مصممة للتعبير النووي (P35S-RLuc-TNOS، الجدول 1).
    2. لتركيبات الببتيد PDNA تستهدف الميتوكوندريا، إضافة 6.6 ميكرولتر من Cytcox- (KH) 9 (1 ملغ / مل) إلى 20 ميكرولتر من PDNA (1 ملغ / مل)، وتخلط جيدا من قبل pipetting. يسمح هذا المزيج على استقرار لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة 25 مئوية ثم قم بإضافة 2.4 ميكرولتر من BP100 (1 ملغ / مل). يسمح هذا المزيج على استقرار لمدة 15 دقيقة في 256؛ مئوية لمدة 15 دقيقة أخرى. إضافة 771 ميكرولتر من الماء عالى النقاء تعقيمها لتمييع الحل إلى الحجم النهائي من 800 ميكرولتر. استخدام بناء PDNA مصممة للتعبير الميتوكوندريا (pDONR-COX2: rluc، الجدول 1).
    3. لتركيبات الببتيد لمكافحة dsDNA، إضافة 5.1 ميكرولتر من (KH) 9 -BP100 (1 ملغ / مل) إلى 8 ميكرولتر من dsDNA (1 ملغ / مل)، وتخلط جيدا من قبل pipetting. يسمح هذا المزيج على استقرار لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة 25 درجة مئوية. إضافة 786.9 ميكرولتر من الماء عالى النقاء تعقيمها لتمييع الحل إلى الحجم النهائي من 800 ميكرولتر.
    4. لتركيبات الببتيد الرنا المزدوج الجديلة، إضافة 50 ميكرولتر من (KH) 9 -BP100 (800 نيوتن متر) إلى 50 ميكرولتر من الرنا المزدوج الجديلة (400 نيوتن متر) وتخلط جيدا من قبل pipetting. يسمح هذا المزيج على استقرار لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة 25 درجة مئوية. إضافة 700 ميكرولتر من ريبونوكلياز خالية من المياه لتمييع الحل إلى الحجم النهائي من 800 ميكرولتر.
    5. لتركيبات الببتيد من البروتين، إضافة 16 ميكرولتر من (BP100) 2 ك 8 (70 ميكرومتر) إلى 16 ميكرولتر من ADH (7 ميكرون) وتخلطكذلك من قبل pipetting. يسمح هذا المزيج على استقرار لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة 25 درجة مئوية. إضافة 768 ميكرولتر من الماء عالى النقاء تعقيمها لتمييع الحل إلى الحجم النهائي من 800 ميكرولتر.
  5. السماح للتركيبات لتحقيق الاستقرار لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة 25 درجة مئوية.

2. توصيف تركيبات الببتيد القائم على

  1. نقل كل حل (800 ميكرولتر) في كفيت لتحليل ديناميكية تشتت الضوء (DLS). تحديد القطر والتشتت المتعدد مؤشر الهيدروديناميكية المجمعات شكلت مع nanosizer زيتا، وذلك باستخدام 633 نانومتر وني الليزر عند 25 درجة مئوية مع زاوية الكشف ارتدادي من 173 درجة.
  2. وبعد قياسات حجم، ونقل كل حل (800 ميكرولتر) في خلية الشعرية مطوية لقياس المحتملة زيتا في المعلمات الافتراضية ثابت العزل الكهربائي، معامل الانكسار واللزوجة من الماء عند 25 درجة مئوية.
  3. مراقبة كمية صغيرة من حل معقد، وتستخدم لتحليل دائرة الأراضي والمساحة، من خلال مجهر القوة الذرية (AFM). إيداع 10 ميكرولتر من حل معقد على سطح المشقوق تتعرض حديثا من ورقة الميكا وترك الميكا في الهواء بين عشية وضحاها الجافة في طبق بتري بلاستيكية مغطاة.
  4. الحصول على صورة من المجمعات في الهواء عند درجة حرارة 25 درجة مئوية باستخدام ناتئ السيليكون مع ثابت ربيع 1.3 نيوتن / متر في الوضع 27،28 التنصت.

3. تسلل أوراق النبات

  1. استخدام 3 أسابيع النباتات التي تزرع في التربة القديمة (نبات الأرابيدوبسيس thaliana 24، النيكوتين benthamiana 24 أو الحور 26). Transfect لا يقل عن 3 أوراق لتكون بمثابة ثلاث نسخ لتقدير حجم التعبير الجيني أو تسليم البروتين.
  2. تحميل 1 مل حقنة بلاستيكية needleless مع 100 ميكرولتر من حل معقد للترنسفكأيشن من ورقة واحدة. ضع غيض من حقنة على سطح مجافي المحور من ورقة.
  3. اضغط على طرف الحقنة ضد ورقة قليلا وتضغط على المكبس حقنة ببطء بينما تمارس الضغط مواجهة مع طإصبع ndex اليد من مادة اللاتكس القفاز من الجانب الآخر. تسلل ناجحة ويمكن ملاحظة مثل انتشار منطقة غارقة في الماء في ورقة. تسمية أوراق تسلل لسهولة تحديد الهوية.
  4. احتضان ورقة transfected لفترات الأمثل التالية تسلل مع الببتيد PDNA (12 ساعة)، الببتيد لمكافحة dsDNA (12 ساعة)، الببتيد الرنا المزدوج الجديلة - مستحضرات (9 48 ساعة)، والببتيد بروتين (6 ساعات) وفقا للشروط التالية: 16 ساعة ضوء / 8 ساعات الظلام في 22 درجة مئوية لمدة A. thaliana والحور، أو 24 ساعة ضوء ثابت في 29 درجة مئوية لمدة benthamiana N..

4. تقييم كفاءة ترنسفكأيشن

  1. استئصال كله transfected أوراق النباتات الصغيرة (على سبيل المثال.، A. thaliana) أو قسم 1 سم 2 من منطقة تسلل للنباتات الكبيرة (على سبيل المثال، N. benthamiana).
  2. للتجارب ترنسفكأيشن باستخدام Renilla وسيفيراز (Rluc) ناقلات مراسل، وتحديد transfectioكفاءة ن كميا باستخدام أدوات Rluc الفحص.
    1. وضع كل ورقة رفعه أو قسم ورقة في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. إضافة 100 ميكرولتر من 1 × Rluc الفحص الاحتياطي تحلل في أنبوب. بنفس الطريقة، وإعداد لست] من الأوراق السيطرة غير transfected (ثلاث نسخ).
    2. طحن ورقة باستخدام مدقة التجانس واحتضان المحللة الناتجة عند 25 درجة مئوية لمدة 6-10 ساعة.
    3. الطرد المركزي المحللة في 12470 × ز في microcentrifuge لمدة 1 دقيقة. نقل 20 ميكرولتر من المحللة تطهيرها من بئر في صفيحة 96-جيدا، واستخدام حجم المتبقية لتحديد مقدار تركيز البروتين الكلي باستخدام الفحص كيت BCA البروتين وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
    4. إضافة 100 ميكرولتر من 1 × Rluc الفحص الركيزة (مخفف باستخدام العازلة Rluc الفحص) في البئر ومزيج من قبل pipetting بطيئة. وضع صفيحة في قارئ صفيحة المتعدد والشروع في القياس.
    5. طرح التلألؤ الخلفية (يعني من لاثلاث نسخ) من التلألؤ كل عينة التجريبية التي استمرت transfected ن. حساب نسبة من معان ضوئي (وحدات الخفيفة النسبية، RLU) لكمية من البروتين (ملغ).
  3. للتجارب ترنسفكأيشن باستخدام الأخضر بروتين فلوري (GFP) ناقلات مراسل أو البروتين fluorescently المسمى (على سبيل المثال، ADH-رهب)، ومراقبة مضان باستخدام متحد البؤر مجهر المسح بالليزر.
    1. قطع حواف ورقة كاملة (للمساعدة في إزالة الفراغات الهوائية)، في حين أن ورقة مقطوع يمكن استخدامها كما هي. إزالة المكبس من حقنة 10 مل ووضع كل ورقة أو ورقة القسم رفعه في المحقنة.
    2. استبدال الغطاس ودفعها برفق إلى أسفل الحقنة دون سحق ورقة. سحب المياه في حقنة حتى يتم ما يقرب من نصف ملأها.
    3. نشير حقنة صعودا ودفع في المكبس لإزالة الهواء من الحقنة من خلال طرف. تغطية غيض من حقنة وسحب المكبس ببطء لطرد الهواء من مرجةF. كرر هذه العملية عدة مرات حتى تظهر ورقة شفافة.
    4. تغطي سطح شريحة المجهر مع شريط لاصق. قطع مساحة مربعة على الشريط كبيرة بما يكفي لاستيعاب العينة ورقة باستخدام شفرة، وقشر قطعة مربعة من الشريط قبالة مع ملقط لإنشاء غرفة العينة. فإن الشريط بمثابة فاصل بين الشرائح وساترة.
    5. وضع ورقة في غرفة مع سطح مجافي المحور تواجه التصاعدي وملء منطقة الغرفة المتبقية مع الماء. ختم ورقة داخل الغرفة مع ساترة الزجاج وتأمين حواف ساترة مع شريط لاصق.
    6. فحص العينة ورقة باستخدام متحد البؤر مجهر المسح الضوئي ليزر تحت هدف 40X أو الهدف الغمر 63X المياه. GFP أو رهب مضان يمكن تصور في موجات الإثارة من 488 نانومتر أو 555 نانومتر، على التوالي.

Representative Results

أدخلت مجموعة من الشحنات الأحماض والبروتينات النووية بنجاح في النباتات المختلفة باستخدام الببتيدات التي صممت لناقلات التسليم. أدت التفاعلات كهرباء بين الببتيدات الموجبة والشحنات السالبة في تشكيل المجمعات ترنسفكأيشن التي يمكن أن تسلل مباشرة إلى أوراق النبات باستخدام حقنة needleless (الشكل 1). وترد الصيغ الأمثل (تحدد تجريبيا في هذه الدراسات 21،23-26) لترنسفكأيشن من الخلايا النباتية في الجدول رقم 1، حيث يتم تمثيل كل نوع من مجموعة واسعة من البضائع تسليمها (PDNA، dsDNA، الرنا المزدوج الجديلة والبروتين). وكانت قطر يعني من كل الصيغ القائمة على الببتيد في نطاق تقريبي من 150-300 نانومتر. واستنادا إلى تحليل دائرة الأراضي والمساحة، عرض جميع التركيبات polydispersities حجم منخفضة نسبيا، مشيرا الى ان المجاميع الببتيد البضائع شكلت لديها توزيع حجم موحد. والأشكال التضاريسية منالمجمعات بين الببتيد وPDNA (الشكل 2A) أو البروتين (الشكل 2B)، على الميكا، تم تصوير كتبها فؤاد. وقد لوحظت المجمعات كروية متجانسة لكل من تركيبات الببتيد PDNA والببتيد من البروتين، وذلك بالاتفاق مع البيانات من القياسات DLS. من حيث إمكانات زيتا من المجمعات (الجدول 1)، وكان pDNA- والمجمعات المستمدة dsDNA صافي الرسوم سطح السلبي في حين أن المجمعات القائمة على الرنا المزدوج الجديلة تهمة سطح شبه محايدة. المجمعات الببتيد من البروتين، من جهة أخرى، وجهت بشكل إيجابي.

تم تقييم كفاءات الببتيد PDNA وتركيبات الببتيد لمكافحة dsDNA في التوسط في ترنسفكأيشن من A. thaliana أو benthamiana N. كما نظم مصنع نموذج كمي ونوعي. كان يعمل في RLuc التعبير الجيني فحص لتقدير مستويات التعبير الجيني (الجدول 1)، لذلك، لهذا PDNA التجربة أوdsDNA ترميز الجين RLuc يجب أن تستخدم لcomplexation مع الببتيدات الناقل منهما. باستخدام (KH) 9 -BP100 / صياغة PDNA، والتسليم المستهدفة النووية والتعبير عن PDNA لا يمكن أن يتحقق، وبعد فترة حضانة من 12 ساعة، مع RLU / قيمة ملغ يقدر حوالي 1 × 10 5. للتسليم استهداف الميتوكوندريا والتعبير عن PDNA، وهو مزيج من الببتيدات، Cytcox- (KH) 9 و BP100، مطلوب لتكوين معقد. مع نفس فترة حضانة الأمثل من 12 ساعة، ولكن تم تحقيق مستوى أدنى بكثير من ترنسفكأيشن (حوالي 1 × 10 3 RLU / ملغ). وفي الوقت نفسه، كان مطلوبا الفترة المماثلة الحضانة (12 ساعة)، ومستوى التعبير الجيني (حوالي 1 × 10 3 RLU / ملغ) / سجلت للمجمعات تستند dsDNA، كما وضعت باستخدام (KH) 9 -BP100 الببتيد. وأجريت تقييمات نوعية في التعبير الجيني من خلال الملاحظة المجهرية المباشرة للأوراق تعامل مع prepar المجمعاتإد باستخدام PDNA أو dsDNA ترميز الجين مراسل GFP. في الخلايا transfected مع المجمعات غير المستهدفة الببتيد PDNA، ونشر مخضر المقابلة مع لوحظ التعبير GFP بشكل واضح وجدت في توطين في العصارة الخلوية (الشكل 3A). كانت اختلافات واضحة في نمط توطين مضان GFP اضحة في خلايا تسلل مع المجمعات الببتيد PDNA استهداف الميتوكوندريا. هنا، كان مخضر منقط أن colocalize مع وصمة عار الميتوكوندريا واضحة، مما يؤكد خصوصية التعبير الجيني حصرا في حجرة الميتوكوندريا من الخلايا (الشكل 3B).

في حالة تركيبات الببتيد من البروتين، وتصريف البضائع البروتين (ADH) إلى fluorophore (رهب) تمكين التصور من البروتين تسليمها في حجرة داخل الخلايا. في غضون فترة حضانة قصيرة من 6 ساعات، تم العثور على بروتين ADH-رهب (الأزرق) ليتم توزيعها في جميع أنحاءالعصارة الخلوية وفجوة من الخلايا تسلل (الشكل 3C). وفي الوقت نفسه، يمكن أن يتحقق أسفل اللائحة السريع والفعال للتعبير الجينات في النباتات المختلفة باستخدام تركيبات الببتيد الرنا المزدوج الجديلة. في التجربة الأولى، تم اختراق ورقة A. thaliana مع الببتيد الرنا المزدوج الجديلة مجمعات لإسكات الجينات كالكون سينسيز (كلية العلوم الصحية) مسؤولة عن الأنثوسيانين (الصبغة الحمراء) الحيوي في ظل ظروف الجفاف. الفرق في مظهر A. thaliana يترك تحت العادي (الشكل 3D، أ) وظروف الجفاف (الشكل 3D، ب) تقدم وسيلة سهلة لتقييم كلية العلوم الصحية إسكات باستخدام صياغة الببتيد الرنا المزدوج الجديلة الأمثل (السهم 1 يشير إلى المنطقة تسلل). في التجربة الثانية، تم اختراق المجمعات الببتيد الرنا المزدوج الجديلة في أوراق المعدلة وراثيا A. thaliana التعبير عن بروتين فلوري أصفر (YFP). يمكن أن ينظر إلى انخفاض واضح في التعبير YFP في خلايا البشرة 9 ساعة صمعاهدة الفضاء الخارجي ترنسفكأيشن (الشكل 3E، F). تم التحقق من فعالية صياغة في التعبير الجيني الذي ينظم عليها في نظام النباتية المختلفة (الحور، 12 ساعة بعد ترنسفكأيشن) أيضا (الشكل الجيل الثالث 3G، H).

شكل 1
الشكل 1: صياغات استنادا الببتيد من أجل تسليم الأحماض النووية والبضائع البروتين في النباتات الحية.
تتكون الببتيدات الناقل مصممة من polycations مترافق إلى اختراق الخلية أو تسلسل عبور organellar. Polycations تمكن ملزمة و / أو التكثيف من البضائع المشحونة سلبا وكذلك الهروب من مقصورة endosomal التالية استيعاب داخل الخلايا. وتوسطت تسليم البضائع إلى داخل الخلايا وبالتالي إلى العضيات المحددة من قبل خلية اختراق تسلسل وتسلسل عبور organellar، على التوالي. الشحنات المختلفة التي يمكن أن تكون ناجحهسلمت LLY في المصنع تشمل الأحماض النووية مثل PDNA، dsDNA والرنا المزدوج الجديلة، وكذلك البروتينات نموذج مثل زلال المصل البقري (BSA)، نازعة الكحول (ADH) والسترين (البديل من البروتين الفلوري أصفر). الجزيئات النشطة بيولوجيا قادرة على شكل مجمعات ترنسفكأيشن مع تقارن الببتيد عبر التفاعلات كهرباء، والتي يتم تقديمها في أوراق النبات عن طريق التسلل حقنة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: الأشكال التضاريسية من تركيبات استنادا الببتيد.
(A) AFM السعة صورة (KH) 9 -BP100 صياغة / PDNA في N / P 0.5. (ب) صورة ارتفاع AFM من (BP100) 2 ك 8 صياغة / ADH في راتي الرحىس 10. مستنسخة بإذن من مصادر منشورة 23،24. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل (3): مجهرية تقييم ترنسفكأيشن الكفاءة باستخدام محسن صياغات القائم على الببتيد.
(A) عصاري خلوي GFP التعبير (الأخضر)، والتمييز بوضوح بين تألق ذاتي بلاستيدات الخضراء (الأحمر)، لوحظ في خلايا نسيج الورقة المتوسط الاسفنجية من A. thaliana يترك تسللوا مع (KH) 9 صياغة -BP100 / PDNA (N / P 0.5 و 12 ساعة ). تم الكشف عن (B) التعبير GFP (الأخضر) في الميتوكوندريا (الحمراء) في خلايا البشرة من أوراق A. thaliana تسلل مع Cytcox- (KH) 9 / BP100 / صياغة PDNA (N / P 0.5 لكل ببتيده؛ 12 ساعة). وأظهرت صور مكبرة من الميتوكوندريا مع التعبير GFP في لوحة اليمينية المتطرفة. (ج) تسليم ADH-رهب (الأزرق) إلى خلايا نسيج الورقة المتوسط الاسفنجية من A. thaliana يترك بوساطة (BP100) 2 ك 8 في نسبة الرحى الببتيد / البروتين من 10، تصور 6 ساعة بعد تسلل. (D) ورقة A. thaliana قبل (أ) وبعد (ب) العلاج (KH) 9 -BP100 / صياغة الرنا المزدوج الجديلة (نسبة المولي 2 و 48 ساعة)، والتي أسفرت عن قمع المسار الحيوي الأنثوسيان. وقد تسلل صيغة مشابهة تحتوي على GFP5 الرنا المزدوج الجديلة في ورقة عن السيطرة السلبية (ج). سهام 1 و 3 تشير إلى منطقة مخترقة بينما السهام 2 و 4 تشير إلى منطقة غير مخترقة داخل ورقة. (E) A. thaliana يترك التعبير عن بروتين أصفر فلوري (YFP) و (F) وتقلص مضان YFP التالية تسلل مع (KH) 9 -BP100 / صياغة الرنا المزدوج الجديلة (نسبة المولي 2، 9 ساعة). (G) أوراق الحور المعدلة وراثيا التعبير عن بروتين أصفر فلوري (YFP) و (H) وتقلص YFP مضان بعد تسلل مع (KH) 9 صياغة -BP100 / الرنا المزدوج الجديلة (نسبة المولي 2 و 12 ساعة). مستنسخة بإذن من مصادر منشورة 21،23،24،26. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل (4): الاختلاف في الببتيد إلى الحمض النووي (N / P) نسبة وتأثير على خصائص البيوفيزيائية من المجمعات.
مع زيادة الببتيد إلى نسبة الحمض النووي، وانخفاض الصيغ القائمة على الببتيد في الحجم في حين-زيتا المحتملة القيم الانتقال من السلبية إلى الإيجابية./files/ftp_upload/54972/54972fig4large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1
الجدول 1: توصيف وتقييم الصيغ المختلفة على أساس الببتيد. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الجدول.

الجدول 2
الجدول 2: مقارنة بين القائمة تقنيات الحمض النووي تسليم المستندة إلى الببتيد وغيرها من النباتات السليمة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الجدول.

Discussion

وتناقش الخطوات الحاسمة في البروتوكول الذي تم التعرف تجريبيا. تسلل حقنة، وعرض الصيغ القائمة على الببتيد في الأجواء داخل أوراق النبات من خلال الثغور. لضمان امتصاص القصوى من الحل، يجب إجراء عملية تسلل خارجا عندما النباتات تحت ظروف تؤدي إلى فتح الثغور أي.، مع توفير ما يكفي من المياه وذلك خلال الفترة الخفيفة. وفيما يتعلق إعداد مجمعات ترنسفكأيشن، لتركيبات التي تنطوي على مزيج من اثنين من الببتيدات (لاستهداف الميتوكوندريا تسليم DNA)، وتسلسل لإضافة كل عنصر بالغ الأهمية، وينبغي ألا مقلوب.

هناك العديد من التعديلات معقولة لهذا الإجراء. خيار آخر للتسلل خلايا النبات هو استخدام تسلل الفراغ، التي هي قادرة على تقديم حل معقد إلى النباتات الكاملة و / أو الأنسجة جزئية بما في ذلكالخلايا الإنشائية قمي. لهذا الإجراء البديل، وغرقت الشتلات في حل ترنسفكأيشن، وبناء على ضغط الناتجة عن الفراغ، وأجبرت المجمعات الببتيد البضائع عبر الثغور وفي الخلايا النباتية (Yoshizumi، T.، بيانات غير منشورة).

التعبير الجيني عابرة، بناء على الدراسات التي تستخدم الخلايا الحيوانية، وقد تبين لزيادة مع ارتفاع تركيز الحمض النووي 29-31. من المهم أن نلاحظ أن نسبة الببتيد إلى الحمض النووي يؤثر على الخصائص الفيزيائية الحيوية (الحجم، وتهمة السطحية) من المجمعات (الشكل 4)، الأمر الذي يؤثر كفاءة ترنسفكأيشن. وبالتالي، يجب على النسبة المثلى أن يستمر حتى مع زيادة تركيز الحمض النووي.

واحدة من المزايا الرئيسية في استخدام الببتيدات كعامل توصيل الجينات / البروتين هو أن تسلسله هو قابل للضبط على الوفاء الوظيفة المطلوبة. على سبيل المثال، المجال استهداف الميتوكوندريا من الببتيد الناقل وصفها في هذا مسمارذ يمكن استبدالها مع تسلسل chloroplastic أو استهداف peroxisomal لتوطين هذه العضيات. في حين تحول بلاستيدات الخضراء ممكن في العديد من المصانع التي تستخدم biolistics 32-34، يمكن أن أيا من الأجرعية ولا طريقة biolistic إدخال جينات وراثية في الميتوكوندريا أو عضيات أخرى إلى جانب النواة (الجدول 2).

لا توجد قيود المضيف مجموعة جامدة لترنسفكأيشن القائم على الببتيد، على عكس طريقة المستندة الأجرعية (الجدول 2). وحتى الآن، تركيبات لترنسفكأيشن من A. thaliana، N. benthamiana والحور وقد تم تحسين (الجدول 1)، ولكن يمكن أيضا أن تطبق أسلوب النيكوتين تبغ، نباتات الطماطم الصغيرة توم والأرز (على أساس التجارب الأولية)، وغيرها من النباتات أحادية وذوات الفلقتين.

حتى الآن، ليس هناك قيود معروفة في حجم التحوير عند استخدام الببتيدات لناقلات الصورة ترنسفكأيشن. في المقابل، تم العثور على جزيئات الحمض النووي كبيرة للحد من كفاءة تحويل الأجرعية طرق بوساطة 35،36، والحد الأقصى لحجم العلوي لالجينات المحورة ما يقرب من 200 كيلو بايت تم الإبلاغ 37-39. باستخدام biolistics، من ناحية أخرى، قد تكون المنفصمة شظايا الحمض النووي كبيرة أثناء إعداد أو تسليم في النباتات 38. على الرغم من عدم الحد الأعلى وقد تم تحديد التحول biolistic حتى الآن، تم العثور على القيود المادية لتقييد حجم الحمض النووي التي يمكن نقلها إلى أقل بكثير من 150 كيلو بايت 40. الفوائد الرئيسية لاستخدام النظام القائم على الببتيد لنقل الجينات بالمقارنة مع النهج القائمة توظيف إما الأجرعية أو قصف microprojectile، التي نوقشت أعلاه، وتتلخص في الجدول 2.

وجود عدد قليل من القيود لهذا الأسلوب كما هو عليه. أولا، تستهدف تقديم PDNA إلى العضيات محددة، مثل معهد ماساتشوستس للتكنولوجياochondria، وقد ثبت ذلك ممكنا من خلال مزيج بسيط من، متواليات اختراق الخلية وعضية العبور ملزم الحمض النووي على الرغم من أن الكفاءة كانت منخفضة. يمكن أن يتم الكشف عن التعبير التحوير، من خلال الفحص المجهري متحد البؤر، إلا في عدد قليل من السكان الميتوكوندريا في الخلايا. وبالتالي، هي مزيد من التعديلات اللازمة ل: (ط) تعزيز النبات من أكثر المجمعات عبر الخلية / غشاء organellar، و (ب) تحسين التفكك ونقل PDNA من الببتيد الناقل في العضية المستهدفة للتعبير. ثانيا، وذلك باستخدام هذا النظام تسليم الحمض النووي، وقد تحقق التعبير عابرة من الجينات مراسل خارجية بنجاح في مقصورة عصاري خلوي والميتوكوندريا من الخلايا. لم يثبت التأسيس مستقر والتعبير عن الجينات التي أدخلت في محطة نووية / الجينوم organellar بعد، ولكن نظرا لعدم وجود استراتيجيات اختيار مناسبة.

ومع التسليم بأن هناك مجالات للتحسين أو مزيد من دevelopment، الاستراتيجية المستمدة من الببتيد هو موضح هنا تبقى تقنية بسيطة وتنوعا الذي مهد الطريق لتسليم البضائع المختلفة إلى أنواع النباتات المتنوعة.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

فإن الكتاب أن نعترف بتمويل من اليابان العلوم واستكشافية بحوث التكنولوجيا وكالة للتكنولوجيا المتقدمة (JST-ايراتو)، والطاقة الجديدة والتكنولوجيا الصناعية منظمة التنمية (نيدو)، وبرنامج تعزيز الابتكار الاستراتيجي عبر الوزاري (SIP)، اليابان .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(KH)9-BP100 peptide Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute N/A Sequence: KHKHKHKHKHKHKHKH-
KHKKLFKKILKYL
(BP100)2-K8 peptide Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute N/A Sequence: KKLFKKILKYLKKLFKKIL-
KYLKKKKKKKK
BP100 peptide Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute N/A Sequence: KKLFKKILKYL
Cytcox-(KH)9 peptide Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute N/A Sequence: MLSLRQSIRFFKKHKHKH-
KHKHKHKHKHKH
P35S-GFP(S65T)-TNOS and P35S-RLuc-TNOS N/A N/A Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of CaMV 35S constitutive promoter (Ref: Lakshmanan et al. Biomacromolecules 2013, 14, 10)
pDONR-cox2:gfp and pDONR-cox2:rluc N/A N/A Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of cox2 mitochondrial-specific promoter (Ref: Chuah et al. Sci Rep 2015, 5, 7751)
dsDNA (PCR-amplified from pBI221-P35S-Rluc-TNOS) N/A N/A Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of CaMV 35S constitutive promoter (Ref: Lakshmanan et al. Plant Biotechnol 2015, 32, 39)
GFP5 siRNA N/A N/A For RNA interference-mediated silencing of green fluorescent protein (Ref: Numata et al. Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027)
CHS siRNA N/A N/A For RNA interference-mediated silencing of chalcone synthase (Ref: Numata et al Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027)
1 ml and 10 ml Plastic Syringes TERUMO Corporation SS-01T, SS-10ESZ
1.5 ml Microcentrifuge Tube AS ONE Corporation 151212
96-Well Flat-Bottom Plate Asahi Glass Co., Ltd. 3860-096
Adhesive Tape Sekisui Chemical Co., Ltd. No. 835
Alcohol Dehydrogenase Sigma-Aldrich Co., LLC. A-7011
Atomic Force Microscope Seiko Instruments Inc. SPI3800, SPA 300HV
Atomic Force Microscope Hitachi High-Tech Science Corporation AFM5300E
BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific Inc. 23227
Cantilever Hitachi High-Tech Science Corporation K-A102001593
Confocal Laser Scanning Microscope Carl Zeiss LSM700
Cork Borer Sigma-Aldrich Co., LLC. Z165220 For excision of leaves into 1-cm diameter disks
Coverslip Matsunami Glass Ind., Ltd. C02261
Cuvette Sarstedt 759116
Folded Capillary Cell Malvern Instruments, Ltd. DTS1070
Forceps Shimizu Akira Inc. Stainless pincet 150
Homogenization Pestle Ieda Trading Corp. 9993
Mica Nisshin EM Co., Ltd. LC23Z
Microcentrifuge Beckman Coulter BKA46472
Microplate Reader Molecular Devices Corporation Spectra MAX M3
Microscope Slide Matsunami Glass Ind., Ltd. S011120
Pipette Eppendorf Research® plus 3120000909
Pipette Tips AS ONE Corporation 2-5138-01, 2-5138-02, 2-5138-03
Plastic Petri Dish AS ONE Corporation 1-7484-01
Renilla Luciferase Assay Kit Promega corporation E2810
Rhodamine B Isothiocyanate Sigma-Aldrich Co., LLC. 283924
RNase-Free Water Qiagen 129112
Sodium Carbonate Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 199-01585
Surgical Blade and Handle FEATHER Safety Razor Co., Ltd. Stainless steel No. 14 (blade), No. 3L (handle)
Syringe Tip Cap Musashi Engineering Inc. NC-3E
Weighing Balance Sartorius CPA225D
Zeta Potentiometer Malvern Instruments, Ltd. Zetasizer Nano-ZS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Altman, A., Hasegawa, P. M. Plant biotechnology and agriculture: Prospects for the 21st century. Academic Press. Cambridge, MA. (2011).
  2. Horn, M. E., Woodard, S. L., Howard, J. A. Plant molecular farming: systems and products. Plant Cell Rep. 22, 711-720 (2004).
  3. Gelvin, S. B. Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the "gene-jockeying" tool. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 67, 16-37 (2003).
  4. Klein, T. M., Wolf, E. D., Wu, R., Sanford, J. C. High-velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells. Nature. 327, 70-73 (1987).
  5. Fromm, M., Taylor, L. P., Walbot, V. Expression of genes transferred into monocot and dicot plant cells by electroporation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 82, 5824-5828 (1985).
  6. Krens, F. A., Molendijk, L., Wullems, G. J., Schilperoort, R. A. In vitro transformation of plant protoplasts with Ti-plasmid DNA. Nature. 296, 72-74 (1982).
  7. Birch, R. G. Plant transformation: problems and strategies for practical application. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48, 297-326 (1997).
  8. Newell, C. A. Plant transformation technology. Developments and applications. Mol. Biotechnol. 16, 53-65 (2000).
  9. Nielsen, K. M., Bones, A. M., Smalla, K., van Elsas, J. D. Horizontal gene transfer from transgenic plants to terrestrial bacteria--a rare event? FEMS Microbiol. Rev. 22, 79-103 (1998).
  10. Chuah, J. A., Kaplan, D., Numata, K. Chapter 25, Engineering peptide-based carriers for drug and gene delivery. Engineering in Translational Medicine. Cai, W. Springer. 667-689 (2014).
  11. Nitta, S., Numata, K. Biopolymer-based nanoparticles for drug/gene delivery and tissue engineering. Int. J. Mol. Sci. 14, 1629-1654 (2013).
  12. Numata, K. Poly(amino acid)s/polypeptides as potential functional and structural materials. Polym. J. 47, 537-545 (2015).
  13. Numata, K., Kaplan, D. L. Silk-based delivery systems of bioactive molecules. Adv. Drug Deliv. Rev. 62, 1497-1508 (2010).
  14. Numata, K., Subramanian, B., Currie, H. A., Kaplan, D. L. Bioengineered silk protein-based gene delivery systems. Biomaterials. 30, 5775-5784 (2009).
  15. Chugh, A., Eudes, F., Shim, Y. S. Cell-penetrating peptides: nanocarrier for macromolecule delivery in living cells. IUBMB Life. 62, 183-193 (2010).
  16. Eggenberger, K., Mink, C., Wadhwani, P., Ulrich, A. S., Nick, P. Using the peptide Bp100 as a cell-penetrating tool for the chemical engineering of actin filaments within living plant cells. ChemBioChem. 12, 132-137 (2011).
  17. Numata, K., Kaplan, D. L. Silk-based gene carriers with cell membrane destabilizing peptides. Biomacromolecules. 11, 3189-3195 (2010).
  18. Numata, K., Hamasaki, J., Subramanian, B., Kaplan, D. L. Gene delivery mediated by recombinant silk proteins containing cationic and cell binding motifs. J. Control. Release. 146, 136-143 (2010).
  19. Numata, K., Mieszawska-Czajkowska, A. J., Kvenvold, L. A., Kaplan, D. L. Silk-based nanocomplexes with tumor-homing peptides for tumor-specific gene delivery. Macromol. Biosci. 12, 75-82 (2012).
  20. Numata, K., Reagan, M. R., Goldstein, R. H., Rosenblatt, M., Kaplan, D. L. Spider silk-based gene carriers for tumor cell-specific delivery. Bioconjugate Chem. 22, 1605-1610 (2011).
  21. Chuah, J. A., Yoshizumi, T., Kodama, Y., Numata, K. Gene introduction into the mitochondria of Arabidopsis thaliana via peptide-based carriers. Sci. Rep. 5, 7751 (2015).
  22. Plant transformation method. Patent. Numata, K., Yoshizumi, T., Kodama, Y. WO2015133652 A1 (2015).
  23. Ng, K. K., et al. Intracellular delivery of proteins in intact plants via fusion peptides. PLoS ONE. 11, e0154081 (2016).
  24. Lakshmanan, M., Kodama, Y., Yoshizumi, T., Sudesh, K., Numata, K. Rapid and efficient gene delivery into plant cells using designed peptide carriers. Biomacromolecules. 14, 10-16 (2012).
  25. Lakshmanan, M., Yoshizumi, T., Sudesh, K., Kodama, Y., Numata, K. Double-stranded DNA introduction into intact plants using peptide-DNA complexes. Plant Biotechnol. 32, 39-45 (2015).
  26. Numata, K., Ohtani, M., Yoshizumi, T., Demura, T., Kodama, Y. Local gene silencing in plants via synthetic dsRNA and carrier peptide. Plant Biotechnol. J. 12, 1027-1034 (2014).
  27. Numata, K., et al. Enzymatic degradation processes of poly[(R)-3-hydroxybutyric acid] and poly[(R)-3-hydroxybutyric acid-co-(R)-3-hydroxyvaleric acid] single crystals revealed by atomic force microscopy: effects of molecular weight and second-monomer composition on erosion rates. Biomacromolecules. 6, 2008-2016 (2005).
  28. Numata, K., et al. Adsorption of biopolyester depolymerase on silicon wafer and poly[(R)-3-hydroxybutyric acid] single crystal revealed by real-time AFM. Macromol. Biosci. 6, 41-50 (2006).
  29. Kawai, S., Nishizawa, M. New procedure for DNA transfection with polycation and dimethyl sulfoxide. Mol. Cell. Biol. 4, 1172-1174 (1984).
  30. Liu, F., Song, Y., Liu, D. Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA. Gene Ther. 6, 1258-1266 (1999).
  31. Luo, D., Saltzman, W. M. Enhancement of transfection by physical concentration of DNA at the cell surface. Nat. Biotechnol. 18, 893-895 (2000).
  32. Boynton, J. E., et al. Chloroplast transformation in Chlamydomonas with high velocity microprojectiles. Science. 240, 1534-1538 (1988).
  33. Sikdar, R. S., Serino, G., Chaudhuri, S., Maliga, P. Plastid transformation. Arabidopsis thaliana Plant Cell Rep. 18, 20-24 (1998).
  34. Svab, Z., Hajdukiewicz, P., Maliga, P. Stable transformation of plastids in higher plants. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 87, 8526-8530 (1990).
  35. Liu, Y. G., et al. Complementation of plant mutants with large genomic DNA fragments by a transformation-competent artificial chromosome vector accelerates positional cloning. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 6535-6540 (1999).
  36. Park, H. S., Lee, B. M., Salas, G. M., Srivatanakul, M., Smith, H. R. Shorter T-DNA or additional virulence genes improve Agrobactrium-mediated transformation. Theor. Appl. Genet. 101, 1015-1020 (2000).
  37. Frary, A., Hamilton, C. M. Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: an analysis in tomato. Transgenic Res. 10, 121-132 (2001).
  38. Que, Q., et al. Maize transformation technology development for commercial event generation. Front. Plant Sci. 5, 379 (2014).
  39. Miranda, A., Janssen, G., Hodges, L., Peralta, E. G., Ream, W. Agrobacterium tumefaciens transfers extremely long T-DNAs by a unidirectional mechanism. J. Bacteriol. 174, 2288-2297 (1992).
  40. Loeb, T. A., Spring, L. M., Steck, T. R., Reynolds, T. L. Transgenic wheat (Triticum spp.). Transgenic Crops I. Bajaj, Y. P. S. Springer. 14-36 (2000).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics